Summary
세포 분열은 형광성 으로 태그된 단백질 및 시간 경과 현미경 검사법을 사용하여 실시간으로 구상될 수 있습니다. 여기에 제시된 프로토콜을 사용하여 사용자는 세포 분열 타이밍 역학, 유사분열 스핀들 어셈블리 및 염색체 의회 및 분리를 분석할 수 있습니다. RNA 간섭 (RNAi)-매개 유전자 녹다운 다음 이 사건에 있는 결점은 평가되고 정량화될 수 있습니다.
Abstract
초파리 S2 세포는 조직 배양에서 유사분열을 연구하는 데 중요한 도구로, 신속하고 처리량이 많은 방식으로 이 근본적인 세포 과정에 대한 분자 통찰력을 제공합니다. S2 세포는 고정 및 라이브 셀 이미징 응용 프로그램 모두에 대한 의무가 입증되었습니다. 특히, 살아있는 세포 화상 진찰은 유전자의 손실 또는 녹다운이 유사분열 스핀들 어셈블리, 염색체 의회 및 분리를 포함하여 세포 분열 도중 중요한 사건의 역학 그리고 역학에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지에 관하여 귀중한 정보를 산출할 수 있습니다, 뿐만 아니라 전체 셀 주기 타이밍. 여기서 우리는 형광태그mCherry로 안정적으로 형질감염된 S2 세포를 활용합니다:α-tubulin은 유사분열 스핀들 및 GFP를 표시합니다:CENP-A (Drosophila에있는 'CID' 유전자로 지칭)는 중도변동을 표시하여 주요 유사분열 유전자의 타이밍에 미치는 영향을 분석합니다. 세포 분열, 위상에서 (특히 핵 봉투 고장에서; NEBD)를 아나페이즈 개시에. 이 화상 진찰 프로토콜은 또한 유사분열을 통하여 스핀들 미세소관 및 염색체 역학의 시각화를 허용합니다. 본 명세서에서, 우리는 독자가 라이브 이미징 실험을 위해 S2 세포를 쉽게 적응시킬 수 있는 간단하면서도 포괄적인 프로토콜을 제공하는 것을 목표로 한다. 이러한 실험에서 얻은 결과는 여러 동시 및 동적 이벤트에서 자신의 역할을 정의하여 세포 분열에 관련된 유전자에 대한 우리의 이해를 확장해야합니다. 이 세포 배양 시스템에서 이루어진 관찰은 파리에서 유전적 접근법의 인상적인 툴킷을 사용하여 생체 내에서 검증되고 추가로 조사될 수 있다.
Introduction
세포 분열은 모든 다세포 유기체에 중요한 과정입니다, 모두그들의 발달과 항상성 1. 초파리는 다양한 조직 유형과 유전 적 조건에 대한 실험으로 세포 분열 연구를위한 모델로 오랫동안 사용되어 왔으며 프로세스에 대한 주요 통찰력을 제공합니다. 이러한 통찰력의 대부분은 고정 된 세포 조건에서 온 동안, 세포 분열은 많은 움직이는 부분과 동적 절차, 세포 분열의 수많은 부분에 RNAi 또는 유전 녹아웃 효과를 평가하는 데 필수적인 라이브 세포의 시각화를 만들기, 포함 스핀들 형성, 염색체 의회 및 분리, 및 사이토 카인시스.
많은 프로토콜개발 및 생체 내에서 Drosophila 세포 분열을 시각화 하기 위해 수년에 걸쳐 활용 되었습니다. 다양한 그룹은 애벌레 상상력 디스크와 애벌레 뇌2,3,4,5,6,7,8 모두에서 이미지 분열을 심기 하는 기술을 육성 했다 . 이 기술은, 특정 조직에 있는 화상 진찰을 위해 유용하 동안, 처리량에서 제한되고 수시로 형광 성분을 생성하고 관심있는 유전자의 표정을 바꾸기 위하여 유전 주식의 생성 그리고 정비를 요구합니다. Drosophila에서 배양된 S2 세포는 세포 분열에 있는 각종 유전자의 효력을 급속하게 시험하기 위하여 더 높은 처리량 대안을 제공합니다. 또한, 다양한 형광 단백질을 트랜스펙트하는 능력으로, S2 세포는 세포 분열의 수많은 성분에 대한 RNAi 녹다운의 효과를 결정하기 위해 신속하게 변형 될 수있다. 관심 있는 형광 태그유전자는 세포 분열에서도 관찰될 수 있으며, 이들의기능 9의 동적 특성화를 가능하게 한다.
여기에서 우리는 우리가 최근에 기술한방법 10를사용하여 유사분열S2 세포의 살아있는 화상 진찰을 위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 우리의 방법은 구리 유도 성 프로모터 (metallothionein; pMT)의 통제하에 있는 미세소관 및 centromeres를 위한 형광 마커를 가진 안정적으로 형질감염된 세포를 이용합니다. 이 방법론은 기본적인 화상 진찰 소프트웨어를 가진 상대적으로 간단한 형광 현미경을 이용하는 유사분열의 모든 단계에서 스핀들 및 염색체 역학을 심상하기 위하여 이용될 수 있습니다. 그것은 개별적인 연구 필요에 맞추기 위하여 추가 주문을 받아서 만들 수 있습니다, 과도 한 transfection 및 RNAi 유사분열에 있는 후보 유전자의 역할을 결정하기 위한 확장된 가능성을 제안하는. 프로토콜의 상대적 단순성 때문에, 그것은 생체 내에서 추가 연구가 도움이 될 것입니다 유전자를 식별하기 위해 작은 규모의 기능 손실 스크린에 사용할 수 있습니다, 후속 유전과 더 집중 된 노력과 효율성을 허용 파리에서 조작.
Protocol
1. RNAi로 치료를위한 S2 세포의 준비
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공조 pMT:CiD 및 pMT:mCherry:α-tubulin 안정적으로 형질 감염된 S2 세포 (~80% 생존; 24-28 °C에서 성장), 종자 세포에서 6 잘 멸 균 배양 플레이트의 밀도1 x 106 세포/mL 의 밀도, 따뜻한, 10% 태아 소 혈청 (FBS) 슈나이더의 곤충 미디어 (SIM)를 보완.
참고: 안정적으로 형질감염된 S2 세포는 초파리 RNAi 스크리닝 센터(DRSC)(https://dgrc.bio.indiana.edu/Protocols?tab=cells)로부터 프로토콜을 따짐으로써 생성될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 특정 안정S2 라인은 GFP 및 mCherry를 이용하지만, 수많은 대안은 이들 뿐만 아니라 이들 내에 존재한다. 이 형광 성 단백질의 상세한 토론은 이 프로토콜의 범위를 벗어납니다, 그러나 그들의 속성 및 잠재적인 이점/단점은 다른 곳에서 전문적으로 검토되었습니다 11.- 세포 카운터 또는 혈혈계를 사용하여, 결합 세포 스톡의 밀도를 결정한다.
- 총 4 mL(예: ~ ~4 x 106 총 셀)에서 1 x 106 셀/mL을 달성하는 데 필요한 결합 셀 현탁액의 부피를 결정합니다. 이 볼륨의 셀 스톡을 신선한 SIM 볼륨에 추가하여 4 mL/웰 총 볼륨을 만듭니다. 100 μL의 매체로 스톡 플라스크에서 직접 100 μL의 셀을 희석하고 이 1:2 희석을 혈세포계 또는 자동 셀 카운터로 수동으로 계산하여 셀 스톡(cell/mL)의 밀도를 결정합니다.
참고: S2 세포를 안정적으로 형질감염시키지 않는 경우, 형광태그(GFP, mCherry 등) α-또는 β-tubulin, 및 DNA 마커(CENP-A, 히스톤 H2B 등)를 이용한 과도 형질전환 분석이 수행될 수 있다. 또한, 다양한 유사분열 스핀들 및 DNA 마커를 가진 안정적으로 형질감염된 세포주는 사용자의 정확한 실험 요구에 더 잘 부합할 수 있는 Drosophila 유전학 자원 센터에서 사용할 수 있습니다 (https://dgrc.bio.indiana.edu/cells/Catalog). - 갓 씨드 세포를 36-48 시간 동안 24-28 °C 인큐베이터에 놓습니다.
2. 관심 유전자에 대한 dsRNA로 종자 세포의 치료
참고: 다음 의 예 및 결과 섹션은 유격수(Shot)를 사용하여, 액틴-마이크로스터블 가교제를 관심 있는 유전자로서 사용할 것이다. dsRNA가 없거나 관련없는 유전자 (예를 들어, 베타-갈락토시다아제, lacZ)에 대한 지시가없는 모의 치료를 음성 대조군으로 사용하십시오.
- 따뜻한 슈나이더의 곤충 미디어는 FBS로 보충되지 (혈청 무료 미디어; SFM)을 24-28°C 인큐베이터에서
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이전에 시드된 웰(단계 1.1.2)으로부터 15 mL 멸균 튜브로 세포를 옮기고, 전달된 세포의 총 부피를 지적했다.
- 세포 카운터 또는 혈세포계에서 계산하기 위해 소량의 세포(~100 μL)를 유지합니다.
- 실온에서 3분 동안 1,000 x g에서 원심분리하여 펠릿 세포를 부드럽게 합니다.
- 세포를 원심분리하는 동안, 세포 카운터 또는 혈세포계를 사용하여 mL당 세포의 농도를 결정한다. 이 숫자를 원심분리되는 총 부피(1.2.2.에 언급됨)를 곱하여 총 세포 수를 얻었다.
- 펠릿 세포에서 상월체를 흡인합니다.
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3 x 106 세포 /mL의 농도를 얻기 위해 따뜻하게 한 SFM에서 세포를 다시 일시 중단하십시오.
- 재중단된 세포의 1 mL을 6웰 플레이트에 있는 새로운 웰로 옮김.
- Shot (또는 관심 대상 유전자)에 대해 dsRNA (RNAase 없는 물 100 μL에서 희석)의 10-50 μg를 세포에 직접 넣고 접시를 소용돌이치게 합니다. 24-28°C 인큐베이터에서 1시간 동안 플레이트를 배양하여 세포 내로 직접 dsRNA 섭취량을 허용한다.
- 1 시간 배양 동안, 24-28 °C 인큐베이터에서 10% FBS 보충제 SIM을 따뜻하게 한다.
- 1 시간 동안 dsRNA로 세포를 인큐베이팅 한 후, 10 % FBS의 2 mL을 첨가하여 1 mL의 미디어를 제거하지 않고 웰에 직접 SIM을 보충했습니다.
- 세포를 24-28 °C 인큐베이터에 3-7 일 동안 놓습니다.
참고: dsRNA 농도와 마찬가지로, 총 처리 시간은 원하는 표적 유전자에 대해 최적화되어야 할 수도 있다. RNAi 효험을 평가하기 위하여는, 표적 유전자에 대하여 항체를 사용하여 전체 세포 용해에 서쪽 얼룩을 능력을 발휘합니다. 초기 dsRNA 표적 서열이 비효과를 입증하는 경우, 표적 유전자 내의 독특한 서열을 표적으로 하는 대체 dsRNAs를 설계한다.
3. 형광 단백질 발현 및 화상 진찰을 위한 세포의 준비의 유도
- 여기서 설명한 바와 같이 pMT 플라스미드(유도성 메탈로티오네인 프로모터 함유)를 사용하여 안정적으로 형질감염된 세포를 생성한 경우, 최종 농도에서구리 황산염(CuSO 4)으로 세포를 처리하여 형광 단백질의 발현을 유도한다. 500 μM 에 대한 24-36 시간 전에 화상 진찰 및 RNAi 처리 후 4 일. pAct와 같은 구성발 플라스미드의 사용은 구리 유도를 필요로 하지 않는다.
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이미징을 위한 세포 준비
- 10% FBS보충제SIM을 24-28°C 인큐베이터에서 1시간 동안 데우세요.
- 세포를 15 mL 멸균 튜브로 옮기고, 전달된 세포의 총 부피를 지적합니다.
- 세포 카운터 또는 혈세포계에서 계산하기 위해 소량의 세포(~100 μL)를 유지합니다.
- 실온에서 3분 동안 1,000 x g에서 원심분리하여 펠릿 세포를 부드럽게 합니다.
- 세포를 원심 분리하는 동안 세포 카운터 또는 혈세포계를 사용하여 농도 (세포 / mL)를 결정하십시오. 이 숫자를 원심분리되는 총 부피(2.2.2.에 언급됨)를 곱하여 총 세포 수를 얻었다.
- 펠릿 세포에서 상월체를 흡인합니다.
- 신선하고 따뜻하게 한 10% FBS 보충제 SIM으로 세포를 다시 일시 중단하여 2 x 106 세포/mL의 농도를 얻습니다. 500 μM 농도를 유지하기 위해 적절한 양의 CuSO 4를 추가하십시오.
- 재부유 세포의 200-500 μL을 다중 웰 라이브 세포 챔버의 한 우물에 옮기고 반전된 형광 현미경상에 놓습니다. 세포가 이미징 실험 전에 15-30 분 동안 챔버에 정착할 수 있도록 하십시오.
참고: 살아있는 세포 챔버 웰은 추가적인 준수를 위해 폴리-L-리신으로 미리 코팅될 수 있다.
4. 라이브 셀 이미징 프로그램 설정
참고: 본 실험에서 라이브 셀 이미징은 반전된 이미징 시스템 및 관련 소프트웨어(예를 들어, 셀센스 치수 소프트웨어 패키지와 함께 올림푸스 IX83)를 사용하여 수행하였다. 세부 사항은 현미경 제조업체 및 소프트웨어 패키지에 따라 다릅니다. 따라서 일반적인 지침 및 작업은 다음과 같습니다.
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반전형광 현미경을 실행하는 소프트웨어를 사용하여 시간이 지남에 따라 세포(또는 세포)를 이미징하기 위한 프로그램을 준비합니다.
- 소프트웨어 데스크톱 아이콘을 두 번 클릭하여 소프트웨어를 엽니다.
- 파일을클릭한 다음 새 실험 파일을 클릭하여 새 실험 파일을만듭니다.
- 먼저 이미지를 촬영할 시간 경과 루프를 삽입합니다. 아이콘 표시줄에서 스톱워치 아이콘(타임랩스 루프 아이콘)을 클릭하여 이 작업을 수행합니다. 실험 관리자 탭에서 s간격을 설정한 다음 원하는 전체 실험 길이(에서)를 간격으로 나누어 동일한 탭의 사이클 수를 설정합니다. 루프가 원하는 총 기간 동안 반복되도록 합니다.
참고: 일반적으로 이미지는 3-4 시간 동안 30-60 s마다 촬영됩니다. - 타임랩스 루프 레이어 내에서 적외선 포커스 검사를 삽입하여 목표초점(사용 가능한 경우)을 유지합니다. 이렇게 하려면 두 개의 화살표 아이콘(XY 이동 아이콘)이 있는 사각형을 클릭하고 드롭다운 메뉴에서 Z-드리프트 보정을 선택하여 시간 경과 루프 레이어 내에 Z-드리프트 보상(ZDC) 단계를 추가합니다.
참고: 적외선 포커스 검사라는 용어는 적외선 펄스가 목표와 슬라이드/이미징 챔버 사이의 일정한 거리를 유지하는 데 사용되는 시스템을 말합니다. 많은 현미경에는 각각 독점적 인 명명명이있는 시스템이 있습니다. 독자는 특정 이름 지정 세부 사항에 대한 작업 설명서 또는 담당자에게 문의해야 합니다. - 적외선 포커스 검사 후, 먼저 z 스택 단계를 삽입한 다음 채널을 지정하여 3-5z 스택 위에 다중 채널 이미지(예: GFP용 FITC 및 mCherry용 TRITC)를 취하는 프로그램의 단계를 추가합니다. 색상 휠 아이콘(다중 채널그룹 아이콘)을 클릭하여 타임랩스 루프 레이어 내에 다중 채널 그룹 레이어를 추가합니다. 다음으로 3계층 아이콘(Z 스택 루프 아이콘)을 클릭하여 다중 채널 그룹 레이어 내에Z 스택 루프 레이어를 추가합니다. 실험 관리자 탭에서 원하는 단계 크기 및 슬라이스 수를 설정하고 각 채널의 노출을 가능한 한 낮게 설정하여 광표백을 최소화합니다.
참고: LED의 z 스택 간격, 노출 시간 및 백분율 전송은 다를 수 있습니다. 이러한 실험에서 전형적인, 3 μm의 범위에 걸쳐 촬영 세 z 스택을 사용 하 여, 각 스택 사이 1 μm의 간격을 주는. 상하가 아닌 셀의 중심을 정의하는 것은 최상의 결과로 이어지는 경향이 있습니다. 그런 다음 각 채널에 대해 50ms의 노출과 50%의 전송률로 중립 밀도(ND) 필터가 결합되지 않고 이미지를 수집합니다.
5. 라이브 셀 이미징 프로그램을 사용하여 세포를 분할하는 이미지
참고: S2 세포는 CO2를 필요로 하지 않으며 23-27°C에서 최적으로 성장한다. 모든 이미징은 잘 조절된 방에서 주변 온도에서 수행되었다.
- 안구를 사용하여 웰의 위쪽(또는 아래쪽) 모서리를 찾아 mCherry(α-tubulin) 채널을 사용하여 세포에 목표(40-60x 오일 침지)를 집중시다.
- 웰의 위쪽(또는 아래쪽)을 따라 스캔하여 수직 웰 디바이더에서 멀리 이동합니다.
참고: 웰 디바이더에 너무 가깝게 이미징하면 적외선 초점 검사를 방해할 수 있습니다. - G2 후반 또는 초기 M상(prophase)에 있는 세포(또는 세포)를 찾습니다.
참고: 이 세포는 정확하게 2개의 '별 같이' 미세소관 구조물 (centrosomes) 및 본래 핵 (세포 내굴린빛의 원형 지구에 의해 표시됨)의 존재에 의해 가장 잘 확인될 수 있습니다, 둘 다 α-tubulin (적색)를 사용하여 쉽게 구별됩니다 여기 필터. 쉽게 볼 수 있는 중도에서 주목할 만한 초기 중간 상에서 세포를 선택하면 G2/M 진행의 지연으로 인해 시간을 낭비할 수 있습니다. 반대로, NEBD 후에 세포의 선택은 초기 스핀들 어셈블리 및 염색체 역학의 유사분열 타이밍 그리고 화상 진찰의 정확한 계산을 방지할 것입니다. 또한, S2 세포는 종종 >2 센트로솜을 함유한다. 이들은 전형적으로 양극성 스핀들(12)로군집하지만, 실험 설계를 원하지 않는 한 사용자는 이러한 세포를 피하는 것이 좋습니다. 선택할 적절한 셀에 대한 이미지와 토론은 대표 결과 섹션에서 찾을 수 있습니다. - 라이브 뷰 버튼을 클릭하여 소프트웨어 화면에서 셀 보기를 시작합니다. 현미경의 미세 초점 손잡이를 사용하여 관심있는 세포 (또는 세포)에 초점을 맞춥니다. 초점 설정 버튼을 클릭하여 적외선 초점 검사를 설정합니다.
- 시작 단추를 클릭하여 시간 경과 이미징 프로그램을 시작합니다. 원하는 채널을 선택하고 관심 있는 셀(또는 셀)을 명확하게 볼 수 있도록 평균 픽셀 강도를 조정하여 필요에 따라 히스토그램을 조정합니다.
- 프로그램을 실행하도록 허용하고 15-20 분 후에 세포를 확인하여 핵 봉투 고장 (NEBD)이 발생했는지 확인하며, 이는 세포 중심 근처의 굴절 된 반점인 둥근 어두운 지점의 실종에 의해 결정됩니다.
- 계속 프로그램을 실행하도록 허용하고, 간헐적으로(15-20분마다) anaphase 발병이 발생한 후 결정합니다. 총 기간에 남은 시간이 더 많으면 이 시점에서 프로그램을 중지하고 파일을 저장합니다. 또는 말단 말단 상 및 사이토 카인증 중 이벤트가 관심이있는 경우 프로그램이 이러한 프로세스를 이미지화하기 위해 충분한 시간을 실행할 수 있습니다.
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NEBD의 분석을 수행하여 NEBD의 시간 (tNEBD)의시간을 최소로 지적하고 초기 염색체 분리 시간 (tanaphase개시)을 분에서 빼고 tanaphase 개시에서 tNEBD를 빼기 주어진 세포에 대한 anaphase 발병 시간으로 NEBD.
- 프레임 업 버튼을 클릭하고 NEBD 및 anaphase 발병이 발생하는 프레임을 기록하고 이를 빼서 경과 프레임의 총 수를 결정하고 이미징 프레임 사이의 시간 간격을 곱합니다.
- 주어진 조건에 대한 여러 n's를 얻기 위해 사전 분할 셀에 대한 스캐닝을 계속합니다. 세포는 그들의 처음 침전 후에 최대 12 시간 동안 살아있는 세포 챔버에서 잘 심상화될 수 있습니다.
Representative Results
우리가 위에서 설명하는 방법은 세포 분열을 겪고 있는 Drosophila S2 세포의 식별 및 화상 진찰 귀착될 것입니다. 분할하려고 하는 세포(즉, M상을 입력하기 직전에) α-tubulin 채널에서 볼 때 굴절된 빛과 세포 내의 더 어두운 반점으로 표시된 2개의 중도체 및손상되지 않은 핵의 존재에 의해 표적화될 수 있다(그림 1, 가장 왼쪽 패널, 빨간색 채널; 그림 1A의화살촉)을 클릭합니다. 우리는 세포의 대략 2-5%가 이 분류에 속한다는 것을 추정하고, 화상 진찰 실험 사이, 우리는 일반적으로 다른 자격을 갖춘 세포를 위한 스캐닝을 2-3 분의 최대 를 보냅니다. NEBD는 이 어두운 반점의 실종을 통해 시각화될 수 있으며, 그결과 세포질의 균일한 색소가 생성됩니다(그림 1, 패널이 "00:00", 빨간색으로 표시함). NEBD 후에, 각 세포가 스핀들을 형성하는 데 걸리는 시간, 의회 염색체 및 분리 염색체는 NEBD에 상대적인 이 사건의 시간 점을 주의해서 간단하게 측정될 수 있습니다.
우리는 염색체가 분리되기 시작하는 점을 지적하는 anaphase 개시에 NEBD의 특히 유사분열 타이밍을 평가하기 위하여 이 분할을 이용합니다. 과반수 (~90%) 구리 유도 세포의, mCherry:α-tubulin 및 GFP:CID를 모두 발현하였다. 세포의 작은 비율 (~10%) 마커가 하나만 표시되거나 둘 다 표현되지 않습니다. 이들 세포는 세포 선택 중에 피하였다. 전형적으로, S2 세포는 20-30 분 사이의 anaphase 개시 타이밍에 NEBD를 표시합니다 (그림1A,대조군). 다음으로 DsRNA를 대상으로 한 세포를 유격수(Shot)로 처리했으며, 이는 세포 주기 역학에 영향을 줄 수 있다고 의심되는 액틴-마이크로스터풀 가교 단백질입니다. 실제로, 다음 샷 녹다운 세포는 상당한 유사 분열 지연을 나타냈다 (그림1B,ShotRNAi 지연), 많은 세포가 메타상에서 체포하고 전체 2-3 시간 화상 진찰 실험 동안 아나상으로 전환하지 (그림1D, 쇼트RNAi 체포). 우리는 이 지연/체포 표현형이 스핀들 어셈블리 체크포인트(즉, M-phase checkpoint)의 활성화 때문일 수 있다고 추론했습니다. 이 가설을 직접 테스트하기 위해, 우리는 이 체크포인트13의중요한 구성 요소인 샷 및 러프 딜(Rod)에 대해 dsRNA를 가진 세포를 공동 처리하였다. 이것은 정지 표현형의 억압으로 이끌어 냈습니다, 대조군과 유사한 anaphase 시간NEBD귀착되었습니다 (그림1C,ShotRNAi+RodRNAi). 따라서, 이 살아있는 화상 진찰 프로토콜은 우리가 Shot이 적시에 M 단계 진행을 위해 요구되고 그것의 손실이 미토틱 세포를 연기하거나 체포하는 체크포인트 활성화로 이끌어 낸다는 결론을 내릴 수 있었습니다.
그림 1: 살아있는 화상 진찰은 S2 세포에 있는 유사점 체크포인트 활성화 때문에 세포 주기 결점을 제시합니다.
모든 조건에서, 살아있는 세포 이미징은 유도성 GFP로 안정적으로 공동 형질감염된 S2 세포에서 수행되었다:CID 및 mCherry:αTubulin 본원에 기재된 바와 같이. (A) 만화는 유사분열 시 중요한 랜드마크를 보여주며, 해당 이미지는 NEBD(t=00:00)를 기준으로 한 시간 포인트가 표시된 표시된 유전자형의 대표 영화에서 표시됩니다. 대조군 세포는 전형적으로 20-30 분 안에 anaphase로 진행합니다. ShotRNAi처리된 세포는 NEBD-anaphase delay (B)를 표시하고 빈번하게 화상 진찰 실험 내의 anaphase를 입력하지 않는 중추가 체포를 겪습니다 (D). 스핀들 어셈블리 체크포인트의 구성 요소인 ShotRNAi 및 RodRNAi와 세포의 공동 치료는 대조군 세포와 유사한 발병 역학으로 이어지는샷 표현형을 억제합니다(C). (A)의화살표는 '별모양' 중심 구조를 나타내고 큰 화살촉은 핵을 나타냅니다. 각 스케일 막대는 5 미크론을 나타냅니다. 이 그림은 10(https://www.molbiolcell.org/info-for-authors)의 허가를 받아 다시 게시됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: '제어' S2 셀 분할의 타임랩스 동영상. 비디오는 '제어' 유전자형에서 S2 세포 분열의 대표적인 영화를 보여줍니다. 이 동영상은 그림 1A에해당합니다. 이 비디오는10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors)의 허가를 받아 다시 게시됩니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 2: 지연된 'ShotRNAi' S2 세포 분열의 타임랩스 동영상. 비디오는 표현형 유사분열 지연으로 이끌어 내는 'ShotRNAi' 유전자형에 있는 S2 세포 분할의 대표적인 영화를 보여줍니다. 이 동영상은 그림 1B에해당합니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 3: 'ShotRNAi+RodRNAi' S2 세포 분열의 타임랩스 영화. 비디오는 'ShotRNAi +RodRNAi' 유전자형에서 S2 세포 분열의 대표적인 영화를 보여줍니다. 이 동영상은 그림 1C에해당합니다. 이 비디오는10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors)의 허가를 받아 다시 게시됩니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 4: 체포 된 'ShotRNAi'S2 세포 분열의 타임 랩스 영화. 비디오는 표현형 유사분열 체포로 이끌어 내는 'ShotRNAi' 유전자형에 있는 S2 세포 분할의 대표적인 영화를 보여줍니다. 이 동영상은 그림 1D에해당합니다. 이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
적절한 셀 식별
S2 세포를 분할하는 화상 진찰의 열쇠는 먼저 적당한 세포를 찾아내는 것입니다. 시간은 실수로 분할 할 준비가 될 것으로 생각하지만 합리적인 기간에 그렇게하지 못하는 이미징 세포를 낭비 할 수 있습니다. 세포는 2개의 명백하고 눈에 보이는 centrosome 및 온전한 핵이 있는 확인되어야 합니다. 센트로좀은 미세소관 섬유가 방출되어 "별과 같은" 모양을 만들어야 합니다. 그대로 핵은 초점을 조정할 때 빛을 굴절시키고, 또한 외관에서 세포의 대략적인 중심을 어둡게 만듭니다. 핵은 또한 GFP를 포함 할 것이다 : CID "점", 그것의 식별에 도움이 또 다른 구별 기능. >2 센트로솜을 가진 세포, 수관 섬유가없는 수분 puncta, 또는 1 센트로솜이있는 세포는 피해야합니다. 추가적으로, 2개의 centrosomes가 보이고 있는 경우에, 그러나 핵은, NEBD는 이미 발생하고 완전한 M 상 분석이 요구되는 경우에 그 분할에서 심상될 세포가 너무 멀리 진보합니다. 일단 적당한 세포가 발견되면, NEBD가 빨리 (전형적으로 3-5 분 안에) 일어나고 화상 진찰의 시작을 연기하는 것은 놓친 기회로 이끌어 낼 수 있기 때문에 화상 진찰을 시작하는 속도는 중요합니다. 이미징 소프트웨어에 셀을 빠르게 초점을 맞추어 두 중심체가 서로 평면에 없는 경우, Z 스택이 정의된 중심 위와 아래에 수집될 때 각각 캡처할 수 있도록 둘 사이의 초점을 설정합니다. 지점. 일단 집중되면, 적외선 포커스 검사(가능한 경우)를 사용하여 스테이지와 라이브 셀 챔버 표면 사이의 오프셋을 즉시 설정하고 이미징 프로그램을 시작합니다. 여기에 제시된 프로토콜은 NEBD-anaphase 역학을 평가하는 실험을 위해 특별히 맞춤화되었지만 간단한 수정은 대체 유사분열 사건을 연구하는 독자에게 적합할 수 있습니다. NEBD-메타페이즈 및 아나페이즈-투-말단 위상 이미징의 경우, 이러한 프로세스가 매우 동적이며 S2 세포에서 빠르게 발생하기 때문에 10초의 이미지 캡처 간격을 제안합니다(5-10분). 메타페이즈-아나페이즈 전이(일반적인 실험 적 초점)는 S2 세포에서 더 긴 과정(20-30분)이며, 30초 간격으로 이미지를 수집합니다. 마지막으로, 말단 단계 통해 사이토 카인증은 S2 세포에서 아주 느리게 발생하고, 우리는 이 대략 적인 시간 긴 프로세스를 위한 충분한 해결책을 제공하는 60s 간격을 건의합니다.
이미징 프로그램 전반에 걸쳐 초점 유지
적외선 초점 검사 장치를 사용할 수 없는 경우 이미징 프로그램 중에 세포가 초점이 벗어나어 모호하고 해석할 수 없는 결과를 초래할 수 있으므로 현미경이나 테이블에 부딪히지 않도록 해야 합니다. 폴리-L-리신으로 라이브 셀 챔버 웰을 미리 코팅하면 세포 순결에 도움이 될 수 있으며, 이는 세포 이동을 방지하고 적외선 초점 검사없이 설정에 특히 유용합니다. 또한 충격 흡수 플랫폼이나 에어 테이블을 포함한 설정은 세포가 초점이 벗어나는 것을 방지하는 데 도움이 될 수 있습니다. 마지막으로 일부 소프트웨어 프로그램에는 일시 중지 기능이 있어 사용자가 프로그램을 다시 초점을 맞추고 다시 시작할 수 있습니다.
여러 세포 이미징
데이터의 축적에 도움이 되는 것은 종종 여러 셀을 분할할 준비가 되어 있는 이미징을 위해 동일한 시야 내에 배치할 수 있다는 것입니다. 이는 세포가 긴 M상 기간 또는 장기간 체포(예를 들어, SAC의 활성화를 유도하는 조건)가 있는 실험에 특히 유용할 수 있다. 이 세포를 위해, 우리는 전형적으로 세포가 광표백될 때까지 심상 (대략 2-3 h), 그러나 체포된 세포의 전체 타이밍은 연구원의 재량에 따라야 합니다. 때로는 여러 사전 분할 셀이 다른 초점 평면에있을 수 있으며, 이 경우 모든 셀을 수용하기 위해 z 스택을 추가하는 것이 유용 할 수 있습니다. z 스택을 더 추가하면 해상도를 개선하는 데도 도움이 됩니다. 그러나 이 작업을 수행하려면 셀이 더 많은 방사선에 노출되고 더 빠른 광표백으로 이어질 뿐만 아니라 하드 디스크 저장 장치에서 큰 파일 크기로 이어질 수 있으므로 주의해야 합니다.
포토표백 및 광독성 방지
당사의 방법은 일반적으로 실험 설정 및 원하는 결과에 적합한 LED 광원에 대한 노출 시간, 이미징 간격, z 스택 및 퍼센트 투과에 대한 특정 설정을 설명합니다. 현미경과 실험 적인 목표는 다를 수 있습니다, 우리의 시스템에 대 한 잘 작동 수 있습니다 조기 광 표백 또는 다른 사람에 광 독성으로 이어질 수 있습니다. 광손상은 스핀들 움직임, 미세소관 단편화, 결함이 있는 미세소관 역학 및 장기간 스핀들 체크포인트 활성화의 부족을 나타낼 수 있습니다. 이러한 함정을 피하는 한 가지 잠재적인 방법은 노출 시간을 제한하는 것입니다. 대부분의 최신 카메라는 이제 넓은 다이나믹 레인지를 가지고 있으며, 히스토그램은 매우 낮은 노출에서도 구조를 시각화하도록 조정할 수 있습니다. 또 다른 기술은 이미징 간격(예를 들어, 이미지 들 사이에서 몇 분)을 증가시키는 것으로, 세포가 총 수집 간격에 걸쳐 빛에 노출되는 횟수가 감소되도록 한다. 이것은 특히 더 긴 시간 (많은 시간)에 대한 이미징에 유리하며, 또한 그러한 실험의 파일 크기를 줄이는 데 도움이 될 수 있습니다. 촬영 z 스택의 수를 제한 하는 또한 빛 노출을 줄일 수 있습니다., 사용 하 여 2 또는 단지 1 대신 3. 또한, 빛의 퍼센트 투과도(LED 광원의 경우) 또는 중성 밀도(ND) 필터(할로겐 램프 및 LED 광원 모두)를 사용하면 광세기가 감소하고 노출 시간이 길어 가시성을 유지할 수 있습니다. . 이미 분리된 centrosomes를 가진 세포를 선택해서, 전반적인 노출은 이 세포가 일반적으로 화상 진찰을 시작한 후에 (1 분 또는 2 안에) 빨리 유사분열을 입력한다는 점에서 제한될 수 있습니다. 하나는 또한 NEBD 전에 세포가 이미지화 될 수 있는 시간을 제한할 수 있습니다. 우리 실험실은 일반적으로 이 시간을 10분으로 설정하지만 사용자가 보다 보수적인 제한을 쉽게 부과할 수 있습니다. 추가적으로, 우리가 추천하는 더 '침략적인' 측정은 SAC의 분대 (로드 또는 Mad2와 같은)에 대하여 표적으로 한 dsRNA를 가진 처리입니다. 체포 표현형이 비특이적 세포 손상(예를 들어, 결함이 있는 미세소관 역학)에 기인하는 경우, 이러한 치료는 본래 실험에서 관심 있는 유전자의 선의의 효과에 비해 체포를 억제할 가능성이 적다.
향후 방향
여기서 설명한 방법은 비교적 간단한 에피플루오닉 현미경을 활용하여 살아있는 세포 분열을 빠르게 이미지화할 수 있으며 연구자의 특정 실험 설계 및 목표에 맞게 쉽게 조정할 수 있습니다. 배양을 위한 몇몇 우수한 방법, RNAi 녹다운 접근, 과도 성 수표 및 형광 현미경 검사법은 S2및 그밖 Drosophila 세포9,14,15, 16세 , 17. 우리의 프로토콜은 몇 가지 장점을 제공합니다. (1) 이중 안정 세포주 (GFP :CID, mCherry:α-Tubulin)를 동시에 사용하면 두 가지 주요 유사 분열 구조를 표시하고 과도 성 수표의 번거 로움과 잠재적 인 합병증을 방지하고 거의 모든 세포가 형광 마커를 표현하도록 보장합니다. 이미징을 위한 잠재적인 후보자. (2) 유사분열에 대한 적응은 운동성, 비분열 세포에서 세포골격 역학을 검사하는 출판 된 프로토콜에 추가하고 실시간으로 유사분열 사건을 검사로 확장합니다. 우리는 우리의 다른 사람의 레퍼토리에 추가 하는 강력한 기술 이라고 생각 하는 동안, 항상 개선 될 수 있다. 우리가 심상하기 어려운 세포 분열의 1개의 특정 지역은 centrosome 분할입니다. 이것은 NEBD 이전에 발생하고 단일 중심체가 2로 분리 할 준비가되어 있는지 결정하기가 어렵습니다. 형광 세포 주기 마커를 사용하여 (Cyclin A 및 Cyclin B) 이 문제를 해결하는 것을 도울 수 있었습니다, 그러나 세포 분열 분대를 구상하기 위하여 이용될 수 있는 채널의 비용으로 옵니다. 중심 분열을 시각화하기 위한 최선의 전략은 이미징 프로그램에 다중 포인트 수집을 추가하는 것입니다(XY 평면에서 이미지에 다른 점을 정의)하지만 이로 인해 큰 파일이 발생할 수 있으며(점 수에 따라 다름)가 필요할 수도 있습니다. 이미지 수집 사이의 간격을 늘리고 결과 동영상의 시간 해상도를 줄입니다. 또 다른 해결책은 이 방법이 S2 세포에서 특히 믿을 수 없을지도 모르지만, 화상 진찰의 앞에 후속 세척에 선행된 세포 주기 레귤레이터를 표적으로 하는 약을 사용하여 원하는 세포 주기 단계에서 세포의 동기화일 수 있었습니다.
여기에 제시된 프로토콜은 라이브 셀 이미징의 향후 응용 분야도 위한 토대를 제공합니다. 향상된 이미징 및 소프트웨어 기술을 통해 더 높은 용량을 사용하는 이 프로토콜의 처리량이 매우 높은 멀티 챔버 플레이트를 사용할 수 있습니다. 이러한 혁신은 이미 고정 제제12,18,라이브 셀 포맷에서 더 견딜 수있는 것과 같은 대규모 RNAi 스크린을 만들 것입니다. 소분자 약물 스크린은 또한 세포 분열 프로세스를 표적으로 하는 새로운 화합물을 확인하는 수단으로 구상될 수 있었습니다. 형광단 및 광학 필터의 개선은 또한 특정 유사분열 조절제및 DNA 및/또는 스핀들과의 상호 작용을 가능하게 하는 다중 유사분열 성분(우리가 설명하는 2개뿐 아니라)의 이미징으로 이어질 수 있습니다. 예를 들면, DNA 손상을 따르거나 apoptosis 도중 표현하는 형광기자를 가진 세포를 생성하는 것은 이 프로세스에서 관련시킨 새로운 유전자를 확인하기 위하여 유용한 공구일 것입니다. 유사한 접근법은 형광태그된 사이클린(19)의 발현을 이용하여 세포주기역학을 검사하는데 사용될 수 있다.
Disclosures
저자는 선언할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 투자 되었다 (R01 GM108756). 우리는 게리 카펜 (캘리포니아 대학, 버클리 대학)에게 GFP : CID S2 세포주 주식을 아낌없이 제공한 것에감사드립니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | for cell counting |
| cellSens imaging software | Olympus | ||
| CELLSTAR Cell Culture Flask, 50 mL, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10 PCS/BAG | Greiner Bio-One | 690175 | |
| CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Centrifuge 5804 R | eppendorf | Cat. 022623508 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% | Sigma-Aldrich | C3036-250G | |
| Corning Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35015CV | |
| Effectene Transfection Reagent 1 mL | Qiagen | 301425 | for transient transfection |
| IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope | Olympus | ||
| LabTek Chambered Slide Insert | Applied Scientific Instruments | I-3016 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | For dsRNA production |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit | ORFLO | MXZ001 | for cell counting |
| MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller | Applied Scientific Instruments | ||
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
| Orca-Flash 4.0 LT Camera | Hammamatsu Photonics K.K. | C11440-42U | |
| pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets | Labconco | 302310000 | |
| Schneider's insect medium | Sigma-Aldrich | S0146-100ML | |
| Spectra Tub Centrifuge Tubes | VWR | 470224-998 | |
| Uner Counter BOD Incubator | Sheldon manufacturing (VWR) | 89409-346 | |
| X-CITE 120 LED | ExcelitasTechnologies | Led light source | |
| Z -Drift Compensator (ZDC) | Olympus | infrared focus check |
References
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