Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Single-molekylet Förster resonans energi overføring metoder for Real-Time gransking av Holliday Junction oppløsning av GEN1

Published: September 18, 2019 doi: 10.3791/60045
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1Laboratory of DNA Replication and Recombination, Biological and Environmental Sciences and Engineering Division (BESE), King Abdullah University of Science and Technology (KAUST)
* These authors contributed equally

Summary

Presentert her er en protokoll for å utføre enkelt-molekyl Förster resonans energi overføring til å studere HJ oppløsning. To fargers vekslende eksitasjon brukes til å bestemme dissosiasjon konstanter. Single-Color tid forfalle smFRET blir deretter brukt i sanntid kløft analyser for å få bo tids fordelingen før HJ oppløsning.

Abstract

Bulk metoder måle ensemble atferden til molekyler, der enkelte reaksjons rater av de underliggende trinnene er gjennomsnitt i hele befolkningen. Single-molekylet Förster resonans energi overføring (smFRET) gir en innspilling av conformational endringene som skjer ved individuelle molekyler i sanntid. Derfor er smFRET kraftig i å måle strukturelle endringer i enzymet eller substrat under binding og katalyse. Dette arbeidet presenterer en protokoll for single-molekylet Imaging av samspillet av en fire-veis Holliday Junction (HJ) og gap endonuclease jeg (GEN1), en cytosolic homologe rekombinasjon enzym. Også presentert er single-farge og to-farge alternerende eksitasjon (ALEX) smFRET eksperimentelle protokoller for å følge oppløsningen av HJ av GEN1 i sanntid. Den Kinetics av GEN1 dimerization bestemmes på HJ, som har blitt foreslått å spille en nøkkelrolle i oppløsningen av HJ og har vært unnvikende til nå. Teknikkene beskrevet her kan bli mye brukt for å få verdifull mekanistisk innsikt i mange enzym-DNA-systemer.

Introduction

Enkelt molekyl metoder basert på fluorescens deteksjon gir høy signal-til-støy-forhold1. Bånd er en spektroskopiske teknikk som kan måle avstander i området 1-10 NM, rendering denne teknikken som en molekylær linjal for å måle avstander i nanometer området2,3. Acceptor absorpsjons spektrum har en delvis Spectral overlapping med giverens utslipps spektrum på den kortere bølgelengde enden. BÅND er formidlet av stråling-mindre energi overføring mellom en donor og Acceptor par, mens effektiviteten av energi overføring er avhengig av avstand og orientering av Acceptor4.

Det er iverksatt flere tilnærminger for å minimere bakgrunnen og forbedre deteksjons effektiviteten til fluorescens signal5,6. En tilnærming er konfokalmikroskopi mikroskopi, der en pinhole begrenser eksitasjon stedet til en størrelse under Diffraksjon grensen7. En annen tilnærming er total intern refleksjon fluorescens (TIRF), som er et bredt felt belysning teknikk der lyset er rettet off-aksen over en kritisk vinkel8. Lyset er så helt internt reflektert i grensesnittet mellom glass og vandig løsning, genererer en evanescent bølge som bare lyser opp fluorophores festet til glassflaten og hindrer bakgrunn fra fluorophores i resten av løsningen.

I konfokalmikroskopi mikroskopi kan molekylene enten fritt spre eller flate immobilisert. Den oppnådde timelige resolusjonen kan være innenfor mikrosekunder til flere millisekunder9. Konfokalmikroskopi deteksjon for et enkelt molekyl er utført av single-Foton skred diode (SPAD) og punkt-for-punktskanning av regionen av interesse10. I TIRF, en tid-serie av noen få hundre molekyler immobilisert på overflaten er registrert av en posisjon-følsom to-dimensjonal ladning kombinert detektor (CCD). CCD forsterker fluorescens signalet enten ved intensivert fosfor skjerm og MicroChannel plate eller on-chip multiplikasjon av photoelectrons (EMCCD). Den timelige oppløsningen er avhengig av avlesning hastighet og Quantum effektiviteten av CCD og vanligvis på rekkefølgen av få titalls millisekunder6.

HJ er en sentral mellomliggende i DNA reparasjon og rekombinasjon11,12,13,14. HJ har to kontinuerlige og to krysset tråder som kobler mellom den kontinuerlige tråder uten kryssende hverandre. HJ eksisterer i løsningen som X-stablet conformers, som gjennomgår kontinuerlig isomerization av den kontinuerlige tråder blir krysset og krysset trådene blir kontinuerlig i den andre conformer15. Isomer preferanse for HJ er avhengig av kjernen sekvens og ioniske miljø og har blitt grundig studert av bånd16,17,18,19.

GEN120 er en monomere protein i løsning21 og krever DIMERIZATION å Cleave den HJ, og dermed gir riktig separasjon av saman tråder22,23. Den stabling conformer preferanse for HJ påvirker utfallet av genetisk rekombinasjon ved å sette retningen av oppløsningen ved HJ resolvases24. Forstå hvordan GEN1 binder HJ, koordinerer de to snittene, og sikrer sin fulle oppløsning har alle vært under intensiv studie21,22,23,25,26 ,27,28,29,30.

I denne studien brukes en objektiv basert TIRF-oppsett som beskrevet tidligere31. To-farge alternerende eksitasjon (ALEX) er brukt for å bestemme conformational endringer på samspillet av GEN1 med fluoroforen merket HJ. ALEX produserer 2D histogrammer basert på to ratiometrisk parametre bånd effektivitet E, som er donor-Acceptor avstand avhengig, og støkiometri parameteren S, som måler donor-Acceptor støkiometri32. ALEX gjør det mulig å sortere fluorescerende arter basert på stoichiometries til fluorophores, inkludert bare giver, Acceptor og blandede subpopulasjoner. ALEX kan forlenge bruken av bånd til hele spekteret og kan oppdage forskjeller i fluoroforen lysstyrke og oligomerisering samt overvåke Makromolekyl-ligand interaksjoner33.

Det er funnet at GEN1 konsekvent lykkes i å løse HJ i løpet av levetiden til GEN1-HJ kompleks. De tidsavhengige conformational endringene er avledet fra tids sporene til enkelte molekyler, mens histogrammer representerer fordelingen av de underliggende populasjoner. Bruke time-lapse single-Color bånd, rask på priser og langsom off-priser for GEN1 dimer er demonstrert, noe som øker affinitet av de monterte GEN1 dimer ved første snitt produktet.

Protocol

1. utarbeidelse av overflate-funksjonalisert coverslips

  1. Rengjøring
    1. Plasser fem coverslips (24 mm x 60 mm) i etanol inne i en Coplin krukke. Sonikere i etanol deretter i 1 M kalium i 30 minutter for 3x. Vask i aceton 3x deretter Dekanter.
  2. Silanisering
    1. Forbered en løsning på 2,8% 3-aminopropyltrietoksysilan (APTES) i aceton. Forsegle APTES flasken med en para fin film og oppbevares ved 4 ° c.
      Merk: Bruk vernebriller og arbeid under en avtrekksvifte. Beholderen av silan løsningen skal være helt tørr og skylles av aceton umiddelbart før og etter helle den silan løsningen inn i glasset.
    2. Hell 70 mL av 2,8% APTES-oppløsningen i Coplin-glasset som inneholder coverslips. Rist glasset for 4 min i en orbital shaker.
    3. La glasset stå på benken i 5 min, sonikere i 1 min, og til slutt holde glasset på benken for en annen 10 min for silan å reagere med hydroksyl grupper på glassoverflaten.
    4. Slukke reaksjonen ved tilsetning av 1 L av deionisert vann ved å helle vann direkte inn i glasset for rask løsemiddel utveksling. Skyll lysbildene 3x i vann ved å riste den sidelengs av glasset på et flatt underlag.
    5. Ta coverslips ut av glasset og legg dem på en aluminiumsfolie skuff. Stek coverslips i en ovn ved 110 ° c i 30 min for å tørke coverslips og kurere silan. La skuffen stå på benken for at coverslips skal avkjøles til romtemperatur.
  3. PEGylation
    1. Varm opp biotinylated PEG og PEG, lagret ved-20 ° c til romtemperatur (RT) for å hindre kondens av fuktighet ved åpning av beholderen.
    2. Plasser fem coverslips med silanized overflate vendt opp på en eske. Plasser to dekkglass slips (22 mm x 22 mm) som avstandsstykker langs kantene av silanized coverslips.
    3. Når varmet opp, lage biotinylated PEG og PEG løsninger i forholdet ~ 1:100 i 1 mL frisk, 0,1 M natrium bikarbonat løsning ved å legge 1,5 mg biotinylated PEG og 150 mg av PEG til en 1,5 mL tube.
    4. Vortex røret for å oppløse PEG og spinne ned for å fjerne luftbobler.
      Merk: å gå videre fra dette trinnet, være rask, fordi PEG hydrolyzes i løsning innenfor en tidsskala på min.
    5. Påfør raskt 100 μL av PEG-løsningen på hver dekkglass. Ta en annen bakt dekkglass og plasser den øvre silanized overflaten med forsiden ned på toppen av dekkglass med PEG-løsningen, derav danner en glass-løsning-glass sandwich der 22 mm x 22 mm ikke-silanized coverslips la de to funksjonalisert coverslips til skilles lett.
    6. Ruge coverslips over natten (16 timer) i mørket og på RT. Når inkubasjons er ferdig, ta coverslips fra hverandre, og skyll deretter 10x med deionisert vann ved å vaske fra siden med en sprut flaske.
    7. Tørk av coverslips under en strøm av tørr nitrogen. Oppbevar den tørre coverslips under vakuum.
      Merk: lysbildene kan brukes i 1 måned uten nedbrytning av kvalitet.

2. utarbeidelse av strømningscelle

  1. Flytcelle med én kanal
    1. Bor to hull med 1,22 mm diameter i den midtre delen av et kvarts lysbilde (50 mm x 20 mm) med sentrene som ligger 37 mm fra hverandre og 6,5 mm fra kanten av raset (figur 1a).
    2. Skjær ut en 41 mm x 2,25 mm-kanal i en 50 mm x 20 mm del av et dobbelt-selvklebende ark ved hjelp av en elektronisk kutter.
    3. Skrell av plast siden av beskyttelsesdekselet og Juster kantene på stykket med kantene på kvarts lysbildet. Fjern innestengte luftbobler ved å trykke forsiktig med et par polytetrafluoretylen pinsett.
    4. Trekk av papiret siden av limet stykke. Monter arb på den funksjonalisert overflaten på dekkglass.
    5. Skjær polyetylen slange (ID 1,22 mm) i en lengde på 11 cm for innløpet og 25 cm for uttaket. Sett røret inn i tidligere boret hull som innløp og utløp for strømningscellen.
    6. Bruk 5 min epoxy lim til å forsegle rundt kantene av kvarts-dekkglass grensesnitt og rundt rørene for innløp og utløp.
    7. Bruk strømningscellen umiddelbart når den tørker eller oppbevares under tørr vakuum for senere bruk.
    8. Løs opp avidin i PBS til en konsentrasjon på 0,03 mg/mL. Filtrer gjennom sprøyte filter på 0,2 μm.
    9. Flow avidin inn i strømningscellen ved hjelp av en 1 mL sprøyte. Bruk en annen sprøyte fylt med buffer for å vaske ut overflødig avidin. Vær forsiktig så du ikke innfører luftbobler under bytte av sprøyter.
  2. Flytcelle med flere kanaler
    1. Bor seks hull med en diameter på 1,22 mm på hver av de lange sidene av et kvarts lysbilde (76 mm x 25 mm) (figur 1B). Gjør hullene 4,5 mm fra kanten av lysbildet og 9,3 mm fra hverandre. Sørg for at avstanden mellom sentrene i hvert hull par er 15 mm.
    2. Klipp ut seks kanaler (20 mm x 2,25 mm) i et 76 mm x 25 mm stykke dobbel tape ved hjelp av den elektroniske kniven.
    3. Skrell av plast siden av beskyttelsesdekselet og Juster kantene på limet med kantene på kvarts lysbildet. Fjern eventuelle inneluft bobler ved å trykke forsiktig ved hjelp av et par polytetrafluoretylen pinsett.
    4. Trekk av papiret siden av limet stykke og Monter på funksjonalisert overflate av dekkglass.
      Merk: noen ganger peeling av papiret side og feste til kvarts Slide fungerer godt i flerkanals strømningscelle.
    5. Skjær innløps rørene (11 cm) og utløpsrørene (25 cm) for de seks kanalene. Klargjør strømningscellen som beskrevet i trinn 2.1.6 – 2.1.9.
    6. Koble utløpet av den første kanalen til pumpen. Plasser innløpet i 0,5 mL rør med OSS.
      Merk: lengden på innløpsrøret er valgt for å maksimere antall hendelser i kløften som utføres under kontinuerlig strømning ved å synkronisere tiden for enzym inngang til strømningscellen og starten på bildebehandling og dermed redusere for tidlig photobleaching av fluorophores.
    7. Flytt til en ny kanal ved å koble fra uttaket på den brukte kanalen. Lukk stikkontakten med en plugg laget av en sprøyte nål forseglet med lim i plastdelen. Steng innløpet til den brukte kanalen.

3. utarbeidelse av oksygen rensing system (OSS)

  1. Oppløse 0,2 g av (±) -6-AHA-2, 5, 7, 8-tetramethylchromane-2-kar bok syls acid (Triplet State tørste som minimerer blinking av fluorophores) i 800 μL av metanol.
  2. Tilsett 6 mL deionisert H2O og tilsett 1 N NaOH dråpevis til den oppløses. Filtrer gjennom et sprøyte filter, gjør i 1 mL alikvoter og oppbevar ved-80 ° c. Lager konsentrasjonen er ~ 100 μM.
  3. Forbered en frisk løsning av 3, 4-dihroxybenzoic acid (PCA) ved oppløsning 61 mg av PCA pulver i 4 mL ddH2O. Lager konsentrasjonen er ~ 100 nM.
  4. Tilsett 58 μL av 10 N NaOH-dråpevis, og pass på å Vortex etter hver dråpe til PCA er fullstendig oppløst (pH = 9).
  5. Løs opp 5,3 mg protocatechuate 3, 4-dioxygenase (3, 4-PCD) i 7 mL PCD lagrings buffer (tabell 1). 3, 4-PCD fjerner oksygen fra bindingen/kløften buffere ved katalyserende oksidasjon av protocatechuic acid34.
  6. Del opp PCD-oppløsningen i 1 mL alikvoter. Lager konsentrasjonen er ~ 1 μM. fest fryse alikvoter i flytende nitrogen og oppbevar ved-80 ° c for langtidslagring eller ved-20 ° c for kortvarig lagring.
  7. Klargjør en ny bindings buffer (tabell 1). Erstatt 2 mM CaCl2 med 2 mm MgCl2 for smFRET kløft eksperimenter.
  8. Klargjør 1 mL av bilde bufferen (tabell 1). Hold bilde bufferen på isen til den innføres i strømningscellen for å opprettholde aktiviteten i oksygen systemet.

4. utarbeidelse av fluorescensmerkete merket HJs

  1. Rekonstituer lyofilisert oligos (tabell 2) i Tris-EDTA-buffer (tabell 1) til en konsentrasjon på 100 μM.
  2. Forbered det syntetiske krysset ved å blande ekvimolare porsjoner ~ 3 μL av hver av X0 oligos oppført i tabell 1.
  3. Anneal ved oppvarming ved 95 ° c i 5 min etterfulgt av langsom kjøling til RT med en hastighet på 1 ° c/min. Bruk enten en varme blokk eller PCR-thermocycler for å oppnå ønsket kjøle hastighet.
  4. Legg blandingen på 8 cm x 8 cm av 10% Tris-borate-EDTA polyakrylamid gel. Påfør 100 V og kjøre gel for ~ 2 h. Bandene er tydelig sett av øyet, og fargen er lilla.
  5. Avgiftsdirektoratet bandet av glødet substrat med et rent blad. Overfør gel-brikken til en autoklaveres 1,5 mL slange.
  6. Knus gel-brikken i røret med et rent stempel og legg deretter til 100 μL av TE100-buffer (tabell 1).
  7. Pakk HJ ved å riste røret ved 20 ° c ved 1 500 RPM i en thermomixer for ~ 2 h eller ruge over natten ved 4 ° c.
  8. Utfør etanol nedbør på løsningen som inneholder underlaget35.
  9. Resuspend underlaget i 20 μL av TE100 buffer (tabell 1). Den endelige konsentrasjonen er 1–3 ΜM. Alikvot 2 μL i hvert rør og oppbevares ved-20 ° c.

5. protein uttrykk og rensing av GEN1

  1. Konstruere plasmider for uttrykk for avkortet Human GEN11,2,3,4,5 med Hexa histidin-tag på C-Terminus20 av PCR av oppføringen vektoren.
    Merk: N-Terminal merking vil føre til deaktivering av GEN1. Det ustrukturert C-tail gjengir rensing av full lengde GEN1 betydelig hardere. Også full lengde GEN1 ble rapportert å vise mindre aktivitet enn avkortet versjon23.
  2. Forvandle uttrykket vektor til E. COLI BL21-CodonPlus (DE3)-Ripl belastning.
  3. Vaksinere de forvandlet cellene i to 6 L flasker hver inneholder 2 L av Luria buljong medier ved 37 ° c med risting ved 180 RPM til en OD600 på 0,8 er nådd.
  4. Kjøl ned kulturen til 16 ° c og indusere GEN1 uttrykk med 0,1 mM isopropylalkohol-β-d-thiogalactopyranoside (IPTH) for 48 h.
  5. Høste cellene ved å spinne dem ned ved 4 ° c ved 1000 x g i en sentrifuge. Hver liter kultur gir 5–6 g av pellet.
  6. Forkast supernatanten og resuspend de pelleted cellene i lyseringsbuffer (tabell 1) ved hjelp av 4 ml/g av celler.
  7. Utfør cellelyse med en celle disruptor ved 30 kPsi, og snurr deretter ned ved 10 000 x g for 1 t ved 4 ° c. Samle supernatanten og Filtrer den på isen ved hjelp av 0,45 μm filtre.
  8. Utfør protein rensing ved hjelp av FPLC ved å sende Filtrer gjennom en 5 mL ni-NTA kolonne på 2,5 ml/min strømningshastighet ved hjelp av buffer A (tabell 1).
  9. Vask med 15 Kol onne volumer (CV). Eluere med en lineær gradering av buffer A og 500 mM Imidazole over 20 CV i 5 mL fraksjoner. GEN1 elutes fra kolonnen på rundt 100 mM Imidazole.
  10. Pipetter 10 μL alikvoter fra de innsamlede fraksjoner, tilsett like volum av 2x SDS lasting fargestoff til hver alikvot. Denaturere prøvene ved oppvarming ved 90 ° c i 5 min, kjølig, og snurr ned prøvene.
  11. Legg prøvene på 10% BIS-Tris gel. Kjør gel for 30-45 min på 200 V. stain bruke Coomassie brilliant Blue, deretter destain. Samle fraksjoner som inneholder renset GEN1.
  12. Reduser salt konsentrasjonen av de kombinerte fraksjonene til 100 mM ved fortynning ved hjelp av buffer C (tabell 1).
  13. Gi det lave salt proteinet gjennom en 5 mL heparin-kolonne med en strømningshastighet på 3 mL/min ved hjelp av buffer B (tabell 1).
  14. Vask med 10 CV. Eluere med en gradering på 20 CV med buffer B og 1 M NaCl. Samle 5 mL fraksjoner der GEN1 elutes rundt 360 mM NaCl.
  15. Sjekk eluert fraksjoner for renset GEN1 fraksjoner som beskrevet i trinn 5,8. Kombiner de fraksjoner og fortynne til 100 mM NaCl bruker buffer C.
  16. Legg det lavere salt proteinet på en spalte søyle med 1 mL/min strømningshastighet ved hjelp av buffer B.
  17. Eluere med en gradering på 40 CV ved hjelp av buffer B og 1 M NaCl. Samle 1,7 mL fraksjoner der GEN1 elutes rundt 300 mM NaCl.
  18. Se etter renheten på GEN1 i eluert fraksjoner som beskrevet i trinn 5,8.
  19. Kombiner de reneste fraksjonene og dialyze ved 4 ° c mot lagrings buffer (tabell 1). Utfør minst én utveksling av bufferen under dialyse.
  20. Mål protein konsentrasjonen ~ 0,5–1 mg/ml. Alikvot det dialyzed proteinet i 10–15 μL volumer i små rør, blits frysing i flytende nitrogen og oppbevares ved-80 ° c.

sjette single-molekyl bånd eksperimenter

Merk: smFRET-eksperimentene utføres på en spesialbygd mål BAS ert TIRF-oppsett (figur 1C) som er beskrevet tidligere31.

  1. Enkelt-fargebånd eksperimenter
    1. Påfør en dråpe nedsenking olje på den 100 TIRF målsettingen. Sett EMCCD til passende gevinst for å optimalisere signalet til bakgrunnen og forhindre metning.
      Merk: ikke se rett inn i laserstrålen og Bruk vernebriller når du justerer laseren.
    2. Sett strømningscellen forsiktig på prøveholderen. Gradvis heve målet ved hjelp av grov justering til oljen berører dekkglass.
    3. Skru på den grønne laseren (532 nm). Bytt til fin justeringsmodus for målsettingen. Direkte utslipp til kamera porten for å observere bildet på skjermen.
    4. Juster høyden på målsettingen til den funksjonalisert overflaten på dekkglass er i fokus og kan observeres på monitoren.
      Merk: bildet oppkjøpet av EMCCD utløser laser eksitasjon via akustiske-optikk tunable filter (AOTF) for å hindre prøve photobleaching når bildene ikke er ervervet.
    5. Kontroller at bakgrunnen fra funksjonalisert overflate av coverslips ikke overstiger noen flekker før de flyter i fluorescensmerkete merket HJ.
    6. Fortynne lager underlaget ca 1000 ganger i TE100 buffer (tabell 1) til en endelig konsentrasjon på 1-5 nM. Pipetter 0,2 – 0,5 μL av fortynnet substrat i 120, μL av bilde bufferen med OSS inn i et 0,5 mL rør.
    7. Koble utløpet av strømningscellen til sprøyte pumpen. Sett innløpsrøret på strømningscellen inn i 1,5 mL røret og betjen sprøyte pumpen med en strømningshastighet på 30 – 50 μL/min for å trekke oppløsningen ut av slangen.
    8. Kontroller ofte overflaten for god dekning (100 – 300 av homogenously fordelt, godt plassert substrat) ved å avbilde en kort stund med den grønne laseren.
    9. Hvis overflaten dekningen er fortsatt ikke nok enten vente i noen minutter for fluorescensmerkete merket HJ fra løsningen for å bosette seg på overflaten eller gjenta rennende trinn.
    10. Flow annen 120 μL av bilde buffer (tabell 1) ved 30 – 50 μL/min for å vaske ubundet FLUORESCENSMERKETE merket HJ. La deretter strømningscellen sitte i 5 minutter for å tillate OSS å tømme oppløst oksygen. Photobleaching av fluorophores bør være minimal ved starten av bildebehandling.
    11. Angi eksponeringstid (~ 60 MS), syklusen tid vil automatisk bli satt av programvare basert på hastigheten på dataoverføring (~ 104 MS), og angi ønsket antall sykluser eller rammer (~ 400). Utslippet fra donor (Cy3) og Acceptor (Alexa fluor 647) er delt inn i to fargekanaler av en bilde splitter enhet.
    12. Finn et passende område på overflaten, Fokuser bildet ved å justere høyden på målsettingen og ta opp og lagre filmen i 16-biters TIFF-format.
    13. Flytte til et nytt område.
      Merk: Flytt alltid i én retning (dvs. fra utløp til innløp) for å unngå bildebehandling i det samme området to ganger.
    14. Forbered 1, 2, 5, 10, 25, 50, 75 og 100 nM GEN1 i 120 μL av bilde buffer én om gangen. Flyt oppløsningen med en strømningshastighet på 30-50 μL/min.
      Merk: Hvis den nødvendige målingen er gjort under steady state som i bindingen av HJ ved GEN1 eller isomerization av gratis HJ, deretter vente 3-5 min etter flyten stopper å spille inn filmen. Skaff tre til fire filmer fra nye områder for hver GEN1 konsentrasjon.
    15. Hvis målingen utføres under kontinuerlig flyt som i kløft av HJ av GEN1 deretter starte innspillingen 5-10 s før inngangen av GEN1 inn i strømningscelle. Gjenta målingen ved å flytte til en ny kanal i flyt cellen med seks kanaler.
    16. På slutten, bruk en fast fluorescerende perle lysbilde for å kartlegge donor og Acceptor partikler til hverandre i bildet splitting enheten.
    17. Tilsett 0,2 μL av 1 μm diameter fluorescerende perler i 500 μL av 1 M Tris (pH = 8,0) for at perlene skal holde seg til overflaten.
    18. Klipp en firkant (18 mm x 18 mm) i en 22 mm x 22 mm del av en dobbeltsidig lim forsegling. Skrell av og stikk stykket til midten av en 76 mm x 25 mm kvarts Slide.
    19. Plasser 50 μL av fortynnet perler oppløsning og la i 5 – 10 min å bosette seg. Fest en 22 mm x 22 mm dekkglass på toppen av den firkantede brikken. Tørr overflødig perler løsning med vev, deretter forsegle kammeret med epoxy lim.
    20. Tilegne 100 rammer av perlene lysbildet på en 60 MS eksponeringstid.
      FORSIKTIG: Senk laser strømmen og EMCCD gevinsten til minimum for å unngå metning av detektoren.
    21. Installer programvarepakken (f. eks, TwoTones) og åpne filmene deri som angitt i bruksanvisningen36. Velg posisjonene til de enkelte perlene i donor-og Acceptor-kanalene. Generer en transformerings matrise som beskrevet i håndboken.
      Merk: denne programvaren bruker transformasjon matrise å matche posisjonene til partiklene i donor og Acceptor kanaler og riktig for noen liten forskyvning i bildet splitting enheten.
    22. Gå til fil, trykk Load Movie, Velg deretter filmfilen og trykk Åpne. I fil menyen, trykk Load TFORM og velg transformasjon matrise generert fra perlene lysbildet. Juster terskelen for giver-og Acceptor kanaler til ingen falske positiver er inkludert.
    23. I kanal filter menyen velger du D & & A for å velge for partikler merket med både giver og Acceptor. Sjekk nærmeste nabo grense feltet for å utelukke molekyler som er svært nær hverandre. Sjekk Max ellipticity å utelukke svært eksentriske molekyler og sjekk bredde grenser for å utelukke svært brede eller svært smale molekyler.
    24. Skriv inn plotHistCW som beskrevet i TWOTONES manual for å konstruere histogrammer.
      Merk: den "tilsynelatende" bånd effektivitet er beregnet av programmet ved å dele utslipp av Acceptor av de totale utslippene fra donor og Acceptor. TWOTONES bruker 100 intervaller for å hylle fordelingen av statene i molekylene mot bånd effektivitet.
    25. Type plotTimetraceCW som instruert i TWOTONES manualen til å generere tid-spor for hvert molekyl.
      Merk: time-spor kan bli ytterligere analysert av vbFRET37 å identifisere ulike bånd stater, deres respektive bo tider, og overgangen priser mellom ulike stater.
  2. To-farge alternerende eksitasjon bånd (ALEX) eksperimenter
    1. Spille inn en film bestående av påfølgende rammer av donor og Acceptor utslipp av direkte excitations med grønne og røde lasere, henholdsvis hver ~ 80 MS i varighet.
    2. Åpne de kjøpte ALEX-filmene i TWOTONES. Angi passende deteksjons terskel som ~ 300 for de tre kanalene: giver utslipp på grunn av giver eksitasjon (DexDem); Acceptor utslipp på grunn av donor eksitasjon (DexAem); og Acceptor utslipp på grunn av direkte eksitasjon (AexAem).
    3. Bruk kanal filteret DexDem & & DexAem & & AexAem til å velge for partiklene som har både giver og Acceptor. Koble partiklene ~ 200 – 300 i de tre kanalene.
    4. Bruk plotHistALEX MATLAB-koden til å generere ALEX histogrammer. Passer forskjellige topper i histogrammer til Gaussian funksjoner og bestemme prosentandelen av hver befolkning området under kurven ved hjelp Origin programvare38.
      Merk: toppene i bindingen analysen tilsvarer bundet GEN1-HJ kompleks, mens i den frie HJ, toppene representerer interchanging isomerene.
    5. Bruk plotTimetraceALEX MATLAB-koden for å generere en tid-spor for hvert molekyl viser donor utslipp av direkte eksitasjon, og Acceptor utslipp på grunn av bånd og direkte eksitasjon.
      Merk: ALEX tid-spor uavhengig å vise utslipp av både donor og Acceptor, men ved lavere Temporal oppløsning enn single-Color bånd. I likhet med single-Color bånd, ALEX tid-spor kan bli ytterligere analysert av vbFRET å identifisere ulike bånd stater og deres respektive bo ganger.
    6. Bestem dissosiasjon konstanten ved å tilpasse prosentene av den bundne populasjonen versus GEN1 konsentrasjon til en hyperbolske funksjon.
  3. Time lapse single-fargebånd
    1. Angi eksponeringstiden for den grønne laseren til 60 MS og sykle tid til 624 MS eller lavere, avhengig av hastigheten på den observerte dynamikken.
    2. Sett strømningshastigheten til 110 μL/min i én kanal av strømningscellen med seks kanaler. Start innspillingen kort før inngangen til GEN1 inne i strømningscellen.
      Merk: kontinuerlig flyt fører til rask photobleaching av fluorophores, derfor synkroniserer starten av bildebehandling og protein oppføring maksimerer antall registrerte hendelser. Den optimale sprøyte pumpe målingen avhenger av de døde-volum og den nøyaktige slangen som brukes til å montere strømningscellen; i vårt tilfelle er det ~ 25 μL.
    3. Skaff deg en film av ~ 125 rammer for en total oppkjøps tid på 78 s. På slutten av opptaket, utsett prøven til den røde laseren for 50 rammer hver med 25 MS eksponeringstid å granske Acceptor.
      Merk: denne metoden forlenger observasjons vinduet i kløft eksperiment gjennom å redusere antall eksitasjon sykluser. Kinetic parametere som kpå og kav av dimerization er avledet ved å montere fordelingen til en bi-eksponentiell modell30,38.

7. Elektroforetiske mobilitets Skift analyser (EMSA)

  1. I 50 til μL totalt volum, ruge den ønskede konsentrasjonen av GEN1 med 50 pM Cy5-merket HJ ved RT i 30 min i EMSA bindings buffer (tabell 1).
  2. Last prøvene på 8 cm x 8 cm av 6% Tris-borate-EDTA gel. Kjør gelen bruker 100 V for 1 h + 20 min i 1x TBE buffer på RT.
  3. Bestem prosentandelen av bundet substrat ved en GEN1 konsentrasjon fra sitt relative bidrag til den totale fluorescens intensiteten til de respektive kjørefelt.
    Merk: GEN1 monomer-HJ (band i) er identifisert av avtalen av sin størrelse med picomolar binding av GEN1 monomer til nicked HJ21,30. GEN1-dimer-HJ er tildelt band II på grunn av trinnvis binding av GEN1 monomer til HJ21,23.
  4. Beregn de tilsynelatende bindings konstantene Kd-monomer-app-EMSA og Kd-dimer-app-EMSA ved hjelp av ligningen:
    Equation
    Hvor: Max er konsentrasjonen der de respektive artene nådde sin maksimale binding (monomer eller dimer); n er Hill-koeffisienten; K d-app-EMSA er den åpenbare bindende konstanten til de respektive artene, og betegner KONSENTRASJONEN av GEN1 der halv-maksimum av monomer eller dimer er til stede.

Representative Results

Conformer bias og isomerization av HJ

Den isomerization av HJ har blitt grundig undersøkt av bånd gjennom merking av to tilstøtende armene i krysset17,18,39. Giveren (Cy3) og Acceptor (Alexa fluor 647) er plassert ved de to nabo armene, R (strand 2) og X (strand 3), henholdsvis (figur 2a). De stablet-X isomerene ble tildelt av deres to sammenhengende tråder [dvs. ISO (1, 3) eller ISO (2, 4)]. Den ALEX bånd histogram av tilstøtende-Label X0 viser to topper som tilsvarer interchanging av de mer tallrike ISO (1, 3) (e ~ 0,75) og mindre rikelig ISO (2, 4) (e ~ 0,40) (figur 2b).

Single-fargebånd brukes til å tilegne seg tid-spor for opptak den raske conformational endringer i gratis HJ med høy Temporal oppløsning ~ 10 MS via redusere brukt område av EMCCD2 kameraet. En representativ én fargebånd tid-spor av X0 Junction viser overganger mellom høy og lav bånd isomerene (figur 2b). Den isomerization priser kISO (1, 3)-ISO (2, 4) og kISO (2, 4)-ISO (1, 3) innhentet fra botid histogrammer av ISO (1, 3) og ISO (2, 4) (figur 2C) er i samsvar med de rapporterte tidligere17.

SMFRET demonstrerer aktiv forvrengning av HJ ved GEN1

HJ gjennomgår strukturelle omorganisering ved binding til GEN122. Dermed er avstanden mellom donor og Acceptor lik i både ISO (1, 3) og ISO (2, 4) (figur 3a). Den smFRET bindende analysene ble utført i nærvær av ca2 + for å hindre KLØFT av HJ. BÅND histogrammer av tilstøtende etikett X0 Junction ved ulike GEN1 konsentrasjoner ble kjøpt av Alex (figur 3b). Histogrammet er egnet til to Gaussian funksjoner: en som tilsvarer den frie høy bånd ISO (1, 3), og den andre tilsvarer den bundne GEN1-HJ befolkningen etter subtrahere bidraget av ISO (2, 4) fra den lave bånd peak.

På mette GEN1 konsentrasjon, har bånd histogram av X0 bare en enkelt lav bånd peak tilsvarende GEN1 bundet til enten ISOMER av HJ som spådd av modellen22. Den tilsynelatende monomer dissosiasjon konstanten (Kd-monomer-app) fastsettes ut fra den hyperbolske tilpasningen av prosentandelene av GEN1-bundne befolkning som en funksjon av GEN1-konsentrasjon (figur 3c). Den tilstøtende-Label NK-X0 representerer en enkeltvis NICKED versjon HJ som etterligner produktet etter første snitt reaksjon. På grunn av lindring av stabling stamme av simulert Nick, NK-X0 er en ikke-isomerizing struktur40 som tydelig fra singelen underlaget peak på E ~ 0,40, i motsetning til X0 (figur 3D vs figur 3b). Strukturen i GEN1-NK-X0 kompleks er lik som i GEN1-x0 kompleks, som INDIKERT av likheten i bånd effektivitet (E ~ 0,25 for NK-X0 og 0,32 for X0) (figur 3D vs. Figur 3B). Den sterke bindingen av GEN1 monomer til NK-X0 er demonstrert av den 40-fold lavere Kd-monomer-app verdi enn for X0 (figur 3e vs. figur 3c). Denne stramme bindingen kan fungere som en beskyttelse mekanisme mot ufullstendig oppløsning av HJ i det usannsynlige tilfelle av dissosiasjon av GEN1 dimer eller en av dens monomerer.

Trinnvis binding av GEN1 monomer til HJ

Bindingen av GEN1 monomer til HJ etterfulgt av dimer formasjon er en unik funksjon for eukaryote HJ resolvase GEN1 sammenlignet med prokaryote resolvases, som finnes i dimeric form i løsning21,23,41. EMSA av GEN1 på 50 pM X0 viser trinnvis SAMMENSLUTNING av GEN1 i høyere orden komplekser, som indikert av den romerske tall i øvre panel (figur 4a). Den dissosiasjon konstanten til GEN1 monomer bestemt av EMSA (Kd-monomer-EMSA) sammenfaller med dissosiasjon konstanten fra smFRET bindings analysen Kd-monomer-app (figur 4a og figur 3c , henholdsvis). Kvantifisering av band II brukes til å beregne likevekt dissosiasjon konstant av GEN1 dimer (Kd-dimer-EMSA). EMSA av GEN1 på 50 pM NK-X0 demonstrerer fremtredende monomer bindende som indikert av svært lav Kd-monomer-app-EMSA som er 30-fold lavere enn for X0, mens den Kd-dimer-EMSA er sammenlignes med X0 (figur 4b).

Ytterligere bevis for at GEN1 monomer binder og forvrenger HJ er observasjon av et betydelig antall spor av uncleaved partikler med stabil lav bånd tilstand (figur 4c) i nærvær av mg2 + ved lave GEN1 konsentrasjoner. Antallet av disse sporene sank ved å øke GEN1 konsentrasjon. Oppløsningen av HJ er drevet av stram binding av GEN1 monomer, som støtter dimer formasjon. Den monomer binding er observert i tiden-spor av uncleaved NK-X0 i mg2 +, som strekker seg til noen Nanomolar konsentrasjon (figur 4d). Den GEN1 monomer binder tett for å beskytte NK-X0, til slutt sikre full oppløsning gjennom dimer formasjon.

SMFRET oppløsning analysen av HJ

Begrepet "kløft" i smFRET analysene brukes om hverandre med "oppløsning" av HJ, siden i denne analysen bare produktet utgivelse som følger den andre kløften hendelsen oppdages. Hendelsene er registrert av time-lapse single-Color eksitasjon å minimere photobleaching av foto-sensitive Acceptor over oppkjøpet tid på ~ 1,3 min.

Den Skjematisk i figur 5a illustrerer snittene av tråder 1 og 3 av X0 ISO (1, 3) etter binding og forvrengning av GEN1 av en X0 festet til funksjonalisert glass. Både donor og Acceptor gå inn i løsningen som resulterer i tap av sine signaler etter HJ oppløsning. Den første og andre snitt er koblet i NK-X0, som illustrerer en prototype for delvis løst HJ. Ved binding av GEN1, vedtar NK-X0 en lignende struktur til X0. Oppløsningen fortsetter med et enkelt snitt i strand 1, som illustrert i figur 5B.

Den samtidige avgang av donor og Acceptor etter en stabil lav bånd tilstand i spor av løst X0 oppstod uten fremveksten av en mellomliggende bånd (E = ~ 0,40) indikerer at fullstendig oppløsning skjer i løpet av levetiden til GEN1-HJ kompleks (figur 5c). Derfor disse resultatene tyder på at HJ oppløsning skjer innenfor GEN1-HJ komplekse levetid. Oppløsningen av NK-X0 også provenyet etter strukturelle omorganisering og konkluderer med avgang av dupleks bære to Fluorophores (figur 5D) ligner på X0.

Kinetics av GEN1 dimerization på GEN1 monomer bundet HJ

Time-lapse smFRET tiltak τfør-kløft som i hovedsak omfatter tiden som kreves for dimer dannelse og oppløsning av HJ etter forvrengning av GEN1 monomer. Ved anvendelse av denne teknikken, er direkte bevis gitt for å støtte påstanden om at dimer formasjon er nødvendig for oppløsningen av både X0 og NK-X0, siden fordelingen av τfør kløften er GEN1 konsentrasjon-avhengig.

Den åpenbare rate av HJ oppløsning (kapp) er definert som den inverse av gjennomsnittet av τfør-kløft på de respektive GEN1 konsentrasjon. Begrepet "tilsynelatende" brukes for å beskrive frekvensen av HJ oppløsning, siden muligheten for at GEN1 forblir bundet til produktet etter HJ oppløsningen ikke kan utelukkes.

Sannsynlighets tetthets funksjonene (PDF) til τfør-kløft- distribusjoner av X0 (figur 6a) gjenspeiler tiden for dimer dannelse, som er lengre ved lave GEN1 KONSENTRASJONER, deretter kortere ved høyere GEN1 konsentrasjoner. Foreningen og dissosiasjon satser for dimer, kpå-dimer og koff-dimer, henholdsvis, bestemmes av en bi-eksponentiell modell30. Også PDF-filer av NK-X0 (figur 6b) Vis en tilsvarende fordeling til X0 som indikerer krav til dimer formasjon.

Plottet av kapp versus GEN1 konsentrasjon ble montert til en hyperbolske funksjon. Den tilsynelatende katalyse rate konstanter (kMax-app) av X0 og NK-X0 er 0,107 ± 0,011 s-1 og 0,231 ± 0,036 s-1, henholdsvis (figur 6C). Den plott av kapp for X0 og NK-X0 veikryss skjærer på GEN1 konsentrasjon ~ 5,6 nM på grunn av raskere kMax-app og tregere kpå-dimer av nicked i forhold til det intakte veikrysset.

Oppsummert, den relativt raske kpå-dimer og langsom koff-dimer føre til progresjon av Forward reaksjon mot HJ oppløsning når dimer er dannet. Den sterke bindingen av GEN1 monomer til NK-X0 Junction utgjør en fail-safe mekanisme mot noen usannsynlig avbrutt andre kløft eller bidrar til å plukke opp noen ufullstendig uløste HJs etterlatt av primær oppløsning trasé i cellen.

Figure 1
Figur 1: flytceller med én og flere kanaler og oppsett for det optiske oppsettet.
(A) skjematisk av flyt cellen med én kanal. (B) skjematisk av den seks-kanals strømningscelle. (C) utformingen av det optiske oppsettet som viser de eksitasjon KILDENE, TIRF-målet, dichroic speilet som er installert inne i filter kuben, og utslipps filtre som brukes i bilde Delings enheten. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Conformer bias og isomerization av HJ observert av bånd.
(A) Isomerization av tilstøtende-Label X-stablet HJ conformers oppkalt etter de to sammenhengende tråder. Trådene er nummerert, mens armene er merket med bokstaver. Snittet nettsteder er vist av piler. Posisjonene til donor (grønn) og Acceptor (rød) og endringen i bånd ved isomerization er indikert. (B) høyre panel: bånd tid-spor (svart) og idealisert bånd spor (rød) av X0 ved 50 mm mg2 +. Venstre panel: bånd histogram av X0 ved 50 mm mg2 +. Fluorescens intensitet av donor (grønn) og Acceptor (rød) er vist nedenfor. (C) botid histogrammer av tilstøtende-Label X0 ISO (1, 3) og ISO (2, 4) ble montert til enkelt-eksponentiell funksjoner for å bestemme isomerization priser. Usikkerheten indikerer 95% sikkerhetsintervall på passformen. Dette tallet er endret fra tidligere publisert litteratur30.

Figure 3
Figur 3: aktiv forvrengning av HJ av GEN1.
(A) strukturelle modifisering av adjacentlabel HJ basert på den foreslåtte modellen22. (B) Alex bånd histogram av tilstøtende-Label X0 har en stor høy bånd Peak (E = ~ 0,6) tilsvarende ISO (1, 3) og lavere bånd Peak (E = ~ 0,4) for ISO (2, 4). Hele histogrammet er egnet til to Gaussian funksjoner: en tilsvarende den frie høy bånd ISO (1, 3), og den andre tilsvarende den bundne befolkningen minus den innledende bidrag av ISO (2, 4) til den totale befolkningen. (C) den tilsynelatende monomer dissosiasjon konstanten (Kd-monomer-app) fastsettes fra en HYPERBOLSKE tilpasning av prosentandelene av GEN1-bundne populasjoner som en funksjon av GEN1 konsentrasjon. (D) bånd histogrammer av tilstøtende-Label NK-X0 på ulike GEN1 konsentrasjoner. Området under lav bånd (E = ~ 0,25) Gaussian tilsvarer prosentandelen av den bundne befolkningen. (E) Kd-monomer-app av NK-X0 er bestemt fra den hyperbolske tilpasning av GEN1-bundet befolkning. Feilfeltene representerer standardavvikene fra to eller flere eksperimenter. Dette tallet er endret fra tidligere publisert litteratur30. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: trinnvis binding av GEN1 til HJ.
(A) Elektroforetiske mobilitet Skift ANALYSEN (EMSA) av GEN1 på 50 pM X0. Øvre panel: de romerske tallene angir antall GEN1-monomerer i komplekset. Nedre panel: binding av GEN1 monomer til X0. Den tilsynelatende dissosiasjon konstantene ble innhentet fra en sigmoidal anfall av de respektive artene og representerer gjennomsnittet av to eksperimenter. (B) EMSA av GEN1 på 50 pM NK-X0 demonstrerer fremtredende monomer bindende som indikert av svært lav Kd-monomer-app-EMSA. (C) bånd tid-spor av bundet men uncleaved tilstøtende-Label X0 i mg2 +. Giver eksitasjon for ~ 1,3 min ble fremført, etterfulgt av direkte Acceptor eksitasjon (skyggelagte rosa region). (D) bånd tid-spor av bundet men uncleaved tilstøtende-Label NK-X0 i mg2 +. Dette tallet er endret fra tidligere publisert litteratur30. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: SMFRET oppløsning analysen av HJ.
(A) skjematisk av tilstøtende etikett X0 ISO (1, 3) etter forvrengning av GEN1. Underlaget er festet til funksjonalisert overflate via biotin/avidin kobling. Dissosiasjon av GEN1 etter de to snitt resulterer i tap av både donor og Acceptor som går inn i løsningen. (B) skjematisk av oppløsningen av tilstøtende-Label NK-X0 ved spalte strand 1. (C) time-Trace (svart) ved 2 mm mg2 + av kløften av ISO (1, 3). Utbruddet av GEN1 bindende danner en stabil lav bånd tilstand til bånd signalet er brått tapt på grunn av kløft. Tilsvarende er økningen i donor og reduksjon av Acceptor fluorescens intensitet på GEN1 binding etterfulgt av samtidig forsvinningen av fluorescens fra begge fargestoffer på kløft. (D) på samme måte, viser tid-spor av NK-X0 et stabilt lavt bånd tilstand upon GEN1 binding som er konkludert med brå tap av bånd signal. Dette tallet er endret fra tidligere publisert litteratur30. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Kinetics av GEN1 dimerization på GEN1 monomer bundet HJ.
(A) tomten til τfør-kløft- fordelingen av X0 illustrerer dens avhengighet av GEN1-konsentrasjon. Dvele tider av lav bånd tilstand (τfør-kløft) ved de respektive GEN1 konsentrasjon ble innhentet fra to eller flere eksperimenter og brukes til å oppnå gjennomsnittlig priser (kapp). De oppførte k-appens priser fastsettes fra den inverse av gjennomsnitts τfør kløften ved den respektive GEN1-konsentrasjonen. (Kon-dimer) og dissosiasjon (koff-dimer) satser for dimer dannelse beregnes ut fra en bi-eksponentiell modell38. Feilene representerer SEM av kapp. (B) PDF plottet av τfør-kløft distribusjoner av NK-X0 og de respektive kapp priser. (C) plot av kapp versus GEN1 konsentrasjon montert til en hyperbolske funksjon for å fastslå den tilsynelatende katalysator (kMax-app). Plottet av kapp for X0 og NK-X0 illustrerer raskere første kapp av X0 som deretter overgått av NK-X0 ovenfor [GEN1] ~ 5,6 nM. Dette tallet er endret fra tidligere publisert litteratur30. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Buffer Compostion
Innbindings buffer 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 40 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 1 mm DTT, 0,1% BSA og 5% (v/v) glyserol
Buffer A 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM DTT og 300 mM NaCl
Buffer B 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM DTT og 100 mM NaCl
Buffer C 20 mM Tris-HCl pH 8,0 og 1 mM DTT
Hurtigbuffer for kløft 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 40 mM NaCl, 2 mM MgCl2, 1 mm DTT, 0,1% BSA og 5% (v/v) glyserol
EMSA binding-buffer 40 mM Tris-HCl pH 7,5, 40 mM NaCl, 1 mM DTT, 2 mM CaCl2, 0,1 mg/ml BSA, 5% (v/v) glyserol og 5 ng/μL Poly-di-dC
Bilde buffer (binding) 40 μL (±) -6-AHA-2, 5, 7, 8-tetramethylchromane-2-kar bok syls acid (4 μM), 60 μL PCA (6 nM), 60 μL PCD (60 nM) og 840 μL av bindende buffer
Bilde buffer (kløft) 40 μL (±) -6-AHA-2, 5, 7, 8-tetramethylchromane-2-kar bok syls acid (4 μM), 60 μL PCA (6 nM), 60 μL PCD (60 nM) og 840 μL av kløft buffer
Lyseringsbuffer 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM β-mercaptoethanol, 300 mM NaCl og 2 mM PMSF
PCD lagrings buffer 100 mM Tris-HCl pH 7,5, 1 mM EDTA, 50 mM KCl og 50% glyserol
lagrings buffer 20 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 mM DTT, 0,1 mM EDTA, 100 mM NaCl og 10% glyserol
TBE-buffer 89 mM Tris-HCl, 89 mM borsyre syre og 2 mM EDTA
TE100 buffer 10 mM Tris. HCl pH 8,0 og 100 mM NaCl
Tris-EDTA-buffer 50 mM Tris-HCl pH 8,0 og 1 mM EDTA pH 8,0

Tabell 1: listen over buffere og komposisjoner som brukes i denne studien.

Oligo Sekvens
X0-ST1 ACGCTGCCGAATTCTACCAGTGCCTTGCTAGGACATCTTTGCCCACCTGCAGGTTCACCC
X0-st2 GGGTGAACCTGCAGGTGGG/iCy3/AAAGATGTCCATCTGTTGTAATCGTCAAGCTTTATGCCGT
X0-st3 ACGGCATAAAGCTTGACGA/iAF647-dT/TACAACAGATCATGGAGCTGTCTAGAGGATCCGACTATCG
X0-st4 5 ' BiotinCGATAGTCGGATCCTCTAGACAGCTCCATGTAGCAAGGCACTGGTAGAATTCGGCAGCGT
X0-justering X0-St1, x0-st2, x0-st3 & X0-st4
X0In_st2 GGGTGAACCTGCAGGTGGGCAAAGATGTCCATCTGTTGTAATCGTCAAGCTTTATGCCGT
X0In_st4 5 ' BiotinCGATAGTCGGATCCTCTAGACAGCTCCATGTAGCAAGGCA/iCy3/TGGTAGAATTCGGCAGCGT
NK-X0 X0-St1, x0-st2, x0-nk3a, x0-nk3b & X0-st4
X0-nk3a ACGGCATAAAGCTTGACGA/iAF647-dT/TACAACAGATC
X0-nk3b ATGGAGCTGTCTAGAGGATCCGACTATCG

Tabell 2: SMFRET og EMSA HJ underlag. Listen over oligonukleotider som brukes for utarbeidelse av fluorescensmerkete merket HJs for smFRET og EMSA. Oligos ble kommersielt innhentet. Fluorescensmerkete merket oligos var HPLC-renset og, når mulig, oligos av ≥ 60 BP var side-renset.

Discussion

I denne studien, ulike smFRET teknikker ble iverksatt for å bestemme Kinetics av HJ oppløsning av GEN130. Lignende smFRET tilnærminger ble brukt til å følge dobbel klaff DNA conformational krav og kløft av DNA replikering og reparasjon klaff endonuclease 142,43,44. Her diskuteres kritiske trinn i denne protokollen. Den silanisering reaksjonen skal være fri for spor av fuktighet. Den pegylation løsningen skal påføres raskt på det silanized glasset når PEG oppløses for å unngå hydrolyse. I flerkanals strømningscelle bør eventuell fanget luft i selvklebende ark fjernes for å unngå lekkasje mellom nabo kanaler. PCA-løsningen bør tilberedes på en nylaget siden den oksiderer over tid. Tillegg av 10 N NaOH bør være dråpevis, med virvlingen i mellom. Den fluorescens bakgrunnen i dekkglass bør være minimal før du strømmer fluorescensmerkete merket HJ. Bildebehandling i strømningscellen skal utføres i én retning for å unngå bilde av bleket områder. I ALEX eksperimenter, bør kraften i den røde laseren reduseres for å unngå rask bleking av Acceptor. I eksperimenter med tidsforløp må syklustiden være kortere enn den raskeste hendelsen.

smFRET er en følsom teknikk som kan gi verdifull sanntidsinnsikt i Biomolecular reaksjoner. Imidlertid har denne metoden flere tekniske utfordringer, blant annet er å oppnå målbar endring i bånd under biokjemiske reaksjon. Dette er nødvendig for å oppnå godt separerte funksjoner i histogrammer og skille stater i tid-spor. I mange tilfeller krever smFRET nøye utforming av underlag, valg av fluoroforen parene og deres posisjoner, og forsterkning av bånd endringer i DNA underlaget på grunn av den lille strukturelle endringer i underlaget45. En annen tilnærming for å utføre bånd er å bruke merket proteiner46. Observasjons vinduet i bånd er begrenset av stabiliteten i Acceptor som Cy5 eller Alexa fluor 647 som har en tendens til å bleke mer raskere enn donor (Cy3 i dette tilfellet). Derfor krever bånd et kontinuerlig Søk etter stabile fluorophores for å forlenge eksperimentet varighet og arbeidet med å utvikle oksygen rensing systemer for å forlenge fluorescens signalet og maksimere signal-til-støy-forhold47,48 .

Blant tipsene for feilsøking i smFRET er å balansere flere parametre involvert i avbildning som laser strøm, eksponeringstid, syklustid, og antall sykluser for å maksimere fluorescens utslipp, forlenge eksperimentet varighet, og oppnå passende sampling intervaller for enzymet dynamikk. Lengre observasjons tider og minimale effekter fra photobleaching er avgjørende for å oppnå høy troskap dvele tids distribusjoner som representerer enzymet dynamikk. ALEX genererer bedre histogrammer siden denne metoden er utsatt for lavere bidrag fra photobleached partikler i forhold til én fargebånd. Men den timelige oppløsningen i ALEX er lavere enn i en enkelt fargebånd.

Til slutt, smFRET ' s vekt på å oppdage conformational/strukturelle endringer i individuelle molekyler i sanntid broer gapet mellom høy oppløsning strukturelle teknikker (dvs., X-ray crystallography, kjernefysisk magnetisk resonans, elektron mikroskopi), som gir Atomic oppløsning strukturelle detaljer under statiske forhold og bulk metoder som gir ensemblet gjennomsnittet av en målbar eiendom. I mange aspekter, smFRET har vist seg å være en kraftig teknikk for å studere biologiske systemer i sanntid.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av kong Abdullah University of Science and Technology gjennom kjernen finansiering og konkurrerende Research Award (CRG3) til S. M. H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
(±)-6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid (Trolox) Sigma-Aldrich 238813
0.1 M sodium bicarbonate buffer Fisher 144-55-8
10 % Novex Tris-Borate-EDTA gel Thermo Fisher Scientific EC6275BOX
100 X TIRF objective Olympus NAPO 1.49
3,4-dihroxybenzoic acid (PCA) Sigma-Aldrich P5630
3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) Sigma-Aldrich 741442
6% Novex Tris-Borate-EDTA gel Thermo Fisher Scientific EC6265BOX
Adhesive sheet Grace bio-labs SA-S-1L
Benchtop refrigerated centrifuge Eppendorf Z605212
Biotin-PEG Laysan Bio Biotin-PEG-SVA 5000
Bovine Serum Albumin (BSA) New England Biolabs B9001S
Calcium Chloride Dihydrate Sigma-Aldrich 31307
cation exchange column GE healthcare MonoS (4.6/100)
Cell distruptor Constant Cell Disruption System TS5/40/CE/GA
Coomassie Brilliant Blue MP Biomedicals 808274
Cy3 emission filter Chroma HQ600/40M-25
Cy5/Alexa Fluor 647 emission filter Chroma HQ700/40M-25
Dichroic for DV2 filter cube Photometrics 630dcxr-18x26
Dithiothreitol (DTT) Thermo Scientific R0861
Drill Dremel 200-1/21
Electronic cutter Copam CP-2500
EMCCD camera Hamamatsu C9100-13
Epoxy glue Devcon 14250
FPLC Aktapurifier UPC 10 GE Healthcare 28406268
GelQuant.NET software biochemlabsolutions.com Version 1.8.2
GEN1 entry vector Harvard plasmid repository HSCD00399935
Glycerol Sigma Life Science G5516
green laser (emission 532 nm) Coherent Compass 315M-100
Heparin column GE healthcare HiTrap Heparin column
HEPES BDH BDH4162
Image splitter Photometrics Dualview (DV2)
Imidazole Sigma-Aldrich I2399
Inverted microscope Olympus IX81
Isopropyl-ß-D-thiogalactoside (IPTG) Goldbio. 12481C100
Laser scanner GE healthcare Typhoon Trio
LB Broth Fisher Scientific BP1426-500
Long pass 532nm filter Semrock LPD02-532RU-25
Magnesium Chloride Sigma Life Science M8266
mPEG Laysan Bio mPEG-SVA 5000
Neutravidin Pierce 31000
Ni-NTA column GE healthcare HisTrap FF
NuPAGE 10% Bis-Tris gels Novex Life technologies NP0301BOX
NuPAGE 10% Bis-Tris Protein Gels Thermo Fisher Scientific NP0302PK2
Origin software OriginLab Corporation Version 8.5
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF) Alexis Biochemicals 270-184-G025
Phosphate-buffered saline GIBCO 14190
Polyethylene Tubing (I.D. 0.76 mm O.D. 1.22mm) Fisher (Becton Dickinson) 427416
Protocatechuate 3,4-dioxygenase (3,4-PCD) Sigma-Aldrich P8279-25UN
Quad-band dichroic Chroma Inc Z405/488/532/640rpc
red laser (emission 640 nm) Coherent Cube 640 100C
Sodium Chloride Fisher Chemical S271
Sorvall RC-6 plus centrifuge Thermo Fisher Scientific 46910
Spectrophotometer Thermo Fisher Scientific Nanodrop 2000
Syringe pump Harvard Apparatus 70-3007
Teflon tweezers Rubis K35A
Tris Base Promega H5135
Ultracentrifuge Beckman Coulter Optima L-90K
Ultrafiltration membrane Millipore UFC90300

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Moerner, W. E., Fromm, D. P. Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy. Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).
  2. Ha, T. Single-molecule fluorescence resonance energy transfer. Methods. 25 (1), 78-86 (2001).
  3. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  4. Stryer, L. Fluorescence energy transfer as a spectroscopic ruler. Annual Review of Biochemistry. 47, 819-846 (1978).
  5. Roy, R., Hohng, S., Ha, T. A practical guide to single-molecule FRET. Nature Methods. 5 (6), 507-516 (2008).
  6. Walter, N. G., Huang, C. Y., Manzo, A. J., Sobhy, M. A. Do-it-yourself guide: how to use the modern single-molecule toolkit. Nature Methods. 5 (6), 475-489 (2008).
  7. Conchello, J. A., Lichtman, J. W. Optical sectioning microscopy. Nature Methods. 2 (12), 920-931 (2005).
  8. Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Methods in Enzymology. 361, 1-33 (2003).
  9. Kim, H. D., et al. Mg2+-dependent conformational change of RNA studied by fluorescence correlation and FRET on immobilized single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (7), 4284-4289 (2002).
  10. Lee, T. H., et al. Measuring the folding transition time of single RNA molecules. Biophysical Journal. 92 (9), 3275-3283 (2007).
  11. Holliday, R. Mechanism for Gene Conversion in Fungi. Genetical Research. 5 (2), 282-304 (1964).
  12. West, S. C., et al. The Formation and Resolution of Holliday Junctions during the Recombinational Repair of DNA Damages. Journal of Cellular Biochemistry. , 269-269 (1995).
  13. Cox, M. M., et al. The importance of repairing stalled replication forks. Nature. 404 (6773), 37-41 (2000).
  14. West, S. C. Molecular views of recombination proteins and their control. Nature Reviews: Molecular Cell Biology. 4 (6), 435-445 (2003).
  15. Duckett, D. R., et al. The structure of the Holliday junction, and its resolution. Cell. 55 (1), 79-89 (1988).
  16. Clegg, R. M., et al. Fluorescence resonance energy transfer analysis of the structure of the four-way DNA junction. Biochemistry. 31 (20), 4846-4856 (1992).
  17. McKinney, S. A., Declais, A. C., Lilley, D. M., Ha, T. Structural dynamics of individual Holliday junctions. Nature Structural Biology. 10 (2), 93-97 (2003).
  18. Joo, C., McKinney, S. A., Lilley, D. M., Ha, T. Exploring rare conformational species and ionic effects in DNA Holliday junctions using single-molecule spectroscopy. Journal of Molecular Biology. 341 (3), 739-751 (2004).
  19. Hyeon, C., Lee, J., Yoon, J., Hohng, S., Thirumalai, D. Hidden complexity in the isomerization dynamics of Holliday junctions. Nature Chemistry. 4 (11), 907-914 (2012).
  20. Ip, S. C., et al. Identification of Holliday junction resolvases from humans and yeast. Nature. 456 (7220), 357-361 (2008).
  21. Rass, U., et al. Mechanism of Holliday junction resolution by the human GEN1 protein. Genes & Development. 24 (14), 1559-1569 (2010).
  22. Liu, Y., et al. Crystal Structure of a Eukaryotic GEN1 Resolving Enzyme Bound to DNA. Cell Reports. 13 (11), 2565-2575 (2015).
  23. Chan, Y. W., West, S. GEN1 promotes Holliday junction resolution by a coordinated nick and counter-nick mechanism. Nucleic Acids Research. 43 (22), 10882-10892 (2015).
  24. van Gool, A. J., Hajibagheri, N. M., Stasiak, A., West, S. C. Assembly of the Escherichia coli RuvABC resolvasome directs the orientation of holliday junction resolution. Genes & Development. 13 (14), 1861-1870 (1999).
  25. Lee, S. H., et al. Human Holliday junction resolvase GEN1 uses a chromodomain for efficient DNA recognition and cleavage. eLife. 4, (2015).
  26. Chan, Y. W., West, S. C. Spatial control of the GEN1 Holliday junction resolvase ensures genome stability. Nature Communications. 5, 4844 (2014).
  27. Liu, Y., Freeman, A. D., Declais, A. C., Lilley, D. M. J. A monovalent ion in the DNA binding interface of the eukaryotic junction-resolving enzyme GEN1. Nucleic Acids Research. 46 (20), 11089-11098 (2018).
  28. Zhou, R., et al. Junction resolving enzymes use multivalency to keep the Holliday junction dynamic. Nature Chemical Biology. 15 (3), 269-275 (2019).
  29. Bellendir, S. P., et al. Substrate preference of Gen endonucleases highlights the importance of branched structures as DNA damage repair intermediates. Nucleic Acids Research. 45 (9), 5333-5348 (2017).
  30. Sobhy, M. A., et al. Resolution of the Holliday junction recombination intermediate by human GEN1 at the single-molecule level. Nucleic Acids Research. 47 (4), 1935-1949 (2019).
  31. Sobhy, M. A., et al. Versatile single-molecule multi-color excitation and detection fluorescence set-up for studying biomolecular dynamics. Review of Scientific Instruments. 82 (11), 113702 (2011).
  32. Kapanidis, A. N., et al. Fluorescence-aided molecule sorting: analysis of structure and interactions by alternating-laser excitation of single molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (24), 8936-8941 (2004).
  33. Lee, N. K., et al. Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation. Biophysical Journal. 88 (4), 2939-2953 (2005).
  34. Rashid, F., et al. Initial state of DNA-Dye complex sets the stage for protein induced fluorescence modulation. Nature Communications. 10 (1), 2104 (2019).
  35. Sambrook, J., Russell, D. W. Standard ethanol precipitation of DNA in microcentrifuge tubes. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), (2006).
  36. Holden, S. J., et al. Defining the limits of single-molecule FRET resolution in TIRF microscopy. Biophysical Journal. 99 (9), 3102-3111 (2010).
  37. Bronson, J. E., Fei, J., Hofman, J. M., Gonzalez, R. L. Jr, Wiggins, C. H. Learning rates and states from biophysical time series: a Bayesian approach to model selection and single-molecule FRET data. Biophysical Journal. 97 (12), 3196-3205 (2009).
  38. Kou, S. C., Cherayil, B. J., Min, W., English, B. P., Xie, X. S. Single-molecule Michaelis-Menten equations. Journal of Physical Chemistry B. 109 (41), 19068-19081 (2005).
  39. Clegg, R. M., Murchie, A. I., Lilley, D. M. The solution structure of the four-way DNA junction at low-salt conditions: a fluorescence resonance energy transfer analysis. Biophysical Journal. 66 (1), 99-109 (1994).
  40. Pohler, J. R., Duckett, D. R., Lilley, D. M. Structure of four-way DNA junctions containing a nick in one strand. Journal of Molecular Biology. 238 (1), 62-74 (1994).
  41. Fogg, J. M., Lilley, D. M. Ensuring productive resolution by the junction-resolving enzyme RuvC: large enhancement of the second-strand cleavage rate. Biochemistry. 39 (51), 16125-16134 (2000).
  42. Sobhy, M. A., Joudeh, L. I., Huang, X., Takahashi, M., Hamdan, S. M. Sequential and multistep substrate interrogation provides the scaffold for specificity in human flap endonuclease 1. Cell Reports. 3 (6), 1785-1794 (2013).
  43. Rashid, F., et al. Single-molecule FRET unveils induced-fit mechanism for substrate selectivity in flap endonuclease 1. eLife. 6, e21884 (2017).
  44. Zaher, M. S., et al. Missed cleavage opportunities by FEN1 lead to Okazaki fragment maturation via the long-flap pathway. Nucleic Acids Research. 46 (6), 2956-2974 (2018).
  45. Didenko, V. V. DNA probes using fluorescence resonance energy transfer (FRET): designs and applications. BioTechniques. 31 (5), 1106-1116 (2001).
  46. Toseland, C. P. Fluorescent labeling and modification of proteins. Journal of Chemical Biology. 6 (3), 85-95 (2013).
  47. Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. An oxygen scavenging system for improvement of dye stability in single-molecule fluorescence experiments. Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).
  48. Swoboda, M., et al. Enzymatic oxygen scavenging for photostability without pH drop in single-molecule experiments. ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).

Tags

Genetikk Holliday Junction enkelt-molekyl bånd homologe rekombinasjon 5 ' nukleaser gap endonuclease jeg GEN1 Holliday veikryss resolvases
Single-molekylet Förster resonans energi overføring metoder for Real-Time gransking av Holliday Junction oppløsning av GEN1
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sobhy, M. A., Bralić, A.,… More

Sobhy, M. A., Bralić, A., Raducanu, V. S., Tehseen, M., Ouyang, Y., Takahashi, M., Rashid, F., Zaher, M. S., Hamdan, S. M. Single-Molecule Förster Resonance Energy Transfer Methods for Real-Time Investigation of the Holliday Junction Resolution by GEN1. J. Vis. Exp. (151), e60045, doi:10.3791/60045 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter