Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Single-molecuul Förster Resonance Energy Transfer methoden voor real-time onderzoek van de Holliday Junction-resolutie door GEN1

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60045
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of DNA Replication and Recombination, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)
* These authors contributed equally

Summary

Gepresenteerd hier is een protocol voor het uitvoeren van single-molecuul Förster resonantie energie overdracht te bestuderen HJ resolutie. Voor het bepalen van de dissociatieconstanten wordt tweekleurige alternerende excitatie gebruikt. Single-Color timelapse smFRET wordt vervolgens toegepast in real-time decolleté assays om de dwelltijd verdeling vóór HJ resolutie te verkrijgen.

Abstract

Bulk methodes meten het ensemble gedrag van moleculen, waarbij de individuele reactiepercentages van de onderliggende stappen gemiddeld zijn in de gehele populatie. Single-molecuul Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) biedt een opname van de conformationele veranderingen die door individuele moleculen in real-time plaatsvinden. Daarom is smFRET krachtig in het meten van structurele veranderingen in het enzym of substraat tijdens binding en katalyse. Dit werk presenteert een protocol voor single-molecuul beeldvorming van de interactie van een vierweg Holliday Junction (HJ) en gap endonuclease I (GEN1), een cytosolische homologe recombinatie enzym. Ook gepresenteerd zijn single-Color en twee-Color afwisselend excitatie (ALEX) smFRET experimentele protocollen te volgen van de resolutie van de HJ door GEN1 in real-time. De kinetiek van GEN1 door dimerisatie worden bepaald bij de HJ, die is gesuggereerd om een sleutelrol te spelen in de resolutie van de HJ en is ongrijpbaar gebleven tot nu toe. De hier beschreven technieken kunnen op grote schaal worden toegepast om waardevolle mechanistische inzichten van veel enzym-DNA-systemen te verkrijgen.

Introduction

Enkelvoudige molecuul methoden op basis van fluorescentiedetectie zorgen voor hoge signaal-ruis verhoudingen1. FRET is een spectroscopische techniek die afstanden in het bereik van 1 – 10 nm kan meten, waardoor deze techniek als moleculaire heerser voor het meten van afstanden in het nanometer bereik2,3wordt weergeven. Het absorptiespectrum van de acceptor heeft een gedeeltelijke spectrale overlap met het emissiespectrum van de donor op het kortere golflengte uiteinde. FRET wordt gemedieerd door de door straling minder energie overdracht tussen een donor-en acceptor-paar, terwijl de efficiëntie van de energie overdracht afhankelijk is van de afstand en de oriëntatie van de acceptor4.

Er zijn verschillende benaderingen geïmplementeerd om de achtergrond te minimaliseren en de detectie-efficiëntie van het fluorescentie signaal5,6te verbeteren. Een benadering is confocale microscopie, waarbij een pinhole de excitatie vlek beperkt tot een grootte onder de diffractie-limiet7. Een andere benadering is de totale inwendige reflectie fluorescentie (TIRF), een breedveld verlichtingstechniek waarbij het licht uit de as boven een kritische hoek8wordt geleid. Het licht wordt dan volledig intern weerspiegeld op het raakvlak tussen de glas-en waterige oplossing, waardoor een evanescerende Golf wordt gegenereerd die alleen de op het glasoppervlak bevestigde fluor stralen verlicht en achtergrond van de fluor in de rest van de oplossing.

Bij confocale microscopie kunnen de moleculen vrij worden verspreid of geïmmobiliseerd oppervlak. De bereikte tijdelijke resolutie kan worden binnen microseconden tot enkele milliseconden9. De confocale detectie voor een enkel molecuul wordt uitgevoerd door Single-Photon Avalanche diode (SPAD) en Point-by-Point scanning van de regio van belang10. In TIRF wordt een tijdreeks van enkele honderden moleculen geïmmobiliseerd op het oppervlak opgenomen door een positie gevoelige tweedimensionale lading gekoppelde detector (CCD). De CCD versterkt het fluorescentie signaal door geïntensiveerd fosfor scherm en Microchannel plaat of op-chip vermenigvuldiging van photoelek tronen (EMCCD). De tijdelijke resolutie is afhankelijk van de uitlezen snelheid en de kwantum efficiëntie van de CCD en meestal op volgorde van enkele tientallen milliseconden6.

HJ is een centrale intermediair in DNA reparatie en recombinatie11,12,13,14. HJ heeft twee doorlopende en twee kruisende strengen die verbinding maken tussen de doorlopende strengen zonder elkaar te snijden. HJ bestaat in oplossing als X-gestapelde conformers, die continue isomerisatie ondergaan door de doorlopende strengen die kruisingen worden en de kruisende strengen continu worden in de andere conformer15. Isomeer voorkeur van de HJ is afhankelijk van de kern sequentie en Ionische omgeving en is uitgebreid bestudeerd door fret16,17,18,19.

GEN120 is een monomere proteïne in oplossing21 en vereist door dimerisatie te klieven de HJ, waardoor de juiste scheiding van de gerecombineerde strengen22,23. De stapelen conformer voorkeur van de HJ beïnvloedt de uitkomst van genetische recombinatie door het instellen van de oriëntatie van de resolutie door de HJ resolvazen24. Begrijpen hoe GEN1 bindt de HJ, coördineert de twee incisies, en zorgt ervoor dat de volledige resolutie zijn allemaal onder intensieve studie21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.

In deze studie wordt een objectief gebaseerde TIRF-opstelling gebruikt zoals eerder beschreven31. Twee kleuren alternerende excitatie (Alex) wordt toegepast om te bepalen van de conformationele veranderingen op de interactie van GEN1 met de gelabeld HJ. Alex produceert 2D histogrammen op basis van twee ratiometrische parameters fret efficiency E, dat is donor-acceptor distance-afhankelijke, en de stoichiometrie parameter S, die meet de donor-acceptor stoichiometrie32. ALEX maakt het sorteren van fluorescerende soorten mogelijk op basis van de stoichiometrieën van de fluor Foren, inclusief alleen donor-, acceptor-en gemengde subpopulaties. Alex kan het gebruik van fret uitbreiden naar het volledige bereik en kan verschillen in de-helderheid en oligomerisatie detecteren, evenals macromoleculaire-ligand-interacties controleren33.

Het is gevonden dat GEN1 consistent slaagt in het oplossen van de HJ binnen de levensduur van de GEN1-HJ complex. De tijdsafhankelijke conformationele veranderingen zijn afgeleid van de tijd-sporen van individuele moleculen, terwijl de histogrammen de verdeling van de onderliggende populaties vertegenwoordigen. Met behulp van time-lapse single-Color FRET, snelle on-rates en trage tarieven voor de GEN1 dimeer worden gedemonstreerd, die de affiniteit van de geassembleerde GEN1 dimeer bij de eerste incisie product te verhogen.

Protocol

1. voorbereiding van oppervlakte-Gefunctionaliseerde dekstroken

  1. Reiniging
    1. Plaats vijf dekstroken (24 mm x 60 mm) in ethanol in een Coplin jar. Sonicaat in ethanol dan in 1 M kaliumhydroxide gedurende 30 min voor 3x. Was in aceton 3x dan decant.
  2. Silanisatie
    1. Bereid een oplossing van 2,8% 3-aminopropyltriethoxysilaan (APTES) in aceton. Sluit de APTES-fles af met een paraffine folie en bewaar deze bij 4 °C.
      Opmerking: gebruik een veiligheidsbril en werk onder een rook afzuigkap. De container van de silaan-oplossing moet volledig droog en gespoeld worden door aceton onmiddellijk voor en na het gieten van de silaan-oplossing in de pot.
    2. Giet 70 mL van de 2,8% APTES-oplossing in de Coplin-pot met de dekstroken. Schud de pot gedurende 4 minuten in een rondschudapparaat.
    3. Laat de pot gedurende 5 minuten op de Bank staan, soniceren gedurende 1 minuut en houd de pot tenslotte nog 10 minuten op de Bank om te reageren met de hydroxylgroepen op het glazen oppervlak.
    4. Quench de reactie door de toevoeging van 1 L gedeïoniseerd water door water direct in de pot te gieten voor snelle oplosmiddel uitwisseling. Spoel de dia's 3x in water door zijwaarts schudden van de pot op een vlakke ondergrond.
    5. Neem de dekstroken uit de pot en plaats ze op een aluminiumfolie bakje. Bak de dekstroken in een oven bij 110 °C gedurende 30 minuten om de afdek stroken te drogen en de silaan te genezen. Laat de lade op de Bank staan om de dekstroken af te koelen tot kamertemperatuur.
  3. PEGylation
    1. Verwarm de biotinyleerd Peg en Peg, opgeslagen bij-20 °c tot kamertemperatuur (RT) om condensatie van vocht bij het openen van de container te voorkomen.
    2. Plaats vijf dekstroken met het gesilaneerde glaswol oppervlak naar boven op een doos. Plaats twee afdekglas stroken (22 mm x 22 mm) als afstandhouders langs de randen van de gesilaneerde glaswol dekstroken.
    3. Eenmaal opgewarmd, maken biotinyated Peg en Peg oplossingen in een verhouding van ~ 1:100 in 1 ml van verse, 0,1 M natriumbicarbonaat oplossing door toevoeging van 1,5 mg biotinyleerd Peg en 150 mg Peg in een 1,5 ml buis.
    4. Vortex de buis om te ontbinden PEG en spin naar beneden om luchtbellen te verwijderen.
      Opmerking: Ga verder vanaf deze stap, wees snel, omdat PEG hydrolyseert in oplossing binnen een tijdschaal van min.
    5. Breng 100 μL van de PEG-oplossing snel aan op elke dekslip. Neem nog een gebakken dekglaasje en plaats het bovenste gesilaneerde glaswol oppervlak op de bovenkant van de afdekplaat met de Peg-oplossing, vandaar het vormen van een glas-Solution-Glass sandwich waarin de 22 mm x 22 mm niet-gesilaniseerde dekstroken toestaan dat de twee Gefunctionaliseerde dekstroken gemakkelijk gescheiden worden.
    6. Inbroed de afdek stroken 's nachts (16 uur) in het donker en bij RT. Zodra de incubatie voltooid is, neem de dekstroken uit elkaar, spoel vervolgens 10x met gedeïoniseerd water door van de zijkant te wassen met een spuitfles.
    7. Droog de dekstroken onder een stroom van droge stikstof. Bewaar de droge dekstroken onder vacuüm.
      Opmerking: de dia's kunnen worden gebruikt voor 1 maand zonder verslechtering van de kwaliteit.

2. bereiding van de stroomcel

  1. Eenkanaals stroomcel
    1. Boor twee gaten met een diameter van 1,22 mm in het middelste deel van een kwarts glijbaan (50 mm x 20 mm) met de Centreer punten 37 mm uit elkaar en 6,5 mm van de rand van de glijbaan (Figuur 1a).
    2. Knip een 41 mm x 2,25 mm-kanaal in een stuk van een dubbele kleefplaat van 50 mm x 20 mm met behulp van een elektronische frees.
    3. Schil de plastic kant van de beschermkap en lijn de randen van het stuk uit met de randen van de kwarts glijbaan. Verwijder ingesloten luchtbellen door zachtjes te drukken met een paar polytetrafluorethyleen pincet.
    4. Verwijder de papier zijde van het Kleef stuk. Monteer het stuk op het Gefunctionaliseerde oppervlak van de dekslip.
    5. Snijd polyethyleen slang (I.D. 1,22 mm) in een lengte van 11 cm voor de inlaat en 25 cm voor de uitlaat. Plaats de buis in de eerder geboorde gaten als inlaat en uitlaat voor de stroomcel.
    6. Gebruik 5 min epoxy lijm om rond de randen van de Quartz-coverslip-interface en rond de buizen voor de inlaat en uitlaat te verzegelen.
    7. Gebruik de stroomcel onmiddellijk zodra deze droogt of bewaar onder droog vacuüm voor later gebruik.
    8. Los avidin in PBS op tot een concentratie van 0,03 mg/mL. Filter door middel van een spuit filter van 0,2 μm.
    9. Stroom avidin in de stroomcel met behulp van een 1 mL spuit. Gebruik een andere spuit gevuld met buffer om overtollige avidin te wassen. Wees voorzichtig om geen luchtbellen te introduceren tijdens het uitwisselen van de spuiten.
  2. Meerkanaals stroomcel
    1. Boor zes gaten met een diameter van 1,22 mm op elk van de lange zijden van een kwarts glijbaan (76 mm x 25 mm) (Figuur 1b). Maak de gaten 4,5 mm van de rand van de glijbaan en 9,3 mm uit elkaar. Zorg ervoor dat de afstand tussen de centra van elk hole paar 15 mm is.
    2. Knip zes kanalen (20 mm x 2,25 mm) in een tweeklevende tape van 76 mm x 25 mm met behulp van de elektronische frees.
    3. Schil de plastic kant van de beschermkap en lijn de randen van het lijm stuk uit met de randen van de kwarts glijbaan. Verwijder eventuele ingesloten luchtbellen door zachtjes te drukken met behulp van een paar polytetrafluorethyleen pincet.
    4. Verwijder de papier zijde van het Kleef stuk en monteer het op het Gefunctionaliseerde oppervlak van de afdekfolie.
      Opmerking: soms afbladderen van de papier kant en hechten aan de Quartz Slide werkt goed in de multichannel stroomcel.
    5. Knip de inlaatbuizen (11 cm) en de uitlaat buizen (25 cm) voor de zes kanalen. Bereid de stroomcel voor zoals beschreven in stap 2.1.6 – 2.1.9.
    6. Sluit de uitlaat van het eerste kanaal aan op de pomp. Plaats de inlaat in een buis van 0,5 mL met OSS.
      Opmerking: de lengte van de inlaatbuis wordt gekozen om het aantal gebeurtenissen in de splijting experimenten uitgevoerd onder continue stroom te maximaliseren door het synchroniseren van de tijd van enzym ingang in de stroomcel en het begin van de beeldvorming waardoor vroegtijdige fotobleking van de fluorohores.
    7. Ga naar een nieuw kanaal door de uitlaat van het gebruikte kanaal los te koppelen. Sluit het stopcontact met een plug die is gemaakt van een injectienaald die is verzegeld met lijm in het kunststof gedeelte. Sluit de inlaat van het gebruikte kanaal.

3. bereiding van het zuurstof ruimings systeem (OSS)

  1. Los 0,2 g (±) -6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchromane-2-carboxylzuur op (triplet State dorstlesser die het knipperen van de fluoroforen minimaliseert) in 800 μL methanol.
  2. Voeg 6 ml gedeïoniseerde H2O toe en voeg 1 N NaOH druppelsgewijs toe totdat het oplost. Filtreer door een spuit filter, maak in 1 mL aliquots en bewaar bij-80 °C. De voorraad concentratie is ~ 100 μM.
  3. Bereid een nieuwe oplossing van 3, 4-dihroxybenzoinezuur (PCA) door het oplossen van 61 mg PCA-poeder in 4 mL ddH2O. De voorraad concentratie is ~ 100 nM.
  4. Voeg 58 μL 10 N NaOH dropwise toe, zorg ervoor dat u na elke druppel een Vortex maakt totdat de PCA volledig is opgelost (pH = 9).
  5. Los 5,3 mg protocatechuate 3, 4-dioxygenase (3, 4-PCD) op in 7 mL opslag buffer voor PCD (tabel 1). 3, 4-PCD verwijdert zuurstof uit de binding/splijting buffers door het katalyseren van de oxidatie van protocatechuïnezuur acid34.
  6. Verdeel de PCD-oplossing in 1 mL aliquots. De voorraad concentratie is ~ 1 μM. Klik in de vriezer om de aliquots in vloeibare stikstof te bevriezen en bewaar bij-80 °C voor langdurige opslag of bij-20 °C voor korte-termijn opslag.
  7. Bereid een nieuwe bindings buffer (tabel 1). Vervang 2 mM CaCl2 met 2 mm MgCl2 voor smfret decolleté experimenten.
  8. Bereid 1 mL van de beeldvormings buffer (tabel 1). Houd de beeldvormings buffer op ijs totdat deze in de stroomcel wordt ingebracht om de activiteit van het zuurstof opruimingssysteem te behouden.

4. bereiding van fluorescently gelabelde HJs

  1. Reconstitueer de gelyofiliseerde oligos (tabel 2) in tris-EDTA-buffer (tabel 1) tot een concentratie van 100 μM.
  2. Bereid de synthetische kruising door equimolaire porties te mengen ~ 3 μL van elk van de X0 oligos die in tabel 1worden vermeld.
  3. Anneal door verwarming bij 95 °C gedurende 5 minuten gevolgd door langzame koeling tot RT met een snelheid van 1 °C/min. gebruik een warmte blok of PCR-Thermocycler om de gewenste koelsnelheid te bereiken.
  4. Laad het mengsel op 8 cm x 8 cm van 10% tris-borate-EDTA polyacrylamidegel. Breng 100 V aan en voer de gel uit voor ~ 2 uur. De bands worden duidelijk gezien door het oog, en hun kleur is paars.
  5. Accijns de band van het gegloeide substraat met een schoon blad. Breng het gelstuk over in een geautoclaveerd 1,5 mL Tube.
  6. Plet het gelstuk in de buis met een schone zuiger en voeg vervolgens 100 μL TE100-buffer (tabel 1) toe.
  7. Pak de HJ door schudden van de buis bij 20 ° c bij 1.500 rpm in een thermomixer voor ~ 2 h of inincuberen 's nachts bij 4 ° c.
  8. Voer ethanol precipitatie uit op de oplossing die het substraat35bevat.
  9. Breng de ondergrond in 20 μL TE100 buffer uit (tabel 1). De uiteindelijke concentratie is 1–3 ΜM. aliquot 2 μL in elke buis en bewaren bij-20 °c.

5. eiwit expressie en zuivering van GEN1

  1. Bouw het plasmide voor de uitdrukking van afgeknotte menselijke GEN11,2,3,4,5 met hexa histidine-tag aan de C-Terminus20 door PCR van de ingangs vector.
    Opmerking: N-Terminal tagging zou resulteren in de inactivatie van GEN1. De ongestructureerde C-tail maakt de zuivering van de volledige lengte GEN1 aanzienlijk moeilijker. Ook is de volledige lengte GEN1 gerapporteerd aan minder activiteit dan afgekapt versie23vertonen.
  2. Transformeer de expressie vector in E. coli BL21-codonplus (DE3)-ripl stam.
  3. De getransformeerde cellen worden in twee kolven van 6 l geënt, elk met 2 l Luria Bouillon-media bij 37 °c, met een schud snelheid van 180 rpm tot een od600 van 0,8 is bereikt.
  4. Koel de cultuur af tot 16 °C en induceren GEN1 expressie met 0,1 mM Isopropyl-β-d-thiogalactopyranoside (IPTG) voor 48 h.
  5. Oogst de cellen door ze te spinnen bij 4 °C bij 1000 x g in een centrifuge. Elke liter cultuur levert 5–6 g van de pellet.
  6. Gooi de supernatant weg en regeer de cellen met pellets in de lysisbuffer (tabel 1) met 4 ml/g cellen.
  7. Voer celllysis uit met behulp van een cel disruptor bij 30 kPsi en spin vervolgens op 10.000 x g gedurende 1 uur bij 4 °c. Verzamel het supernatant en filtreer het op ijs met behulp van 0,45 μm filters.
  8. Voer met FPLC een eiwit zuivering uit door het filtraat door te geven via een 5 mL ni-NTA-kolom met een debiet van 2,5 ml/min met buffer A (tabel 1).
  9. Wassen met 15 kolom volumes (CV). Elute met een lineaire gradiënt van buffer A en 500 mM imidazol over 20 CV in fracties van 5 mL. GEN1 kolom uit de kolom rond 100 mm imidazol.
  10. Pipetteer 10 μL aliquots uit de verzamelde fracties, voeg gelijk volume van 2x SDS loading Dye toe aan elk aliquot. Denature de monsters door te verwarmen bij 90 °C gedurende 5 min, koel, en draai de monsters.
  11. Laad de monsters op 10% bis-tris gel. Voer de gel 30–45 min op 200 V. vlek met behulp van Coomassie Brilliant Blue, dan destain. Verzamel de fracties die gezuiverde GEN1 bevatten.
  12. Verminder de zoutconcentratie van de gecombineerde fracties tot 100 mM door verdunning met behulp van buffer C (tabel 1).
  13. Geef het lage zout eiwit door een 5 mL heparine kolom met een debiet van 3 mL/min met buffer B (tabel 1).
  14. Wassen met 10 CV. Elute met een helling van 20 CV met buffer B en 1 M NaCl. Verzamel 5 mL fracties waarin GEN1 rond 360 mM NaCl.
  15. Controleer de elerefracties voor gezuiverde GEN1 fracties zoals beschreven in stap 5,8. Combineer die fracties en Verdun tot 100 mM NaCl met behulp van buffer C.
  16. Laad het onderste zout eiwit op een kationen wisselingskolom bij 1 mL/min stroomsnelheid met buffer B.
  17. Elute door een helling van 40 CV met buffer B en 1 M NaCl. Verzamel 1,7 ml fracties in welke GEN1 kolom rond 300 mm NaCl.
  18. Controleer de zuiverheid van GEN1 in de elerefracties zoals beschreven in stap 5,8.
  19. Combineer de zuiverste fracties en dialyze bij 4 °C tegen opslag buffer (tabel 1). Ten minste één uitwisseling van de buffer tijdens dialyse uitvoeren.
  20. Meet de eiwitconcentratie ~ 0,5–1 mg/ml. Aliquot het dialyzed eiwit in 10–15 μL in kleine buisjes, in vloeibare stikstof, en bewaar bij-80 °c.

6. single-molecule FRET experimenten

Opmerking: de smFRET-experimenten worden uitgevoerd op een op maat gemaakte objectief gebaseerde TIRF-opstelling (figuur 1c) die eerder werd beschreven31.

  1. Single-Color FRET experimenten
    1. Breng één druppel Dompel olie aan op de 100x TIRF-doelstelling. Stel de EMCCD in op een geschikte versterking om het signaal naar de achtergrond te optimaliseren en verzadiging te voorkomen.
      Opmerking: kijk niet direct in de laserstraal en draag een beschermende bril bij het uitlijnen van de laser.
    2. Plaats de stroomcel voorzichtig op de monsterhouder. Verhoog geleidelijk het doel met behulp van grove aanpassing totdat de olie de dekslip raakt.
    3. Zet de groene laser aan (532 nm). Overschakelen naar de modus voor fijnafstelling van de doelstelling. Directe de emissie naar de camera poort om het beeld op de monitor te observeren.
    4. Pas de hoogte van de doelstelling aan totdat het Gefunctionaliseerde oppervlak van de Afdeklijst scherp wordt gesteld en op de monitor kan worden waargenomen.
      Opmerking: de beeld verwerving door EMCCD activeert de laser excitatie via het acousto-optische instelbare filter (AOTF) om fotobleking van het monster te voorkomen wanneer beelden niet worden verkregen.
    5. Controleer of de achtergrond van het Gefunctionaliseerde oppervlak van de dekstroken niet meer dan enkele vlekken overschrijdt voordat deze in het fluorescently label HJ stroomt.
    6. Verdun het voorraad substraat ongeveer 1000 keer in TE100 buffer (tabel 1) tot een eindconcentratie van 1 – 5 nm. Pipetteer 0,2 – 0,5 μL van het verdunde substraat in 120 μL van de beeldvormings buffer met OSS in een buis van 0,5 mL.
    7. Sluit de uitlaat van de stroomcel aan op de pomp van de spuit. Steek de inlaatbuis van de stroomcel in de buis van 1,5 mL en bedien de spuitpomp met een debiet van 30 – 50 μL/min om de oplossing uit de buis te trekken.
    8. Controleer regelmatig het oppervlak voor een goede dekking (100 – 300 van homogenously verdeelde, goed verdeelde ondergrond) door een korte beeldvorming met de groene laser.
    9. Als de dekking van het oppervlak nog steeds niet voldoende is, wacht dan enkele minuten tot het fluorescently label HJ van de oplossing om zich op het oppervlak te vestigen of herhaal de vloeiende stap.
    10. Stroom nog eens 120 μL van de beeldvormings buffer (tabel 1) bij 30 – 50 μL/min om niet-afhankelijke fluorescently met het label HJ te wassen. Laat vervolgens de stroomcel 5 minuten zitten, zodat de OSS opgeloste zuurstof kan afbreken. De fotobleking van de fluor Foren moet bij aanvang van de beeldvorming minimaal zijn.
    11. Stel de belichtingstijd (~ 60 MS) in, de cyclustijd wordt automatisch ingesteld door software op basis van de snelheid van de gegevensoverdracht (~ 104 MS) en specificeer het gewenste aantal cycli of frames (~ 400). De emissie van donor (Cy3) en acceptor (Alexa Fluor 647) is opgesplitst in twee kleurkanalen door een beeld splitter apparaat.
    12. Zoek een geschikt gebied op het oppervlak, concentreer de afbeelding door de hoogte van de doelstelling aan te passen en de film in een 16-bits TIFF-indeling te registreren en op te slaan.
    13. Naar een nieuw gebied verplaatsen.
      Opmerking: Beweeg altijd in één richting (d.w.z. van de uitlaat naar de inlaat) om Imaging niet hetzelfde gebied tweemaal te vermijden.
    14. Bereid 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75 en 100 nM GEN1 in 120 μL van de beeldvormings buffer een voor een. Debiet van de oplossing met een debiet van 30-50 μL/min.
      Opmerking: als de vereiste meting wordt uitgevoerd onder steady state als in de binding van HJ door GEN1 of de isomerisatie van de gratis HJ, wacht dan 3 – 5 min na de stroom stopt om de film op te nemen. Verwerven van drie tot vier films uit nieuwe gebieden voor elke GEN1-concentratie.
    15. Als de meting wordt uitgevoerd onder continue stroom als in splitsing van HJ door GEN1 Start opnemen 5 – 10 s voor de ingang van GEN1 in de stroomcel. Herhaal de meting door naar een nieuw kanaal in de stroomcel met zes kanalen te gaan.
    16. Aan het einde, gebruik een vaste fluorescerende kraal dia om de donor en acceptor deeltjes aan elkaar in de afbeelding splitsings apparaat.
    17. Voeg 0,2 μL fluorescerende kralen met een diameter van 1 μm toe aan 500 μL van 1 M Tris (pH = 8,0), zodat de parels aan het oppervlak kunnen blijven plakken.
    18. Snijd een vierkant (18 mm x 18 mm) binnen een 22 mm x 22 mm stuk van een dubbelzijdige Kleef zegel. Schil het stuk en plak het in het midden van een kwarts glijbaan van 76 mm x 25 mm.
    19. Plaats 50 μL van de verdunde kralen oplossing en laat 5 – 10 min. om zich te vestigen. Bevestig een 22 mm x 22 mm afdek bovenop het vierkante stuk. Droge overtollige kralen oplossing met weefsel, dan verzegelen de kamer met epoxy lijm.
    20. Verkrijg 100 frames van de kralen glijbaan bij een 60 MS belichtingstijd.
      Let op: verlaag het Laser vermogen en de EMCCD Gain tot een minimum om verzadiging van de detector te voorkomen.
    21. Installeer het softwarepakket (bijv. Twotonen) en open de daarin opgenomen films zoals aangegeven in de gebruikershandleiding36. Selecteer de posities van de individuele kralen in de donor-en accepterende kanalen. Genereer een transformatie matrix zoals beschreven in de handleiding.
      Opmerking: deze software gebruikt transformatie matrix om de posities van de deeltjes in de donor-en accepterende kanalen te matchen en om een lichte afwijking in het beeld splitsings apparaat te corrigeren.
    22. Ga naar bestand, druk op film laden, Selecteer het filmbestand en druk op Open. Druk in het menu bestand op Load TFORM en selecteer de transformatie matrix die is gegenereerd op basis van de Beads-dia. Pas de drempel voor de kanalen van de donor en acceptor aan totdat er geen valse positieven zijn opgenomen.
    23. Kies in het menu kanaal filter D & & een optie om te selecteren voor deeltjes die zijn gelabeld met zowel de donor als de acceptor. Controleer het dichtstbijzijnde neighbor Limit-veld om moleculen uit te sluiten die dicht bij elkaar liggen. Vink Max ellipsiteit aan om zeer excentrische moleculen uit te sluiten en de breedte limieten te controleren om zeer brede of zeer nauwe moleculen uit te sluiten.
    24. Typ Plothistcw zoals geïnstrueerd in twotones Manual om histogrammen te construeren.
      Opmerking: de "schijnbare" FRET-efficiëntie wordt berekend door het programma door de emissie van de acceptor te delen door de totale emissies van de donor en acceptor. Twotones gebruikt 100 intervallen om de verdeling van de toestanden van de moleculen tegen de FRET-efficiëntie te bin-
    25. Typ Plottimetracecw zoals geïnstrueerd in Twotones handleiding voor het genereren van de tijd-traces voor elk molecuul.
      Opmerking: tijd sporen kunnen verder worden geanalyseerd door vbFRET37 om verschillende fret-toestanden, hun respectieve verblijfs tijden en overgangs snelheden tussen verschillende statussen te identificeren.
  2. Experimenten met twee kleuren voor afwisselend excitatie FRET (ALEX)
    1. Neem een film op die bestaat uit opeenvolgende frames van donor-en accepterende emissies door directe excitaties met respectievelijk de groene en rode lasers, elk ~ 80 MS in duur.
    2. Open de verworven ALEX-films in Twotones. Stel de geschikte detectiedrempel in als ~ 300 voor de drie kanalen: donor emissie als gevolg van donor excitatie (DexDem); afgifte van acceptor door donor excitatie (DexAem); en accepterende emissie door directe excitatie (AexAem).
    3. Pas het kanaal filter DexDem & & DexAem & & AexAem toe om te selecteren voor de deeltjes die zowel de donor als de acceptor hebben. Koppel de deeltjes ~ 200 – 300 in de drie kanalen.
    4. Gebruik de plotHistALEX MATLAB code om ALEX histogrammen te genereren. Passen verschillende pieken in de histogrammen aan Gaussiaanse functies en bepaal het percentage van elke populatie het gebied onder de curve met behulp van Origin software38.
      Opmerking: de pieken in de bindende assay corresponderen met de afhankelijke GEN1-HJ complex, terwijl in de gratis HJ, de pieken vertegenwoordigen de verwisseling van de isomeren.
    5. Gebruik de Plottimetracealex MATLAB-code om een tijds tracering te genereren voor elk molecuul dat de donor emissie weergeeft door middel van directe excitatie, en accepterende emissies als gevolg van fret en direct excitatie.
      Opmerking: ALEX time-traceert zelfstandig om de uitstoot van zowel de donor als de acceptor te laten zien, maar met een lagere temporele resolutie dan single-Color FRET. Net als bij single-Color FRET, kan ALEX time-traces verder worden geanalyseerd door vbFRET om verschillende FRET toestanden en hun respectieve verblijfs tijden te identificeren.
    6. Bepaal de Dissociatieconstante door de percentages van de gebonden populatie versus de GEN1-concentratie te monteren op een hyperbolische functie.
  3. Time lapse single-Color FRET
    1. Stel de belichtingstijd van de groene laser in op 60 MS en cyclustijd tot 624 MS of lager, afhankelijk van de snelheid van de waargenomen dynamiek.
    2. Stel de stroomsnelheid in op 110 μL/min in één kanaal van de zeskanaalstroomcel. Start de opname kort voor de ingang van GEN1 in de stroomcel.
      Opmerking: continue stroom leidt tot snelle fotobleking van de fluoroforen, waardoor het begin van de opname van Imaging en proteïne wordt gesynchroniseerd, maximaliseert het aantal vastgelegde gebeurtenissen. De optimale aflezing van de spuitpomp is afhankelijk van het dode volume en de exacte slang die wordt gebruikt om de stroomcel te monteren; in ons geval is het ~ 25 μL.
    3. Verkrijg een film van ~ 125 frames voor een totale acquisitie tijd van 78 s. Aan het einde van de opname, bloot het monster aan de rode laser voor 50 frames elk met 25 MS belichtingstijd om de acceptor te sonde.
      Opmerking: deze methode verlengt het observatie venster in decolleté experiment door het verminderen van het aantal excitatie cycli. Kinetische parameters als kop en koff van de door dimerisatie worden afgeleid door het monteren van de verdeling naar een bi-exponentiële model30,38.

7. elektroforetisch mobiliteits verschuiving assays (EMSA)

  1. In 50 μL totaal volume, incuberen de gewenste concentratie van GEN1 met 50 pM Cy5-gelabelde HJ bij RT voor 30 min in EMSA bindings buffer (tabel 1).
  2. Laad de monsters op 8 cm x 8 cm van 6% tris-borate-EDTA gel. Voer de gel uit met 100 V voor 1 h + 20 min in 1x TBE buffer op RT.
  3. Bepaal het percentage gebonden substraat bij een GEN1-concentratie van zijn relatieve bijdrage aan de totale fluorescentie intensiteit van de respectieve rijstrook.
    Opmerking: GEN1 monomeer-HJ (band I) wordt geïdentificeerd door de overeenkomst van zijn grootte met de picomolaire binding van GEN1 monomeer aan de verkreukeld HJ21,30. Gen1-dimer-HJ is toegewezen aan band II vanwege de stapsgewijze binding van GEN1 monomeer aan de HJ21,23.
  4. Bereken de schijnbare bindings constanten Kd-monomeer-app-EMSA en Kd-dimer-app-EMSA met behulp van de vergelijking:
    Equation
    Waar: Max de concentratie is waarbij de respectieve soorten zijn maximale binding bereikten (monomeer of dimeer); n = de heuvel coëfficiënt; K d-app-EMSA is de schijnbare bindende constante van de respectieve soorten, die de concentratie van GEN1 aangeeft waarbij het halve maximum van monomeer of dimeer aanwezig is.

Representative Results

Conformer bias en isomerisatie van de HJ

De isomerisatie van HJ is uitgebreid onderzocht door fret door het labelen van twee aangrenzende armen van de kruising17,18,39. De donor (Cy3) en acceptor (Alexa Fluor 647) zijn gepositioneerd aan de twee naburige armen, R (onderdeel 2) en X (onderdeel 3), respectievelijk (Figuur 2a). De gestapelde-X-isomeren werden toegewezen door hun twee continue strengen [dat wil zeggen, ISO (1, 3) of ISO (2, 4)]. Het ALEX FRET histogram van aangrenzend label X0 toont twee pieken die corresponderen met de onderlinge verandering van de meer overvloedige ISO (1, 3) (e ~ 0,75) en minder overvloedig ISO (2, 4) (e ~ 0,40) (Figuur 2b).

Single-Color FRET wordt gebruikt om tijd sporen te verwerven voor het opnemen van de snelle conformationele veranderingen in de gratis HJ met een hoge temporele resolutie ~ 10 MS via het verminderen van het gebruikte gebied van de EMCCD2 camera. Een representatieve eenkleurige FRET time-trace van X0 Junction toont de overgangen tussen hoge en lage fret-isomeren (Figuur 2b). De isomerisatie percentages kISO (1, 3)-ISO (2, 4) en kISO (2, 4)-ISO (1, 3) verkregen uit de dwelltijd histogrammen van ISO (1, 3) en ISO (2, 4) (figuur 2c) zijn consistent met die gerapporteerd eerder17.

SMFRET demonstreert actieve vervorming van de HJ door GEN1

HJ ondergaat structurele herschikking bij binding aan GEN122. Zo is de afstand tussen de donor en de acceptor vergelijkbaar in zowel ISO (1, 3) als ISO (2, 4) (Figuur 3a). De smFRET binding assays werden uitgevoerd in de aanwezigheid van CA2 + om decolleté van de HJ te voorkomen. FRET histogrammen van het naastgelegen-label X0 Junction bij verschillende GEN1 concentraties werden overgenomen door Alex (Figuur 3b). Het histogram is geschikt voor twee Gaussiaanse functies: één overeenkomend met de vrije hoge FRET ISO (1, 3), en de andere overeenkomt met de afhankelijke GEN1-HJ populatie na aftrek van de bijdrage van de ISO (2, 4) van de lage FRET piek.

Bij verzakende GEN1 concentratie, de FRET histogram van X0 heeft slechts een enkele lage fret piek OVEREENKOMEND met GEN1 gebonden aan ofwel isomeer van de HJ zoals voorspeld door de model22. De schijnbare monomeer dissociatieconstante (Kd-monomeer-app) wordt bepaald aan de hand van de hyperbolische pasvorm van de percentages van gen1 gebonden populatie als een functie van gen1 concentratie (figuur 3c). De naastgelegen-label NK-X0 vertegenwoordigt een afzonderlijk verkreukeld versie HJ dat het product na de eerste incisie reactie bootst. Als gevolg van het reliëf van de stapel spanning door de gesimuleerde Nick, is NK-X0 een niet-isomeriserende structuur40 zoals blijkt uit de enkele substraat piek bij E ~ 0,40, in tegenstelling tot X0 (figuur 3D VS. Figuur 3b). De structuur van het complex GEN1-NK-X0 is vergelijkbaar met die van het complex gen1-x0 , zoals wordt aangegeven door de gelijkenis in fret-efficiëntie (E ~ 0,25 voor NK-x0 en 0,32 voor X0) (afbeelding 3D VS. Figuur 3B). De sterke binding van GEN1 monomeer aan NK-X0 wordt aangetoond door de 40-voudige lagere Kd-monomeer-app- waarde dan die van X0 (figuur 3e VS. figuur 3c). Deze strakke binding kan fungeren als een vrijwaringsmechanisme tegen de onvolledige resolutie van de HJ in het onwaarschijnlijke geval van de dissociatie van GEN1 dimeer of een van haar monomeren.

Stepwise binding van GEN1 monomeer aan de HJ

De binding van GEN1 monomeer aan de HJ gevolgd door dimeer formatie is een unieke eigenschap voor de eukaryotische HJ resolvase GEN1 in vergelijking met prokaryote resolvazen, die bestaan in dimere vorm in de oplossing21,23,41. EMSA van GEN1 op 50 pM X0 toont de stapsgewijze Association of GEN1 in hogere orde complexen, zoals aangegeven door de Romeinse cijfers in het bovenste paneel (figuur 4a). De dissociatieconstante van GEN1 monomeer bepaald door EMSA (Kd-MONOMEER-EMSA) valt samen met de dissociatieconstante van de Smfret binding assay Kd-monomeer-app (figuur 4a en figuur 3c , respectievelijk). De kwantificering van band II wordt gebruikt om de evenwichts dissociatieconstante van GEN1 dimeer (Kd-DIMEER-EMSA) te berekenen. EMSA van GEN1 op 50 pM NK-X0 demonstreert de prominente monomeer binding, zoals aangegeven door de zeer lage Kd-MONOMEER-app-EMSA die 30-voudige lager is dan die van X0, terwijl de kd-dimer-EMSA vergelijkbaar met die van X0 (figuur 4b).

Verder bewijs dat GEN1 monomeer bindt en verstoort de HJ is de waarneming van een significant aantal sporen van niet-gespleten deeltjes met stabiele lage FRET staat (figuur 4c) in de aanwezigheid van mg2 + bij lage GEN1 concentraties. Het aantal van deze traceringen daalde bij toenemende GEN1 concentratie. De resolutie van de HJ wordt gedreven door de strakke binding van GEN1 monomeer, die dimeer-vorming ondersteunt. De monomeer binding wordt waargenomen in de tijd-sporen van de uncleaved NK-X0 in mg2 +, die zich uitstrekt tot weinig nanomolaire concentratie (figuur 4D). De GEN1 monomeer bindt strak om te beschermen NK-X0, uiteindelijk zorgen voor volledige resolutie door dimeer vorming.

SMFRET resolutie assay van de HJ

De term "splijting" in smFRET assays wordt door elkaar gebruikt met "resolutie" van de HJ, aangezien in deze bepaling alleen de product vrijgave die volgt op de tweede decolleté gebeurtenis wordt gedetecteerd. De gebeurtenissen worden opgenomen door de time-lapse single-Color excitatie om het fotobleekmoment van de foto-gevoelige acceptor te minimaliseren over de overname tijd van ~ 1,3 min.

Het schematisch beeld in figuur 5a illustreert de incisies van strengen 1 en 3 van X0 ISO (1, 3) na de binding en vervorming door GEN1 van een X0 verbonden aan het Gefunctionaliseerde glas. Zowel donor als acceptor gaan in oplossing, wat resulteert in het verlies van hun signalen na de HJ-resolutie. De eerste en tweede incisies worden ontkoppeld in NK-X0, wat een voorbeeld is van een prototype voor de gedeeltelijk opgeloste HJ. Na binding van GEN1 neemt NK-X0 een vergelijkbare structuur op X0. De resolutie gaat uit van een enkele incisie in onderdeel 1, zoals geïllustreerd in Figuur 5b.

Het gelijktijdige vertrek van de donor en acceptor na een stabiele lage FRET toestand in sporen van opgeloste X0 trad op zonder de opkomst van een tussenliggende fret (E = ~ 0,40) geeft aan dat de volledige resolutie plaatsvindt binnen de levensduur van de GEN1-HJ complex (figuur 5c). Daarom, deze resultaten suggereren dat de HJ resolutie vindt plaats binnen de GEN1-HJ complexe levensduur. De resolutie van NK-X0 wordt ook voortgezet na structurele herschikking en eindigt bij het vertrek van de duplex met twee fluor Foren (figuur 5d), vergelijkbaar met X0.

Kinetiek van gen1 door dimerisatie op gen1 monomeer gebonden HJ

Time-lapse smFRET meet τbefore-decolleté , die vooral de tijd omvat die nodig is voor dimeer vorming en resolutie van de HJ na de vervorming door GEN1 monomeer. Door deze techniek toe te passen, wordt direct bewijs geleverd ter ondersteuning van de bewering dat dimeer-formatie nodig is voor de resolutie van zowel X0 als NK-X0, aangezien de verdeling van τ-DECOLLETÉ afhankelijk is van GEN1-concentratie.

De schijnbare snelheid van de HJ-resolutie (k-app) wordt gedefinieerd als de inverse van het gemiddelde van τbefore-DECOLLETÉ bij de respectieve GEN1 concentratie. De term "schijnbare" wordt gebruikt om het tarief van de HJ-resolutie te beschrijven, aangezien de mogelijkheid dat GEN1 blijft gebonden aan het product na de HJ-resolutie niet kan worden uitgesloten.

De kansdichtheids functies (PDF) van de verdelingenvóór-decolleté van X0 (Figuur 6a) weerspiegelen de tijd voor dimeer-vorming, die langer is bij lage gen1 concentraties, dan korter bij hogere gen1 concentraties. De associatie-en dissociatie percentages voor de dimer, kon-dimer en koff-dimer, worden respectievelijk bepaald vanuit een bi-exponentieel model30. Ook de Pdf's van NK-X0 (afbeelding 6b) vertonen een vergelijkbare verdeling naar X0 die de vereiste voor dimeer vorming aangeeft.

De plot van kapp versus GEN1 concentratie werd gemonteerd op een hyperbolische functie. De schijnbare katalyse-rate constanten (kMax-app) van X0 en nk-X0 zijn respectievelijk 0,107 ± 0,011 s-1 en 0,231 ± 0,036 s-1(figuur 6c). De plots van kapp voor X0 en NK-X0 kruisingen snijden in GEN1 concentratie ~ 5,6 nm vanwege de snellere kMax-app en langzamer kon-dimer van de verkreukeld in vergelijking met de intacte kruising.

Samengevat, de relatief snelle kon-dimeer en langzame koff-dimeer leiden tot de progressie van de voorwaartse reactie naar HJ resolutie zodra de dimeer wordt gevormd. De sterke binding van GEN1 monomeer aan het knooppunt NK-X0 vormt een fail-safe mechanisme tegen een onwaarschijnlijk afgebroken tweede decolleté of helpt bij het ophalen van niet-volledig onopgeloste hjs achtergelaten door primaire resolutie trajecten in de cel.

Figure 1
Figuur 1: enkelvoudige en meerkanaals stroomcellen en indeling van de optische opstelling.
(A) Schematische voorstelling van de eenkanaals stroomcel. B) Schematische voorstelling van de stroomcel met zes kanalen. C) lay-out van de optische opstelling die de excitatie bronnen weergeeft, tirf-objectief, dichroïde spiegel die in de filtercube is geïnstalleerd, en emissie filters die worden gebruikt in het apparaat voor het splitsen van afbeeldingen. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: conformer bias en isomerisatie van de HJ waargenomen door fret.
A) isomerisatie van het aangrenzende X-gestapelde HJ-conformeren, vernoemd naar de twee doorlopende strengen. De strengen zijn genummerd, terwijl de armen worden aangeduid met letters. De incisie sites worden weergegeven door pijlen. De posities van de donor (groen) en de acceptor (rood) en de verandering in FRET bij isomerisatie zijn geïndiceerd. (B) rechter paneel: fret time-trace (zwart) en geïdealiseerde fret trace (rood) van X0 bij 50 mm mg2 +. Linker paneel: FRET histogram van X0 bij 50 mm mg2 +. De fluorescentie intensiteiten van de donor (groen) en de acceptor (rood) worden hieronder weergegeven. C) de verblijfstijd histogrammen van de aangrenzende-label X0 ISO (1, 3) en ISO (2, 4) werden op enkele exponentiële functies gemonteerd om de isomerisatie percentages te bepalen. De onzekerheden geven het 95% betrouwbaarheidsinterval van de pasvorm aan. Dit cijfer is gewijzigd van eerder gepubliceerde literatuur30.

Figure 3
Figuur 3: actieve vervorming van de HJ door GEN1.
A) structurele modificatie van aangrenentlabel HJ op basis van het voorgestelde model22. (B) Alex fret histogram van aangrenzend label X0 heeft een grote hoge fret piek (e = ~ 0,6) overeenkomend met ISO (1, 3) en onderste fret piek (e = ~ 0,4) voor ISO (2, 4). Het gehele histogram is geschikt voor twee Gaussiaanse functies: één overeenkomend met de vrije hoge FRET ISO (1, 3), en de andere overeenkomt met de gebonden populatie minus de initiële bijdrage van ISO (2, 4) aan de totale populatie. C) de schijnbare monomeer dissociatieconstante (Kd-monomeer-app) wordt bepaald aan de hand van een hyperbolische pasvorm van de percentages van gen1-gebonden populaties als een functie van de GEN1-concentratie. D) fret histogrammen van het naastgelegen label NK-X0 bij verschillende GEN1 concentraties. Het gebied onder de lage FRET (E = ~ 0,25) Gaussiaan komt overeen met het percentage van de gebonden populatie. (E) de Kd-monomeer-app van NK-X0 wordt bepaald door de hyperbolische pasvorm van de met GEN1 afhankelijke populatie. De foutbalken vertegenwoordigen de standaarddeviaties van twee of meer experimenten. Dit cijfer is gewijzigd van eerder gepubliceerde literatuur30. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: stepwise binding van GEN1 aan de HJ.
A) elektroforetisch mobiliteits verschuiving test (EMSA) van GEN1 op 50 pM X0. Bovenste paneel: de Romeinse cijfers geven het aantal GEN1 monomeren in het complex. Onderste deelvenster: binding van GEN1 monomeer aan X0. De schijnbare dissociatieconstanten werden verkregen uit een sigmoïdale pasvorm van de respectieve soorten en vertegenwoordigen het gemiddelde van twee experimenten. (B) EMSA van GEN1 bij 50 pM NK-X0 demonstreert de prominente monomeer binding, zoals aangegeven door het zeer lage Kd-monomeer-app-EMSA. C) fret time-trace van gebonden doch ongespleten aangrenzend label X0 in mg2 +. Donor excitatie voor ~ 1,3 min werd uitgevoerd, gevolgd door directe acceptor excitatie (gearceerde roze regio). D) fret time-trace van gebonden maar niet-cleaved aangrenzende-label NK-X0 in mg2 +. Dit cijfer is gewijzigd van eerder gepubliceerde literatuur30. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 5
Figuur 5: SMFRET resolutie assay van de HJ.
A) Schematische voorstelling van het naastgelegen label X0 ISO (1, 3) na vervorming door GEN1. De ondergrond is bevestigd aan het Gefunctionaliseerde oppervlak via de Biotine/avidin-koppeling. De dissociatie van GEN1 na de twee incisies resulteert in het verlies van zowel donor als acceptor die in de oplossing gaan. B) Schematische voorstelling van de resolutie van de aangrenzende-label NK-X0 door klieft strand 1. (C) time-trace (zwart) bij 2 mm mg2 + van het splijting van ISO (1, 3). Het begin van de GEN1-binding vormt een stabiele lage FRET-toestand totdat het FRET-signaal abrupt verloren is gegaan door decolleté. Dienovereenkomstig wordt de toename van de donor en de afname van de fluorescentie intensiteit van de acceptor bij GEN1 binding gevolgd door het gelijktijdig verdwijnen van de fluorescentie van beide kleurstoffen op decolleté. (D) op dezelfde manier toont de tijd-trace van NK-X0 een stabiele lage fret-status op GEN1-binding, die wordt gesloten door het PLOTSELINGE verlies van het fret-signaal. Dit cijfer is gewijzigd van eerder gepubliceerde literatuur30. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: kinetiek van gen1 door dimerisatie op GEN1 monomeer gebonden HJ.
(A) de kansdichtheidsfunctie (PDF) van de verdeling van de τvóór decolleté van X0 illustreert de afhankelijkheid van de GEN1-concentratie. Dwelltijden van de lage FRET-toestand (τbefore-decolleté) bij de respectieve GEN1-concentratie werden verkregen uit twee of meer experimenten en gebruikt om de gemiddelde tarieven te verkrijgen (k-app). De vermelde k-app -percentages worden bepaald aan de hand van de inverse van de gemiddelde τvóór-DECOLLETÉ bij de respectieve GEN1-concentratie. De vereniging (kon-dimeer) en dissociatie (koff-dimeer) tarieven voor dimeer vorming worden berekend op basis van een bi-exponentieel model38. De fouten vertegenwoordigen SEM van kapp. (B) het PDF-plot van de distributies van de τbefore-decolleté van NK-X0 en de respectieve k-app -tarieven. (C) plot van k-app versus GEN1-concentratie gemonteerd op een hyperbolische functie om het schijnbare katalytische percentage (kMax-app) te bepalen. De plot van k-app voor x0 en NK-x 0 illustreert de snellere initiële k-app van x0 die vervolgens wordt overtroffen door NK-X0 boven [GEN1] ~ 5,6 nm. Dit cijfer is gewijzigd van eerder gepubliceerde literatuur30. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Buffer Compositie
Bindende buffer 40 mM tris-HCl pH 7,5, 40 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mm dtt, 0,1% BSA en 5% (v/v) glycerol
Buffer A 20 mM tris-HCl pH 8,0, 1 mM DTT en 300 mM NaCl
Buffer B 20 mM tris-HCl pH 8,0, 1 mM DTT en 100 mM NaCl
Buffer C 20 mM tris-HCl pH 8,0 en 1 mM DTT
Splijting buffer 40 mM tris-HCl pH 7,5, 40 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mm dtt, 0,1% BSA en 5% (v/v) glycerol
EMSA-bindende buffer 40 mM tris-HCl pH 7,5, 40 mM NaCl, 1 mM DTT, 2 mM CaCl2, 0,1 mg/ml BSA, 5% (v/v) glycerol en 5 ng/μl poly-di-DC
Imaging buffer (binding) 40 μL (±) -6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchromane-2-carboxylzuur (4 μM), 60 μL PCA (6 nM), 60 μL PCD (60 nM) en 840 μL bindings buffer
Imaging buffer (decolleté) 40 μL (±) -6-hydroxy-2, 5, 7, 8-tetramethylchromane-2-carboxylzuur (4 μM), 60 μL PCA (6 nM), 60 μL PCD (60 nM) en 840 μL splijting buffer
Lysisbuffer 20 mM tris-HCl pH 8,0, 10 mM β-mercaptoethanol, 300 mM NaCl en 2 mM PMSF
PCD opslag buffer 100 mM tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 50 mM KCl en 50% glycerol
opslag buffer 20 mM tris-HCl pH 8,0, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 100 mM NaCl en 10% glycerol
TBE-buffer 89 mM tris-HCl, 89 mM boorzuur en 2 mM EDTA
TE100 buffer 10 mM Tris. HCl pH 8,0 en 100 mM NaCl
Tris-EDTA-buffer 50 mM tris-HCl pH 8,0 en 1 mM EDTA pH 8,0

Tabel 1: de lijst van buffers en hun composities die in deze studie worden gebruikt.

Oligo Volgorde
X0-ST1 ACGCTGCCGAATTCTACCAGTGCCTTGCTAGGACATCTTTGCCCACCTGCAGGTTCACCC
X0-ST2 GGGTGAACCTGCAGGTGGG/iCy3/AAAGATGTCCATCTGTTGTAATCGTCAAGCTTTATGCCGT
X0-ST3 ACGGCATAAAGCTTGACGA/iAF647-dT/TACAACAGATCATGGAGCTGTCTAGAGGATCCGACTATCG
X0-ST4 5 "BiotinCGATAGTCGGATCCTCTAGACAGCTCCATGTAGCAAGGCACTGGTAGAATTCGGCAGCGT
X0-ADJ X0-St1, x0-ST2, x0-ST3 & X0-ST4
X0In_st2 GGGTGAACCTGCAGGTGGGCAAAGATGTCCATCTGTTGTAATCGTCAAGCTTTATGCCGT
X0In_st4 5 "BiotinCGATAGTCGGATCCTCTAGACAGCTCCATGTAGCAAGGCA/iCy3/TGGTAGAATTCGGCAGCGT
NK-X0 X0-St1, x0-ST2, x0-nk3a, x0-nk3b & X0-ST4
X0-nk3a ACGGCATAAAGCTTGACGA/iAF647-dT/TACAACAGATC
X0-nk3b Een van de meest gekaarte schoenen.

Tabel 2: SMFRET en EMSA HJ substraten. De lijst van oligonucleotiden gebruikt voor de bereiding van de fluorescently gelabelde HJs voor smFRET en EMSA. De oligos werden commercieel verkregen. De fluorescently gelabelde oligos waren HPLC-gezuiverd en, indien mogelijk, oligos van ≥ 60 BP waren pagina-gezuiverd.

Discussion

In deze studie, verschillende smFRET technieken werden geïmplementeerd om te bepalen van de kinetiek van HJ resolutie door GEN130. Vergelijkbare smfret-benaderingen werden gebruikt om de DNA-conformationale eis en decolleté met dubbele flap te volgen door de DNA-replicatie en reparatie flap endonuclease 142,43,44. Hier worden kritieke stappen in dit protocol besproken. De silanisatie reactie moet vrij zijn van elk spoor van vochtigheid. De pegylation-oplossing moet snel worden toegepast op het gesilaniseerde glas zodra de PEG is opgelost om hydrolyse te voorkomen. In de meerkanaals stroomcel moet elke ingesloten lucht in de lijm plaat worden verwijderd om lekkage tussen naburige kanalen te voorkomen. De PCA-oplossing moet vers worden bereid, omdat het na verloop van tijd oxiderende. De toevoeging van 10 N NaOH moet dropwise zijn, met grondig daartussenin. De fluorescentie achtergrond in de dekslip moet minimaal zijn voordat het fluorescendig gelabelde HJ stroomt. De imaging in de stroomcel moet in één richting worden uitgevoerd om te voorkomen dat er gebleekte gebieden worden geblondeerd. Bij ALEX-experimenten moet de kracht van de rode laser worden verlaagd om snel bleken van de acceptor te voorkomen. In de time-lapse-experimenten moet de cyclustijd korter zijn dan de snelste gebeurtenis.

smFRET is een gevoelige techniek die waardevolle real-time inzichten in biomoleculaire reacties kan bieden. Deze methode heeft echter verschillende technische uitdagingen, waaronder het bereiken van meetbare verandering in FRET tijdens de biochemische reactie. Dit is nodig voor het verkrijgen van goed gescheiden functies in de histogrammen en te onderscheiden toestanden in de tijd-traces. In veel gevallen vereist smfret een zorgvuldig ontwerp van de substraten, de selectie van de de paren en hun posities, en de versterking van de fret veranderingen in het DNA substraat vanwege de kleine structurele veranderingen in het substraat45. Een andere benadering voor het uitvoeren van FRET is het gebruik van gelabelde eiwitten46. Het observatie venster in FRET wordt beperkt door de stabiliteit van de acceptor zoals Cy5 of Alexa Fluor 647 die de neiging heeft om sneller te bleken dan de donor (Cy3 in dit geval). Daarom vereist fret een continue zoektocht naar stabiele fluor Foren om de duur van het experiment te verlengen en de inspanningen om zuurstof opruimings systemen te ontwikkelen om het fluorescentie signaal te verlengen en de signaal-ruis verhouding te maximaliseren47,48 .

Een van de tips voor het oplossen van problemen in smFRET is het balanceren van de verschillende parameters die betrokken zijn bij beeldvorming, zoals het Laser vermogen, de belichtingstijd, de cyclusduur en het aantal cycli om de fluorescentie-emissie te maximaliseren, het experiment te verlengen en passende bemonsterings intervallen voor de enzym dynamiek. Langere observatie tijden en minimale effecten van foto bleken zijn essentieel voor het verkrijgen van hooggetrouwheids dwelltijd verdelingen die de enzym dynamiek vertegenwoordigen. ALEX genereert betere histogrammen, omdat deze methode wordt onderworpen aan lagere bijdragen van fotogebleekte deeltjes in vergelijking met single-Color FRET. De tijdelijke resolutie in ALEX is echter lager dan die in single-Color FRET.

Tot slot, de nadruk die smFRET legt op het opsporen van conformationale/structurele veranderingen in individuele moleculen in real-time overbrugt de kloof tussen hoge resolutie structurele technieken (d.w.z. Röntgen kristallografie, nucleaire magnetische resonantie, elektronenmicroscopie), dat voorziet in atomaire resolutie structurele details onder statische omstandigheden en bulk methoden die het ensemble gemiddelde van een meetbare eigenschap opleveren. In veel opzichten heeft smFRET bewezen een krachtige techniek te zijn om in real-time biologische systemen te bestuderen.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de King Abdullah University of Science and Technology via Core funding en Competitive Research Award (CRG3) aan S. M. H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) Sigma-Aldrich 238813
0.1 M sodium bicarbonate buffer Fisher 144-55-8
10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel Thermo Fisher Scientific EC6275BOX
100 X TIRF objective Olympus NAPO 1.49
3,4-dihroxybenzoic acid (PCA) Sigma-Aldrich P5630
3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich 741442
6% Novex Tris-Borate-EDTA gel Thermo Fisher Scientific EC6265BOX
Adhesive sheet Grace bio-labs SA-S-1L
Benchtop refrigerated centrifuge Eppendorf Z605212
Biotin-PEG Laysan Bio Biotin-PEG-SVA 5000
Bovine Serum Albumin (BSA) New England Biolabs B9001S
Calcium Chloride Dihydrate Sigma-Aldrich 31307
cation exchange column GE healthcare MonoS (4.6/100)
Cell distruptor Constant Cell Disruption System TS5/40/CE/GA
Coomassie Brilliant Blue MP Biomedicals 808274
Cy3 emission filter Chroma HQ600/40M-25
Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter Chroma HQ700/40M-25
Dichroic for DV2 filter cube Photometrics 630dcxr-18x26
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0861
Drill Dremel 200-1/21
Electronic cutter Copam CP-2500
EMCCD camera Hamamatsu C9100-13
Epoxy glue Devcon 14250
FPLC Aktapurifier UPC 10 GE Healthcare 28406268
GelQuant.NET software biochemlabsolutions.com Version 1.8.2
GEN1 entry vector Harvard plasmid repository HSCD00399935
Glycerol Sigma Life Science G5516
green laser (emission 532 nm) Coherent Compass 315M-100
Heparin column GE healthcare HiTrap Heparin column
HEPES BDH BDH4162
Image splitter Photometrics Dualview (DV2)
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Inverted microscope Olympus IX81
Isopropyl-ß-D-thiogalactoside (IPTG) Goldbio. 12481C100
Laser scanner GE healthcare Typhoon Trio
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500
Long pass 532nm filter Semrock LPD02-532RU-25
Magnesium Chloride Sigma Life Science M8266
mPEG Laysan Bio mPEG-SVA 5000
Neutravidin Pierce 31000
Ni-NTA column GE healthcare HisTrap FF
NuPAGE 10% Bis-Tris gels Novex Life technologies NP0301BOX
NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific NP0302PK2
Origin software OriginLab Corporation Version 8.5
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Alexis Biochemicals 270-184-G025
Phosphate-buffered saline GIBCO 14190
Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm) Fisher (Becton Dickinson) 427416
Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD) Sigma-Aldrich P8279-25UN
Quad-band dichroic Chroma Inc Z405/488/532/640rpc
red laser (emission 640 nm) Coherent Cube 640 100C
Sodium Chloride Fisher Chemical S271
Sorvall RC-6 plus centrifuge Thermo Fisher Scientific 46910
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Nanodrop 2000
Syringe pump Harvard Apparatus 70-3007
Teflon tweezers Rubis K35A
Tris Base Promega H5135
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-90K
Ultrafiltration membrane Millipore UFC90300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  2. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  3. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  6. Walter, N. G., Huang, C. Y., Manzo, A. J., Sobhy, M. A. Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit. Nature Methods. 5 (6), 475-489 (2008).
  7. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
  8. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Methods in Enzymology. 361, 1-33 (2003).
  9. Kim, H. D., et al. Mg2+-dependent conformational change of RNA studied by fluorescence correlation and FRET on immobilized single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (7), 4284-4289 (2002).
  10. Lee, T. H., et al. Measuring the folding transition time of single RNA molecules. Biophysical Journal. 92 (9), 3275-3283 (2007).
  11. Holliday, R. Mechanism for Gene Conversion in Fungi. Genetical Research. 5 (2), 282-304 (1964).
  12. West, S. C., et al. The Formation and Resolution of Holliday Junctions during the Recombinational Repair of DNA Damages. Journal of Cellular Biochemistry. , 269-269 (1995).
  13. Cox, M. M., et al. The importance of repairing stalled replication forks. Nature. 404 (6773), 37-41 (2000).
  14. West, S. C. Molecular views of recombination proteins and their control. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (6), 435-445 (2003).
  15. Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction, and its resolution. Cell. 55 (1), 79-89 (1988).
  16. Clegg, R. M., et al. Fluorescence resonance energy transfer analysis of the structure of the four-way DNA junction. Biochemistry. 31 (20), 4846-4856 (1992).
  17. McKinney, S. A., Declais, A. C., Lilley, D. M., Ha, T. Structural dynamics of individual Holliday junctions. Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2003).
  18. Joo, C., McKinney, S. A., Lilley, D. M., Ha, T. Exploring rare conformational species and ionic effects in DNA Holliday junctions using single-molecule spectroscopy. Journal of Molecular Biology. 341 (3), 739-751 (2004).
  19. Hyeon, C., Lee, J., Yoon, J., Hohng, S., Thirumalai, D. Hidden complexity in the isomerization dynamics of Holliday junctions. Nature Chemistry. 4 (11), 907-914 (2012).
  20. Ip, S. C., et al. Identification of Holliday junction resolvases from humans and yeast. Nature. 456 (7220), 357-361 (2008).
  21. Rass, U., et al. Mechanism of Holliday junction resolution by the human GEN1 protein. Genes & Development. 24 (14), 1559-1569 (2010).
  22. Liu, Y., et al. Crystal Structure of a Eukaryotic GEN1 Resolving Enzyme Bound to DNA. Cell Reports. 13 (11), 2565-2575 (2015).
  23. Chan, Y. W., West, S. GEN1 promotes Holliday junction resolution by a coordinated nick and counter-nick mechanism. Nucleic Acids Research. 43 (22), 10882-10892 (2015).
  24. van Gool, A. J., Hajibagheri, N. M., Stasiak, A., West, S. C. Assembly of the Escherichia coli RuvABC resolvasome directs the orientation of holliday junction resolution. Genes & Development. 13 (14), 1861-1870 (1999).
  25. Lee, S. H., et al. Human Holliday junction resolvase GEN1 uses a chromodomain for efficient DNA recognition and cleavage. eLife. 4, (2015).
  26. Chan, Y. W., West, S. C. Spatial control of the GEN1 Holliday junction resolvase ensures genome stability. Nature Communications. 5, 4844 (2014).
  27. Liu, Y., Freeman, A. D., Declais, A. C., Lilley, D. M. J. A monovalent ion in the DNA binding interface of the eukaryotic junction-resolving enzyme GEN1. Nucleic Acids Research. 46 (20), 11089-11098 (2018).
  28. Zhou, R., et al. Junction resolving enzymes use multivalency to keep the Holliday junction dynamic. Nature Chemical Biology. 15 (3), 269-275 (2019).
  29. Bellendir, S. P., et al. Substrate preference of Gen endonucleases highlights the importance of branched structures as DNA damage repair intermediates. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5333-5348 (2017).
  30. Sobhy, M. A., et al. Resolution of the Holliday junction recombination intermediate by human GEN1 at the single-molecule level. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1935-1949 (2019).
  31. Sobhy, M. A., et al. Versatile single-molecule multi-color excitation and detection fluorescence set-up for studying biomolecular dynamics. Review of Scientific Instruments. 82 (11), 113702 (2011).
  32. Kapanidis, A. N., et al. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).
  33. Lee, N. K., et al. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).
  34. Rashid, F., et al. Initial state of DNA-Dye complex sets the stage for protein induced fluorescence modulation. Nature Communications. 10 (1), 2104 (2019).
  35. Sambrook, J., Russell, D. W. Standard ethanol precipitation of DNA in microcentrifuge tubes. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  36. Holden, S. J., et al. Defining the limits of single-molecule FRET resolution in TIRF microscopy. Biophysical Journal. 99 (9), 3102-3111 (2010).
  37. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L. Jr, Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: a Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  38. Kou, S. C., Cherayil, B. J., Min, W., English, B. P., Xie, X. S. Single-molecule Michaelis-Menten equations. Journal of Physical Chemistry B. 109 (41), 19068-19081 (2005).
  39. Clegg, R. M., Murchie, A. I., Lilley, D. M. The solution structure of the four-way DNA junction at low-salt conditions: a fluorescence resonance energy transfer analysis. Biophysical Journal. 66 (1), 99-109 (1994).
  40. Pohler, J. R., Duckett, D. R., Lilley, D. M. Structure of four-way DNA junctions containing a nick in one strand. Journal of Molecular Biology. 238 (1), 62-74 (1994).
  41. Fogg, J. M., Lilley, D. M. Ensuring productive resolution by the junction-resolving enzyme RuvC: large enhancement of the second-strand cleavage rate. Biochemistry. 39 (51), 16125-16134 (2000).
  42. Sobhy, M. A., Joudeh, L. I., Huang, X., Takahashi, M., Hamdan, S. M. Sequential and multistep substrate interrogation provides the scaffold for specificity in human flap endonuclease 1. Cell Reports. 3 (6), 1785-1794 (2013).
  43. Rashid, F., et al. Single-molecule FRET unveils induced-fit mechanism for substrate selectivity in flap endonuclease 1. eLife. 6, e21884 (2017).
  44. Zaher, M. S., et al. Missed cleavage opportunities by FEN1 lead to Okazaki fragment maturation via the long-flap pathway. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2956-2974 (2018).
  45. Didenko, V. V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. BioTechniques. 31 (5), 1106-1116 (2001).
  46. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
  47. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  48. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).

Tags

Genetica uitgave 151 Holliday Junction single-molecuul FRET homologe recombinatie 5 ' nucleasen Gap endonuclease I GEN1 Holliday Junction resolvazen
Single-molecuul Förster Resonance Energy Transfer methoden voor real-time onderzoek van de Holliday Junction-resolutie door GEN1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sobhy, M. A., Bralić, A.,… More

Sobhy, M. A., Bralić, A., Raducanu, V. S., Tehseen, M., Ouyang, Y., Takahashi, M., Rashid, F., Zaher, M. S., Hamdan, S. M. Single-Molecule Förster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1. J. Vis. Exp. (151), e60045, doi:10.3791/60045 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter