Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Brug af Drosophila S2-celler til levende billeddannelse af celle division

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/60049
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of New Mexico

Summary

Celle inddelinger kan visualiseres i realtid ved hjælp af fluorescently mærkede proteiner og tidsforskudt mikroskopi. Ved hjælp af protokollen præsenteres her, kan brugerne analysere celle division timing dynamik, mitotisk spindel samling, og kromosom kongresssion og adskillelse. Defekter i disse hændelser efter RNA-interferens (RNAi)-medieret gen-Knockdown kan vurderes og kvantificeres.

Abstract

Drosophila S2-celler er et vigtigt redskab til at studere mitose i vævs kulturen, hvilket giver Molekylær indsigt i denne grundlæggende cellulære proces i en hurtig og høj gennemløb måde. S2-celler har vist sig at være modtagelige for både faste og levende celle billedbehandlings applikationer. Især kan Live-Cell Imaging give værdifulde oplysninger om, hvordan tab eller Knockdown af et gen kan påvirke kinetikken og dynamikken i vigtige begivenheder under celledeling, herunder mitotisk spindel samling, kromosom kongresssion, og adskillelse, samt samlede celle cyklus timing. Her bruger vi S2 celler stabilt transficeret med fluorescently Tagged mcherry: α-Tubulin at markere mitotiske spindel og gfp: cenp-A (benævnt ' CID ' gen i Drosophila) at markere centromer at analysere virkningerne af centrale mitotiske gener på timingen af celle inddelinger, fra prophase (specifikt ved opdeling af nukleare konvolutter; NEBD) til indtræden af anaphase. Denne billeddannelses protokol giver også mulighed for visualisering af spindel mikrotubulen og kromosom dynamik i hele mitosis. Heri sigter vi mod at levere en enkel, men omfattende protokol, der gør det muligt for læserne nemt at tilpasse S2-celler til eksperimenter med levende billeddannelse. Resultater opnået fra sådanne eksperimenter bør udvide vores forståelse af gener involveret i celledelingen ved at definere deres rolle i flere samtidige og dynamiske begivenheder. Observationer foretaget i dette cellekultursystem kan valideres og yderligere undersøges in vivo ved hjælp af den imponerende værktøjskasse af genetiske tilgange i fluer.

Introduction

Celledeling er en proces, der er kritisk for alle flercellede organismer, både i deres udvikling og homøostase1. Drosophila har længe været brugt som model for studiet af celledeling, med eksperimenter i forskellige vævstyper og genetiske tilstande, der giver vigtig indsigt i processen. Mens mange af disse indsigter kommer fra faste celle forhold, er celledeling en dynamisk procedure med mange bevægelige dele, hvilket gør visualisering af levende celler integreret i vurderingen af RNAi eller genetiske knockout effekter på mange dele af celledeling, herunder spindel dannelse, kromosom Kongressens og segregation, og Cytokinesis.

Mange protokoller er blevet udviklet og udnyttet i årenes løb til at visualisere Drosophila celle divisioner in vivo. Forskellige grupper har dyrket teknikker til billed inddelinger i både larve imaginal skiver og larve hjerner2,3,4,5,6,7,8 . Disse teknikker, som er nyttige til billeddannelse i specifikke væv, er begrænsede i gennemløb og kræver ofte generering og vedligeholdelse af genetiske bestande for at generere fluorescerende komponenter og ændre udtryk for gener af interesse. Kulturperler S2 celler fra Drosophila giver en højere gennemløb alternativ til hurtigt at teste virkningerne af forskellige gener i celledeling. Desuden, med evnen til at transficere forskellige fluorescerende proteiner, kan S2 celler hurtigt ændres for at bestemme virkningerne af RNAi Knockdown på talrige komponenter i celledeling. Fluorescently mærkede gener af interesse kan også observeres i celledeling, giver mulighed for dynamisk karakterisering af deres funktion9.

Her giver vi en detaljeret protokol for levende billeddannelse af mitotiske S2-celler ved hjælp af metoder, vi for nylig beskrev10. Vores metode udnytter stabilt transficeret celler med fluorescerende markører for microtubuler og centromeres, hvis udtryk er under kontrol af en kobber-inducerbar promotor (metallothionein; PMT). Denne metode kan bruges til at billed spindel og kromosom dynamik i alle faser af mitose udnytte en relativt simpel fluorescerende mikroskop med grundlæggende imaging software. Det kan tilpasses yderligere til at passe individuelle forskningsbehov, med forbigående transfektering og RNAi tilbyder udvidede muligheder for at bestemme rollen af kandidat gener i mitose. På grund af protokollens relative enkelhed kan den anvendes til mindre tabs-of-Function-skærme for at identificere gener, for hvilke yderligere undersøgelse in vivo ville være gavnlig, hvilket giver mulighed for en mere fokuseret indsats og effektivitet med efterfølgende genetiske manipulation i fluer.

Protocol

1. klargøring af S2-celler til behandling med RNAi

  1. Fra en bestand kultur af flydende PMT: gfp: CID og PMT: mcherry: α-Tubulin stabilt transficeret S2-celler (~ 80% levedygtige, dyrket ved 24-28 °c), frøceller i en 6 brønd steril kultur plade med en densitet på 1 x 106 celler/ml i frisk, opvarmet, 10% føtal kvægserum (FBS) har suppleret Schneiders insekt medie (SIM).
    Bemærk:     stabilt transficeret S2-celler kan genereres ved at følge en protokol fra Drosophila RNAi screening Center (drsc) (https://dgrc.bio.Indiana.edu/Protocols?tab=cells). Selv om den specifikke stabile S2-linje, der anvendes heri, udnytter GFP og mCherry, findes der talrige alternativer både inden for disse fluorescerende spektre såvel som andre. En detaljeret diskussion af disse fluorescerende proteiner er uden for rammerne af denne protokol, men deres egenskaber og potentielle fordele/ulemper er blevet fagligt gennemgået andre steder 11.
    1. Ved hjælp af en celle tæller eller hemocytometer, bestemme tætheden af flydende celle bestand.
    2. Bestem mængden af flydende-cellesuspension, der er nødvendig for at opnå 1 x 106 celler/ml i et samlet volumen på 4 ml (f. eks. ~ 4 x 106 celler i alt). Tilføj denne mængde celle lager til et volumen frisk SIM for at lave 4 mL/godt total volumen. Bestem tætheden af celle bestanden (celler/mL) ved at fortynde 100 μL af cellerne direkte fra lager kolben med 100 μL medier og tælle denne 1:2 fortynding enten manuelt med et hemocytometer eller med en automatisk celle tæller, hvis det er muligt.
      Bemærk: Hvis du bruger S2-celler, som ikke er stabilt transfteret, kan der udføres en forbigående transfektering-analyse med fluorescently mærket (gfp, mcherry osv.) α-eller β-Tubulin og en DNA-markør (cenp-a, histone H2B osv.). Yderligere, stabilt transficeret cellelinjer med forskellige mitotiske spindel og DNA markører er tilgængelige fra Drosophila genetik Resource Center, der kan bedre passer til de nøjagtige eksperimentelle behov for brugeren (https://dgrc.bio.Indiana.edu/cells/Catalog).
    3. Placer nyseedede celler i 24-28 °C inkubator for 36-48 h.

2. behandling af seedede celler med dsRNA mod gen (s) af interesse

Bemærk: Følgende eksempel og resultater sektion vil bruge shortstop (shot), en actin-microtubule binding agent som genet af interesse. Brug en mock-behandling uden dsRNA eller med dsRNA rettet mod et irrelevant gen (f. eks. beta-galactosidase, LacZ) som en negativ kontrol.

  1. Warm Schneiders insekt medier ikke suppleret med FBS (serum frie medier; SFM) i 24-28 °C inkubator.
  2. Overfør celler fra den tidligere seedede brønd (fra trin 1.1.2) til et 15 mL sterilt rør, der noterer det totale volumen af de overførte celler.
    1. Opbevar en lille mængde celler (~ 100 μL) til tælling i en celle tæller eller hemocytometer.
  3. Forsigtigt pellet cellerne ved at centrifuger ved 1.000 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.
    1. Mens centrifuger celler, bestemme koncentrationen af celler pr mL ved hjælp af en celle tæller eller hemocytometer. Dette tal multipliceres med det samlede rumfang, der centrifugeres (noteret i 1.2.2.) for at opnå det samlede antal celler.
  4. Aspirer supernatanten fra de pelleterede celler.
  5. Gensuspender cellerne i opvarmet SFM for at opnå en koncentration på 3 x 106 celler/ml.
    1. Overfør 1 mL af de resuspenderede celler til en ny brønd i en 6-brønd plade.
  6. Tilsæt 10-50 μg dsRNA (fortyndet i 100 μL RNAase-frit vand) mod skud (eller målgenet af interesse) direkte til cellerne og hvirvle pladen for at blande. Pladen inkubes i 1 time i 24-28 °C-inkubator for at give mulighed for direkte dsRNA-optagelse i celler.
  7. I løbet af 1 h inkubationen, varm de 10% FBS suppleret SIM i 24-28 ° c kuruator.
  8. Efter inkubering af celler med dsRNA i 1 time, tilsættes 2 mL 10% FBS suppleret SIM direkte til brønden uden at fjerne 1 mL af medierne.
  9. Placer cellerne i 24-28 °C inkubator i 3-7 dage.
    Bemærk: Som med dsRNA-koncentrationen kan det være nødvendigt at optimere den samlede behandlingstid for det ønskede målgen. For at evaluere RNAi effekt, udføre en vestlig skamplet på hele cellen lysater ved hjælp af et antistof mod målgenet. Hvis den oprindelige dsRNA Target sekvens viser sig ineffektiv, designe alternative dsRNAs målrettet til unikke sekvenser inden for målgenet.

3. induktion af fluorescerende protein udtryk og klargøring af celler til billeddannelse

  1. Hvis der blev genereret stabilt transficeret celler ved hjælp af PMT plasmid (indeholdende en inducerbar metallothionein promotor) som beskrevet her, inducere ekspression af fluorescerende proteiner ved at behandle celler med kobbersulfat (CuSO4) i en endelig koncentration af 500 μM for 24-36 h før billeddannelse og 4 dage efter behandling med RNAi. Brug af konstitutiv udtryk plasmider såsom pAct kræver ikke kobber induktion.
  2. Forbered celler til billeddannelse
    1. Varm 10% FBS suppleret SIM i 24-28 °C inkubator i 1 time.
    2. Overfør cellerne til et 15 mL sterilt rør, der noterer det totale volumen af de overførte celler.
      1. Opbevar en lille mængde celler (~ 100 μL) til tælling i en celle tæller eller hemocytometer.
    3. Forsigtigt pellet cellerne ved at centrifuger ved 1.000 x g i 3 minutter ved stuetemperatur.
      1. Mens centrifuger celler, bestemme koncentrationen (celler/mL) ved hjælp af en celle tæller eller hemocytometer. Multiplicer dette tal med den totale mængde, der centrifugeres (noteret i 2.2.2.) for at opnå det samlede antal celler.
    4. Aspirer supernatanten fra de pelleterede celler.
    5. Resuspendere cellerne i frisk, varmet 10% FBS suppleret SIM for at opnå en koncentration på 2 x 106 celler/ml. Tilsæt en passende mængde CuSO4 for at vedligeholde 500 μM koncentration.
    6. Overfør 200-500 μL af re-suspenderede celler til en brønd af et multi-Well levende celle kammer og Placer på det inverterede fluorescerende mikroskop. Lad cellerne bosætte sig i kammeret i 15-30 min før billeddannelse eksperimenter.
      Bemærk: Levende celle kammer brønde kan præ-belagt med poly-L-lysin for yderligere overholdelse.

4. Indstil et live Cell Imaging program

Bemærk: Live Cell Imaging i dette eksperiment blev udført ved hjælp af et inverteret billedsystem og dets tilhørende software (f. eks Olympus IX83 med cellSens dimensions softwarepakke). Detaljerne vil variere efter mikroskop producent og softwarepakke; generelle retningslinjer og operationer er således anført nedenfor.

  1. Ved hjælp af den software, der kører inverteret fluorescerende mikroskop, forberede et program til billeddannelse en celle (eller celler) over tid.
    1. Åbn softwaren ved at dobbeltklikke på ikonet for software-skrivebordet.
    2. Opret en ny eksperimentel fil ved at klikke på filog derefter på ny eksperimentel fil.
    3. Indsæt først en tidsforskudt løkke, som billederne skal tages over. Gør dette ved at klikke på stopur ikonet (time-lapse loop ikon) fra ikonlinjen. Angiv intervallet i s under fanen eksperiment styring , og angiv derefter antallet af cyklusser i den samme fane ved at dividere den ønskede samlede eksperiment længde (i s) med intervallet. Lad løkken gentage sig over den ønskede samlede tidsperiode.
      Bemærk: Typisk, billeder er taget hver 30-60 s over en periode på 3-4 h.
    4. Indsæt en infrarød fokus kontrol inden for tidsforløbs løkken for at bevare fokus for målsætningen (hvis den er tilgængelig). For at gøre dette skal du tilføje et Z-drift-kompensations trin (ZDC) i time lapse-loop-laget ved at klikke på firkanten med ikonet med to pile (Flyt XY-ikon) og vælge Z-drift-kompensation i rullemenuen.
      Bemærk: Udtrykket infrarød fokus kontrol refererer til et system, hvormed en infrarød puls bruges til at opretholde en konstant afstand mellem målet og dias/billed kammeret. Mange mikroskoper har et sådant system, hver med deres egen proprietære nomenklatur. Læserne bør konsultere deres betjeningsmanual eller repræsentant for specifikke navngivnings oplysninger.
    5. Efter den infrarøde fokus kontrol skal du tilføje et trin i programmet for at tage et multikanal-billede (f. eks. FITC for gfp og tritc for mcherry) over en 3-5 z-stakke ved først at indsætte et z-stak trin og derefter angive kanalen. Gør dette ved at tilføje et flerkanals Gruppelag inden for tidsforskudt loop Layer ved at klikke på farvehjulet ikon (multikanal gruppe ikon). Tilføj derefter et Z-stack-løkke lag i multikanal gruppe laget ved at klikke på ikonet med 3 lag (Z-stack loop -ikon). Angiv den ønskede trin størrelse og antallet af udsnit under fanen eksperiment styring , og Indstil eksponeringen for hver kanal så lavt som muligt for at minimere fotoblegning.
      Bemærk: Z-stack-intervallet, eksponeringstiden og procent transmitteringen for lysdioder kan variere. Typisk i disse eksperimenter, bruge tre z-stakke taget over en række 3 μm, hvilket giver et interval på 1 μm mellem hver stak. Definering af midten af cellen i stedet for toppen og bunden tendens til at føre til de bedste resultater. Billeder indsamles derefter for hver kanal (er) ved en eksponering på 50 MS og procent transmittans af 50% uden neutral tæthed (ND) filter engageret.

5. billede dividere celler ved hjælp af Live Cell Imaging program

Bemærk: S2-celler kræver ikke CO2 og vokser optimalt ved 23-27 °c. Al billeddannelse blev udført ved stuetemperatur i et velkontrolleret rum.

  1. Ved hjælp af okularerne finder du det øverste (eller nederste) hjørne af brønden og fokuserer målet (40-60x olie nedsænkning) på cellerne ved hjælp af mCherry (α-Tubulin) kanalen.
  2. Scan langs toppen (eller bunden) af brønden for at bevæge sig væk fra den lodrette brønd Divider.
    Bemærk: Imaging for tæt på brønd dividere kan forstyrre infrarøde fokus kontroller.
  3. Find en celle (eller celler), der er i slutningen af G2 eller tidlig M-fase (prophase).
    Bemærk: Disse celler kan bedst identificeres ved eksistensen af præcis to ' stjerne lignende ' mikrotubulære strukturer (centrosomer) og en intakt kerne (indikeret af en cirkulær region af afbrudte lys i cellen), begge let skelnes ved hjælp af α-Tubulin (rød) excitation filter. Udvælgelse af celler i tidligere Interphase, der er kendt af en eller nul let synlige centrosomer, kan resultere i spildtid på grund af en forsinkelse i G2/M progression. Omvendt, udvælgelse af celler efter NEBD vil forhindre nøjagtig beregning af mitotisk timing og billeddannelse af tidlig spindel samling og kromosom dynamik. Også S2-celler indeholder ofte > 2 centrosomes. Selv om disse typisk klynger sig til en bipolar spindel12, anbefales det, at brugerne undgår disse celler, medmindre andet ønskes for det eksperimentelle design. Billeder og diskussion af passende celler til at vælge, kan findes i den repræsentative resultater sektion.
  4. Klik på knappen Live View for at starte visning af celler på software skærmen. Brug den fine fokusknap i mikroskopet til at fokusere den celle (eller de celler), som interesserer sig. Indstil den infrarøde fokus kontrol ved at klikke på knappen Indstil fokus .
  5. Start programmet timelapse Imaging ved at klikke på knappen Begynd . Juster histogrammer efter behov ved at vælge den ønskede kanal og justere de gennemsnitlige pixel intensiteter for at se cellen (eller cellerne) af interesse tydeligt.
  6. Tillad programmet til at køre, kontrol af cellen efter 15-20 min at sikre nuklear konvolut opdeling (nebd) har fundet sted, som er bestemt af forsvinden af den runde mørke, en brydes spot nær cellecenter.
  7. Fortsæt med at tillade programmet til at køre, kontrol periodisk (hver 15-20 min) for at bestemme, når kaldelse debut har fundet sted. Stop programmet på dette tidspunkt, hvis der er mere tid tilbage i den samlede tidsperiode og gemme filen. Alternativt, hvis hændelser under telophase og cytokinese er af interesse, tillade programmet at køre en tilstrækkelig tid til at billedet disse processer samt.
  8. Udfør en analyse af nebd til kaldelse indsættende timing ved at notere tidspunktet for nebd (tnebd) i min og tidspunktet for den initiale kromosom separation (tkaldelse debut) i min og subtrahere tnebd fra tkaldelse debut for at opnå Nebd til kaldelse indsættende tid for en given celle.
    1. Gør dette ved at klikke på knappen frame up og bemærke de rammer, hvor nebd og kaldelse debut opstår, fratrække disse for at bestemme det samlede antal der gå frames, og multiplicere dette med tidsintervallet mellem Imaging frames.
  9. Fortsæt scanningen for forudinddelings celler for at få flere n 's for en given betingelse. Celler kan afbildet i levende celle kammer godt for op til 12 h efter deres oprindelige afregning.

Representative Results

Metoder, vi beskriver ovenfor, vil resultere i identifikation og billeddannelse af Drosophila S2 celler undergår celle division. Celler, der er ved at splitte (dvs. lige før indtastning af M-fase) kan målrettes ved tilstedeværelsen af to centrosomer og en intakt kerne indikeret af afbrudte lys og et mørkere sted i cellen, når de ses i α-Tubulin kanalen (figur 1, venstre-de fleste paneler, rød kanal; pilespids i figur 1a). Vi anslår, at ca. 2-5% af cellerne falder ind under denne kategori, og mellem billedbehandlings eksperimenter bruger vi typisk højst 2-3 minutters scanning til en anden kvalificeret celle. NEBD kan visualiseres gennem forsvinden af denne mørke plet, hvilket resulterer i ensartet farvning af cytoplasmaet (figur 1, paneler mærket "00:00", rød). Efter NEBD, den tid hver celle tager at danne spindel, Kongressen kromosomer, og adskille kromosomer kan måles blot ved at notere tidspunkterne for disse begivenheder i forhold til NEBD.

Vi udnytter disse divisioner til at vurdere mitotisk timing, specifikt af nebd til kaldelse debut, at bemærke det punkt, hvor kromosomer begynder at adskille. Et flertal (~ 90%) af kobber-inducerede celler, udtrykt både mCherry: α-Tubulin og GFP: CID. En lille procentdel af cellerne (~ 10%) kun udtrykte én markør eller ingen af delene. Disse celler blev undgået under celle udvælgelse. Typisk, S2 celler vise nebd til kaldelse debut timing af mellem 20-30 minutter (figur 1a, kontrol). Vi næste behandlede celler med dsRNA målrettet mod shortstop (shot), en actin-microtubule binding protein vi mistænkte kan påvirke celle cyklus dynamik. Faktisk, følgende shot Knockdown celler udstillet en signifikant mitotisk forsinkelse (figur 1b, shotrnai forsinkelse), med mange celler arrestere på Metaponto og aldrig overgang til kaldelse under hele 2-3-timers Imaging eksperiment (figur 1d, ShotRNAi-anholdelse). Vi begrundede denne forsinkelse/anholdelse fænotype kunne sandsynligvis skyldes aktivering af spindel montage check point (dvs. M-fase check point). For direkte at teste denne hypotese, vi Co-behandlede celler med dsRNA mod skudt og grov Deal (stang), en vigtig bestanddel af dette check point13. Dette førte til en undertrykkelse af arrestationen fænotype, hvilket resulterede i nebd til kaldelse gange svarende til kontrol (figur 1c, shotrnai + RodRNAi). Således, denne Live imaging protokol tillod os at konk gøre, at skudt er nødvendig for rettidig M-fase progression, og at dens tab fører til check point aktivering, forsinkelser eller arrestationer mitotiske celler.

Figure 1
Figur 1: Live imaging afslører celle cyklus defekter på grund af mitotisk check point aktivering i S2-celler.
Under alle forhold blev der udført Live-celle-billeddannelse på S2-celler, der var stabilt sammenført med inducerbar GFP: CID og mCherry: αTubulin som beskrevet heri. (A) tegnefilm illustrerer vigtige vartegn under mitose, og tilsvarende billeder vises fra repræsentative film af indikerede genotyper med tidspunkter i forhold til nebd (t = 00:00) angivet. Kontrol celler typisk fremskridt til kaldelse inden for 20-30 min. shotrnai-behandlede celler viser nebd-kaldelse forsinkelse (B) og gennemgår hyppigt metafase anholdelse, aldrig ind i kaldelse inden for Imaging eksperiment (D). Co-behandling af celler med shotrnai og RodRNAi, en komponent af spindel montage check point, undertrykker skud fænotype fører til kaldelse debut kinetik svarende til kontrol celler (C). Pilene i (A) angiver de ' stjerne lignende ' centrosome strukturer, og den store pilespids indikerer kernen. Hver skala bjælke repræsenterer 5 mikroner. Dette tal er tilpasset og genudgives med tilladelse fra10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-Authors). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Video 1: time-lapse film af ' Control ' S2 celle division. Video viser en repræsentativ film af S2 celle division i ' Control ' genotype. Denne film svarer til figur 1a. Denne video er tilpasset og genudgives med tilladelse fra10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-Authors). Venligst klik her for at downloade denne video.

Video 2: time-lapse film af forsinket ' ShotRNAi ' S2 celle division. Video viser en repræsentativ film af S2 celle division i ' ShotRNAi ' genotype, der fører til en fænotypisk mitotisk forsinkelse. Denne film svarer til figur 1b. Venligst klik her for at downloade denne video.

Video 3: time-lapse film af ' ShotRNAi + RodRNAi ' S2 celle division. Video viser en repræsentativ film af S2 celle division i ' ShotRNAi + RodRNAi ' genotype. Denne film svarer til figur 1c. Denne video er tilpasset og genudgives med tilladelse fra10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-Authors). Venligst klik her for at downloade denne video.

Video 4: time-lapse film af anholdt ' ShotRNAi ' S2 celle division. Video viser en repræsentativ film af S2 celle division i ' ShotRNAi ' genotype, der fører til en fænotypisk mitotisk anholdelse. Denne film svarer til figur 1d. Venligst klik her for at downloade denne video.

Discussion

Identifikation af en passende celle

Nøglen til Imaging dividere S2 celler er først at finde den rigtige celle. Tid kan være spildt billed celler, der fejlagtigt menes at være klar til at opdele, men undlader at gøre det inden for en rimelig tidsramme. Celler skal identificeres, der har to forskellige og synlige centrosomer og en intakt kerne. Centrosomes skal have mikrotubulus fibre stammer fra dem, hvilket giver dem et "stjerne-lignende" udseende. En intakt Nucleus indfaldende afbøjes lys, når du justerer fokus, og gør også den omtrentlige midten af cellen mørkere i udseende. Kernen vil også indeholde GFP: CID "dots", en anden karakteristisk funktion til at hjælpe i sin identifikation. Celler med > 2 centrosomer, Tubulin punkta uden Tubulin fibre stammer fra dem, eller celler med kun én centrosomes bør undgås. Derudover, hvis to centrosomer er synlige, men en kerne er ikke, er nebd allerede sket, og cellen er for langt fremme i sin division, der skal afbildet, hvis en komplet M-fase analyse ønskes. Når en passende celle er fundet, hastighed i at starte Imaging er afgørende, da NEBD opstår hurtigt (typisk inden for 3-5 min) og forsinke starten af Imaging kan føre til mistede muligheder. Fokuser cellen i billedbehandlings softwaren hurtigt sådan, at begge centrosomer er synlige, eller hvis centrosomer er ude af flyet med hinanden, sæt omdrejningspunktet mellem de to, således at hver kan fanges, når Z stakke indsamles over og under det definerede Center Punkt. Når fokuseret, straks indstille forskydningen mellem scenen og levende celle kammer overflade ved hjælp af infrarød fokus kontrol (hvis tilgængelig) og begynde Imaging program. Selv om protokollen præsenteres her er specielt skræddersyet til eksperimenter vurdere NEBD-til-anaphase dynamik, enkle modifikationer kunne passe læsere studere alternative mitotiske begivenheder. For NEBD-to-metaphase og anaphase-to-telophase Imaging, foreslår vi 10 s billed optagelses intervaller, da disse processer er meget dynamiske og forekommer hurtigt i S2-celler (5-10 min). Metaphase-to-anaphase Transition (vores typiske eksperimentelle fokus) er en længere proces (20-30 min) i S2-celler, og vi samler billeder med 30 s intervaller. Endelig, telophase-through-Cytokinesis forekommer ganske langsomt i S2-celler, og vi foreslår 60 s intervaller giver nok opløsning til denne omtrentlige time lange proces.

Opretholde fokus i hele billedbehandlingsprogrammet

Hvis en infrarød fokus kontrolenhed ikke er tilgængelig, skal du sørge for at undgå at støde mikroskopet eller bordet det sidder på, da dette kan resultere i cellen bevæger sig ud af fokus under Imaging program, hvilket fører til tvetydige, un-interpretable resultater. Pre-coating den levende celle kammer brønde med poly-L-lysin kan hjælpe i celle tilslutning, som kan hjælpe med at undgå celle bevægelse og er især nyttigt for opsætninger uden infrarød fokus kontrol. Derudover kan opsætninger, herunder stødabsorberende platforme eller luft borde, hjælpe med at undgå, at celler bevæger sig ud af fokus. Til sidst, noget programmel planer nyde pause funktioner tillade den bruger hen til koncentrere og genoptage den plan.

Imaging flere celler

Nyttigt at ophobning af data er, at ofte flere celler klar til at opdele kan placeres inden for samme synsfelt til Imaging. Dette kan især være nyttigt for eksperimenter, hvor cellerne har lange M-fases varigheder eller længerevarende anholdelse (f. eks. tilstande, der inducerer at aktivere SAC). For disse celler, vi typisk billede, indtil cellerne er fotoblegede (ca. 2-3 h), men den fulde timing af arresterede celler bør være på skøn af forskeren. Nogle gange kan de flere præ-dividere celler være i forskellige brændfly, i hvilket tilfælde det kan være nyttigt at tilføje z-stakke for at rumme alle celler. Tilføjelse af flere z-stakke kan også hjælpe med at forbedre opløsningen. Der bør dog udvises forsigtighed ved at gøre dette, da det vil udsætte cellerne for mere stråling og føre til hurtigere foto blegning, samt føre til store filstørrelser på harddisk lagringsenheder.

Undgå foto blegning og fototoksicitet

Vores metode beskriver specifikke indstillinger for eksponeringstider, billedbehandlings intervaller, z-stakke og procent transmittering for vores LED-lyskilde, der generelt arbejder for vores eksperimentelle opsætning og ønskede resultater. Som mikroskoper og eksperimentelle mål kan variere, hvad der kan fungere godt for vores system kan føre til for tidlig foto blegning eller fototoksicitet i andre. Foto skader kan medføre mangel på spindel bevægelse, fragmentering af mikrotubulen, defekt mikrotubulær dynamik og forlænget spindel kontrolpunkts aktivering. En potentiel metode til at undgå sådanne faldgruber er at begrænse eksponeringstid. De fleste moderne kameraer nu besidder brede dynamiske intervaller, og histogrammer kan justeres til at visualisere strukturer selv ved meget lav eksponering. En anden teknik er at øge billedbehandlings intervallet (f. eks. til flere minutter mellem billeder), således at antallet af gange, en celle udsættes for lys over et samlet indsamlings interval, reduceres. Dette er fordelagtigt især i Imaging i længere perioder (mange timer), og kan desuden hjælpe med at mindske filstørrelsen af sådanne eksperimenter. Begrænsning af antallet af z stakke taget kan også bidrage til at reducere lys eksponering, ved hjælp af 2 eller endda bare 1 i stedet for 3. Yderligere, justering af procent transmittans af lys (for LED lyskilder), eller udnytte neutrale tæthed (ND) filtre (for både halogen lampe og LED lyskilder) vil mindske lysintensiteten og kombineret med længere eksponeringstider kan bevare synlighed . Ved at vælge celler med centrosomes allerede adskilt, kan den samlede eksponering begrænses ved, at disse celler normalt indtaster mitose hurtigt (inden for et minut eller to) efter påbegyndelse af billeddannelse. Man kan også begrænse den tid, celler får lov til at blive afbildet før nebd. Vores laboratorium typisk sætter denne gang på 10 min, men en mere konservativ grænse kan nemt pålægges af brugeren. Derudover, en mere "invasiv" foranstaltning, vi anbefaler, er behandling med dsRNA målrettet mod en komponent af SAC (såsom stang eller Mad2). Hvis en arrestation af fænotype skyldes ikke-specifik celle skade (f. eks. defekt mikrotubulær dynamik), er en sådan behandling mindre tilbøjelig til at undertrykke anholdelsen sammenlignet med en bona fide -effekt af det pågældende gen af interesse i det oprindelige eksperiment.

Fremtidige retninger

Den metode, der er beskrevet her, kan udnyttes på et relativt simpelt epifluorescerende mikroskop til hurtigt at billed levende celle divisioner og kan nemt tilpasses til en forskers særlige eksperimentelle design og mål. Flere fremragende metoder til dyrkning, RNAi-Knockdown-tilgange, forbigående transfection og Fluorescens mikroskopi er blevet offentliggjort for S2 og andre Drosophila -celler9,14,15, 16 , 17. vores protokol giver et par fordele. (1) brugen af en dobbelt stabil cellelinje (GFP: CID, mCherry: α-Tubulin) markerer samtidig to centrale mitotiske strukturer, undgår besværet og potentielle komplikationer ved forbigående transfection og sikrer, at næsten alle celler vil udtrykke fluorescerende markører som potentielle kandidater til billeddannelse. (2) tilpasningen til mitose tilføjer til offentliggjorte protokoller undersøger cytoskelet dynamik i motile, ikke-dividere celler og strækker sig til at undersøge mitotiske hændelser i realtid. Mens vi mener, at vores er en kraftfuld teknik, der tilføjer til repertoiret af andre, kan der altid være forbedringer lavet. Et bestemt område af celledeling, som vi har fundet svært at billedet er centrosome division. Dette sker før NEBD, og det er svært at afgøre, hvornår en enkelt centrosome er klar til at adskille i to. Brug af fluorescerende celle cyklus markører (cyclin A og cyclin B) kan hjælpe med at løse dette problem, men kommer på bekostning af kanaler, der kan bruges til at visualisere celledeling komponenter. Vores bedste strategi for at forsøge at visualisere centrosome division er at tilføje multipoint erhvervelse til Imaging program (definere forskellige punkter i XY flyet til billedet), men dette kan resultere i store filer, og kan også kræve (afhængigt af antallet af point) forøgelse af intervallet mellem billedsamling, faldende tidsopløsning af den resulterende film. En anden løsning kunne være synkronisering af celler på en ønsket celle cyklus fase ved hjælp af lægemidler, der er målrettet celle cyklus regulatorer efterfulgt af efterfølgende udskylning forud for Imaging, selv om disse metoder ikke kan være pålidelige i S2 celler specifikt.

Protokollen præsenteres her giver et fundament for fremtidige applikationer i live Cell Imaging samt. Med forbedret billeddannelse og software teknologi, virkelig høj gennemløb tilpasninger af denne protokol ved hjælp af højere kapacitet, multi-Chambered plader kunne være muligt. Sådanne innovationer ville gøre store RNAi-skærme, såsom dem, der allerede er opnået i faste præparater12,18, mere Tractable i et live Cell-format. Små molekyle stof skærme kunne også forestilles som et middel til at identificere nye forbindelser målretning celle division processer. Forbedring af fluorophorer og optiske filtre kan også føre til billeddannelse af flere mitotiske komponenter (ikke kun de to, vi beskriver), hvilket muliggør billeddannelse af specifikke mitotiske regulatorer og deres interaktioner med DNA og/eller spindlen. For eksempel vil generering af celler med fluorescerende reportere, der udtrykker efter DNA-skaden eller under apoptose, være nyttige værktøjer til at identificere nye gener involveret i disse processer. Lignende tilgange kan anvendes til at undersøge celle cyklus dynamik ved hjælp af udtrykket fluorescently Tagged cyclins19.

Disclosures

Forfatterne har intet at erklære.

Acknowledgments

Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health (R01 GM108756). Vi er taknemmelige for Gary karpen (University of California, Berkeley) for generøst at give os en GFP: CID S2 cellelinje bestand, hvorfra vores GFP: CID/mCherry: αTubulin linje blev genereret10.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bright-Line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA for cell counting
cellSens imaging software Olympus
CELLSTAR Cell Culture Flask, 50 mL, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10 PCS/BAG Greiner Bio-One 690175
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed Greiner Bio-One 657160
Centrifuge 5804 R eppendorf Cat. 022623508
Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% Sigma-Aldrich C3036-250G
Corning Fetal Bovine Serum Fisher Scientific MT35015CV
Effectene Transfection Reagent 1 mL Qiagen 301425 for transient transfection
IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope Olympus
LabTek Chambered Slide Insert Applied Scientific Instruments I-3016
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific AM1334 For dsRNA production
MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit ORFLO MXZ001 for cell counting
MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller Applied Scientific Instruments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well Thermo Fisher Scientific 155409
Orca-Flash 4.0 LT Camera Hammamatsu Photonics K.K. C11440-42U
pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector Thermo Fisher Scientific V412020
Poly-L-Lysine Cultrex 3438-100-01
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 302310000
Schneider's insect medium Sigma-Aldrich S0146-100ML
Spectra Tub Centrifuge Tubes VWR 470224-998
Uner Counter BOD Incubator Sheldon manufacturing (VWR) 89409-346
X-CITE 120 LED ExcelitasTechnologies Led light source
Z -Drift Compensator (ZDC) Olympus infrared focus check

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ragkousi, K., Gibson, M. C. Cell division and the maintenance of epithelial order. Journal of Cell Biology. 207 (2), 181-188 (2014).
  2. Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (32), 14217-14222 (2010).
  3. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
  4. Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  5. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
  6. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
  7. Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Imaginal Discs. Methods in Molecular Biology. 1478, 203-213 (2016).
  8. Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).
  9. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).
  10. Dewey, E. B., Johnston, C. A. Diverse mitotic functions of the cytoskeletal cross-linking protein Shortstop suggest a role in Dynein/Dynactin activity. Molecular Biology of the Cell. 28 (19), 2555-2568 (2017).
  11. Rodriguez, E. A., et al. The Growing and Glowing Toolbox of Fluorescent and Photoactive Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).
  12. Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes and Development. 22 (16), 2189-2203 (2008).
  13. Basto, R., Gomes, R., Karess, R. E. Rough deal and Zw10 are required for the metaphase checkpoint in Drosophila. Nature Cell Biology. 2 (12), 939-943 (2000).
  14. Currie, J. D., Rogers, S. L. Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility. Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).
  15. Lu, W., Del Castillo, U., Gelfand, I. V. Organelle transport in cultured Drosophila cells: S2 cell line and primary neurons. Journal of Visualized Experiments. (81), e50838 (2013).
  16. Yang, J., Reth, M. Drosophila S2 Schneider cells: a useful tool for rebuilding and redesigning approaches in synthetic biology. Methods in Molecular Biology. 813, 331-341 (2012).
  17. Zhou, R., Mohr, S., Hannon, G. J., Perrimon, N. Inducing RNAi in Drosophila cells by soaking with dsRNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (5), (2014).
  18. Goshima, G., et al. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316 (5823), 417-421 (2007).
  19. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).

Tags

Genetik Drosophila S2 celler mitose celle cyklus levende celle billeddannelse mitotisk spindel kromosom dynamik mcherry: α-Tubulin GFP: cenp-A CID
Brug af <em>Drosophila</em> S2-celler til levende billeddannelse af celle division
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dewey, E. B., Parra, A. S.,… More

Dewey, E. B., Parra, A. S., Johnston, C. A. Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division. J. Vis. Exp. (150), e60049, doi:10.3791/60049 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter