Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

استخدام خلايا Drosophila S2 للتصوير الحي لقسم الخلايا

doi: 10.3791/60049 Published: August 23, 2019

Summary

يمكن تصور أقسام الخلايا في الوقت الحقيقي باستخدام البروتينات ذات العلامات الفلورية والفحص المجهري الفاصل الزمني. باستخدام البروتوكول المعروض هنا، يمكن للمستخدمين تحليل ديناميات توقيت تقسيم الخلايا، وتجميع المغزل الميتومي، والكونغرس الكروموسومي والفصل. يمكن تقييم العيوب في هذه الأحداث بعد تدخل الحمض النووي الريبي (RNAi) بوساطة الجينات بالضربة القاضية وتحديدها كمياً.

Abstract

دروسوفيلا خلايا S2 هي أداة هامة في دراسة ميتوسيفيفي تثقافة الأنسجة، وتوفير رؤى جزيئية في هذه العملية الخلوية الأساسية بطريقة سريعة وعالية الإنتاجية. وقد ثبت أن الخلايا S2 قابلة للتطبيقات التصوير الثابتة والخلايا الحية على حد سواء. وتجدر الإشارة إلى أن التصوير بالخلايا الحية يمكن أن ينتج معلومات قيمة حول كيفية تأثير فقدان الجين أو ضربه على حركية وديناميات الأحداث الرئيسية أثناء انقسام الخلايا، بما في ذلك تجميع المغزل الميتومي، والكونغرس الكروموسومي، والفصل، وكذلك توقيت دورة الخلية عموما. هنا نستخدم S2 الخلايا transfected بشكل لا يطاق مع الفلورسنت الموسومة mCherry:α-tubulin للاحتفال المغزل الميتيوتيك وGFP:CENP-A (يشار إليها باسم 'CID' الجينات في دروسوفيلا)للاحتفال سنترومير لتحليل آثار الجينات المنوطية الرئيسية على توقيت تقسيمالخلايا، من المرحلة التمهيدية (على وجه التحديد في انهيار المغلف النووي؛ NEBD) إلى بداية الطور. يسمح بروتوكول التصوير هذا أيضًا بتصور الأنابيب الدقيقة المغزل وديناميات الكروموسوم في جميع أنحاء الميكروتواسي. هنا، ونحن نهدف إلى توفير بروتوكول بسيط ولكن شامل من شأنها أن تسمح للقراء بسهولة تكييف خلايا S2 لتجارب التصوير الحي. وينبغي أن تؤدي النتائج التي يتم الحصول عليها من هذه التجارب إلى توسيع فهمنا للجينات المشاركة في انقسام الخلايا من خلال تحديد دورها في العديد من الأحداث المتزامنة والدينامية. ويمكن التحقق من صحة الملاحظات التي أبديت في هذا النظام لثقافة الخلايا ومواصلة التحقيق فيها في الجسم الحي باستخدام مجموعة أدوات مثيرة للإعجاب من النهج الوراثية في الذباب.

Introduction

قسم الخلايا هي عملية حاسمة لجميع الكائنات متعددة الخلايا، سواء في تطورها والتوازن1. وقد استخدمت Drosophila منذ فترة طويلة كنموذج لدراسة انقسام الخلايا، مع تجارب في أنواع الأنسجة المختلفة والظروف الوراثية توفير رؤى رئيسية في هذه العملية. في حين أن العديد من هذه الرؤى تأتي من ظروف الخلايا الثابتة، تقسيم الخلايا هو إجراء ديناميكي مع العديد من الأجزاء المتحركة، مما يجعل التصور من الخلايا الحية جزءا لا يتجزأ من تقييم RNAi أو الآثار الوراثية بالضربة القاضية على أجزاء عديدة من انقسام الخلايا، بما في ذلك تشكيل المغزل، كروموسوم الكونغرس والفصل، والسيتوكينيسيس.

وقد وضعت العديد من البروتوكولات واستخدامها على مر السنين لتصور أقسام الخلايا Drosophila في الجسم الحي. وقد زرعت مجموعات مختلفة تقنيات لأقسام الصورة في كل من الأقراصالتخيلية اليرقات وأدمغة اليرقات 2،8 . هذه التقنيات، على الرغم من أنها مفيدة للتصوير في أنسجة محددة، محدودة في الإنتاجية وتتطلب في كثير من الأحيان توليد وصيانة المخزونات الوراثية لتوليد مكونات الفلورسنت وتغيير التعبير عن الجينات ذات الأهمية. توفر الخلايا المستزرعة S2 من Drosophila بديلاً أعلى للسرعة من الإنتاجية لاختبار آثار الجينات المختلفة في انقسام الخلايا. وعلاوة على ذلك، مع القدرة على نقل مختلف البروتينات الفلورية، يمكن تعديل خلايا S2 بسرعة لتحديد آثار ضربة قاضية RNAi على العديد من مكونات انقسام الخلايا. ويمكن أيضا أن يلاحظ الجينات ذات العلامات الفلورية ذات الأهمية في انقسام الخلايا، مما يسمح بالتوصيف الديناميكي لوظيفتها9.

هنا نقدم بروتوكول مفصل للتصوير الحي لخلايا S2 mitotic باستخدام أساليب وصفنا مؤخرا10. تستخدم طريقتنا الخلايا المتحولة بشكل لا يُطلَك مع علامات الفلورسنت للأنابيب الدقيقة والسنتروميرالتي يكون تعبيرها تحت السيطرة على محرك بروموتور اتنك (ميتالوثيونين؛ pMT). ويمكن استخدام هذه المنهجية لصورة المغزل وديناميات الكروموسوم في جميع مراحل الميثوسية باستخدام مجهر فلورسنت بسيط نسبيا مع برامج التصوير الأساسية. ويمكن تخصيص هاد ليلائم الاحتياجات البحثية الفردية، مع الانحراف العابر وRNAi التي توفر إمكانيات موسعة لتحديد دور الجينات المرشحة في الكيتوسية. وبسبب البساطة النسبية للبروتوكول، يمكن استخدامه لشاشات فقدان الوظائف على نطاق صغير لتحديد الجينات التي سيكون من المفيد إجراء مزيد من الدراسة لها في الجسم الحي، مما يسمح ببذل جهود أكثر تركيزاوكفاءة مع العوامل الوراثية اللاحقة. التلاعب في الذباب.

Protocol

1. إعداد الخلايا S2 للعلاج مع RNAi

  1. من ثقافة الأسهم من pMT confluent:GFP:CID و pMT:mCherry:α-tubulin الخلايا S2 المنقولة بشكل متشعب (~ 80٪ قابلة للحياة؛ نمت في 24-28 درجة مئوية)، خلايا البذور في 6 لوحة ثقافة معقمة جيدا في كثافة 1 × 106 خلايا / مل في الطازجة، ودافئة، 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) تكمل وسائل الإعلام الحشرات شنايدر (SIM).
    ملاحظة:
    يمكن إنشاء خلايا S2 المنقولة بشكل لا يُمكن إنشاؤها باتباع بروتوكول من مركز فحص Drosophila RNAi (DRSC) (https://dgrc.bio.indiana.edu/Protocols?tab=cells). على الرغم من أن خط S2 مستقرة محددة المستخدمة هنا يستخدم GFP وmCherry, العديد من البدائل موجودة على حد سواء داخل هذه الأطياف الفلورسنت، فضلا عن غيرها. مناقشة مفصلة لهذه البروتينات الفلورية هو خارج نطاق هذا البروتوكول، ولكن خصائصها والمزايا المحتملة / العيوب قد استعرضت بخبرة في مكان آخر 11.
    1. باستخدام عداد الخلية أو مقياس الهيموكيتومات، تحديد كثافة مخزون الخلايا confluent.
    2. تحديد حجم تعليق الخلايا المتجانسة اللازمة لتحقيق 1 × 106 خلايا /مل في حجم إجمالي قدره 4 مل (على سبيل المثال، ~ 4 × 106 مجموع الخلايا). إضافة هذا الحجم من مخزون الخلية إلى حجم بطاقة SIM جديدة لجعل 4 مل / كذلك إجمالي حجم. تحديد كثافة مخزون الخلية (الخلايا / مل) عن طريق تخفيف 100 درجة مئوية من الخلايا مباشرة من قارورة الأسهم مع 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام وحساب هذا التخفيف 1:2 إما يدويا مع مقياس الهيموكياتومتر أو مع عداد الخلية التلقائي إذا كان متوفرا.
      ملاحظة: إذا كان استخدام الخلايا S2 لا transfected بشكل لا يطاق، يمكن إجراء فحص التغوط العابر عابرة مع الموسومة فلوري (GFP، mCherry، الخ) α- أو β-tubulin، وعلامة الحمض النووي (CENP-A، الهيستون H2B، الخ) يمكن أن يؤديها. وعلاوة على ذلك، تتوفر خطوط الخلايا المتحولة بشكل لا يُقدر مع مختلف علامات المغزل الميثوتيكي والحمض النووي من مركز الموارد الوراثية Drosophila التي قد تناسب بشكل أفضل الاحتياجات التجريبية الدقيقة للمستخدم (https://dgrc.bio.indiana.edu/cells/Catalog).
    3. ضع الخلايا البذر الطازجة في حاضنة 24-28 درجة مئوية لمدة 36-48 ساعة.

2. علاج الخلايا البذر مع dsRNA ضد الجينات (الجينات) ذات الفائدة

ملاحظة: Example التالي وقسم النتائج سوف تستخدم Shortstop (بالرصاص)، وهو عامل ربط عبر الأكتين ميكروتوبول كجين للاهتمام. استخدام علاج وهمية مع عدم وجود dsRNA أو مع dsRNA الموجهة ضد جين غير ذي صلة (على سبيل المثال، بيتا-galactosidase، lacZ)كسيطرة سلبية.

  1. وسائل الإعلام الحشرات شنايدر الدافئة لا تستكمل مع FBS (المصل وسائل الإعلام الحرة; SFM) في حاضنة 24-28 درجة مئوية.
  2. نقل الخلايا من البئر البذر سابقا (من الخطوة 1.1.2) إلى أنبوب معقم 15 مل، مشيرا إلى الحجم الإجمالي للخلايا المنقولة.
    1. الاحتفاظ بحجم صغير من الخلايا (~ 100 درجة مئوية) للعد في عداد الخلية أو مقياس الهيموكياتومتر.
  3. خلايا بيليه بلطف عن طريق الطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    1. في حين أن الخلايا الطرد المركزي، وتحديد تركيز الخلايا لكل مل باستخدام عداد الخلية أو مقياس الهيموكيتومات. اضرب هذا العدد بالحجم الإجمالي الذي يتم الطرد المركزي (المشار إليه في 1.2.2.) للحصول على العدد الإجمالي للخلايا.
  4. يستنشق الsupernatant من الخلايا الكريات.
  5. إعادة تعليق الخلايا في SFM الدافئة للحصول على تركيز 3 × 106 خلايا / مل.
    1. نقل 1 مل من الخلايا التي أعيد تعليقها إلى بئر جديدة في لوحة بئر 6.
  6. إضافة 10-50 ميكروغرام من dsRNA (المخفف ة في 100 ميكرولتر من المياه الخالية من RNAase) ضد النار (أو الجين المستهدف للاهتمام) مباشرة إلى الخلايا ودوامة لوحة لخلط. احتضان لوحة لمدة 1 ساعة في حاضنة 24-28 درجة مئوية للسماح لdsRNA مباشرة الاستفادة في الخلايا.
  7. خلال الحضانة 1 ح، وتسخين FBS 10٪ تستكمل SIM في حاضنة 24-28 درجة مئوية.
  8. بعد حضانة الخلايا مع dsRNA لمدة 1 ساعة، إضافة 2 مل من 10٪ FBS تكمل SIM مباشرة إلى البئر دون إزالة 1 مل من وسائل الإعلام.
  9. وضع الخلايا في حاضنة 24-28 درجة مئوية لمدة 3-7 أيام.
    ملاحظة: كما هو الحال مع تركيز dsRNA، قد تحتاج إلى تحسين الوقت الإجمالي للعلاج للجين المستهدف المطلوب. لتقييم فعالية RNAi، قم بإجراء لطخة غربية على الخلية بأكملها باستخدام جسم مضاد ضد الجين المستهدف. إذا ثبت أن التسلسل المستهدف الأولي dsRNA غير فعال، فإن تصميم dsRNAs بديلة تستهدف تسلسلات فريدة داخل الجين المستهدف.

3. تحريض التعبير عن البروتين الفلورسنت وإعداد الخلايا للتصوير

  1. إذا تم إنشاء الخلايا المنقولة بشكل متصالع باستخدام بلازميد pMT (تحتوي على المعادن اللاإحتكتية promotor) كما هوموضح هنا، والحث على التعبير عن البروتينات الفلورية عن طريق علاج الخلايا مع كبريتات النحاس (CuSO 4) في تركيز نهائي من 500 درجة مئوية لمدة 24-36 ساعة قبل التصوير و 4 أيام بعد العلاج RNAi. استخدام بلازميدات التعبير التأسيسي مثل pAct لا يتطلب تحريض النحاس.
  2. إعداد الخلايا للتصوير
    1. دافئ FBS 10٪ تستكمل SIM في حاضنة 24-28 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    2. نقل الخلايا إلى أنبوب معقم 15 مل، مشيرا إلى الحجم الإجمالي للخلايا المنقولة.
      1. الاحتفاظ بحجم صغير من الخلايا (~ 100 درجة مئوية) للعد في عداد الخلية أو مقياس الهيموكياتومتر.
    3. خلايا بيليه بلطف عن طريق الطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      1. في حين أن الخلايا الطرد المركزي، وتحديد التركيز (الخلايا / مل) باستخدام عداد الخلية أو مقياس الهيموكياتومتر. اضرب هذا العدد بالحجم الإجمالي الذي يتم الطرد المركزي (المشار إليه في 2.2.2.) للحصول على العدد الإجمالي للخلايا.
    4. يستنشق الsupernatant من الخلايا الكريات.
    5. إعادة تعليق الخلايا في الطازجة، وتسخين هاف س 10٪ تكمل SIM للحصول على تركيز 2 × 106 خلايا / مل. إضافة كمية مناسبة من CuSO4 للحفاظ على تركيز 500 درجة مئوية.
    6. نقل 200-500 درجة مئوية من الخلايا المعاد تعليقها إلى بئر واحد من غرفة خلية حية متعددة جيدا ومكان على المجهر الفلورسنت المقلوب. السماح للخلايا للاستقرار في الغرفة لمدة 15-30 دقيقة قبل تجارب التصوير.
      ملاحظة: يمكن أن تكون الآبار غرفة الخلية الحية المغلفة مسبقا مع بولي-L-يسين للانضمام إضافية.

4. إعداد برنامج تصوير الخلايا الحية

ملاحظة: تم إجراء التصوير بالخلايا الحية في هذه التجربة باستخدام نظام تصوير مقلوب والبرامج المرتبطة به (على سبيل المثال، أوليمبوس IX83 مع حزمة برامج cellSens Dimensions). وسوف تختلف التفاصيل من قبل الشركة المصنعة المجهر وحزمة البرمجيات؛ وبالتالي، ترد أدناه المبادئ التوجيهية العامة والعمليات.

  1. باستخدام البرنامج الذي يقوم بتشغيل المجهر الفلورسنت المقلوب، قم بإعداد برنامج لتصوير خلية (أو خلايا) مع مرور الوقت.
    1. افتح البرنامج بالنقر المزدوج على رمز سطح المكتب الخاص بالبرنامج.
    2. إنشاء ملف تجريبي جديد بالنقر فوق ملف، ثم ملف تجريبي جديد.
    3. أولاً، أدخل حلقة فاصل زمني يتم التقاط الصور فوقها. قم بذلك بالنقر فوق رمز ساعة الإيقاف (رمزحلقة الفاصل الزمني) من شريط الرموز. قم بتعيين الفاصل الزمني في s في علامة التبويب "إدارة التجارب"، ثم قم بتعيين عدد الدورات في نفس علامة التبويب عن طريق قسمة طول التجربة الإجمالي المطلوب (بالفقرات) على الفاصل الزمني. السماح للحلقة لتكرار خلال الفترة الزمنية الإجمالية المطلوبة.
      ملاحظة: عادة، يتم التقاط الصور كل 30-60 s على مدى فترة 3-4 ح.
    4. ضمن طبقة حلقة الفاصل الزمني، أدخل فحص تركيز الأشعة تحت الحمراء للحفاظ على تركيز الهدف (إذا كان متوفرًا). للقيام بذلك، إضافة خطوة تعويض Z-الانجراف (ZDC) داخل طبقة حلقة الفاصل الزمني عن طريق النقر على مربع مع رمز سهمين (نقل رمز XY) وتحديد تعويض Z-الانجراف من القائمة المنسدلة.
      ملاحظة: يشير مصطلح فحص التركيز بالأشعة تحت الحمراء إلى نظام يتم من خلاله استخدام نبض الأشعة تحت الحمراء للحفاظ على مسافة ثابتة بين الهدف وغرفة الشريحة/التصوير. العديد من المجاهر لديها مثل هذا النظام، ولكل منها تسميات الملكية الخاصة بها. يجب على القراء الرجوع إلى دليل التشغيل الخاص بهم أو ممثل للحصول على تفاصيل تسمية محددة.
    5. بعد التحقق من التركيز بالأشعة تحت الحمراء، أضف خطوة في البرنامج لالتقاط صورة متعددة القنوات (على سبيل المثال، FITC لGFP وTRITC لmCherry) على مكدسات z 3-5 عن طريق إدراج خطوة مكدس z أولاً، ثم تحديد القناة. قم بذلك عن طريق إضافة طبقة مجموعة متعددة القنوات داخل طبقة حلقة الفاصل الزمني بالنقر فوق رمز عجلة اللون (رمز مجموعةمتعددة القنوات). بعد ذلك، أضف طبقة حلقة Z-Stack داخل طبقة المجموعة متعددة القنوات بالنقر فوق الرمز ثلاثي الطبقات (رمز حلقةZ-stack). قم بتعيين حجم الخطوة المطلوب وعدد الشرائح في علامة التبويب "إدارة التجارب" وتعيين تعرض كل قناة إلى أدنى مستوى ممكن لتقليل ابيضاض الصور.
      ملاحظة: يمكن أن يختلف الفاصل الزمني لمكدس z ووقت التعرض ونفاذية النسبة المئوية للـ المصابيح. نموذجي في هذه التجارب، واستخدام ثلاثة z-مداخن اتخذت أكثر من مجموعة من 3 ميكرومتر، وإعطاء فاصل زمني من 1 ميكرومتر بين كل كومة. تحديد مركز الخلية بدلا من أعلى وأسفل يميل إلى أن يؤدي إلى أفضل النتائج. ثم يتم جمع الصور لكل قناة (قنوات) في التعرض من 50 مللي ثانية وانتقال في المئة من 50٪ مع عدم وجود كثافة محايدة (ND) مرشح تشارك.

5. صورة تقسيم الخلايا باستخدام برنامج التصوير بالخلايا الحية

ملاحظة: خلايا S2 لا تتطلب CO2 وتنمو على النحو الأمثل في 23-27 درجة مئوية. تم إجراء جميع عمليات التصوير في درجة الحرارة المحيطة في غرفة تسيطر عليها بشكل جيد.

  1. باستخدام العين، والعثور على أعلى (أو أسفل) الزاوية من البئر والتركيز على الهدف (40-60x الغمر النفط) على الخلايا باستخدام mCherry (α-tubulin) قناة.
  2. مسح على طول الجزء العلوي (أو السفلي) من البئر للابتعاد عن مقسم جيدا عمودي.
    ملاحظة: التصوير قريب جدا ً من فواصل الآبار يمكن أن يتداخل مع فحوصات تركيز الأشعة تحت الحمراء.
  3. العثور على خلية (أو خلايا) التي هي في وقت متأخر G2 أو في وقت مبكر M-المرحلة (prophase).
    ملاحظة: ويمكن تحديد هذه الخلايا على أفضل وجه من خلال وجود اثنين بالضبط من هياكل microtubule 'مثل النجوم' (centrosomes) ونواة سليمة (المشار إليها من قبل منطقة دائرية من الضوء المنكسر داخل الخلية)، وكلاهما يتميز بسهولة باستخدام α-tubulin (الأحمر) مرشح الإثارة. اختيار الخلايا في مرحلة ما قبل الطور، ملحوظة من قبل واحد أو صفر centrosomes مرئية بسهولة، يمكن أن يؤدي إلى إضاعة الوقت بسبب تأخر في التقدم G2 / M. وعلى العكس من ذلك، فإن اختيار الخلايا بعد NEBD منع الحساب الدقيق للتوقيت mitotic والتصوير من الجمعية المغزل في وقت مبكر وديناميات الكروموسوم. أيضا، خلايا S2 غالبا ً ما تحتوي على >2 centrosomes. على الرغم من أن هذه عادة ما تتجمع في المغزل ثنائي القطب12, ينصح أن المستخدمين تجنب هذه الخلايا ما لم يكن المطلوب خلاف ذلك للتصميم التجريبي. ويمكن الاطلاع على الصور ومناقشة الخلايا المناسبة للاختيار في قسم النتائج التمثيلية.
  4. انقر فوق الزر Live view لبدء عرض الخلايا في شاشة البرنامج. باستخدام مقبض التركيز غرامة من المجهر، والتركيز على الخلية (أو الخلايا) من الفائدة. تعيين التحقق من تركيز الأشعة تحت الحمراء بالنقر فوق الزر تعيين التركيز.
  5. بدء برنامج التصوير بالفاصل الزمني بالنقر فوق الزر ابدأ. ضبط الرسوم البيانية حسب الحاجة عن طريق تحديد القناة المطلوبة وضبط كثافة بكسل متوسط لرؤية الخلية (أو الخلايا) من الاهتمام بوضوح.
  6. السماح للبرنامج لتشغيل، والتحقق من الخلية بعد 15-20 دقيقة للتأكد من انهيار المغلف النووي (NEBD) قد حدث، والذي يتم تحديده من خلال اختفاء الظلام الجولة، بقعة انكسار بالقرب من مركز الخلية.
  7. متابعة السماح للبرنامج لتشغيل، والتحقق بشكل متقطع (كل 15-20 دقيقة) لتحديد مرة واحدة حدث بداية anaphase. إيقاف البرنامج عند هذه النقطة إذا كان هناك المزيد من الوقت المتبقي في الفترة الزمنية الإجمالية وحفظ الملف. بدلا من ذلك، إذا كانت الأحداث أثناء الطور التلفي وcytokinesis ذات فائدة، والسماح للبرنامج لتشغيل وقت كاف من أجل صورة هذه العمليات كذلك.
  8. إجراء تحليل NEBD إلى توقيت بداية الطور من خلال ملاحظة وقت NEBD (tNEBD)في الحد الأدنى ووقت فصل الكروموسوم الأولي (tبداية الأنافيس)في دقيقة وطرح رNEBD من بداية الإنافيس للحصول على NEBD إلى وقت بداية مرحلة لخلية معينة.
    1. قم بذلك بالنقر فوق زر الإطار وملاحظة الإطارات حيث يحدث NEBD وبداية anaphase طرح هذه لتحديد العدد الإجمالي للإطارات المنقضية ومضاعفة هذا بالفاصل الزمني بين إطارات التصوير.
  9. استمر في البحث عن الخلايا قبل التقسيم للحصول على عدة ن لحالة معينة. يمكن تصوير الخلايا في غرفة الخلية الحية بشكل جيد لمدة تصل إلى 12 ساعة بعد تسويتها الأولية.

Representative Results

الطرق التي نصفها أعلاه سوف يؤدي إلى تحديد وتصوير خلايا Drosophila S2 التي تخضع لتقسيم الخلايا. يمكن استهداف الخلايا التي على وشك الانقسام (أي قبل دخول المرحلة M) بوجود اثنين من سنتروسوماوميس ونواة سليمة تشير إليها الضوء المنكسر وبقعة أغمقداخل الخلية عند النظر إليها في قناة α-tubulin (الشكل 1، اليسار معظم لوحات ، قناة حمراء ، و رأس السهم في الشكل 1A). ونحن نقدر أن ما يقرب من 2-5٪ من الخلايا تندرج في هذه الفئة، وبين تجارب التصوير، ونحن عادة ما تنفق كحد أقصى 2-3 دقائق المسح الضوئي لخلية مؤهلة أخرى. يمكن تصور NEBD من خلال اختفاء هذه البقعة المظلمة، مما أدىإلى تلوين موحد للسيتوبلازم (الشكل 1، لوحات ملحوظ "00:00"، أحمر). بعد NEBD، يمكن قياس الوقت الذي تستغرقه كل خلية لتشكيل المغزل، وكروموسومات الكونغرس، والكروموسومات المنفصلة ببساطة من خلال ملاحظة النقاط الزمنية لهذه الأحداث بالنسبة إلى NEBD.

نحن نستخدم هذه الانقسامات لتقييم التوقيت الميتوتيك، وعلى وجه التحديد من NEBD إلى بداية الطور، مشيرا إلى النقطة التي تبدأ الكروموسومات في الانفصال. أغلبية (حوالي 90%) من الخلايا الناجمة عن النحاس، وأعرب عن كل من mCherry: α-tubulin وGFP: CID. نسبة صغيرة من الخلايا (~ 10٪) أعرب عن علامة واحدة فقط أو لا. تم تجنب هذه الخلايا أثناء اختيار الخلية. عادة، تعرض خلايا S2 NEBD إلى توقيت بداية المرحلة من بين 20-30 دقيقة (الشكل1A، التحكم). نحن علاج الخلايا التالية مع dsRNA المستهدفة ضد شورتستوب (بالرصاص)، وهو البروتين عبر ربط الأكتين ميكروتوبول كنا نشتبه قد تؤثر على ديناميات دورة الخلية. في الواقع، بعد إسقاط خلايا الضربة القاضية أظهرت تأخير الميتوتيك كبيرة (الشكل1B،تأخير ShotRNAi)، مع العديد من الخلايا القبض في metaphase وأبدا الانتقال إلى anaphase خلال كامل 2-3 ساعة تجربة التصوير (الشكل1D، اعتقال شوترناي). وقد يكون سبب هذا التأخير/الاعتقال من النمط الظاهري بسبب تفعيل نقطة تفتيش تجميع المغزل (أي نقطة التفتيش على المرحلة M). لاختبار هذه الفرضية مباشرة، ونحن شارك في معالجة الخلايا مع dsRNA ضد النار والخام صفقة (رود)، وهو عنصر مهم من هذه نقطة التفتيش13. وأدى ذلك إلى قمع النمط الظاهري للاعتقال، مما أدى إلى أن يكون NEBD إلى أوقات غير phase مشابهة للتحكم (الشكل1C,ShotRNAi+RodRNAi). وهكذا، سمح لنا بروتوكول التصوير الحي هذا باستنتاج أن Shot مطلوب للتقدم في الوقت المناسب على مرحلة M وأن خسارته يؤدي إلى تفعيل نقطة التفتيش التي تؤخر أو تعتقل الخلايا الميتومية.

Figure 1
الشكل 1: يكشف التصوير الحي عن عيوب دورة الخلايا بسبب تنشيط نقطة التفتيش المترية في خلايا S2.
في جميع الظروف، تم إجراء التصوير بالخلايا الحية على خلايا S2 بشكل لا يُصْلق بشكل ملحوظ مع GFP:CID وmCherry:αTubulin كما هو موضح هنا. (أ) توضح الرسوم المتحركة المعالم الهامة أثناء الـ mitosis، وتظهر الصور المقابلة لها من الأفلام التمثيلية للأنماط الجينية المشار إليها مع نقاط زمنية تتعلق بـ NEBD (t=00:00) المشار إليها. عادة ما تتقدم خلايا التحكم إلى مرحلة الإنزام في غضون 20-30 دقيقة. المعالجة المشتركة للخلايا مع ShotRNAi وRodRNAi، وهو مكون من نقاط التفتيش الجمعية المغزل، يقمع النمط الظاهري النار مما يؤدي إلى حركية بداية الطور مماثلة لخلايا التحكم (C). تشير الأسهم في (A) إلى الهياكل المركزية "الشبيهة بالنجوم"، ويشير رأس السهم الكبير إلى النواة. كل شريط مقياس يمثل 5 ميكرون. يتم تكييف هذا الرقم وإعادة نشره بإذن من10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1: فيلم الفاصل الزمني من 'التحكم' S2 تقسيم الخلية. يظهر الفيديو فيلم تمثيلي لتقسيم الخلايا S2 في النمط الجيني "التحكم". يتوافق هذا الفيلم مع الشكل 1A. يتم تكييف هذا الفيديو وإعادة نشره بإذن من10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو 2: فيلم الفاصل الزمني من تأخر 'ShotRNAi' S2 تقسيم الخلية. يظهر الفيديو فيلم تمثيلي لتقسيم الخلايا S2 في النمط الجيني 'ShotRNAi' الذي يؤدي إلى تأخير الفينوتيك. يتوافق هذا الفيلم مع الشكل 1B. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو 3: فيلم الفاصل الزمني من 'ShotRNAi + RodRNAi' S2 تقسيم الخلية. فيديو يظهر فيلم تمثيلي من تقسيم الخلية S2 في 'ShotRNAi + RodRNAi' النمط الجيني. يتوافق هذا الفيلم مع الشكل 1C. يتم تكييف هذا الفيديو وإعادة نشره بإذن من10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.

فيديو 4: فيلم الفاصل الزمني من القبض 'ShotRNAi' S2 تقسيم الخلية. فيديو يظهر فيلم تمثيلي من تقسيم الخلية S2 في النمط الجيني 'ShotRNAi' الذي يؤدي إلى اعتقال mitotic الفينوتية. يتوافق هذا الفيلم مع الشكل 1D. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الفيديو.

Discussion

تحديد خلية مناسبة

مفتاح التصوير تقسيم الخلايا S2 هو أولا تحديد موقع الخلية المناسبة. يمكن إضاعة الوقت خلايا التصوير التي يعتقد خطأ أن تكون على استعداد لتقسيم ولكن تفشل في القيام بذلك في إطار زمني معقول. يجب تحديد الخلايا التي تحتوي على اثنين من centrosomes متميزة ومرئية ونواة سليمة. يجب أن يكون Centrosomes ألياف microtubule المنبثقة منها، مما يعطيها مظهر "مثل النجوم". نواة سليمة ينكسر الضوء عند ضبط التركيز، ويجعل أيضا المركز التقريبي للخلية أغمق في المظهر. وستحتوي النواة أيضا على "نقاط" GFP:CID، وهي سمة مميزة أخرى للمساعدة في تحديدها. الخلايا مع > 2 centrosomes، التثواب tubulin دون ألياف توبولين المنبثقة منها، أو الخلايا مع سنتروسوم واحد فقط ينبغي تجنبها. بالإضافة إلى ذلك، إذا كان اثنين من centrosomes مرئية، ولكن نواة ليست كذلك، وقد حدث بالفعل NEBD والخلية متقدمة جدا في تقسيمها ليتم تصويرها إذا كان من المرغوب فيه تحليل مرحلة M كاملة. بمجرد العثور على خلية مناسبة، فإن السرعة في بدء التصوير أمر بالغ الأهمية حيث يحدث NEBD بسرعة (عادة في غضون 3-5 دقائق) وتأخير بدء التصوير يمكن أن يؤدي إلى فرص ضائعة. تركيز الخلية في برنامج التصوير بسرعة بحيث يكون كل من centrosomes مرئية، أو إذا سنتروسومس هي خارج المستوى مع بعضها البعض، تعيين نقطة الاتصال بين الاثنين، بحيث يمكن التقاط كل منها عندما يتم جمع أكوام Z فوق وتحت المركز المحدد نقطه. مرة واحدة تركز، على الفور تعيين الإزاحة بين المرحلة وسطح غرفة الخلية الحية باستخدام فحص التركيز بالأشعة تحت الحمراء (إذا كان متوفرا) والبدء في برنامج التصوير. على الرغم من أن البروتوكول المعروض هنا مصمم خصيصًا للتجارب التي تقيّم ديناميات NEBD-to-anaphase، إلا أن التعديلات البسيطة يمكن أن تناسب القراء الذين يدرسون الأحداث الميتومية البديلة. بالنسبة للتصوير من NEBD إلى metaphase والتصوير من اللافية إلى التيلوفاسي، نقترح 10 فترات لالتقاط الصور لأن هذه العمليات ديناميكية للغاية وتحدث بسرعة في خلايا S2 (5-10 دقائق). الانتقال من المرحلة إلى الطور (تركيزنا التجريبي النموذجي) هو عملية أطول (20-30 دقيقة) في خلايا S2، ونحن نجمع الصور على فترات 30 s. وأخيرا، يحدث التإلى مرحلة من خلال السيتوكينيس ببطء شديد في خلايا S2، ونقترح 60 ق فترات توفير ما يكفي من القرار لهذه العملية التقريبية لمدة ساعة.

الحفاظ على التركيز في جميع أنحاء برنامج التصوير

إذا لم يكن جهاز فحص التركيز بالأشعة تحت الحمراء متوفرًا، فتأكد من تجنب صدم المجهر أو الجدول الذي يجلس عليه، حيث يمكن أن يؤدي ذلك إلى انتقال الخلية من التركيز أثناء برنامج التصوير، مما يؤدي إلى نتائج غامضة وغير قابلة للتفسير. قبل طلاء آبار غرفة الخلية الحية مع بولي-L-يسين يمكن أن تساعد في الالتزام الخلية، والتي يمكن أن تساعد على تجنب حركة الخلية ومفيدة بشكل خاص للإعدادات دون الشيكات التركيز بالأشعة تحت الحمراء. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تساعد الإعدادات بما في ذلك منصات امتصاص الصدمات أو طاولات الهواء في تجنب انتقال الخلايا خارج نطاق التركيز البؤري. وأخيراً، تحتوي بعض البرامج على وظائف إيقاف مؤقت تسمح للمستخدم بإعادة تركيز البرنامج واستئنافه.

تصوير خلايا متعددة

يساعد على تراكم البيانات هو أنه في كثير من الأحيان يمكن وضع خلايا متعددة جاهزة للتقسيم داخل نفس مجال العرض للتصوير. ويمكن أن يكون ذلك مفيداً بشكل خاص للتجارب التي تكون فيها للخلايا فترات طويلة في المرحلة M أو اعتقال مطول (مثل الظروف التي تحفز على تنشيط SAC). بالنسبة لهذه الخلايا، ونحن عادة صورة حتى يتم تبييض الخلايا (حوالي 2-3 ح)، ولكن التوقيت الكامل للخلايا القبض يجب أن يكون وفقا لتقدير الباحث. في بعض الأحيان يمكن أن تكون الخلايا متعددة قبل تقسيم في مستويات محورية مختلفة، وفي هذه الحالة قد يكون من المفيد إضافة مكدسات z لاستيعاب جميع الخلايا. إضافة المزيد من مكدسات z يمكن أن تساعد أيضا في تحسين الدقة. ومع ذلك، ينبغي توخي الحذر عند القيام بذلك، حيث أنه سيعرض الخلايا لمزيد من الإشعاع ويؤدي إلى تبييض ضوئي أسرع، فضلا ً عن أنه يؤدي إلى أحجام ملفات كبيرة على أجهزة تخزين الأقراص الثابتة.

تجنب تبييض الصور والسمية الضوئية

تصف طريقتنا إعدادات محددة لأوقات التعرض، وفواصل التصوير، ومكدسات z، ونفاذية النسبة المئوية لمصدر ضوء LED لدينا الذي يعمل بشكل عام لإعدادنا التجريبي والنتائج المطلوبة. كما المجاهر والأهداف التجريبية قد تختلف، ما قد يعمل بشكل جيد لنظامنا قد يؤدي إلى تبييض الصور قبل الأوان أو السمية الضوئية في الآخرين. قد يقدم الضرر الضوئي عدم وجود حركة المغزل، وتفتت الأنابيب الدقيقة، وديناميات الأنابيب الدقيقة المعيبة، وتفعيل نقطة تفتيش المغزل لفترات طويلة. وتتمثل إحدى الطرق المحتملة لتجنب هذه المزالق في الحد من وقت التعرض. معظم الكاميرات الحديثة تمتلك الآن نطاقات ديناميكية واسعة، ويمكن تعديل الرسوم البيانية لتصور الهياكل حتى في التعرض منخفضة جدا. وثمة تقنية أخرى تتهيى بزيادة الفاصل الزمني للتصوير (على سبيل المثال، إلى عدة دقائق بين الصور) بحيث يتم تقليل عدد المرات التي تتعرض فيها الخلية للضوء على مدى فترة جمع إجمالية. وهذا مفيد بشكل خاص في التصوير لفترات زمنية أطول (ساعات عديدة)، ويمكن أن يساعد بالإضافة إلى ذلك في تقليل حجم ملف هذه التجارب. الحد من عدد مكدسات z التي اتخذت يمكن أن تساعد أيضا في الحد من التعرض للضوء، وذلك باستخدام 2 أو حتى 1 فقط بدلا من 3. وعلاوة على ذلك، فإن ضبط نسبة انتقال الضوء (لمصادر ضوء LED)، أو استخدام مرشحات الكثافة المحايدة (ND) (لكل من مصباح الهالوجين ومصادر ضوء LED) سوف يقلل من شدة الضوء ويقترن بأوقات تعرض أطول يمكن أن يحافظ على الرؤية . عن طريق اختيار الخلايا مع سنتروسوميس منفصلة بالفعل، يمكن أن يكون التعرض العام محدودة في أن هذه الخلايا عادة ما تدخل mitosis بسرعة (في غضون دقيقة أو اثنتين) بعد بدء التصوير. يمكن للمرء أيضا تحديد الوقت الذي يسمح للخلايا ليتم تصويرها قبل NEBD. عادة ما يحدد مختبرنا هذه المرة في 10 دقيقة، ولكن يمكن فرض حد أكثر تحفظا بسهولة من قبل المستخدم. بالإضافة إلى ذلك، فإن إجراء أكثر 'الغازية' نوصي هو العلاج مع dsRNA المستهدفة ضد عنصر من SAC (مثل رود أو Mad2). إذا كان النمط الظاهري للاعتقال يرجع إلى تلف خلية غير محددة (على سبيل المثال، ديناميات microtubule المعيبة)، فإن مثل هذا العلاج أقل عرضة لقمع الاعتقال مقارنة بتأثير حسن النية لجين الاهتمام في التجربة الأصلية.

الاتجاهات المستقبلية

الطريقة الموصوفة هنا يمكن استخدامها على مجهر الفلورسنت بسيطة نسبيا لصورة بسرعة الانقسامات الخلية الحية ويمكن تكييفها بسهولة لتناسب التصميم التجريبي الخاص للباحث والأهداف. وقد نشرت عدة طرق ممتازة للزراعة، RNAi طرق الضربة القاضية، وtransmicroction عابرة، والمجهرية الفلورية لS2 وغيرها من خلايا دروسوفيلا 9،14،15، 16 سنة , 17.بروتوكولنا يقدم اثنين من المزايا. (1) استخدام خط خلية مستقرة مزدوجة (GFP: CID، mCherry:α-Tubulin) في وقت واحد علامات اثنين من الهياكل المصوية الرئيسية، ويتجنب المتاعب والمضاعفات المحتملة للانعاص العابر، ويضمن أن جميع الخلايا تقريبا سوف تعبر عن علامات الفلورسنت كما المرشحين المحتملين للتصوير. (2) يضيف التكيف مع الانقسام إلى البروتوكولات المنشورة التي تفحص الديناميات السيتوووووغفية في الخلايا غير المنقسمة، ويمتد إلى دراسة الأحداث السيتوتيكية في الوقت الحقيقي. في حين أننا نعتقد أن أسلوبنا هو تقنية قوية تضيف إلى ذخيرة الآخرين، يمكن أن يكون هناك دائما تحسينات. مجال معين من تقسيم الخلايا التي وجدنا من الصعب تصويرها هو تقسيم المركزية. يحدث هذا قبل NEBD ومن الصعب تحديد متى يكون centrosome واحد على استعداد للفصل إلى اثنين. استخدام علامات دورة الخلية الفلورية (Cyclin A و Cyclin B) يمكن أن تساعد في حل هذه المشكلة، ولكن يأتي على حساب القنوات التي يمكن استخدامها لتصور مكونات تقسيم الخلية. أفضل استراتيجية لدينا لمحاولة تصور تقسيم سنتروسوم هو إضافة اكتساب عدة نقاط إلى برنامج التصوير (تحديد نقاط مختلفة في مستوى XY إلى صورة)، ولكن هذا يمكن أن يؤدي إلى ملفات كبيرة، ويمكن أن تتطلب أيضا (اعتمادا على عدد من النقاط) زيادة الفاصل الزمني بين جمع الصور، وتقليل دقة الوقت للفيلم الناتج. ويمكن أن يكون حل آخر تزامن الخلايا في مرحلة دورة الخلية المطلوبة باستخدام الأدوية التي تستهدف المنظمين دورة الخلية تليها غسل اللاحقة قبل التصوير, على الرغم من أن هذه الأساليب قد لا تكون موثوقة في الخلايا S2 على وجه التحديد.

ويوفر البروتوكول المعروض هنا أساسا للتطبيقات المستقبلية في التصوير بالخلايا الحية أيضا. ومع تحسين تكنولوجيا التصوير والبرمجيات، يمكن أن يكون من الممكن إجراء تعديلات عالية حقاً على إنتاجية هذا البروتوكول باستخدام قدرة أعلى، يمكن أن تكون اللوحات متعددة الغرف ممكنة. مثل هذه الابتكارات من شأنها أن تجعل شاشات RNAi على نطاق واسع، مثل تلك التي تحققت بالفعل في الاستعدادات الثابتة12،18،أكثر قابلية للبسط في شكل خلية حية. ويمكن أيضا تصور شاشات المخدرات جزيء صغير كوسيلة لتحديد المركبات الجديدة التي تستهدف عمليات تقسيم الخلايا. كما يمكن أن يؤدي تحسين الفلوروفوروالات البصرية إلى تصوير مكونات ميتوتيك متعددة (وليس فقط المكونات التي نصفها)، مما يتيح تصوير جهات تنظيمية ميتوتيكية محددة وتفاعلاتها مع الحمض النووي و/أو المغزل. على سبيل المثال، توليد الخلايا مع الصحفيين الفلورسنت التي تعبر عن بعد تلف الحمض النووي أو أثناء المبرمج سيكون أدوات مفيدة لتحديد الجينات الجديدة المشاركة في هذه العمليات. ويمكن استخدام نُهج مماثلة لدراسة ديناميات دورة الخلايا باستخدام تعبير السيكلينات ذات العلامات الفلورية19.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يعلنونه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (R01 GM108756). نحن ممتنون لغاري كاربن (جامعة كاليفورنيا، بيركلي) لتزويدنا بسخاء مع GFP: CID S2 مخزون خط الخلية التي لدينا GFP: CID / mCherry: تم إنشاء خط αTubulin10.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bright-Line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA for cell counting
cellSens imaging software Olympus
CELLSTAR Cell Culture Flask, 50 mL, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10 PCS/BAG Greiner Bio-One 690175
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed Greiner Bio-One 657160
Centrifuge 5804 R eppendorf Cat. 022623508
Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% Sigma-Aldrich C3036-250G
Corning Fetal Bovine Serum Fisher Scientific MT35015CV
Effectene Transfection Reagent 1 mL Qiagen 301425 for transient transfection
IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope Olympus
LabTek Chambered Slide Insert Applied Scientific Instruments I-3016
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific AM1334 For dsRNA production
MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit ORFLO MXZ001 for cell counting
MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller Applied Scientific Instruments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well Thermo Fisher Scientific 155409
Orca-Flash 4.0 LT Camera Hammamatsu Photonics K.K. C11440-42U
pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector Thermo Fisher Scientific V412020
Poly-L-Lysine Cultrex 3438-100-01
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 302310000
Schneider's insect medium Sigma-Aldrich S0146-100ML
Spectra Tub Centrifuge Tubes VWR 470224-998
Uner Counter BOD Incubator Sheldon manufacturing (VWR) 89409-346
X-CITE 120 LED ExcelitasTechnologies Led light source
Z -Drift Compensator (ZDC) Olympus infrared focus check

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ragkousi, K., Gibson, M. C. Cell division and the maintenance of epithelial order. Journal of Cell Biology. 207, (2), 181-188 (2014).
  2. Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, (32), 14217-14222 (2010).
  3. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013, (10), 970-977 (2013).
  4. Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  5. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, (11), 2207-2215 (2011).
  6. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, (10), 2467-2473 (2007).
  7. Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Imaginal Discs. Methods in Molecular Biology. 1478, 203-213 (2016).
  8. Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11, (9), e0163744 (2016).
  9. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nature Protocols. 3, (4), 606-611 (2008).
  10. Dewey, E. B., Johnston, C. A. Diverse mitotic functions of the cytoskeletal cross-linking protein Shortstop suggest a role in Dynein/Dynactin activity. Molecular Biology of the Cell. 28, (19), 2555-2568 (2017).
  11. Rodriguez, E. A., et al. The Growing and Glowing Toolbox of Fluorescent and Photoactive Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, (2), 111-129 (2017).
  12. Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes and Development. 22, (16), 2189-2203 (2008).
  13. Basto, R., Gomes, R., Karess, R. E. Rough deal and Zw10 are required for the metaphase checkpoint in Drosophila. Nature Cell Biology. 2, (12), 939-943 (2000).
  14. Currie, J. D., Rogers, S. L. Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility. Nature Protocols. 6, (10), 1632-1641 (2011).
  15. Lu, W., Del Castillo, U., Gelfand, I. V. Organelle transport in cultured Drosophila cells: S2 cell line and primary neurons. Journal of Visualized Experiments. (81), e50838 (2013).
  16. Yang, J., Reth, M. Drosophila S2 Schneider cells: a useful tool for rebuilding and redesigning approaches in synthetic biology. Methods in Molecular Biology. 813, 331-341 (2012).
  17. Zhou, R., Mohr, S., Hannon, G. J., Perrimon, N. Inducing RNAi in Drosophila cells by soaking with dsRNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, (5), (2014).
  18. Goshima, G., et al. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316, (5823), 417-421 (2007).
  19. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, (3), 487-498 (2008).
استخدام خلايا <em>Drosophila</em> S2 للتصوير الحي لقسم الخلايا
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dewey, E. B., Parra, A. S., Johnston, C. A. Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division. J. Vis. Exp. (150), e60049, doi:10.3791/60049 (2019).More

Dewey, E. B., Parra, A. S., Johnston, C. A. Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division. J. Vis. Exp. (150), e60049, doi:10.3791/60049 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter