Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Genetics

Bruk av Drosophila S2 Cells for Live Imaging av Cell Division

doi: 10.3791/60049 Published: August 23, 2019

Summary

Celle divisjoner kan vises i sanntid ved hjelp av fluorescensmerkete kodede proteiner og tidsforløp mikroskopi. Ved hjelp av protokollen som presenteres her, kan brukerne analysere celledeling timing dynamikk, mitotisk spindel montering, og kromosom congression og segregering. Defekter i disse hendelsene etter RNA interferens (RNAi)-mediert gen knockdown kan vurderes og kvantifisert.

Abstract

Drosophila S2-celler er et viktig verktøy i å studere mitose i vev kultur, gir molekylær innsikt i denne fundamentale cellulære prosessen i en rask og høy gjennomstrømming måte. S2-celler har vist seg mottagelig for både fast-og live-Cell Imaging applikasjoner. Spesielt kan Live-celle Imaging gi verdifull informasjon om hvordan tap eller knockdown av et gen kan påvirke Kinetics og dynamikken i viktige hendelser under celledeling, inkludert mitotisk spindel montering, kromosom congression og segregering, så vel som total celle syklus timing. Her bruker vi S2-celler stabilt transfekterte med fluorescensmerkete merket mCherry: α-tubulin for å markere mitotisk spindelen og GFP: CENP-A (referert til som "CID"-genet i Drosophila) for å markere centromeren for å analysere virkningene av viktige mitotisk gener på tidspunktet for celle divisjoner, fra profase (spesielt på Nuclear konvolutt Breakdown; NEBD) til utbruddet av anaphase. Denne bilde protokollen gir også mulighet for visualisering av spindel mikrotubulinettverket og kromosom dynamikk gjennom mitose. Heri, vi har som mål å gi en enkel, men likevel omfattende protokoll som gjør at leserne enkelt kan tilpasse S2 celler for Live Imaging eksperimenter. Resultater innhentet fra slike eksperimenter bør utvide vår forståelse av gener som er involvert i celledelingen ved å definere sin rolle i flere samtidige og dynamiske hendelser. Observasjoner gjort i dette cellekultur systemet kan valideres og undersøkes ytterligere i vivo ved hjelp av den imponerende verktøykassen av genetiske tilnærminger i fluer.

Introduction

Cell Division er en prosess som er kritisk for alle flercellede organismer, både i deres utvikling og homeostase1. Drosophila har lenge vært brukt som modell for studiet av celledeling, med eksperimenter i ulike vevstyper og genetiske tilstander som gir viktig innsikt i prosessen. Mens mange av disse innsikt kommer fra faste celle forhold, er celledeling en dynamisk prosedyre med mange bevegelige deler, noe som gjør visualisering av levende celler integrert for å vurdere RNAi eller genetisk knockout effekter på mange deler av celledeling, inkludert spindel dannelse, kromosom Kongressens og segregering, og cytokinesi.

Mange protokoller har blitt utviklet og benyttet gjennom årene for å visualisere Drosophila celle divisjoner in vivo. Ulike grupper har dyrket teknikker til bilde divisjoner i både larvestadiet imaginal plater og larvestadiet hjerner2,3,4,5,6,7,8 . Disse teknikkene, mens nyttig for Imaging i bestemte vev, er begrenset i gjennomstrømning og ofte krever generering og vedlikehold av genetiske aksjer for å generere fluorescerende komponenter og endre uttrykk for gener av interesse. Kultivert S2-celler fra Drosophila gir en høyere gjennomstrømning alternativ til raskt å teste effekten av ulike gener i celledeling. Videre, med evnen til å transfect ulike fluorescerende proteiner, kan S2-celler raskt endres for å bestemme effekten av RNAi-knockdown på en rekke komponenter i celledelingen. Fluorescensmerkete Tagged gener av interesse kan også observeres i celledeling, noe som åpner for dynamisk karakterisering av deres funksjon9.

Her gir vi en detaljert protokoll for Live Imaging av mitotisk S2 celler ved hjelp av metoder vi nylig har beskrevet10. Vår metode benytter stabilt transfekterte celler med fluorescerende markører for mikrotubuli og centromeres hvis uttrykk er under kontroll av en kobber-induserbart Promotor (metallothionein; pMT). Denne metodikken kan brukes til bilde spindel og kromosom dynamikk i alle faser av mitose utnytte en relativt enkel fluorescerende mikroskop med grunnleggende bildebehandling programvare. Det kan bli ytterligere tilpasset for å passe individuelle forskningsbehov, med forbigående transfeksjoner og RNAi som tilbyr utvidede muligheter for å bestemme rollen til kandidat gener i mitose. På grunn av den relative enkelheten i protokollen, kan den brukes for små-skala tap-of-Function-skjermer for å identifisere gener som videre studier in vivo ville være fordelaktig, noe som åpner for mer fokusert innsats og effektivitet med påfølgende genetiske manipulasjon i fluer.

Protocol

1. utarbeidelse av S2-celler for behandling med RNAi

  1. Fra en aksje kultur av confluent pMT: GFP: CID og pMT: mCherry: α-tubulin stabilt transfekterte S2-celler (~ 80% levedyktig, dyrket ved 24-28 ° c), frø celler i en 6 godt steril kultur plate med en tetthet på 1 x 106 celler/ml i frisk, varmet, 10% fosterets storfe serum (FBS) med Schneider ' insekt medier (SIM).
    Merk:
    stabilt transfekterte S2-celler kan genereres ved å følge en protokoll fra Drosophila RNAi SCREENING Center (DRSC) (https://dgrc.bio.Indiana.edu/Protocols?tab=Cells). Selv om den spesifikke stabile S2 linjen brukes her utnytter GFP og mCherry, mange alternativer finnes både innenfor disse fluorescerende Spectra samt andre. En detaljert drøfting av disse fluorescerende proteiner er utenfor omfanget av denne protokollen, men deres egenskaper og potensielle fordeler/ulemper har blitt fagmessig gjennomgått andre steder 11.
    1. Bruke en celle teller eller hemocytometer, bestemme tettheten av confluent celle lager.
    2. Bestem volumet av confluent celle suspensjon er nødvendig for å oppnå 1 x 106 celler/ml i et total volum på 4 ml (f. eks, ~ 4 x 106 totalt celler). Legg dette volumet av celle lager til et volum av friskt SIM for å gjøre 4 mL/vel totalt volum. Bestem tettheten av celle massen (celler/mL) ved å fortynne 100 μL av celler direkte fra lager flasken med 100 μL av medier og telle denne 1:2 fortynning enten manuelt med en hemocytometer eller med en automatisk celle teller hvis tilgjengelig.
      Merk: Hvis du bruker S2-celler ikke stabilt transfekterte, en forbigående transfeksjoner analysen med fluorescensmerkete merket (GFP, mCherry, etc.) α-eller β-tubulin, og en DNA-markør (CENP-A, histone H2B, etc.) kan utføres. Videre er stabilt transfekterte cellelinjer med ulike mitotisk spindel og DNA markører tilgjengelig fra Drosophila genetikk Resource Center som kan bedre passer nøyaktig eksperimentelle behovene til brukeren (https://dgrc.bio.Indiana.edu/Cells/Catalog).
    3. Plasser fersk seeded celler i 24-28 ° c inkubator for 36-48 h.

2. behandling av seeded celler med dsRNA mot Gene (e) av interesse

Merk: Følgende eksempel og resultater delen vil bruke shortstop (shot), en utgangen-mikrotubulinettverket Cross Linking agent som genet av interesse. Bruk en uekte behandling uten dsRNA eller med dsRNA rettet mot et irrelevant gen (f. eks beta-Galaktosidase, lacZ) som en negativ kontroll.

  1. Warm Schneider ' s insekt Media ikke suppleres med FBS (serum frie medier; SFM) i 24-28 ° c inkubator.
  2. Overfør celler fra tidligere seeded godt (fra trinn 1.1.2) til en 15 mL sterilt rør, og bemerker det totale volumet av celler som overføres.
    1. Behold et lite volum av celler (~ 100 μL) for telling i en celle teller eller hemocytometer.
  3. Forsiktig pellet celler ved sentrifugering ved 1 000 x g i 3 min ved romtemperatur.
    1. Mens sentrifugering celler, bestemme konsentrasjonen av celler per mL ved hjelp av en celle teller eller hemocytometer. Multipliser dette tallet med det totale volumet som blir sentrifugert (angitt i 1.2.2.) for å få det totale antallet celler.
  4. Aspirer supernatanten fra pelleted celler.
  5. Re-suspendere cellene i varmet SFM å få en konsentrasjon av 3 x 106 celler/ml.
    1. Overfør 1 mL av resuspendert celler til en ny brønn i en 6 brønn plate.
  6. Tilsett 10-50 μg av dsRNA (fortynnet i 100 μL av RNAase-fritt vann) mot shot (eller målet genet av interesse) direkte til cellene og virvel platen å blande. Ruge platen for 1 time i 24-28 ° c inkubator for å muliggjøre direkte dsRNA-opptak i celler.
  7. I løpet av 1 h inkubasjons, varm 10% FBS supplert SIM i 24-28 ° c inkubator.
  8. Etter incubating celler med dsRNA for 1 h, tilsett 2 mL 10% FBS supplert SIM direkte til brønnen uten å fjerne 1 mL av Media.
  9. Plasser celler i 24-28 ° c inkubator for 3-7 dager.
    Merk: Som med dsRNA konsentrasjon, kan total behandlingstid må optimaliseres for ønsket mål genet. For å evaluere RNAi-effekten, Utfør en vestlig blott på hele celle lysater ved hjelp av et antistoff mot mål genet. Hvis den første dsRNA mål sekvensen beviser ineffektiv, designe alternative dsRNAs målrettet til unike sekvenser innenfor målet genet.

3. induksjon av fluorescerende protein uttrykk og utarbeidelse av celler for Imaging

  1. Hvis det ble generert stabilt transfekterte celler ved hjelp av avdrag-plasmider (som inneholder en induserbart metallothionein Promotor) som beskrevet her, induserer uttrykk for fluorescerende proteiner ved å behandle celler med kobber sulfat (CuSO4) ved en endelig konsentrasjon av 500 μM for 24-36 h før avbildning og 4 dager etter RNAi behandling. Bruk av konstituerende uttrykks plasmider som pakt krever ikke kobber induksjon.
  2. Klargjøre celler for avbildning
    1. Varm 10% FBS supplert SIM i 24-28 ° c inkubator for 1 time.
    2. Overfør celler til en 15 mL sterilt rør, og bemerker det totale volumet av celler som overføres.
      1. Behold et lite volum av celler (~ 100 μL) for telling i en celle teller eller hemocytometer.
    3. Forsiktig pellet celler ved sentrifugering ved 1 000 x g i 3 min ved romtemperatur.
      1. Mens sentrifugering celler, bestemme konsentrasjonen (celler/mL) ved hjelp av en celle teller eller hemocytometer. Multipliser dette tallet med det totale volumet som blir sentrifugert (angitt i 2.2.2.) for å få det totale antallet celler.
    4. Aspirer supernatanten fra pelleted celler.
    5. Resuspend cellene i frisk, varmet 10% FBS supplert SIM for å oppnå en konsentrasjon av 2 x 106 celler/ml. Tilsett en passende mengde CuSO4 for å opprettholde konsentrasjonen på 500 μM.
    6. Overfør 200-500 μL av re-suspenderte celler til en brønn av et multi-godt levende celle kammer og plasser på det omvendte fluorescerende mikroskopet. Tillat cellene til å bosette seg i kammeret for 15-30 min før Imaging eksperimenter.
      Merk: Live celle kammer brønner kan være pre-belagt med Poly-L-lysin for ytterligere overholdelse.

4. Sett opp et live Cell Imaging program

Merk: Live Cell Imaging i dette eksperimentet ble utført ved hjelp av en invertert Imaging system og tilhørende programvare (for eksempel Olympus IX83 med cellSens Dimensions programvarepakke). Detaljer vil variere etter mikroskop produsent og programvarepakke; generelle retningslinjer og operasjoner er derfor listet opp nedenfor.

  1. Ved hjelp av programvaren som kjører invertert fluorescerende mikroskop, forberede et program for Imaging en celle (eller celler) over tid.
    1. Åpne programvaren ved å dobbeltklikke på ikonet for programvare skrivebordet.
    2. Opprett en ny eksperimentell fil ved å klikke på filog deretter på ny eksperimentell fil.
    3. Sett først inn en tidsforløp løkke over hvilke bilder som skal tas. Gjør dette ved å klikke på stoppeklokke ikonet (time-lapse loop Icon) fra ikonlinjen. Angi intervallet i kategorien eksperiment behandling , og angi deretter antall sykluser i samme kategori ved å dele den ønskede totale eksperiment lengden (i s) etter intervallet. Tillat at sløyfen gjentas over ønsket total tidsperiode.
      Merk: Vanligvis er bilder tatt hver 30-60 s over en periode på 3-4 h.
    4. Innenfor tidsforløp løkke laget setter du inn en infrarød fokus kontroll for å opprettholde fokus for målet (hvis tilgjengelig). For å gjøre dette, legge til en Z-drift kompensasjon (ZDC) trinn i time-lapse loop laget ved å klikke på firkant med to piler -ikonet (Flytt XY ikon) og velge Z-drift kompensasjon fra rullegardinmenyen.
      Merk: Begrepet infrarød fokus sjekk refererer til et system der en infrarød puls brukes til å opprettholde en konstant avstand mellom målet og Slide/Imaging kammer. Mange mikroskop har et slikt system, hver med sin egen proprietære nomenklatur. Leserne bør konsultere deres bruksanvisning eller representant for spesifikke navngiving detaljer.
    5. Etter den infrarøde fokus kontrollen, legger du til et trinn i programmet for å ta et flerkanals bilde (for eksempel FITC for GFP og TRITC for mCherry) over en 3-5 z-stabler ved først å sette inn et z-stabel-trinn, og deretter angi kanalen. Gjør dette ved å legge til et flerkanals gruppe-lag innenfor tidsforløp løkke laget ved å klikke på fargehjul ikonet (flerkanals gruppe -ikonet). Deretter legger du til et Z-stack loop-lag i det flerkanals gruppe laget ved å klikke på ikonet med tre lag (Z-stack loop Icon). Angi ønsket trinn størrelse og antall sektorer i kategorien eksperiment behandling , og angi eksponeringen for hver kanal så lavt som mulig for å minimere photobleaching.
      Merk: Z-stack-intervallet, eksponeringstiden og prosent transmisjon for LED-er kan variere. Typisk i disse eksperimentene, bruk tre z-stabler tatt over et område på 3 μm, noe som gir et intervall på 1 μm mellom hver stabel. Definere midten av cellen i stedet for toppen og bunnen har en tendens til å føre til de beste resultatene. Bilder blir deretter samlet inn for hver kanal (er) med en eksponering på 50 MS og prosent transmisjon på 50% uten nøytral tetthet (ND) filter engasjert.

5. image dividere celler ved hjelp av Live Cell Imaging program

Merk: S2-celler krever ikke CO2 og vokser optimalt ved 23-27 ° c. All bildebehandling ble utført ved omgivelsestemperatur i et godt kontrollert rom.

  1. Ved hjelp av okulars, finne toppen (eller bunnen) hjørnet av brønnen og fokusere målet (40-60x olje nedsenking) på cellene ved hjelp av mCherry (α-tubulin) kanal.
  2. Skann langs toppen (eller bunnen) av brønnen for å bevege seg bort fra den vertikale brønn skille ren.
    Merk: Imaging for nær brønnen Skillevegger kan forstyrre infrarød fokus sjekker.
  3. Finn en celle (eller celler) som er i slutten av G2 eller tidlig M-fase (profase).
    Merk: Disse cellene kan best identifiseres ved eksistensen av nøyaktig to "Star-like" mikrotubulinettverket strukturer (centrosomes) og en intakt kjerne (indikert av en sirkulær region av brytes lys i cellen), både lett skilles ved hjelp av α-tubulin (rød) eksitasjon filter. Valg av celler i tidligere Interphase, bemerkelsesverdig av en eller null lett synlige centrosomes, kan resultere i bortkastet tid på grunn av et etterslep i G2/M progresjon. Omvendt, valg av celler etter NEBD vil hindre nøyaktig beregning av mitotisk timing og bilde av tidlig spindel montering og kromosom dynamikk. I tillegg inneholder S2-celler ofte > 2-centrosomes. Selv om disse vanligvis klynger inn i en bipolar spindel12, er det anbefalt at brukerne unngår disse cellene med mindre annet er ønsket for eksperimentell design. Du finner bilder og drøfting av passende celler for å velge i delen representant resultater .
  4. Klikk på Live View-knappen for å begynne å se på celler i programvare skjermen. Bruk den fine fokus knotten på mikroskopet til å fokusere på cellen (eller cellene) av interesse. Angi infrarød fokus kontroll ved å klikke på Angi fokus -knappen.
  5. Start tidsforløp Imaging program ved å klikke på starte knappen. Juster histogrammer etter behov ved å velge ønsket kanal og justere gjennomsnitts piksel intensiteten for å se tydelig cellen (eller cellene).
  6. Tillat programmet å kjøre, sjekke cellen etter 15-20 min for å sikre kjernefysisk konvolutt sammenbrudd (NEBD) har oppstått, noe som bestemmes av forsvinningen av den runde mørke, en brytes flekk nær celle senteret.
  7. Fortsette tillater programmet å løpe, avmerker periodisk (enhver 15-20 min) å avgjøre en gang anaphase utbruddet har hendelse. Stopp programmet på dette stadiet hvis det er mer tid igjen i den totale tidsperioden og lagre filen. Alternativt, hvis begivenheter i løpet av telophase og cytokinesi er av interesse, tillate programmet å løpe en nok tid for at image disse prosesser likeledes.
  8. Utføre analyse av NEBD til anaphase debut tidspunkt ved å merke tiden for NEBD (tNEBD) i min og tidspunktet for første kromosom separasjon (tanaphase utbruddet) i min og trekke tNEBD fra tanaphase utbruddet for å oppnå NEBD til anaphase debut tid for en gitt celle.
    1. Gjør dette ved å klikke knappen ramme opp og merke rammene der NEBD og anaphase utbruddet oppstår, trekke disse til å bestemme det totale antall rammer, og multiplisere dette ved tidsintervallet mellom Imaging rammer.
  9. Fortsett skanning for pre-dele celler for å få flere n ' s for en gitt tilstand. Celler kan bli avbildet i den levende cellen kammer godt for opp til 12 h etter deres første settling.

Representative Results

Metodene vi beskriver ovenfor vil resultere i identifisering og bildebehandling av Drosophila S2-celler som gjennomgår celledeling. Celler som er i ferd med å dele (dvs. like før du går inn M-fase) kan bli målrettet av tilstedeværelsen av to centrosomes og en intakt nucleus indikert av brytes lys og en mørkere flekk i cellen når den vises i α-tubulin kanal (figur 1, venstre-de fleste paneler, rød kanal; pilspissen i figur 1a). Vi anslår at omtrent 2-5% av cellene faller inn under denne kategorien, og mellom bilde eksperimenter bruker vi vanligvis maksimalt 2-3 minutter på å søke etter en annen kvalifisert celle. NEBD kan bli visualisere gjennom forsvinningen av denne mørke flekken, noe som resulterer i uniform farging av cytoplasma (figur 1, paneler merket "00:00", rød). Etter NEBD, den tiden hver celle tar å danne spindelen, kongressen kromosomer, og skille kromosomer kan måles bare ved å merke tiden poeng av disse hendelsene i forhold til NEBD.

Vi bruker disse divisjonene til å vurdere mitotisk timing, spesielt av NEBD til anaphase utbruddet, og bemerker det punktet hvor kromosomer begynner å skille. Et flertall (~ 90%) av kobber-indusert celler, uttrykt både mCherry: α-tubulin og GFP: CID. En liten prosentandel av celler (~ 10%) uttrykt bare en markør eller ingen av delene. Disse cellene ble unngått under Cellevalg. Vanligvis viser S2-celler NEBD til anaphase debut tidspunkt på mellom 20-30 minutter (figur 1a, kontroll). Vi neste behandlet celler med dsRNA rettet mot shortstop (shot), en utgangen-mikrotubulinettverket Cross Linking protein vi mistenkte kan påvirke celle syklus dynamikk. Faktisk, etter shot knockdown celler utstilt en betydelig mitotisk forsinkelse (figur 1B, ShotRNAi forsinkelse), med mange celler arrestere ved metafase og aldri overgangen til anaphase under hele 2-3-timers Imaging eksperiment (figur 1d, ShotRNAi arrestasjon). Vi begrunnet denne forsinkelsen/arrest fenotype kan trolig være på grunn av aktivering av spindelen forsamlingen Checkpoint (dvs. M-fase Checkpoint). For å direkte teste denne hypotesen, vi co-behandlet celler med dsRNA mot shot og grov avtale (Rod), en viktig del av denne Checkpoint13. Dette førte til en undertrykkelse av arrestasjonen fenotype, noe som resulterer i NEBD til anaphase ganger lik Control (figur 1C, ShotRNAi + RodRNAi). Således, denne bo tenkelig protokollen innrømmet oss å konkludere med det skudd er krevde for i rette tid M-Phase progresjon og det dens forlis innlede å sjekkpunkt aktivisering det forsinkelsene eller arrestasjoner mitotisk celler.

Figure 1
Figur 1: Live Imaging avslører celle syklus defekter på grunn av mitotisk Checkpoint aktivering i S2-celler.
Under alle forhold ble Live-celle Imaging utført på S2-celler stabilt transfekterte med induserbart GFP: CID og mCherry: αTubulin som beskrevet her. (A) tegneserier illustrerer viktige landemerker under mitose, og tilsvarende bilder er vist fra representative filmer av indikerte genotyper med tid poeng i forhold til NEBD (t = 00:00) indikert. Kontroll celler vanligvis frem til anaphase innen 20-30 min. ShotRNAi-behandlede celler vise NEBD-anaphase forsinkelse (B) og ofte gjennomgår metafase arrestasjon, aldri inn anaphase i Imaging eksperimentet (D). Co-behandling av celler med ShotRNAi og RodRNAi, en del av spindelen forsamlingen Checkpoint, undertrykker shot fenotype fører til anaphase utbruddet Kinetics ligner Control celler (C). Pilene i (A) indikerer "Star-like" centrosome strukturer, og den store pilspissen indikerer kjernen. Hver skala bar representerer 5 mikron. Dette tallet er tilpasset og publiseres med tillatelse fra10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Video 1: time-lapse film av ' Control ' S2 celle divisjon. Video viser en representativ film av S2 celledeling i ' Control ' genotype. Denne filmen tilsvarer figur 1a. Denne videoen er tilpasset og publiseres med tillatelse fra10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 2: time-lapse film av forsinket ' ShotRNAi ' S2 celle divisjon. Video viser en representativ film av S2 celle divisjon i ' ShotRNAi ' genotype som fører til en fenotypiske mitotisk forsinkelse. Denne filmen tilsvarer figur 1B. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 3: time-lapse film av ' ShotRNAi + RodRNAi ' S2 celle divisjon. Video viser en representativ film av S2 celledeling i ' ShotRNAi + RodRNAi ' genotype. Denne filmen tilsvarer figur 1C. Denne videoen er tilpasset og publiseres med tillatelse fra10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Video 4: time-lapse film av arresterte ' ShotRNAi ' S2 celledeling. Video viser en representativ film av S2 celle divisjon i ' ShotRNAi ' genotype som fører til en fenotypiske mitotisk arrestasjon. Denne filmen tilsvarer figur 1d. Vennligst klikk her for å laste ned denne videoen.

Discussion

Identifisere en passende celle

Nøkkelen til Imaging splitte S2 celler er først å finne den riktige cellen. Tid kan være bortkastet Imaging celler som er feilaktig antatt å være klar til å dele, men ikke klarer å gjøre det på en rimelig tidsramme. Celler må identifiseres som har to distinkte og synlige centrosomes og en intakt kjerne. Centrosomes må ha mikrotubulinettverket fibre som kommer fra dem, gi dem en "stjerne-lignende" utseende. En intakt nucleus brytning lys når du justerer fokus, og gjør også den omtrentlige midten av cellen mørkere i utseende. Kjernen vil også inneholde GFP: CID "prikker", en annen særtrekk for å hjelpe i sin identifisering. Celler med > 2 centrosomes, tubulin puncta uten tubulin fibre som kommer fra dem, eller celler med bare én centrosome bør unngås. I tillegg, hvis to centrosomes er synlige, men en kjerne er ikke, har NEBD allerede skjedd og cellen er for langt avansert i sin divisjon for å bli avbildet hvis en komplett M-fase analyse er ønsket. En gang en passende cellen er grunnlegge, fart inne igangsetting tenkelig er avgjørende idet NEBD hender rask (karakteristisk innen 3-5 min.) og forsinkelsen starten av tenkelig kanne føre til savnet Opportunities. Fokuser cellen i bildebehandlingsprogrammet raskt slik at begge centrosomes er synlige, eller hvis centrosomes er ute av flyet med hverandre, sett fokuspunktet mellom de to, slik at hver kan fanges når Z stabler er samlet over og under den definerte senter Punkt. En gang fokusere, med det samme sette forskyvningen imellom fasen og det bo cellen kammeret overflate benytter det Infrared fokusere sjekk (hvis anvendelig) og begynne det tenkelig program. Selv om protokollen som presenteres her er spesielt skreddersydd for eksperimenter som vurderer NEBD-til-anaphase dynamikk, kan enkle modifikasjoner passe leserne som studerer alternative mitotisk hendelser. For NEBD-til-metafase-og anaphase-til-telophase-avbildning foreslår vi 10 s bilde opptaks intervaller ettersom disse prosessene er svært dynamiske og forekommer raskt i S2-celler (5-10 min). Metafase-to-anaphase overgang (vår typiske eksperimentelle fokus) er en lengre prosess (20-30 min) i S2-celler, og vi samler inn bilder med 30 s intervaller. Endelig, telophase-through-cytokinesi skjer ganske langsomt i S2-celler, og vi foreslår 60 s intervaller som gir nok oppløsning for denne omtrentlige time lange prosessen.

Opprettholde fokus gjennom Imaging program

Hvis en infrarød fokus kontrollenhet ikke er tilgjengelig, må du unngå å dunk mikroskopet eller tabellen den sitter på, da dette kan føre til at cellen går ut av fokus under bildebehandlingsprogrammet, noe som fører til tvetydige, ikke-interpretable resultater. Pre-coating den levende cellen kammer brønner med Poly-L-lysin kan hjelpe i celle etterlevelse, som kan bidra til å unngå celle bevegelse og er spesielt nyttig for oppsett uten infrarød fokus sjekker. I tillegg kan oppsett inkludert støtabsorberende plattformer eller luft tabeller bidra til å unngå at cellene beveger seg ut av fokus. Til slutt, noen programmer har pause funksjoner som tillater brukeren å fokusere på og gjenoppta programmet.

Imaging flere celler

Nyttig å akkumulering av data er at ofte flere celler klare til å dele kan plasseres innenfor samme synsfelt for Imaging. Dette kan være spesielt nyttig for eksperimenter der celler har lang M-fase varigheter eller langvarig arrestasjon (f.eks. betingelser som induserer aktivering av SAC). For disse cellene, vi vanligvis bildet til cellene er photobleached (ca 2-3 h), men full timing av arresterte celler bør være på skjønn av forskeren. Noen ganger kan flere pre-splitte celler være i forskjellige fokal plan, i så fall kan det være nyttig å legge til z-stabler for å imøtekomme alle celler. Å legge til flere z-stabler kan også bidra til å forbedre oppløsningen. Forsiktighet bør utvises ved å gjøre dette, men som det vil utsette celler til mer stråling og føre til raskere photobleaching, samt føre til store filstørrelser på harddisken lagringsenheter.

Unngå Photobleaching og Phototoksisitet

Vår metode beskriver spesifikke innstillinger for eksponeringstider, bilde intervaller, z-stabler og prosent transmisjon for vår LED-lyskilde som generelt fungerer for vårt eksperimentelle oppsett og ønskede resultater. Som mikroskop og eksperimentelle mål kan variere, hva som kan fungere godt for vårt system kan føre til prematur photobleaching eller Phototoksisitet i andre. Photoskade kan utgjøre en mangel på spindel bevegelse, mikrotubulinettverket fragmentering, defekt mikrotubulinettverket dynamikk, og forlenget spindel kontrollpunkt aktivering. En potensiell metode for å unngå slike fallgruver er å begrense eksponeringstiden. De fleste moderne kameraer har nå brede dynamiske områder, og histogrammer kan justeres for å visualisere strukturer selv ved svært lave eksponeringer. En annen teknikk er å øke bildebehandlings intervallet (f.eks. til flere minutter mellom bilder) slik at antall ganger en celle utsettes for lys over et totalt innsamlings intervall reduseres. Dette er fordelaktig spesielt i Imaging for lengre perioder av gangen (mange timer), og kan i tillegg bidra til å redusere filstørrelsen på slike eksperimenter. Begrense antall z stabler tatt kan også bidra til å redusere lys eksponering, ved hjelp av 2 eller bare 1 i stedet for 3. Videre justere prosent Transmisjon av lys (for LED lyskilder), eller bruk av nøytral tetthet (ND) filtre (for både halogen lampe og LED lyskilder) vil redusere lysstyrken og kombinert med lengre eksponeringstider kan bevare synligheten . Ved å velge celler med centrosomes allerede separert, kan generell eksponering begrenses ved at disse cellene vanligvis inn mitose raskt (innen et minutt eller to) etter begynnelsen Imaging. Man kan også begrense tiden som cellene får lov til å bli avbildet før NEBD. Vår Lab vanligvis setter denne gangen på 10 min, men en mer konservativ grense kan lett bli pålagt av brukeren. I tillegg er en mer "invasiv" måle vi anbefaler behandling med dsRNA rettet mot en del av SAC (som Rod eller Mad2). Hvis en arrest fenotype skyldes ikke-spesifikk celle skade (f. eks, defekt mikrotubulinettverket dynamikk), er en slik behandling mindre sannsynlighet for å undertrykke arrestasjonen i forhold til en bona fide effekt av genet av interesse i det opprinnelige eksperimentet.

Future veibeskrivelse

Metoden beskrevet her kan utnyttes på en relativt enkel epifluorescent mikroskop for å raskt bilde Live celle divisjoner og kan lett tilpasses for å passe en forsker spesielle eksperimentelle design og mål. Flere gode metoder for dyrking, RNAi knockdown tilnærminger, transient transfeksjoner, og fluorescens mikroskopi har blitt publisert for S2 og andre Drosophila celler9,14,15, 16 flere , 17. vår protokoll tilbyr et par fordeler. (1) bruk av en dobbel stabil cellelinje (GFP: CID, mCherry: α-Tubulin) markerer samtidig to viktige mitotisk strukturer, unngår stresset og potensielle komplikasjoner av forbigående transfeksjoner, og sikrer at nesten alle celler vil uttrykke fluorescerende markører som potensielle kandidater for bildebehandling. (2) tilpasningen til mitose legger til publiserte protokoller undersøke cytoskjelettkomponenter dynamikk i aktive, ikke-dele celler og strekker seg til å undersøke mitotisk hendelser i sanntid. Selv om vi tror vår er en kraftig teknikk som legger til repertoaret av andre, kan det alltid være forbedringer gjort. Et bestemt område av celledeling som vi har funnet vanskelig å image er centrosome divisjon. Dette skjer før NEBD og det er vanskelig å avgjøre når en enkelt centrosome er klar til å skille i to. Bruke fluorescerende celle syklus markører (cyclin A og cyclin B) kan bidra til å løse dette problemet, men kommer på bekostning av kanaler som kan brukes til å visualisere celledeling komponenter. Vår beste strategi for å forsøke å visualisere centrosome divisjon er å legge multipunkt oppkjøpet til tenkelig program (definere ulike punkter i XY flyet til bildet), men dette kan resultere i store filer, og kan også kreve (avhengig av antall poeng) øke intervallet mellom bilde samlingen og redusere tids oppløsningen på den resulterende filmen. En annen løsning kan være synkronisering av celler på en ønsket celle syklus scene ved hjelp av medikamenter som mål celle syklus regulatorer etterfulgt av påfølgende bleke før Imaging, selv om disse metodene ikke kan være pålitelig i S2-celler spesielt.

Protokollen som presenteres her gir et grunnlag for fremtidige applikasjoner i live celle Imaging også. Med forbedret bildebehandling og programvareteknologi, virkelig høy gjennomstrømning tilpasninger av denne protokollen ved hjelp av høyere kapasitet, multi-kamret plater kan være mulig. Slike innovasjoner ville gjøre store RNAi skjermer, slik som de allerede oppnådd i faste forberedelser12,18, mer medgjørlig i et levende celleformat. Små molekyl narkotika skjermer kan også være seg som et middel til å identifisere romanen forbindelser rettet mot celledeling prosesser. Forbedring av fluorophores og optiske filtre kan også føre til Imaging av flere mitotisk komponenter (ikke bare de to vi beskriver), slik at Imaging av spesifikke mitotisk regulatorer og deres interaksjon med DNA og/eller spindelen. For eksempel generere celler med fluorescerende journalister som uttrykker følgende DNA skade eller under apoptose ville være nyttig verktøy for å identifisere romanen gener involvert i disse prosessene. Lignende tilnærminger kan brukes til å undersøke celle syklus dynamikk ved hjelp av uttrykk for fluorescensmerkete merket cyclins19.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å erklære.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble finansiert av National Institutes of Health (R01 GM108756). Vi er takknemlige for Gary karpen (University of California, Berkeley) for sjenerøst å gi oss en GFP: CID S2 cellelinje lager som vår GFP: CID/mCherry: αTubulin linje ble generert10.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bright-Line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA for cell counting
cellSens imaging software Olympus
CELLSTAR Cell Culture Flask, 50 mL, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10 PCS/BAG Greiner Bio-One 690175
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed Greiner Bio-One 657160
Centrifuge 5804 R eppendorf Cat. 022623508
Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% Sigma-Aldrich C3036-250G
Corning Fetal Bovine Serum Fisher Scientific MT35015CV
Effectene Transfection Reagent 1 mL Qiagen 301425 for transient transfection
IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope Olympus
LabTek Chambered Slide Insert Applied Scientific Instruments I-3016
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific AM1334 For dsRNA production
MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit ORFLO MXZ001 for cell counting
MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller Applied Scientific Instruments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well Thermo Fisher Scientific 155409
Orca-Flash 4.0 LT Camera Hammamatsu Photonics K.K. C11440-42U
pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector Thermo Fisher Scientific V412020
Poly-L-Lysine Cultrex 3438-100-01
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 302310000
Schneider's insect medium Sigma-Aldrich S0146-100ML
Spectra Tub Centrifuge Tubes VWR 470224-998
Uner Counter BOD Incubator Sheldon manufacturing (VWR) 89409-346
X-CITE 120 LED ExcelitasTechnologies Led light source
Z -Drift Compensator (ZDC) Olympus infrared focus check

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ragkousi, K., Gibson, M. C. Cell division and the maintenance of epithelial order. Journal of Cell Biology. 207, (2), 181-188 (2014).
  2. Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107, (32), 14217-14222 (2010).
  3. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013, (10), 970-977 (2013).
  4. Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  5. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138, (11), 2207-2215 (2011).
  6. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2, (10), 2467-2473 (2007).
  7. Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Imaginal Discs. Methods in Molecular Biology. 1478, 203-213 (2016).
  8. Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11, (9), e0163744 (2016).
  9. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nature Protocols. 3, (4), 606-611 (2008).
  10. Dewey, E. B., Johnston, C. A. Diverse mitotic functions of the cytoskeletal cross-linking protein Shortstop suggest a role in Dynein/Dynactin activity. Molecular Biology of the Cell. 28, (19), 2555-2568 (2017).
  11. Rodriguez, E. A., et al. The Growing and Glowing Toolbox of Fluorescent and Photoactive Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42, (2), 111-129 (2017).
  12. Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes and Development. 22, (16), 2189-2203 (2008).
  13. Basto, R., Gomes, R., Karess, R. E. Rough deal and Zw10 are required for the metaphase checkpoint in Drosophila. Nature Cell Biology. 2, (12), 939-943 (2000).
  14. Currie, J. D., Rogers, S. L. Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility. Nature Protocols. 6, (10), 1632-1641 (2011).
  15. Lu, W., Del Castillo, U., Gelfand, I. V. Organelle transport in cultured Drosophila cells: S2 cell line and primary neurons. Journal of Visualized Experiments. (81), e50838 (2013).
  16. Yang, J., Reth, M. Drosophila S2 Schneider cells: a useful tool for rebuilding and redesigning approaches in synthetic biology. Methods in Molecular Biology. 813, 331-341 (2012).
  17. Zhou, R., Mohr, S., Hannon, G. J., Perrimon, N. Inducing RNAi in Drosophila cells by soaking with dsRNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2014, (5), (2014).
  18. Goshima, G., et al. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316, (5823), 417-421 (2007).
  19. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, (3), 487-498 (2008).
Bruk av <em>Drosophila</em> S2 Cells for Live Imaging av Cell Division
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dewey, E. B., Parra, A. S., Johnston, C. A. Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division. J. Vis. Exp. (150), e60049, doi:10.3791/60049 (2019).More

Dewey, E. B., Parra, A. S., Johnston, C. A. Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division. J. Vis. Exp. (150), e60049, doi:10.3791/60049 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter