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Genetics

GEN1 द्वारा Holliday जंक्शन संकल्प की वास्तविक समय जांच के लिए एकल अणु F$rster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण तरीके

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60045
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of DNA Replication and Recombination, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)
* These authors contributed equally

Summary

यहाँ प्रस्तुत HJ संकल्प का अध्ययन करने के लिए एकल अणु एफrster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण प्रदर्शन के लिए एक प्रोटोकॉल है. दो रंग बारी उत्तेजना वियोजन स्थिरांकों का निर्धारण करने के लिए प्रयोग किया जाता है। एकल रंग समय चूक smFRET तो वास्तविक समय दरार assays में लागू किया जाता है रहने के समय वितरण HJ संकल्प से पहले प्राप्त करने के लिए.

Abstract

थोक तरीके अणुओं की टुकड़ी व्यवहार को मापने, जिसमें अंतर्निहित चरणों के व्यक्तिगत प्रतिक्रिया दरों जनसंख्या भर में औसत रहे हैं. एकल अणु एफजेडर्स्टर अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण (smFRET) वास्तविक समय में अलग-अलग अणुओं द्वारा होने वाले संरचना परिवर्तनों की एक रिकॉर्डिंग प्रदान करता है। इसलिए, बंधन और उत्प्रेरक के दौरान एंजाइम या सब्सट्रेट में संरचनात्मक परिवर्तन को मापने में smFRET शक्तिशाली है। यह काम एक चार तरह Holliday जंक्शन (HJ) और अंतर endonuclease I (GEN1), एक साइटोसोलिक समजात पुनर्संयोजन एंजाइम की बातचीत के एकल अणु इमेजिंग के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है. इसके अलावा प्रस्तुत कर रहे हैं एकल रंग और दो रंग बारी उत्तेजना (ALEX) smFRET प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल वास्तविक समय में GEN1 द्वारा HJ के संकल्प का पालन करने के लिए. GEN1 dimerization की गतिज HJ, जो एचजे के संकल्प में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए सुझाव दिया गया है और अब तक मायावी बनी हुई है पर निर्धारित कर रहे हैं. यहाँ वर्णित तकनीक व्यापक रूप से कई एंजाइम-डीएनए प्रणालियों के मूल्यवान मशीनी अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है.

Introduction

फ्लोरोसेंट का पता लगाने पर आधारित एकल अणु विधियों उच्च संकेत करने वाली शोर अनुपात1प्रदान करते हैं। FRET एक स्पेक्ट्रोस्कोपिक तकनीक है कि 1-10 एनएम की सीमा में दूरी को मापने कर सकते हैं, नैनोमीटर रेंज2में दूरी को मापने के लिए एक आणविक शासक के रूप में इस तकनीक प्रतिपादन2 ,3. स्वीकारकर्ता के अवशोषण स्पेक्ट्रम कम तरंगदैर्ध्य अंत में दाता के उत्सर्जन स्पेक्ट्रम के साथ एक आंशिक वर्णक्रमीय ओवरलैप है. FRET एक दाता और स्वीकारकर्ता जोड़ी के बीच विकिरण-कम ऊर्जा हस्तांतरण द्वारा मध्यस्थता की है, जबकि ऊर्जा हस्तांतरण की दक्षता की दूरी और स्वीकारकर्ता4के अभिविन्यास पर निर्भर है.

पृष्ठभूमि को कम करने और फ्लोरोसेंस सिग्नल5,6 की पता लगाने की दक्षता में सुधार करने के लिए अनेक दृष्टिकोण लागू किए गएहैं. एक दृष्टिकोण confocal माइक्रोस्कोपी है, जिसमें एक pinhole विवर्तन सीमा7से नीचे एक आकार के लिए उत्तेजना स्थान को प्रतिबंधित करता है. एक अन्य दृष्टिकोण कुल आंतरिक प्रतिबिंब फ्लोरोसेंट (TIRF) है, जो एक विस्तृत क्षेत्र रोशनी तकनीक है जिसमें प्रकाश एक महत्वपूर्ण कोण8के ऊपर बंद अक्ष निर्देशित है. प्रकाश तो पूरी तरह से आंतरिक कांच और जलीय समाधान के बीच इंटरफेस पर परिलक्षित होता है, एक evancent लहर है कि केवल कांच की सतह से जुड़ी फ्लोरोफोर्स illuminates और बाकी के आराम में फ्लोरोफोर से पृष्ठभूमि से बचाता पैदा समाधान.

confocal माइक्रोस्कोपी में, अणुओं या तो स्वतंत्र रूप से diffusing या सतह स्थिर हो सकता है. प्राप् त लौकिक संकल्प माइक्रोसेंड से कई मिसे9तक हो सकता है . एक एकल अणु के लिए confocal पता लगाने एकल-फोटोन हिमस्खलन डायोड (SPAD) और ब्याज10के क्षेत्र के बिंदु द्वारा बिंदु द्वारा बिंदु स्कैनिंग द्वारा किया जाता है। TIRF में, सतह पर स्थिर अणुओं के कुछ सैकड़ों की एक समय श्रृंखला एक स्थिति के प्रति संवेदनशील दो आयामी प्रभारी युग्मित डिटेक्टर (सीसीडी) द्वारा दर्ज की गई है. सीसीडी तेज फॉस्फोर स्क्रीन और माइक्रोचैनल प्लेट या ऑन-चिप गुणन के फोटोइलेक्ट्रोन (ईएमसीसीडी) द्वारा फ्लोरोसेंट सिग्नल को बढ़ा देता है। लौकिक संकल्प सीसीडी की पठन गति और क्वांटम दक्षता पर निर्भर करता है और आमतौर पर कुछ दसियों मिलीसेकेंड6के क्रम पर होता है ।

एचजे डी एन ए मरम्मत और पुनर्संयोजन11,12,13,14में एक केंद्रीय मध्यवर्ती है . HJ दो सतत और दो पार किस्में है कि एक दूसरे को एक दूसरे को काटना बिना निरंतर किस्में के बीच कनेक्ट है. एचजे समाधान में एक्स-स्टैक्ड अनुरूपक के रूप में मौजूद है, जो लगातार किस्में पार करते हुए और क्रॉसिंग किस्में अन्य कंटेस्टेंटर15में निरंतर होते जा रहे हैं। एचजे की समीपार्थ वरीयता मुख्य अनुक्रम और आयनी पर्यावरण पर निर्भर है और इसका अध्ययन फ्रेट16, 17,18,19द्वारा किया गया है .

GEN120 समाधान21 में एक एकमेव प्रोटीन है और इसके लिए डिमराइजेशन की आवश्यकता होती है ताकि एचजे को छोड़ दिया जा सके, जिससे पुनः संयुक्त किस्में22,23को उचित रूप से अलग कर दी जा सकीं . एचजे की स्टैकिंग कंपोजर वरीयता एचजे रिसोल्स24द्वारा संकल्प के अभिविन्यास की स्थापना करके आनुवंशिक पुनर्संयोजन के परिणाम को प्रभावित करती है . समझ कैसे GEN1 HJ बांधता है, दो चीरों निर्देशांक , और यह सुनिश्चित करता है कि अपने पूर्ण संकल्प सभी गहन अध्ययन के तहत किया गया है21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.

इस अध्ययन में, एक उद्देश्य आधारित TIRF सेट अप के रूप में पहले31वर्णित प्रयोग किया जाता है. दो रंग बारी उत्तेजना (ALEX) fluorophor लेबल HJ के साथ GEN1 की बातचीत पर अनुरूप परिवर्तन निर्धारित करने के लिए लागू किया जाता है. ALEX दो अनुपातमितीय पैरामीटर FRET दक्षता ई के आधार पर 2D हिस्टोग्राम का उत्पादन करता है, जो दाता-ग्राही दूरी-निर्भर है, और स्टोइचीमिट्री पैरामीटर एस, जो दाता-ग्राही मिति32को मापता है। ALEX केवल दाता, स्वीकारकर्ता, और मिश्रित subpopulations सहित फ्लोरोफोरी की स्टोइचिओमेटरी के आधार पर फ्लोरोसेंट प्रजातियों की छँटाई सक्षम बनाता है। ALEX पूरी रेंज के लिए FRET के उपयोग का विस्तार कर सकते हैं और फ्लोरोफोर चमक और ओलिगोमराइजेशन के साथ ही मॉनिटर मैक्रो अणु-लिगन्ड बातचीत33में मतभेद का पता लगा सकते हैं।

यह पाया गया है कि GEN1 लगातार GEN1-HJ परिसर के जीवनकाल के भीतर HJ को हल करने में सफल होता है. समय पर निर्भर अनुरूपता परिवर्तन अलग-अलग अणुओं के समय-अंशों से प्राप्त होते हैं, जबकि हिस्टोग्राम अंतर्निहित आबादी के वितरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। समय चूक एकल रंग FRET का उपयोग करना, तेजी से दर पर और GEN1 dimer के लिए धीमी गति से बंद दर का प्रदर्शन कर रहे हैं, जो पहले चीरा उत्पाद में इकट्ठे GEN1 dimer की समानता में वृद्धि.

Protocol

1. सतह-कार्यात्मक कवरलिप्स की तैयारी

  1. सफाई
    1. एक Coplin जार के अंदर इथेनॉल में पांच coverslips (24 मिमी x 60 मिमी) रखें. इथेनॉल में Sonicate तो 3x के लिए 30 मिनट के लिए 1 एम पोटेशियम हाइड्रॉक्साइड में। एसीटोन 3x में धो तो decant.
  2. सिलानीकरण
    1. एसीटोन में 2.8% 3-एमिनोप्रोपिलट्राइथॉक्सीलेन (एपीटीईएस) का समाधान तैयार करें। एक पैराफिन फिल्म के साथ APTES बोतल सील और 4 डिग्री सेल्सियस पर दुकान।
      नोट: सुरक्षा काले चश्मे का प्रयोग करें और एक धूआं हुड के तहत काम करते हैं। silane समाधान के कंटेनर पूरी तरह से सूखा होना चाहिए और एसीटोन द्वारा तुरंत पहले और जार में silane समाधान डालने के बाद कुल्ला.
    2. कोपलिन जार में 2.8% APTES समाधान के 70 एमएल डालो coverss युक्त. एक कक्षीय शेकर में 4 मिनट के लिए जार हिलाओ.
    3. जार 5 मिनट के लिए बेंच पर खड़े हो जाओ, 1 मिनट के लिए sonicate, और अंत में silane के लिए एक और 10 मिनट के लिए बेंच पर जार रखने के लिए कांच की सतह पर hydroxyl समूहों के साथ प्रतिक्रिया.
    4. तेजी से विलायक विनिमय के लिए जार में सीधे पानी डालने से deionized पानी के 1 एल के अलावा द्वारा प्रतिक्रिया को निचोड़. एक फ्लैट सतह पर जार के बग़ल में मिलाते हुए पानी में 3x स्लाइड कुल्ला.
    5. जार से बाहर coverss ले लो और उन्हें एक एल्यूमीनियम पन्नी ट्रे पर जगह है. कवरलिप्स को सुखाने और सिलेन का इलाज करने के लिए 30 मिनट के लिए 110 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में कवरलिप्स को बेक करें। कमरे के तापमान को ठंडा करने के लिए कवरलिप्स के लिए ट्रे को बेंच पर छोड़ दें।
  3. PEGylation
    1. कंटेनर खोलने पर नमी के संघनन को रोकने के लिए -20 डिग्री सेल्सियस से कमरे के तापमान (आरटी) में संग्रहीत बायोटिनीलेट्स ्ड खूंटी और खूंटी को गर्म करें।
    2. एक बॉक्स पर सामना करना पड़ silanized सतह के साथ पांच coversps रखें. silanized coversकेस के किनारों के साथ स्पेसर्स के रूप में दो कवर ग्लास पर्चियां (22 मिमी x 22 मिमी) रखें।
    3. एक बार गर्म हो जाने पर, 1 एमएल ताजा, 0.1 एम सोडियम बाइकार्बोनेट समाधान में $1:100 के अनुपात में बायोटिनिनलेटिड पीईजी और खूंटी के 1.5 मिलीग्राम और 150 मिलीग्राम पेग को 1.5 एमएल ट्यूब में मिलाकर बना लें।
    4. नल को खूंटी भंग करने और हवा के बुलबुले को दूर करने के लिए नीचे स्पिन करने के लिए भंवर।
      नोट: इस कदम से आगे जा रहे हैं, जल्दी हो, क्योंकि खूंटी मिनट के एक timescale के भीतर समाधान में hydrolyzes.
    5. प्रत्येक कवरस्लिप के लिए खूंटी समाधान के 100 $L को तुरंत लागू करें। एक और बेक्ड कवरस्लिप लें और अपने ऊपरी silanized सतह चेहरा नीचे खूंटी समाधान के साथ कवरस्लिप के शीर्ष पर जगह है, इसलिए एक गिलास समाधान ग्लास सैंडविच जिसमें 22 मिमी x 22 मिमी गैर silanized coverslips दो functionalized coverslips के लिए अनुमति बनाने आसानी से अलग किया जा सकता है.
    6. अंधेरे में और आरटी में रात भर (16 ज) कवरलिप्स को इनक्यूबेट करें। एक बार ऊष्मायन पूरा हो गया है, कवरलिप्स अलग ले, तो एक धार की बोतल के साथ पक्ष से धोने से deionized पानी का उपयोग कर 10x कुल्ला.
    7. सूखे नाइट्रोजन के प्रवाह के नीचे आवरणों को सुखा लें। शुष्क कवरलिप्स को निर्वात के अंतर्गत संग्रहीत करें।
      नोट: स्लाइड गुणवत्ता की गिरावट के बिना 1 महीने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

2. प्रवाह सेल की तैयारी

  1. एकल चैनल प्रवाह कक्ष
    1. एक क्वार्ट्ज स्लाइड के मध्य भाग में 1.22 मिमी व्यास के साथ दो छेद ड्रिल (50 मिमी x 20 मिमी) केन्द्रों के साथ स्थित 37 मिमी के अलावा और स्लाइड के किनारे से 6.5 मिमी (चित्र 1A)।
    2. एक 41 मिमी x 2.25 मिमी चैनल में एक 50 मिमी x 20 मिमी टुकड़ा एक डबल चिपकने वाला शीट का उपयोग कर एक इलेक्ट्रॉनिक कटर का उपयोग कर कट.
    3. सुरक्षात्मक कवर के प्लास्टिक पक्ष को छीलें और क्वार्ट्ज स्लाइड के किनारों के साथ टुकड़े के किनारों को संरेखित करें। पॉलीटेट्राफ्लोरोएथिलीन चिमटी की एक जोड़ी के साथ धीरे से दबाकर फंस हवा के बुलबुले निकालें।
    4. चिपकने वाला टुकड़ा के कागज की ओर छील. कवरस्लिप के कार्यात्मक सतह पर टुकड़ा माउंट करें।
    5. प्रवेश के लिए 11 सेमी और आउटलेट के लिए 25 सेमी की लंबाई में पॉलीथीन ट्यूबिंग (आई.डी. 1.22 मिमी) काटें। प्रवाह सेल के लिए इनलेट और आउटलेट के रूप में पहले से drilled छेद में ट्यूब डालें.
    6. क्वार्ट्ज-कवरस्लिप इंटरफ़ेस के किनारों के आसपास और इनलेट और आउटलेट के लिए ट्यूबों के आसपास सील करने के लिए 5 मिनट epoxy गोंद का उपयोग करें।
    7. प्रवाह सेल का उपयोग तुरंत एक बार यह सूख जाता है या बाद में उपयोग के लिए सूखी वैक्यूम के तहत की दुकान.
    8. पीबीएस में avidin को 0.03 मिलीग्राम/एमएल की सांद्रता में भंग करें। 0.2 m सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें।
    9. एक 1 एमएल सिरिंज का उपयोग कर प्रवाह सेल में avidin प्रवाह. अतिरिक्त avidin बाहर धोने के लिए बफर से भरा एक और सिरिंज का प्रयोग करें. सीरिंज का आदान-प्रदान करते समय हवा के बुलबुले पेश न करने के लिए सावधान रहें।
  2. एकाधिक चैनल प्रवाह सेल
    1. एक क्वार्ट्ज स्लाइड के लंबे पक्षों में से प्रत्येक पर 1.22 मिमी के व्यास के साथ छह छेद ड्रिल (76 मिमी x 25 मिमी) (चित्र 1B)। स्लाइड के किनारे से छेद 4.5 मिमी और 9.3 मिमी अलग करें। प्रत्येक छेद जोड़ी के केन्द्रों के बीच की दूरी सुनिश्चित करें 15 मिमी है.
    2. इलेक्ट्रॉनिक कटर का उपयोग कर डबल चिपकने वाला टेप के एक 76 मिमी x 25 मिमी टुकड़ा में छह चैनलों (20 मिमी एक्स 2.25 मिमी) कट.
    3. सुरक्षात्मक कवर के प्लास्टिक पक्ष को छीलें और क्वार्ट्ज स्लाइड के किनारों के साथ चिपकने वाला टुकड़ा के किनारों को संरेखित करें। polytetrafluoroethylene चिमटी की एक जोड़ी का उपयोग कर कोमल दबाने से किसी भी फंस हवा बुलबुले निकालें।
    4. चिपकने वाला टुकड़ा के कागज की ओर छील और coverslip के functionalized सतह पर माउंट.
      नोट: कभी कभी बंद कागज की ओर छीलने और क्वार्ट्ज स्लाइड करने के लिए संलग्न multichannel प्रवाह सेल में अच्छी तरह से काम करता है.
    5. छह चैनलों के लिए इनलेट ट्यूब (11 सेमी) और आउटलेट ट्यूब (25 सेमी) काटें। 2.1.6-2.1.9 चरणों में वर्णित प्रवाह कक्ष को तैयार की है।
    6. पहले चैनल के आउटलेट को पंप से कनेक्ट करें. ओएसएस के साथ 0.5 एमएल ट्यूब में इनलेट रखें।
      नोट: इनलेट ट्यूब की लंबाई प्रवाह सेल में एंजाइम प्रवेश के समय सिंक्रनाइज़ और इमेजिंग के शुरू इस प्रकार समय से पहले photobleaching कम द्वारा निरंतर प्रवाह के तहत प्रदर्शन दरार प्रयोगों में घटनाओं की संख्या को अधिकतम करने के लिए चुना जाता है फ्लोरोफोर्स।
    7. उपयोग किए गए चैनल के आउटलेट को डिस्कनेक्ट करके किसी नए चैनल पर जाएँ. प्लास्टिक भाग में गोंद के साथ सील एक सिरिंज सुई से बने प्लग के साथ आउटलेट बंद करें। उपयोग किए गए चैनल का इनलेट बंद करें.

3. ऑक्सीजन अपमार्जन प्रणाली की तैयारी (ओएसएस)

  1. 0.2 ग्राम ($)-6-हाइड्रॉक्सी-2,5,7,8-टेट्रामेथिलक्रोमेन-2-कार्बोक्सिलिक एसिड (ट्रिपल स्टेट क्वेश्चर जो मिथेनॉल के 800L में फ्लोरोफोर्स की झपकी को कम करता है) को भंग करता है।
  2. 6 एमएल डिओनिएट्स एच2हे जोड़ें और 1 छ नाह ड्रॉपवार जोड़ें जब तक कि यह घुल न जाय। एक सिरिंज फिल्टर के माध्यम से फ़िल्टर करें, 1 एमएल एलिकोट्स में बनाएं, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। स्टॉक सांद्रता 100 डिग्री सेल्सियस है।
  3. 4 एमएल डीडीएच2हे में पीसीए पाउडर की 61 मिलीग्राम को भंग करके 3,4-डिहोक्सीबेन्जोइक एसिड (पीसीए) का एक ताजा समाधान तैयार करें। स्टॉक सांद्रता $100 एनएम है।
  4. 10 N NaOH dropwise के 58 डिग्री सेल्सियस जोड़ें, प्रत्येक बूंद के बाद भंवर के लिए सुनिश्चित कर रही है जब तक पीसीए पूरी तरह से भंग कर दिया है (पीएच $ 9).
  5. पीसीडी भंडारण बफर (तालिका 1) के 7 एमएल में प्रोटोकैटुएट 3,4-डिऑक्सीजने (3,4-पीसीडी) की 5.3 मिलीग्राम भंग करें। 3,4-पीसीडी प्रोटोकेचुइक एसिड34के ऑक्सीकरण को उत्प्रेरित करके बाइंडिंग/फ्लेवेज बफर्स से ऑक्सीजन को हटा देता है।
  6. PCD समाधान को 1 एमएल एलिकोट्स में विभाजित करें. स्टॉक सांद्रता तरल नाइट्रोजन में एलिकोट्स को स्नैप-फ्रीज कर देती है और दीर्घकालिक भंडारण के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर या अल्पकालिक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करती है।
  7. एक नया बंधन बफर तैयार करें (तालिका 1)। स्मगल्ट क्लीवेज प्रयोगों के लिए 2 एमएम एमजीसीएल2 केसाथ 2 एमएम सीसीएल 2 विकल्प।
  8. इमेजिंग बफर के 1 एमएल तैयार करें (सारणी 1)। बर्फ पर इमेजिंग बफर रखें जब तक यह प्रवाह सेल में पेश किया है ऑक्सीजन अपमार्जन प्रणाली की गतिविधि को बनाए रखने के लिए.

4. फ्लोरोसेंट लेबल HJs की तैयारी

  1. ट्रास-एड्टा बफर (तालिका 1) में 100 डिग्री सेल्सियस की सांद्रता के लिए लाइओफिलीकृत ओलिगोस (सारणी 2) का पुनर्गठन करना।
  2. सारणी 1में सूचीबद्ध ग्0 ओलिगो में से प्रत्येक के समअणुक भागों को मिलाकर संश्लेषित संधि तैयार की जा रही है।
  3. 5 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करके, इसके बाद 1 डिग्री सेल्सियस/मिनट की दर से आरटी को धीमी गति से ठंडा किया जाता है। वांछित शीतलन दर प्राप्त करने के लिए हीट ब्लॉक या पीसीआर थर्मोसाइकिलर का उपयोग करें।
  4. मिश्रण को 8 सेमी x 8 सेमी 10% ट्रिस-बोरेट-एड्टा पॉलीऐक्रिलमाइड जेल पर लोड करें। 100 वी लागू करें और $ 2 एच के लिए जेल चलाते हैं। बैंड स्पष्ट रूप से आंख से देखा जाता है, और उनके रंग बैंगनी है.
  5. एक साफ ब्लेड के साथ annealed सब्सट्रेट के बैंड Excise. जेल टुकड़ा एक ऑटोक्लेव्ड 1.5 एमएल ट्यूब में स्थानांतरण।
  6. एक साफ प्लंजर के साथ ट्यूब के अंदर जेल टुकड़ा क्रश तो TE100 बफर के 100 $L जोड़ें (तालिका 1) .
  7. 2 डिग्री सेल्सियस के लिए एक थर्मोमिक्सर में 1,500 आरपीएम पर 20 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब मिलाते हुए या 4 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट द्वारा HJ निकालें।
  8. सब्सट्रेट35युक्त समाधान पर इथेनॉल वर्षण प्रदर्शन करते हैं।
  9. त100 बफर (सारणी 1) के 20 डिग्री एल में सब्सट्रेट को पुन: स्फूर्ति देता है। अंतिम सांद्रता 1-3 र्. अलीकोट 2 प्रत्येक ट्यूब में ख्0क्ब् है तथा -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर किया जाता है।

5. प्रोटीन अभिव्यक्ति और GEN1 की शुद्धि

  1. प्रवेश वेक्टर के पीसीआर द्वारा सी-टर्मिनस20 पर हेक्सा हिस्टेडिन-टैग के साथ छोटा मानव GEN11,2,3,4,5 की अभिव्यक्ति के लिए प्लाज़्मिड का निर्माण करें।
    नोट: एन-टर्मिनल टैगिंग GEN1 की निष्क्रियता में परिणाम होगा। असंरचित सी पूंछ पूरी लंबाई GEN1 की शुद्धि काफी कठिन renders. इसके अलावा, पूरी लंबाई GEN1 छोटा संस्करण23की तुलना में कम गतिविधि प्रदर्शित करने के लिए सूचित किया गया था।
  2. ई. कोलाई BL21-CodonPlus(DE3)-RIPL तनाव में अभिव्यक्ति वेक्टर रूपांतरण।
  3. तब्दील कोशिकाओं को दो 6 एल फ्लास्क में टीका करें जिनमें से प्रत्येक 37 डिग्री सेल्सियस पर लुरिया शोरबा मीडिया का 2 L था, जब तक 0.8 के ओडी600 तक 180 आरपीएम पर मिलाते हुए।
  4. संस्कृति को 16 डिग्री सेल्सियस तक शांत करें और GEN1 व्यंजक को 0ण्1 m समियोप्रोपिल-जेड-डी-थियोगालाक्टोपाइरानोसाइड (IPTG) के साथ 48 ज के लिए प्रेरित करें।
  5. कोशिकाओं को अपकेंद्रण में 1000 x ग्राम पर 4 डिग्री सेल्सियस पर घुमाकर फसलें। संस्कृति के प्रत्येक लीटर गोली के 5-6 ग्राम पैदावार.
  6. अधिनात को त्यागें तथा 4 एमएल/ह कोशिकाओं का उपयोग करते हुए लिसिस बफर (सारणी 1) में गोलीमार कोशिकाओं को पुन: स्फूर्ति दें।
  7. 30 केपीएसआई पर एक सेल disruptor का उपयोग कर सेल lysis प्रदर्शन तो 4 डिग्री सेल्सियस पर 1 एच के लिए 10,000 x ग्राम पर नीचे स्पिन। supernatant लीजिए और 0.45 डिग्री मीटर फिल्टर का उपयोग कर बर्फ पर यह फिल्टर।
  8. एफपीएलसी का उपयोग करते हुए प्रोटीन शुद्धिकरण करते हुए बफर ए (तालिका 1) का उपयोग करके 2.5 मिलीलीटर/न्यूनतम प्रवाह दर पर 5 एमएल नी-एनटीए कॉलम के माध्यम से निस्यंदक पारित करके प्रोटीन शुद्धिकरण करें।
  9. 15 कॉलम वॉल्यूम (सीवी) से धोलें। 5 एमएल अंशों में 20 सीवी पर बफर ए और 500 एम एम इमिडाज़ोल की रैखिक प्रवणता के साथ एल्यूट। GEN1 लगभग 100 एमएम इमिडाज़ोल पर कॉलम से elutes.
  10. एकत्र भिन्नों से Pipette 10 $L alicots, प्रत्येक alicot करने के लिए 2x एसडीएस लोडिंग डाई के बराबर मात्रा जोड़ें। 5 मिनट के लिए 90 डिग्री सेल्सियस पर हीटिंग द्वारा नमूनों को विकृत, शांत, और नीचे नमूने स्पिन.
  11. 10% बिस्-ट्रिस जेल पर नमूने लोड करें। के लिए जेल चलाने के लिए 30-45 मिनट पर 200 V. दाग Coomasie शानदार ब्लू का उपयोग कर, तो destain. उन भिन्नों को एकत्रित करें जिनमें शुद्ध GEN1 है.
  12. बफर ब् (सारणी 1) का उपयोग करके कमजोर पड़ने से संयुक्त भिन्नों की नमक सांद्रता को 100 उउ तक कम करें।
  13. बफर बी (सारणी 1)का उपयोग करते हुए 3 एमएल/मिनट की प्रवाह दर पर 5 एमएल हेपरिन कॉलम के माध्यम से कम नमक प्रोटीन पास करें।
  14. बफर बी और 1 एम NaCl के साथ 20 CV की एक ढाल का उपयोग कर 10 CV. Elute के साथ धो लें। 5 एमएल अंश ों लीजिए जिसमें GEN1 360 m M NaCl के आसपास elutes.
  15. चरण 5.8 में वर्णित के रूप में शुद्ध GEN1 अंशों के लिए eluted भिन्नों की जाँच करें। उन अंशों को मिलाकर बफर सी का उपयोग करके 100 एमएम NaCl को पतला कर दिया।
  16. बफर बी का उपयोग करके 1 एमएल/न्यूनतम प्रवाह दर पर कम नमक प्रोटीन को एक धन विनिमय कॉलम पर लोड करें।
  17. बफर बी और 1 एम NaCl का उपयोग कर 40 सीवी की एक ढाल द्वारा Elute. 1.7 एमएल अंश लीजिए जिसमें GEN1 लगभग 300 m M NaCl को एल्यूट करता है।
  18. चरण 5.8 में वर्णित के रूप में eluted भिन्नों में GEN1 की शुद्धता के लिए जाँच करें.
  19. शुद्ध भागों का मिश्रण और 4 डिग्री सेल्सियस पर डायलीज भंडारण बफर के खिलाफ (तालिका 1)। डायलिसिस के दौरान बफर के कम से कम एक विनिमय प्रदर्शन.
  20. प्रोटीन एकाग्रता को मापने $0.5-1 मिलीग्राम / अलीकोट 10-15 डिग्री सेल्सियस मात्रा में छोटे ट्यूबों में डायलीज़प्रोटीन, तरल नाइट्रोजन में फ्लैश-फ्रीज, और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।

6. एकल अणु FRET प्रयोगों

नोट: smFRET प्रयोगों एक कस्टम निर्मित उद्देश्य आधारित TIRF सेट-अप (चित्र 1C) पहले31वर्णित पर प्रदर्शन कर रहे हैं.

  1. एकल-रंग FRET प्रयोग
    1. 100x TIRF उद्देश्य पर विसर्जन तेल की एक बूंद लागू करें. पृष्ठभूमि के लिए संकेत का अनुकूलन और संतृप्ति को रोकने के लिए उपयुक्त लाभ के लिए ईएमसीडी सेट करें।
      नोट: लेजर बीम में सीधे देखो और जब लेजर aligning सुरक्षात्मक काले चश्मे पहनते हैं मत करो।
    2. नमूना धारक पर प्रवाह सेल को ध्यान से रखें। धीरे धीरे मोटे समायोजन का उपयोग कर उद्देश्य बढ़ा जब तक तेल कवरपर्ची छू लेती है.
    3. हरे रंग की लेजर (532 एनएम) चालू करें। उद्देश्य के ठीक समायोजन मोड पर स्विच करें. मॉनिटर पर छवि का निरीक्षण करने के लिए कैमरा पोर्ट के लिए उत्सर्जन को निर्देशित करें।
    4. उद्देश्य की ऊंचाई को समायोजित करें जब तक कवरस्लिप की कार्यात्मक सतह ध्यान में लाया जाता है और मॉनिटर पर देखा जा सकता है।
      नोट: EMCCD द्वारा छवि अधिग्रहण acousto-ऑप्टिकल टूनाबल फिल्टर (AOTF) के माध्यम से लेजर उत्तेजना चलाता है नमूना photobleaching को रोकने के लिए जब छवियों को प्राप्त नहीं किया जा रहा है.
    5. जाँच करें कि covers lips के functionalized सतह से पृष्ठभूमि fluorcently लेबल HJ में बहने से पहले कुछ स्थानों से अधिक नहीं है.
    6. स्टॉक को लगभग 1000 बार TE100 बफर (सारणी 1) में 1-5 दउ म की अंतिम सांद्रता में कम कर दिया गया है। पिपेट 0ण्2ण्5ण्5 ल् की पतला सब्सट्रेट का 120 उदृल् का ओएसएस के साथ 0ण्5 एमएल ट्यूब में oss के साथ 120 डल्।
    7. सिरिंज पंप करने के लिए प्रवाह सेल के आउटलेट कनेक्ट. प्रवाह कोशिका की इनलेट ट्यूब को 1.5 एमएल ट्यूब में डालें और सिरिंज पंप को ट्यूब से समाधान निकालने के लिए 30-50 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट की प्रवाह दर पर संचालित करें।
    8. अक्सर हरे रंग की लेजर के साथ संक्षेप में इमेजिंग द्वारा अच्छा कवरेज (100-300 समरूप रूप से वितरित, अच्छी तरह से पुस्तक सब्सट्रेट) के लिए सतह की जाँच करें।
    9. यदि सतह कवरेज अभी भी पर्याप्त नहीं है या तो फ्लोरोसेंट के लिए कुछ मिनट के लिए प्रतीक्षा करें सतह पर बसने या बह कदम दोहराने के लिए समाधान से HJ लेबल.
    10. एक अन्य 120 डिग्री सेल्सियस इमेजिंग बफर (सारणी 1) को 30-50 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट पर प्रवाहित करें ताकि असीमित फ्लोरोसेंटी लेबल वाले एचजे को धो सके। तो प्रवाह सेल 5 मिनट के लिए बैठते हैं ओएसएस भंग ऑक्सीजन को कम करने के लिए अनुमति देने के लिए. फ्लोरोफोर्स की फोटोब्लीचिंग इमेजिंग की शुरुआत में कम से कम होनी चाहिए।
    11. जोखिम समय सेट ($60 एमएस), चक्र समय स्वचालित रूप से डेटा हस्तांतरण की गति के आधार पर सॉफ्टवेयर द्वारा निर्धारित किया जाएगा ($104 एमएस), और चक्र या फ्रेम ($ 400) की वांछित संख्या निर्दिष्ट करें। दाता से उत्सर्जन (Cy3) और स्वीकारकर्ता (एलेक्सा फ्लोर 647) एक छवि विभाजक डिवाइस द्वारा दो रंग चैनलों में विभाजित है.
    12. सतह पर एक उपयुक्त क्षेत्र ढूँढें, उद्देश्य और रिकॉर्ड की ऊंचाई का समायोजन करके छवि ध्यान केंद्रित करने और 16-बिट TIFF स्वरूप में फिल्म को बचाने के।
    13. किसी नए क्षेत्र में जाना.
      नोट: हमेशा एक ही दिशा में केवल (यानी, आउटलेट से इनलेट के लिए) दो बार एक ही क्षेत्र इमेजिंग से बचने के लिए ले जाएँ।
    14. एक समय में 120 डिग्री सेल्सियस में 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75 और 100 एनएम GEN1 तैयार करें। विलयन को 30-50 डिग्री प्रति ग्राम की प्रवाह दर पर प्रवाहित करें।
      नोट: यदि आवश्यक माप स्थिर राज्य के तहत किया जाता है के रूप में GEN1 द्वारा HJ की बाइंडिंग या मुक्त HJ के isomerization में, उसके बाद प्रवाह फिल्म रिकॉर्ड करने के लिए बंद हो जाता है 3-5 मिनट प्रतीक्षा करें. प्रत्येक GEN1 एकाग्रता के लिए नए क्षेत्रों से तीन से चार फिल्में प्राप्त करें.
    15. यदि माप के रूप में GEN1 द्वारा HJ के दरार में निरंतर प्रवाह के तहत किया जाता है तो प्रवाह सेल में GEN1 के प्रवेश से पहले 5-10 s रिकॉर्डिंग शुरू करते हैं. छह चैनल प्रवाह कक्ष में एक नए चैनल पर ले जाकर माप दोहराएँ.
    16. अंत में, छवि बंटवारे डिवाइस में एक दूसरे के लिए दाता और स्वीकारकर्ता कणों नक्शा करने के लिए एक निश्चित फ्लोरोसेंट मनका स्लाइड का उपयोग करें।
    17. मोती सतह से चिपके रहने के लिए अनुमति देने के लिए 1 मीटर व्यास फ्लोरोसेंट मोती के 0.2 $L को 1 एम त्रिस (पीएच जेड 8.0) के 500 डिग्री एल में जोड़ें।
    18. एक वर्ग में कटौती (18 मिमी x 18 मिमी) एक 22 मिमी x 22 एक डबल तरफा चिपकने वाला सील के टुकड़ा के अंदर. छील और एक 76 मिमी x 25 मिमी क्वार्ट्ज स्लाइड के बीच करने के लिए टुकड़ा छड़ी.
    19. पतला मोती समाधान के 50 डिग्री सेल्सियस प्लेस और 5-10 मिनट के लिए व्यवस्थित करने के लिए छोड़ दें। वर्ग टुकड़ा के शीर्ष पर एक 22 मिमी x 22 मिमी कवरस्लिप संलग्न करें। ऊतक के साथ सूखी अतिरिक्त मोती समाधान, तो epoxy गोंद द्वारा कक्ष सील.
    20. एक 60 एमएस जोखिम समय पर मोती स्लाइड के 100 फ्रेम प्राप्त करें।
      चेतावनी: कम लेजर शक्ति और ईएमसीडी कम करने के लिए कम से कम डिटेक्टर की संतृप्ति से बचने के लिए लाभ.
    21. सॉफ्टवेयर पैकेज स्थापित करें (जैसे, TwoTones) और उसमें फिल्मों को खोलने के रूप में उपयोगकर्ता पुस्तिका36में संकेत दिया. दाता और स्वीकारकर्ता चैनलों में अलग-अलग मोती की स्थितियों का चयन करें। मैन्युअल में वर्णित के रूप में एक रूपांतरण मैट्रिक्स जनरेट करें।
      नोट: इस सॉफ्टवेयर परिवर्तन मैट्रिक्स का उपयोग करता है दाता और स्वीकार करने वाले चैनलों में कणों की स्थिति से मेल खाते हैं और छवि बंटवारे डिवाइस में किसी भी मामूली misalignment के लिए सही है.
    22. फ़ाइलपर जाएँ, मूवी दबाएँ, फिर चलचित्र फ़ाइल का चयन करें और खोलें दबाएँ. फ़ाइल मेनू में, लोड TFORM दबाएँ और मोती स्लाइड से उत्पन्न रूपांतरण मैट्रिक्स का चयन करें। कोई गलत सकारात्मक शामिल हैं जब तक दाता और स्वीकार करने वाले चैनलों के लिए सीमा समायोजित करें.
    23. चैनल फ़िल्टर मेनू में, दाता और स्वीकारकर्ता दोनों के साथ लेबल किए गए कणों के लिए चयन करने के लिए डी एंड ए विकल्प चुनें. एक दूसरे के बहुत निकट अणुओं को बाहर करने के लिए निकटतम पड़ोसी सीमा क्षेत्र की जाँच करें। बहुत सनकी अणुओं को बाहर करने और बहुत व्यापक या बहुत संकीर्ण अणुओं को बाहर करने के लिए चौड़ाई सीमा की जांच करने के लिए अधिकतम दीर्घवृत् ति की जाँच करें।
    24. हिस्टोग्राम बनाने के लिए टूटोन मैनुअल में दिए गए निर्देश के अनुसार प्लॉट हिस्टसीडब्ल्यू टाइप करें।
      नोट: "अदालत" FRET दक्षता दाता और स्वीकारकर्ता से कुल उत्सर्जन द्वारा स्वीकारकर्ता के उत्सर्जन को विभाजित करके कार्यक्रम द्वारा गणना की जाती है। दो टोन ्स-वे फ्रट दक्षता के विरुद्ध अणुओं की अवस्थाओं के वितरण को बिन करने के लिए 100 अंतरालों का उपयोग करता है।
    25. प्रकार plotTimetresCW के रूप में प्रत्येक अणु के लिए समय-traces उत्पन्न करने के लिए Twotones मैनुअल में निर्देश दिया.
      नोट: समय-ट्रेस आगे vbFRET37 द्वारा विश्लेषण किया जा सकता विभिन्न FRET राज्यों की पहचान करने के लिए, उनके संबंधित रहने का समय, और विभिन्न राज्यों के बीच संक्रमण दर.
  2. दो रंग बारी उत्तेजना FRET (ALEX) प्रयोगों
    1. हरे और लाल पराबैंगनीकिरण के साथ प्रत्यक्ष उत्तेजना द्वारा दाता और स्वीकारकर्ता उत्सर्जन के लगातार फ्रेम से बना एक फिल्म रिकॉर्ड, क्रमशः, अवधि में प्रत्येक $ 80 एमएस.
    2. Twotones में अधिग्रहीत ALEX फिल्में खोलें. तीन चैनलों के लिए $ 300 के रूप में उपयुक्त पता लगाने सीमा सेट: दाता उत्तेजना के कारण दाता उत्सर्जन (DexDem); दाता उत्तेजना (DexAem) के कारण स्वीकारकर्ता उत्सर्जन; और प्रत्यक्ष उत्तेजना (AexAem) के कारण स्वीकारकर्ता उत्सर्जन।
    3. चैनल फिल्टर DexDem और DexAem और AexAem लागू कणों है कि दोनों दाता और स्वीकारकर्ता के लिए चयन करने के लिए. तीनों चैनलों में कणों को 200-300 से लिंक कीजिए।
    4. ALEX हिस्टोग्राम उत्पन्न करने के लिए प्लॉटHistALEX MATLAB कोड का उपयोग करें। हिस्टोग्राम में विभिन्न चोटियों को गौसियों के कार्यों के लिए फिट करें और मूल सॉफ्टवेयर38का उपयोग करके वक्र के अंतर्गत आने वाले प्रत्येक जनसंख्या के प्रतिशत का निर्धारण करें ।
      नोट: बंधन परख में चोटियों बाध्य GEN1-HJ परिसर के अनुरूप है, जबकि मुक्त HJ में, चोटियों interchanging isomers प्रतिनिधित्व करते हैं.
    5. FRET और प्रत्यक्ष उत्तेजना के कारण दाता उत्सर्जन दिखा प्रत्येक अणु के लिए एक समय-ट्रेस उत्पन्न करने के लिए plotTimetresALEX MATLAB कोड का उपयोग करें।
      नोट: ALEX समय-traces स्वतंत्र रूप से दोनों दाता और स्वीकारकर्ता के उत्सर्जन को दिखाने के लिए, लेकिन एकल रंग FRET की तुलना में कम लौकिक संकल्प पर. एकल रंग FRET करने के लिए इसी तरह, ALEX समय-traces आगे vbFRET द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है विभिन्न FRET राज्यों और उनके संबंधित रहने के समय की पहचान करने के लिए.
    6. एक अतिपरवलयिक समारोह के लिए बाध्य जनसंख्या बनाम GEN1 सांद्रता के प्रतिशत फिटिंग द्वारा वियोजन स्थिरांक निर्धारित करें।
  3. समय चूक एकल रंग FRET
    1. मनाया गतिशीलता की गति के आधार पर 624 एमएस या कम करने के लिए 60 एमएस और चक्र समय के लिए हरी लेजर के जोखिम समय निर्धारित करें।
    2. छह-चैनल प्रवाह कक्ष के एक चैनल में प्रवाह दर को 110 डिग्री सेल्सियस/न्यूनतम पर सेट करें। प्रवाह कक्ष के अंदर GEN1 के प्रवेश द्वार से पहले रिकॉर्डिंग को संक्षेप में प्रारंभ करें.
      नोट: सतत प्रवाह फ्लोरोफोर्स के तेजी से photobleaching की ओर जाता है, इसलिए इमेजिंग और प्रोटीन प्रविष्टि की शुरुआत सिंक्रनाइज़ कब्जा कर लिया घटनाओं की संख्या को अधिकतम. इष्टतम सिरिंज पंप पढ़ने मृत मात्रा और सटीक टयूबिंग प्रवाह सेल को इकट्ठा करने के लिए इस्तेमाल पर निर्भर करता है; हमारे मामले में यह $ 25 डिग्री सेल्सियस है.
    3. 78 s की कुल अधिग्रहण समय के लिए $ 125 फ्रेम की एक फिल्म का अधिग्रहण. रिकॉर्डिंग के अंत में, स्वीकारकर्ता की जांच करने के लिए 25 एमएस जोखिम समय के साथ प्रत्येक 50 फ्रेम के लिए लाल लेजर के लिए नमूना बेनकाब.
      नोट: यह विधि उत्तेजना चक्र की संख्या को कम करने के माध्यम से दरार प्रयोग में अवलोकन खिड़की को बढ़ाता है। काइनेटिक पैरामीटर्स को डाइमराइजेशनके परऔर केके रूप में एक द्वि-अनुभवात्मक मॉडल 30,38के लिए वितरण को फिट करके प्राप्त किया जाता है।

7. इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता बदलाव परख (EMSA)

  1. 50 डिग्री सेल्सियस कुल आयतन में, 50 पी एम Cy5-लेबल HJ के साथ GEN1 की वांछित सांद्रता को ईएमएसए बाइंडिंग बफर (तालिका 1)में 30 मिनट के लिए आरटी पर इनक्यूबेट करें।
  2. 6% Tris-borate-EDTA जेल के 8 सेमी x 8 सेमी पर नमूने लोड करें। आरटी पर 1h TBE बफर में 1 h + 20 मिनट के लिए 100 V का उपयोग कर जेल चलाएँ।
  3. संबंधित लेन की कुल फ्लोरोसेंट तीव्रता के लिए अपने सापेक्ष योगदान से एक GEN1 सांद्रता पर बाध्य सब्सट्रेट के प्रतिशत का निर्धारण.
    नोट: GEN1 मोनोमर-एचजे (बैंड I) की पहचान उसके आकार के समझौते द्वारा की जाती है जिसमें GEN1 मोनोमर के पिकोमोलर बाइंडिंग से निक्ड एचजे21,30को पहचाना जाता है। GEN1-dimer-HJ को बैंड II को एचजे21,23को GEN1 मोनोमर के चरणवार बंधन के कारण सौंपा गया है।
  4. समीकरण का उपयोग कर स्पष्ट बाइंडिंग स्थिरांकKd-monomer-app-EMSA और Kd-dimer-app-EMSA की गणना करें:
    Equation
    कहाँ: अधिकतम एकाग्रता जिस पर संबंधित प्रजातियों अपनी अधिकतम बंधन (मोनोमर या dimer) तक पहुँच गया है; द हिल गुणांक है; कश्मीर डी-ऐप-ईएमएसए संबंधित प्रजातियों का स्पष्ट बंधन स्थिरांक है, जिसमें GEN1 की सांद्रता को दर्शाता है, जिस पर मोनोमर या डिमर का आधा-अधिकतम मौजूद है।

Representative Results

एचजे के कंफॉर्मर पूर्वाग्रह और आइसोमराइजेशन

एचजे के समवेतीकरण की जांच फ्राट द्वारा जंक्शन के दो निकटवर्ती भुजाओं की लेबलिंग के माध्यम से की गईहै 17,18,39. दाता (Cy3) और स्वीकारकर्ता (एलेक्सा Fluor 647) दो पड़ोसी हथियारों पर तैनात हैं, आर (स्ट्रेंड 2) और एक्स (स्ट्रेंड 3), क्रमशः (चित्र 2A)। खड़ी-X समीजक उनके दो निरंतर किस्में [यानी, Iso(1,3) या Iso(2,4)] द्वारा असाइन किए गए थे। आसन्न लेबल X0 के ALEX FRET हिस्टोग्राम दो चोटियों को दर्शाता है जो अधिक प्रचुर मात्रा में इसो(1,3) (ई $0.75) और कम प्रचुर मात्रा में इसो (2,4) (ई $0.40) (चित्र 2बी) के परस्पर परिवर्तन के अनुरूप हैं।

एकल रंग FRET EMCCD2 कैमरे का इस्तेमाल किया क्षेत्र को कम करने के माध्यम से उच्च लौकिक संकल्प के साथ मुक्त HJ में तेजी से अनुरूप परिवर्तन रिकॉर्डिंग के लिए समय-ट्रेस प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है। X0 संधि का एक प्रतिनिधि एकल-रंग FRET समय-ट्रेस उच्च एवं निम्न चित्र समकशकेके बीच संक्रमण दर्शाता है (चित्र 2ख)। समप्रीकरण दर kIso(1,3)-Iso(2,4) और kIso(2,4)-Iso(1,3) Iso(1,3) और Iso(2,4) (चित्र 2C)पहले सूचित17के समय हिस्तोली से प्राप्त की गई हैं।

SMFRET GEN1 द्वारा HJ के सक्रिय विरूपण को दर्शाता है

एचजे GEN122के लिए बाध्यकारी पर संरचनात्मक पुनर्गठन से गुजरना . इस प्रकार दाता और ग्राही के बीच की रिक्ति इसो(1,3) तथा इसो(2,4)(चित्र 3क)दोनों में समान होती है। HJ के दरार को रोकने के लिए Ca2+ की उपस्थिति में smFRET बाइंडिंग परख की गई थी। आसन्न लेबल X0 संधि के फ्रट हिस्टोग्राम विभिन्न GEN1 सांद्रताओं पर ALEX द्वारा अधिग्रहीत किए गए थे (चित्र 3ख) हिस्टोग्राम दो गाऊसी कार्यों के लिए फिट है: एक मुक्त उच्च FRET आईएसओ (1,3) के लिए इसी, और अन्य बाध्य GEN1-HJ आबादी के लिए इसी कम FRET चोटी से आईएसओ (2,4) के योगदान घटाने के बाद.

संतृप्त GEN1 सांद्रता पर, X0 के FRET हिस्टोग्राम में केवल एक ही निम्न FRET शिखर है जो GEN1 के संगत है जो HJ के किसी भी समीम से संबंधित है जैसा कि मॉडल22द्वारा पूर्वानुमानित किया गया है। आभासी मोनोमर वियोजन स्थिरांक (केडी-मोनोमर-ऐप) GEN1-बाउंड जनसंख्या के प्रतिशत के अतिपरवलयिक फिट से GEN1 सांद्रता के एक फ़ंक्शन के रूप में निर्धारित किया जाता है (चित्र 3C) . आसन्न लेबल एनके एक्स0 एक singly nicked संस्करण HJ कि पहली चीरा प्रतिक्रिया के बाद उत्पाद mimics का प्रतिनिधित्व करता है. नकली निक द्वारा स्टैकिंग तनाव की राहत के कारण, एनके-एक्स0 एक गैर-समकारी संरचना40 है, जो ई $0.40 पर एकल सब्सट्रेट चोटी से स्पष्ट है, एक्स0 के विपरीत (चित्र 3डी बनाम चित्रा 3बी)। GEN1-nk-X0 जटिल की संरचना GEN1-X0 जटिल के समान है, जैसा कि FRET दक्षतामेंवृद्धि में समानता द्वारा इंगित किया गया है (E $0.25 nk-X0 के लिए और 0.32 X0के लिए ) (चित्र 3D बनाम. चित्र 3ख) . एनके-एक्स0 के लिए GEN1 मोनोमर की मजबूत बाइंडिंग का प्रदर्शन X0 की तुलना में 40 गुना कमK-मोनोमर-ऐप मान द्वारा किया जाता है(चित्र 3E बनाम चित्रा 3C)। इस तंग बंधन GEN1 dimer या उसके monomers में से एक के वियोजन की संभावना की स्थिति में HJ के अधूरे संकल्प के खिलाफ एक सुरक्षा तंत्र के रूप में कार्य कर सकते हैं.

एचजे के लिए GEN1 मोनोमर के चरणवार बाइंडिंग

एचजे के लिए GEN1 मोनोमर की बाइंडिंग, डाइमर गठन के बाद यूकैरियोटिक एचजे के लिए एक अनूठी विशेषता है जो प्रोकैरियोटिक रिसोलवेस की तुलना में GEN1 है, जो समाधान21,23,41में डिमेरिक रूप में मौजूद है . 50 pM X0 पर GEN1 का EMSA उच्च क्रम परिसरों में GEN1 के चरणवार संघ को दर्शाता है, जैसा कि ऊपरी फलक में रोमन अंकों द्वारा दर्शाया गया है (चित्र 4क)। ईएमएसए द्वारा निर्धारित GEN1 मोनोमर का वियोजन स्थिरांक (केडी-मोनोमर-ईएमएसए) स्मगर्ट बाइंडिंग परख केडी-मोनोमर-ऐप से वियोजन स्थिरांक के साथ मेल खाता है (चित्र 4क और चित्र 3C , क्रमशः). बैंड II के परिमाणीकरण का उपयोग GEN1 dimer(Kd-dimer-EMSA)के संतुलन वियोजन स्थिरांक की गणना करने के लिए किया जाता है। 50 pM nk-X0 पर GEN1 का EMSA प्रमुख मोनोमर बाइंडिंग को दर्शाता है जैसा कि बहुत कम Kd-monomer-app-EMSA द्वारा इंगित किया गया है जो X 0 की तुलना में 30 गुना कमहै, जबकि इसके Kd-dimer-EMSA है X0 (चित्र 4ठ) की तुलना की जा सकती है।

इसके अतिरिक्त प्रमाण यह है कि GEN1 मोनोमर एचजे को बांधता और विकृत करता है, कम GEN1 सांद्रता पर चह2+ की उपस्थिति में स्थिर निम्न FRET अवस्था वाले अशुद्ध कणों के अंशों की एक महत्वपूर्ण संख्या का अवलोकन है (चित्र 4C) GEN1 सांद्रता बढ़ाने पर इन अंशों की संख्या में कमी आई। एचजे का संकल्प GEN1 मोनोमर की तंग बंधन द्वारा संचालित होता है, जो डिमर गठन का समर्थन करता है। मोनोमर बाइंडिंग को मघ2 मेंचाचा द्वारा एनके-एक्स0 के समय-अंशों में देखा जाता है, जो कुछ नैनोमोलर सांद्रता तक बढ़ा ता है (चित्र 4D) । GEN1 मोनोमर nk-X 0 की रक्षा के लिए कसकरबांधता है, अंततः dimer गठन के माध्यम से पूर्ण संकल्प सुनिश्चित करने.

SMFRET संकल्प HJ की परख

शब्द "cleavage" smFRET परख में HJ के "रिज़ॉल्यूशन" के साथ interchangeably प्रयोग किया जाता है, क्योंकि इस परख में केवल उत्पाद रिलीज है कि दूसरी दरार घटना इस प्रकार का पता चला है. घटनाओं समय चूक एकल रंग उत्तेजना द्वारा दर्ज कर रहे हैं $ 1.3 मिनट के अधिग्रहण के समय पर फोटो के प्रति संवेदनशील स्वीकारक की photobleaching कम से कम करने के लिए.

चित्र 5क में योजनाबद्ध रूप से क्रियाओं के 1 और 3 X0 Iso(1,3) के चीरों को कार्यात्मक कांच से जुड़ी एक X0 के GEN1 द्वारा बंधन और विरूपण के बाद दिखाया गया है। दोनों दाता और स्वीकारकर्ता समाधान में जाने के परिणामस्वरूप HJ संकल्प के बाद उनके संकेतों की हानि में. पहले और दूसरे चीरों nk-X 0 में decoupledहैं, जो आंशिक रूप से हल HJ के लिए एक प्रोटोटाइप उदाहरण है. GEN1 की बाइंडिंग पर, nk-X0 X0के लिए एक समान संरचना को गोद ले लेता है। यह संकल्प किनारा 1 में एक चीरा द्वारा प्राप्त होता है, जैसा कि चित्र 5खमें दिखाया गया है।

दाता और स्वीकारकर्ता के एक साथ प्रस्थान हल X0 के निशान में एक स्थिर कम FRET राज्य के बाद एक मध्यवर्ती FRET के उद्भव के बिना हुई (ई $ 0.40) इंगित करता है कि पूरा संकल्प GEN1-HJ के जीवनकाल के भीतर होता है जटिल (चित्र 5C) इसलिए, इन परिणामों का सुझाव है कि HJ रिज़ॉल्यूशन GEN1-HJ जटिल जीवनकाल के भीतर होती है। एनके-एक्स0 का संकल्प संरचनात्मक पुनर्व्यवस्थित करने के बाद भी आगे बढ़ता है और डुप्लेक्स के प्रस्थान से समाप्त होता है जिसमें दो फ्लोरोफोर होते हैं (चित्र 5D) X0के समान .

GEN1 dimerization के KINetics GEN1 मोनोमर बाध्य HJ पर

समय चूक smFRET उपायों सेपहले cleavage जो मुख्य रूप से GEN1 मोनोमर द्वारा विरूपण के बाद Dimer गठन और HJ के संकल्प के लिए आवश्यक समय भी शामिल है. इस तकनीक को लागू करने के लिए, प्रत्यक्ष सबूत के लिए दावा है कि dimer गठन दोनों एक्स0 और एनके एक्स0के संकल्प के लिए आवश्यक है का समर्थन करने के लिए प्रदान की जाती है, के बाद से $पहले cleavage के वितरण GEN1 एकाग्रता पर निर्भर है.

HJ रिज़ॉल्यूशन(kapp) की आभासी दर को संबंधित GEN1 सांद्रता में $से पहले-cleavage के माध्य के व्युत्क्रम के रूप में परिभाषित किया गया है. शब्द "apparent" HJ संकल्प की दर का वर्णन करने के लिए प्रयोग किया जाता है, संभावना है कि GEN1 HJ संकल्प के बाद उत्पाद के लिए बाध्य रहता है के बाद से बाहर रखा जा सकता है.

प्रायिकता घनत्व प्रकार्य (PDF) X0 (चित्र 6A) केपहले-क्लीवेज वितरण का समय मंदर गठन के लिए प्रतिबिंबित होता है, जो कम GEN1 सांद्रता में लंबा होता है, फिर उच्च GEN1 सांद्रता पर कम होता है। डाइमर, केऑन-डिमर और केऑफ-डिमरके लिए संघ और वियोजन दर क्रमशः द्वि-अनुभवीय मॉडल30से निर्धारित की जाती हैं। इसके अलावा, एनके-एक्स0 (चित्र 6ख) के पीडीएफ, एक्स0 के समान वितरण दिखाते हैं जो डिमर गठन की आवश्यकता को दर्शाता है।

केअनुप्रयोग बनाम GEN1 एकाग्रता की साजिश एक अतिपरवलयिक समारोह के लिए फिट किया गया था. एक्स0 और एनके-एक्स0 की स्पष्ट उत्प्रेरितता दर स्थिरांक (केमैक्स-ऐप) 0.107 - 0.011 s-1 और 0.231 - 0.036 s-1, क्रमशः (चित्र 6C) हैं । एक्स0 और एनके-एक्स0 जंक्शनों के लिए केऐप के भूखंडों की तुलना में तेजी से केमैक्स-ऐप और धीमी कश्मीरकी तुलना में GEN1 एकाग्रता $5.6 एनएमपर प्रतिच्छेद करते हैं। बरकरार जंक्शन.

संक्षेप में, अपेक्षाकृत तेजी से kपर-dimer और धीमी गति से kबंद dimer HJ संकल्प की ओर आगे प्रतिक्रिया की प्रगति के लिए नेतृत्व एक बार dimer का गठन किया है. एनके-एक्स0 जंक्शन के लिए GEN1 मोनोमर की मजबूत बाइंडिंग किसी भी संभावना नहीं निरस्त दूसरे दरार के खिलाफ एक असफल-सुरक्षित तंत्र का गठन करता है या सेल में प्राथमिक संकल्प रास्ते द्वारा पीछे छोड़ दिया किसी भी अधूरा अनसुलझे HJs लेने में मदद करता है।

Figure 1
चित्र 1: एकल और एकाधिक चैनल प्रवाह कोशिकाओं और ऑप्टिकल सेट अप के लेआउट.
(A) एकल चैनल प्रवाह सेल का Schematic. (बी) छह चैनल प्रवाह सेल के Schematic. (ग)प्रकाशिक समुच्चय का लेआउट जिसमें उत्तेजना स्रोतों, टीआईआरएफ उद्देश्य, फिल्टर क्यूब के अंदर स्थापित डाइक्रोइक दर्पण और छवि विभाजक उपकरण में प्रयुक्त उत्सर्जन फिल्टर का चित्रण किया गया है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: FRET द्वारा मनाया HJ के conformer पूर्वाग्रह और isomerization.
(ए) आसन्न-लेबल एक्स-स्टैक्ड एचजे अनुचरों का Isomerization जिसका नाम दो सतत किस्में के नाम पर रखा गया है। किस्में गिने जाते हैं, जबकि भुजाएँ अक्षरों द्वारा निरूपित होती हैं। चीरा साइटों तीर द्वारा दिखाए जाते हैं. दाता (हरा) और स्वीकारकर्ता (लाल) की स्थिति और आसमीकरण पर FRET में परिवर्तन इंगित कर रहे हैं. (ख) दायाँ फलक: FRET समय-ट्रेस (काला) और आदर्शीकृत FRET ट्रेस (लाल) X0 के 50 m M Mg2 +पर . वाम पैनल: 50 m M Mg2+पर X0 का FRET हिस्टोग्राम | दाता (हरा) और स्वीकारकर्ता (लाल) की फ्लोरोसेंट तीव्रता नीचे दिखाई गई है। (ग) सम-लेबल X0 Iso(1,3) और Iso(2,4) के रहने के समय के हिस्टोग्राम को सम-प्रगेशन दरों का निर्धारण करने के लिए एकल-प्रम्य कार्यों में लगाया गया था. अनिश्चितताएं फिट के 95% विश्वास अंतराल को दर्शाती हैं। यह आंकड़ा पहले प्रकाशित साहित्य30से संशोधित किया गया है.

Figure 3
चित्र 3: GEN1 द्वारा HJ के सक्रिय विरूपण.
(क)प्रस्तावित मॉडल22के आधार पर आसन्न लेबल एचजे का संरचनात्मक संशोधन . (ख) आसन्न लेबल X0 के ALEX FRET हिस्टोग्राम में इसो(2,4) के लिए एक प्रमुख उच्च FRET शिखर (E $ 0.6) इसी Iso(1,3) और कम FRET शिखर (E $ 0.4) है। पूरे हिस्टोग्राम दो गाऊसी कार्यों के लिए फिट है: एक मुक्त उच्च FRET आईएसओ (1,3) के लिए इसी, और अन्य बाध्य जनसंख्या के लिए इसी कुल जनसंख्या के लिए आईएसओ (2,4) के प्रारंभिक योगदान शून्य से. (ग) स्पष्ट मोनोमर वियोजन स्थिरांक (केडी-मोनोमर-ऐप) GEN1 सांद्रता के एक फ़ंक्शन के रूप में GEN1-बाउंड जनसंख्या के प्रतिशत के अतिपरवलयिक फिट से निर्धारित किया जाता है. (घ)विभिन्न GEN1 सांद्रता पर आसन्न लेबल एनके-X0 के फ्रेट हिस्टोग्राम। निम्न FRET के अंतर्गत क्षेत्र (E $ 0.25) गौसियन बाउंड जनसंख्या के प्रतिशत से मेल खाती है। (ई)एनके-एक्स0 के केडी-मोनोमर-ऐप का निर्धारण GEN1-बाउंड जनसंख्या के अतिपरवलयिक फिट से किया जाता है। त्रुटि पट्टियाँ दो या अधिक प्रयोगों से मानक विचलनों का प्रतिनिधित्व करती हैं. यह आंकड़ा पहले प्रकाशित साहित्य30से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्र 4: एचजे के लिए GEN1 के चरणवार बाइंडिंग।
(ए) 50 पी एम एक्स0पर GEN1 के इलेक्ट्रोफोरेटिक मोबिलिटी शिफ्ट परख (ईएमएसए ) . ऊपरी पैनल: रोमन अंकों परिसर में GEN1 monomers की संख्या से संकेत मिलता है. लोअर पैनल: X0के लिए GEN1 मोनोमर की बाइंडिंग | आभासी वियोजन स्थिरांक संबंधित प्रजातियों के एक सिग्मोइडल फिट से प्राप्त किए गए थे और दो प्रयोगों के औसत का प्रतिनिधित्व करते हैं। (ख) 50 पी एम एनके-एक्स0 पर GEN1 का ईएमएसए बहुत कम Kd-मोनोमर-ऐप-ईएमएसएद्वारा दर्शाई गई प्रमुख मोनोमर बाइंडिंग को दर्शाता है। (ग)सीमाबद्ध लेकिन अशुद्ध आसन्न लेबल X0 में Mg2+में समय-समय पर पता लगाया जाता है। $ 1.3 मिनट के लिए दाता उत्तेजना प्रदर्शन किया गया था, प्रत्यक्ष स्वीकारकर्ता उत्तेजना (शेड गुलाबी क्षेत्र) के बाद. (घ)बाध्य लेकिन uncleaved आसन्न लेबल एनके-X0 में Mg2 +के FRET समय-ट्रेस । यह आंकड़ा पहले प्रकाशित साहित्य30से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्र 5: SMFRET संकल्प HJ की परख.
(ए) GEN1 द्वारा विरूपण के बाद आसन्न लेबल X0 Iso(1,3) का स्केमेटिक। सब्सट्रेट बायोटिन/एविडिन लिंकेज के माध्यम से कार्यात्मक सतह से जुड़ा होता है। दो चीरों के बाद GEN1 के वियोजन के परिणामस्वरूप दाता और स्वीकारकर्ता दोनों का नुकसान होता है जो समाधान में जाते हैं। (B) आसन्न लेबल nk-X0 के संकल्प के Schematic द्वारा cleaving किनारा 1. (ग)समय-ट्रेस (काला) इसो(1,3) के क्लीवेज के 2 मम डह2+ पर। GEN1 बाइंडिंग की शुरुआत एक स्थिर कम FRET राज्य रूपों जब तक FRET संकेत अचानक दरार के कारण खो दिया है. इसी के अनुरूप, दाता में वृद्धि और GEN1 बाइंडिंग पर ग्राही फ्लोरोसेंट तीव्रता की कमी के बाद दरार पर दोनों रंगों से फ्लोरोसेंट के एक साथ गायब होने के बाद है। (घ)इसी प्रकार एनके-एक्स0 का समय-ट्रेस GEN1 बाइंडिंग पर एक स्थिर निम्न FRET अवस्था दर्शाता है जो FRET संकेत के आकस्मिक रूप से समाप्त हो जाता है। यह आंकड़ा पहले प्रकाशित साहित्य30से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 6
चित्र 6: GEN1 एकमेव एचजे पर GEN1 dimerization के Kinetics.
(ए) प्रायिकता घनत्व फलन (पीडीएफ) कांड X0 केपहले-कलेज वितरण की, GEN1 सांद्रता पर अपनी निर्भरता को दर्शाता है। संबंधित GEN1 सांद्रता में निम्न FRET अवस्था([पहले-cleavage) के निवास समय दो या दो से अधिक प्रयोगों से प्राप्त किए गए थे और औसत दर (केअनुप्रयोग) प्राप्त करने के लिए उपयोग किया जाता था। सूचीबद्ध kएप्लिकेशन दरों संबंधित GEN1 एकाग्रता पर मतलब -पहले cleavage के व्युत्क्रम से निर्धारित कर रहे हैं. डाइमर गठन के लिए संघ (केऑन-डिमर) और वियोजन (केऑफ-डिमर) दरों की गणना द्वि-अनुभवीय मॉडल38से की जाती है . त्रुटियों k अनुप्रयोगके SEM का प्रतिनिधित्व करते हैं। (बी) एनके-एक्स0 और संबंधित केऐप दरों केपहले-क्लेवेज वितरण का पीडीएफ प्लॉट। (सी) स्पष्ट उत्प्रेरक दर (केमैक्स-ऐप)निर्धारित करने के लिए एक अतिपरवलयिक समारोह में फिट केएप्लिकेशन बनाम GEN1 एकाग्रता का प्लॉट। X0 और nk-X0 के लिए kऐप की साजिश X0 के तेज़ प्रारंभिक kऐप को दिखाता है, जिसे [GEN1] ]5.6 एनएम से ऊपर एनके-एक्स0 से पार कर जाता है। यह आंकड़ा पहले प्रकाशित साहित्य30से संशोधित किया गया है. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

बफ़र खाद
बफ़र बाइंडिंग 40 एमएम Tris-HCl पीएच 7.5, 40 एमएम NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mM DTT, 0.1% बीएसए और 5% (v/
बफर ए 20 एमएम ट्रास-एचसीएल पीएच 8.0, 1 एमएम डीटीटी और 300 एमएम नैकल
बफर बी 20 एमएम ट्रास-एचसीएल पीएच 8.0, 1 एमएम डीटीटी और 100 एमएम नैकल
बफर सी 20 एमएम ट्राइस-एचसीएल पीएच 8.0 और 1 एमएम डीटीटी
क्लीवेज बफर 40 एमएम Tris-HCl पीएच 7.5, 40 एमएम NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.1% बीएसए और 5% (v/
EMSA बाइंडिंग बफर 40 एमएम Tris-HCl पीएच 7.5, 40 एमएम NaCl, 1 mM DTT, 2 mM CaCl2, 0.1 mg/ml BSA, 5% (v/v) ग्लिसरॉल और 5 एनजी/
इमेजिंग बफ़र (बाइंडिंग) 40 [L ($)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic एसिड (4 $M), 60 जेडएल पीसीए (6 एनएम), 60 जेडएल पीसीडी (60 एनएम) और 840 जेडएल बाइंडिंग बफर के
इमेजिंग बफर (क्लीवेज) 40 [L ($)-6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic एसिड (4 डिग्री), 60 जेडएल पीसीए (6 एनएम), 60 एल पीसीडी (60 एनएम) और 840 जेडएल क्लीवेज बफर
Lysis बफर 20 एमएम ट्रास-एचसीएल पीएच 8.0, 10 एमएम जेड-मेरकैप्टोथेनोल, 300 एमएम नैक्ल और 2 एमएम पीएमएसएफ
पीसीडी भंडारण बफर 100 एमएम Tris-HCl पीएच 7.5, 1 एमएम EDTA, 50 एमएम केसीएल और 50% ग्लिसरोल
भंडारण बफर 20 एमएम ट्रास-एचसीएल पीएच 8.0, 1 एमएम डीटीटी, 0.1 एमएम एडीटीए, 100 एमएम नैकल और 10% ग्लिसरोल
TBE बफर 89 एमएम ट्राइस-एचसीएल, 89 एमएम बोरिक एसिड और 2 एमएम एईटीए
TE100 बफर 10 एमएम Tris.HCl पीएच 8.0 और 100 एम एम NaCl
Tris-EDTA बफर 50 एमएम ट्रास-एचसीएल पीएच 8.0 और 1 एमएम एड्टा पीएच 8.0

तालिका 1: इस अध्ययन में प्रयुक्त बफरों और उनकी रचनाओं की सूची।

ओलिगो अनुक्रम
X0-st1 ACGCTGCGAATTCTACTAGTGCCTGTGCTAGCATTGCCCCCCGTAGTCACCC
X0-st2 GGGTGAACCTGCAGGTGG/iCy3/AAAGATGTCCATGTGTGTCGTCAAGTGATGCTGT
X0-st3 ACGGCATAAAGCTTGACGA/iAF647-dT/TACAACAGATGAGGTTAGTAGCCACTATCG
X0-st4 5'बायोटिनसीगटैगटीसीटीसीटीटीसीटीसीटैगसीसीटीसीटीसीसीटीसीसीटीसीटीजीटीटैगटैगकागकागैक्टगगटगगटगगगगगट
X0-डीजे X0-st1, X0-st2, X0-st3 और X0-st4
X0इन$स्ट2 GGGTGAACCTGCAGGTGGGCAAAGATCCATCTGTGTGTGTCGCTCAAGCTATGCCGT
X0इंजेडस्ट4 5'बायोटिनसीगाटैगटीसीटीसीटीसीटीसीटीएजीसीसीटीसीसीटीसीटीसीटीएजीसीएटैगकाटैगकाटैगकाका/आइसी3/टीजीजीएजीजीजीजीजीजीजीजीटी
एनके-एक्स0 X0-st1, X0-st2, X0-nk3a, X0-nk3b और X0-st4
X0-nk3a ACGGCATAAAGCTTGACGA/iAF647-dT/TACAACAGATC
X0-nk3b ATGGAGCTGTCTAGATCCACTATCG

तालिका 2: SMFRET और EMSA HJ substrates. ओलिगोन्यूक्लिओटाइड्स की सूची जो फ्लोरोसेंट लेबल एचजे को स्मफ्रेट और ईएमएसए के लिए तैयार करने के लिए इस्तेमाल की जाती है। ओलिगो वाणिज्यिक रूप से प्राप्त किए गए थे। फ्लोरोसेंट लेबल ओलिगो एचपीएलसी-शुद्ध थे और जब संभव हो, $ 60 बीपी के ओलिगो को पृष्ठ-शुद्ध किया गया था।

Discussion

इस अध्ययन में, GEN130द्वारा एचजे संकल्प की गतिजता निर्धारित करने के लिए विभिन्न smFRET तकनीकों को लागू किया गया था। इसी प्रकार के स्मफ्रेट दृष्टिकोणों का उपयोग डीएनए प्रतिकृति और मरम्मत फ्लैप एंडोनकलस 142,43,44द्वारा डबल-फ्लैप डीएनए अनुरूपता की आवश्यकता और दरार का पालन करने के लिए किया गया था . यहाँ, इस प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरणों पर चर्चा कर रहे हैं. silanization प्रतिक्रिया आर्द्रता के किसी भी निशान से मुक्त होना चाहिए. PEG हाइड्रोलिसिस से बचने के लिए भंग हो जाने के बाद पेगिलेशन समाधान को सिलनाइज्ड ग्लास पर तेजी से लागू किया जाना चाहिए। मल्टी चैनल प्रवाह सेल में, पड़ोसी चैनलों के बीच रिसाव से बचने के लिए चिपकने वाली शीट में किसी भी फंस हवा को हटाया जाना चाहिए। पीसीए समाधान ताजा तैयार किया जाना चाहिए क्योंकि यह समय के साथ ऑक्सीकरण करता है। 10 N NaOH के अलावा ड्रॉपवार होना चाहिए, बीच में भंवर के साथ. कवरस्लिप में फ्लोरोसेंट पृष्ठभूमि को फ्लोरोसेंट लेबल वाले एचजे को बहने से पहले कम से कम होना चाहिए। प्रवाह कोशिका में इमेजिंग इमेजिंग ब्लीचकिए गए क्षेत्रों से बचने के लिए एक दिशा में किया जाना चाहिए। ALEX प्रयोगों में, लाल लेजर की शक्ति स्वीकारकर्ता की तेजी से विरंजन से बचने के लिए कम किया जाना चाहिए. समय चूक प्रयोगों में, चक्र समय सबसे तेजी से घटना से कम हो गया है.

SmFRET एक संवेदनशील तकनीक है कि जैव आणविक प्रतिक्रियाओं में मूल्यवान वास्तविक समय अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकते है. हालांकि, इस विधि में कई तकनीकी चुनौतियां हैं, जिनमें से जैव रासायनिक प्रतिक्रिया के दौरान FRET में औसत दर्जे का परिवर्तन प्राप्त कर रहा है। यह समय-ट्रैज में हिस्टोग्राम और भेद करने योग्य स्थितियों में अच्छी तरह से अलग विशेषताओं को प्राप्त करने के लिए आवश्यक है। कई मामलों में, smFRET substrates के सावधान डिजाइन की आवश्यकता है, फ्लोरोफोर जोड़े और उनकी स्थिति के चयन, और सब्सट्रेट45में थोड़ा संरचनात्मक परिवर्तन की वजह से डीएनए सब्सट्रेट में FRET परिवर्तन के प्रवर्धन . FRET प्रदर्शन करने के लिए एक और दृष्टिकोण लेबल प्रोटीन46का उपयोग करने के लिए है. FRET में अवलोकन खिड़की ऐसे Cy5 या Alexa Fluor 647 जो दाता की तुलना में अधिक तेजी से ब्लीच करने के लिए जाता है के रूप में स्वीकारकर्ता की स्थिरता द्वारा सीमित है (इस मामले में Cy3). इसलिए, FRET के लिए स्थिर फ्लोरोफोर के लिए एक सतत खोज की आवश्यकता है प्रयोग की अवधि का विस्तार करने के लिए और फ्लोरोसेंट संकेत लम्बा और संकेत करने के लिए शोर अनुपात को अधिकतम करने के लिए ऑक्सीजन अपमार्जन प्रणाली विकसित करने के प्रयासों47,48 .

SmFRET में समस्या निवारण के लिए सुझावों में इस तरह के लेजर शक्ति, जोखिम समय, चक्र समय, और चक्र की संख्या के रूप में इमेजिंग में शामिल कई पैरामीटर संतुलन है फ्लोरोसेंट उत्सर्जन को अधिकतम करने के लिए, प्रयोग की अवधि को लम्बा, और प्राप्त एंजाइम गतिशीलता के लिए उपयुक्त नमूना अंतराल. लंबे समय तक अवलोकन समय और photobleaching से कम से कम प्रभाव उच्च निष्ठा एंजाइम गतिशीलता का प्रतिनिधित्व करते हैं कि समय वितरण निवास प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. ALEX बेहतर हिस्टोग्राम उत्पन्न करता है क्योंकि इस विधि को एकल-रंग FRET की तुलना में photobleached कणों से कम योगदान के अधीन है। हालांकि, ALEX में अस्थायी संकल्प एकल रंग FRET में उस से कम है.

अंत में, वास्तविक समय में अलग-अलग अणुओं में संरचना/संरचनात्मक परिवर्तनों का पता लगाने पर smFRET का जोर उच्च रिज़ॉल्यूशन संरचनात्मक तकनीकों (यानी, एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी, परमाणु चुंबकीय अनुनाद, इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी) के बीच का अंतर है। जो स्थिर परिस्थितियों और थोक तरीकों कि एक औसत दर्जे का संपत्ति की टुकड़ी औसत उपज के तहत परमाणु संकल्प संरचनात्मक विवरण प्रदान करता है. कई पहलुओं में, smFRET वास्तविक समय में जैविक प्रणालियों के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली तकनीक साबित हो गया है.

Disclosures

लेखक कोई प्रतिस्पर्धी वित्तीय हितों की घोषणा करते हैं.

Acknowledgments

इस काम के मुख्य वित्त पोषण और प्रतियोगी अनुसंधान पुरस्कार (CRG3) के माध्यम से विज्ञान और प्रौद्योगिकी के शाह अब्दुल्ला विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था एस एम एच.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) Sigma-Aldrich 238813
0.1 M sodium bicarbonate buffer Fisher 144-55-8
10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel Thermo Fisher Scientific EC6275BOX
100 X TIRF objective Olympus NAPO 1.49
3,4-dihroxybenzoic acid (PCA) Sigma-Aldrich P5630
3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich 741442
6% Novex Tris-Borate-EDTA gel Thermo Fisher Scientific EC6265BOX
Adhesive sheet Grace bio-labs SA-S-1L
Benchtop refrigerated centrifuge Eppendorf Z605212
Biotin-PEG Laysan Bio Biotin-PEG-SVA 5000
Bovine Serum Albumin (BSA) New England Biolabs B9001S
Calcium Chloride Dihydrate Sigma-Aldrich 31307
cation exchange column GE healthcare MonoS (4.6/100)
Cell distruptor Constant Cell Disruption System TS5/40/CE/GA
Coomassie Brilliant Blue MP Biomedicals 808274
Cy3 emission filter Chroma HQ600/40M-25
Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter Chroma HQ700/40M-25
Dichroic for DV2 filter cube Photometrics 630dcxr-18x26
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0861
Drill Dremel 200-1/21
Electronic cutter Copam CP-2500
EMCCD camera Hamamatsu C9100-13
Epoxy glue Devcon 14250
FPLC Aktapurifier UPC 10 GE Healthcare 28406268
GelQuant.NET software biochemlabsolutions.com Version 1.8.2
GEN1 entry vector Harvard plasmid repository HSCD00399935
Glycerol Sigma Life Science G5516
green laser (emission 532 nm) Coherent Compass 315M-100
Heparin column GE healthcare HiTrap Heparin column
HEPES BDH BDH4162
Image splitter Photometrics Dualview (DV2)
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Inverted microscope Olympus IX81
Isopropyl-ß-D-thiogalactoside (IPTG) Goldbio. 12481C100
Laser scanner GE healthcare Typhoon Trio
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500
Long pass 532nm filter Semrock LPD02-532RU-25
Magnesium Chloride Sigma Life Science M8266
mPEG Laysan Bio mPEG-SVA 5000
Neutravidin Pierce 31000
Ni-NTA column GE healthcare HisTrap FF
NuPAGE 10% Bis-Tris gels Novex Life technologies NP0301BOX
NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific NP0302PK2
Origin software OriginLab Corporation Version 8.5
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Alexis Biochemicals 270-184-G025
Phosphate-buffered saline GIBCO 14190
Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm) Fisher (Becton Dickinson) 427416
Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD) Sigma-Aldrich P8279-25UN
Quad-band dichroic Chroma Inc Z405/488/532/640rpc
red laser (emission 640 nm) Coherent Cube 640 100C
Sodium Chloride Fisher Chemical S271
Sorvall RC-6 plus centrifuge Thermo Fisher Scientific 46910
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Nanodrop 2000
Syringe pump Harvard Apparatus 70-3007
Teflon tweezers Rubis K35A
Tris Base Promega H5135
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-90K
Ultrafiltration membrane Millipore UFC90300

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References

  1. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  2. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  3. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  6. Walter, N. G., Huang, C. Y., Manzo, A. J., Sobhy, M. A. Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit. Nature Methods. 5 (6), 475-489 (2008).
  7. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
  8. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Methods in Enzymology. 361, 1-33 (2003).
  9. Kim, H. D., et al. Mg2+-dependent conformational change of RNA studied by fluorescence correlation and FRET on immobilized single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (7), 4284-4289 (2002).
  10. Lee, T. H., et al. Measuring the folding transition time of single RNA molecules. Biophysical Journal. 92 (9), 3275-3283 (2007).
  11. Holliday, R. Mechanism for Gene Conversion in Fungi. Genetical Research. 5 (2), 282-304 (1964).
  12. West, S. C., et al. The Formation and Resolution of Holliday Junctions during the Recombinational Repair of DNA Damages. Journal of Cellular Biochemistry. , 269-269 (1995).
  13. Cox, M. M., et al. The importance of repairing stalled replication forks. Nature. 404 (6773), 37-41 (2000).
  14. West, S. C. Molecular views of recombination proteins and their control. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (6), 435-445 (2003).
  15. Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction, and its resolution. Cell. 55 (1), 79-89 (1988).
  16. Clegg, R. M., et al. Fluorescence resonance energy transfer analysis of the structure of the four-way DNA junction. Biochemistry. 31 (20), 4846-4856 (1992).
  17. McKinney, S. A., Declais, A. C., Lilley, D. M., Ha, T. Structural dynamics of individual Holliday junctions. Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2003).
  18. Joo, C., McKinney, S. A., Lilley, D. M., Ha, T. Exploring rare conformational species and ionic effects in DNA Holliday junctions using single-molecule spectroscopy. Journal of Molecular Biology. 341 (3), 739-751 (2004).
  19. Hyeon, C., Lee, J., Yoon, J., Hohng, S., Thirumalai, D. Hidden complexity in the isomerization dynamics of Holliday junctions. Nature Chemistry. 4 (11), 907-914 (2012).
  20. Ip, S. C., et al. Identification of Holliday junction resolvases from humans and yeast. Nature. 456 (7220), 357-361 (2008).
  21. Rass, U., et al. Mechanism of Holliday junction resolution by the human GEN1 protein. Genes & Development. 24 (14), 1559-1569 (2010).
  22. Liu, Y., et al. Crystal Structure of a Eukaryotic GEN1 Resolving Enzyme Bound to DNA. Cell Reports. 13 (11), 2565-2575 (2015).
  23. Chan, Y. W., West, S. GEN1 promotes Holliday junction resolution by a coordinated nick and counter-nick mechanism. Nucleic Acids Research. 43 (22), 10882-10892 (2015).
  24. van Gool, A. J., Hajibagheri, N. M., Stasiak, A., West, S. C. Assembly of the Escherichia coli RuvABC resolvasome directs the orientation of holliday junction resolution. Genes & Development. 13 (14), 1861-1870 (1999).
  25. Lee, S. H., et al. Human Holliday junction resolvase GEN1 uses a chromodomain for efficient DNA recognition and cleavage. eLife. 4, (2015).
  26. Chan, Y. W., West, S. C. Spatial control of the GEN1 Holliday junction resolvase ensures genome stability. Nature Communications. 5, 4844 (2014).
  27. Liu, Y., Freeman, A. D., Declais, A. C., Lilley, D. M. J. A monovalent ion in the DNA binding interface of the eukaryotic junction-resolving enzyme GEN1. Nucleic Acids Research. 46 (20), 11089-11098 (2018).
  28. Zhou, R., et al. Junction resolving enzymes use multivalency to keep the Holliday junction dynamic. Nature Chemical Biology. 15 (3), 269-275 (2019).
  29. Bellendir, S. P., et al. Substrate preference of Gen endonucleases highlights the importance of branched structures as DNA damage repair intermediates. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5333-5348 (2017).
  30. Sobhy, M. A., et al. Resolution of the Holliday junction recombination intermediate by human GEN1 at the single-molecule level. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1935-1949 (2019).
  31. Sobhy, M. A., et al. Versatile single-molecule multi-color excitation and detection fluorescence set-up for studying biomolecular dynamics. Review of Scientific Instruments. 82 (11), 113702 (2011).
  32. Kapanidis, A. N., et al. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).
  33. Lee, N. K., et al. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).
  34. Rashid, F., et al. Initial state of DNA-Dye complex sets the stage for protein induced fluorescence modulation. Nature Communications. 10 (1), 2104 (2019).
  35. Sambrook, J., Russell, D. W. Standard ethanol precipitation of DNA in microcentrifuge tubes. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  36. Holden, S. J., et al. Defining the limits of single-molecule FRET resolution in TIRF microscopy. Biophysical Journal. 99 (9), 3102-3111 (2010).
  37. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L. Jr, Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: a Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  38. Kou, S. C., Cherayil, B. J., Min, W., English, B. P., Xie, X. S. Single-molecule Michaelis-Menten equations. Journal of Physical Chemistry B. 109 (41), 19068-19081 (2005).
  39. Clegg, R. M., Murchie, A. I., Lilley, D. M. The solution structure of the four-way DNA junction at low-salt conditions: a fluorescence resonance energy transfer analysis. Biophysical Journal. 66 (1), 99-109 (1994).
  40. Pohler, J. R., Duckett, D. R., Lilley, D. M. Structure of four-way DNA junctions containing a nick in one strand. Journal of Molecular Biology. 238 (1), 62-74 (1994).
  41. Fogg, J. M., Lilley, D. M. Ensuring productive resolution by the junction-resolving enzyme RuvC: large enhancement of the second-strand cleavage rate. Biochemistry. 39 (51), 16125-16134 (2000).
  42. Sobhy, M. A., Joudeh, L. I., Huang, X., Takahashi, M., Hamdan, S. M. Sequential and multistep substrate interrogation provides the scaffold for specificity in human flap endonuclease 1. Cell Reports. 3 (6), 1785-1794 (2013).
  43. Rashid, F., et al. Single-molecule FRET unveils induced-fit mechanism for substrate selectivity in flap endonuclease 1. eLife. 6, e21884 (2017).
  44. Zaher, M. S., et al. Missed cleavage opportunities by FEN1 lead to Okazaki fragment maturation via the long-flap pathway. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2956-2974 (2018).
  45. Didenko, V. V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. BioTechniques. 31 (5), 1106-1116 (2001).
  46. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
  47. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  48. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).

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जेनेटिक्स अंक 151 हॉलीडे जंक्शन एकल अणु FRET समजात पुनर्संयोजन 5' न्यूक्लेस अंतराल एंडोन्यूलेस I GEN1 होलिडे जंक्शन resolvases
GEN1 द्वारा Holliday जंक्शन संकल्प की वास्तविक समय जांच के लिए एकल अणु F$rster अनुनाद ऊर्जा हस्तांतरण तरीके
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