Summary
Celsplitsingen kunnen in real-time worden gevisualiseerd met behulp van fluorescently gelabelde eiwitten en timelapse-microscopie. Met behulp van het protocol hier gepresenteerd, gebruikers kunnen analyseren celdeling timing dynamiek, mitotische spindel assemblage, en chromosoom congressen en segregatie. Defecten in deze gevallen na RNA-interferentie (RNAi)-gemedieerde Gene knockdown kunnen worden beoordeeld en bepaald.
Abstract
Drosophila S2-cellen zijn een belangrijk hulpmiddel bij het bestuderen van mitose in weefselcultuur, het verstrekken van moleculaire inzichten in dit fundamentele cellulaire proces op een snelle en hoge doorvoer manier. S2-cellen zijn vatbaar voor zowel vaste-als Live-celbeeldvormings toepassingen. Met name Live-celbeeldvorming kan waardevolle informatie opleveren over hoe verlies of knockdown van een gen de kinetiek en dynamiek van belangrijke gebeurtenissen tijdens celdeling kan beïnvloeden, waaronder mitotische spindel assemblage, chromosoom congressen en segregatie, evenals algehele timing van de celcyclus. Hier gebruiken we S2-cellen stabiel met fluorescentisch gelabelde mcherry: α-tubulin om de mitotische spil te markeren en GFP: cenp-A (aangeduid als ' Cid ' gen in Drosophila) om de centromeer te markeren om de effecten van belangrijke mitotische genen te analyseren op de timing van celsplitsingen, van profase (met name bij afbraak van nucleaire enveloppen; NEBD) aan het begin van een anafhase. Dit beeldvormings protocol maakt ook de visualisatie van de spindel microtubulus en chromosoom dynamiek in de mitose mogelijk. Hierin streven we naar een eenvoudig en toch uitgebreid protocol waarmee lezers gemakkelijk S2-cellen kunnen aanpassen voor Live Imaging-experimenten. Resultaten verkregen uit dergelijke experimenten moeten ons begrip van genen die betrokken zijn bij de celdeling uitbreiden door hun rol in verschillende gelijktijdige en dynamische gebeurtenissen te definiëren. Waarnemingen in dit celkweek systeem kunnen in vivo worden gevalideerd en verder worden onderzocht met behulp van de indrukwekkende Toolkit van genetische benaderingen in vliegen.
Introduction
Celdeling is een proces dat essentieel is voor alle multicellulaire organismen, zowel in hun ontwikkeling als in homeostase1. Drosophila is al lange tijd gebruikt als model voor de studie van celdeling, met experimenten in verschillende weefsel typen en genetische omstandigheden die belangrijke inzichten geven in het proces. Hoewel veel van deze inzichten afkomstig zijn van vaste celomstandigheden, is celdeling een dynamische procedure met veel bewegende delen, waardoor visualisatie van levende cellen integraal is om RNAi te beoordelen of genetische knock-outeffecten op verschillende delen van celdeling, inclusief spindel vorming, chromosoom Congres en segregatie, en cytokinesis.
Veel protocollen zijn ontwikkeld en gebruikt in de loop der jaren om Drosophila celdivisies in vivo te visualiseren. Verschillende groepen hebben technieken ontwikkeld voorbeeld verdelingen in zowel larvale imaginal schijven als larvale Brains2,3,4,5,6,7,8 . Deze technieken, die nuttig zijn voorbeeld vorming in specifieke weefsels, zijn beperkt in doorvoer en vereisen vaak de aanmaak en het onderhoud van genetische voorraden om fluorescerende componenten te genereren en de uitdrukking van de belangen van de genen te veranderen. Gekweekte S2-cellen van Drosophila bieden een hoger doorvoer alternatief om snel de effecten van verschillende genen in celdeling te testen. Bovendien kunnen S2-cellen, met de mogelijkheid om verschillende fluorescerende eiwitten te transfect, snel worden aangepast om de effecten van RNAi-knockdown op talrijke componenten van celdeling te bepalen. Fluorescently gelabelde genen van belang kunnen ook worden waargenomen in celdeling, waardoor dynamische karakterisering van hun functie9mogelijk is.
Hier bieden we een gedetailleerd protocol voor Live beeldvorming van mitotische S2-cellen met behulp van methoden die we onlangs beschreven10. Onze methode maakt gebruik van stabiel getranssinfecteerde cellen met fluorescerende markers voor microtubuli en centromeren waarvan de uitdrukking onder controle is van een koper-induzelijke promotor (metallothionein; pMT). Deze methodologie kan worden gebruikt voorbeeld spindel en chromosoom dynamiek in alle fasen van mitose met behulp van een relatief eenvoudige fluorescerende Microscoop met basis beeldvormings software. Het kan verder worden aangepast aan individuele onderzoeksbehoeften, met voorbijgaande transfectie en RNAi die uitgebreide mogelijkheden bieden voor het bepalen van de rol van kandidaatgenen in mitose. Vanwege de relatieve eenvoud van het Protocol, kan het worden gebruikt voor kleinschalige verlies-van-functie schermen om genen te identificeren waarvoor verdere studie in vivo nuttig zou zijn, waardoor meer gerichte inspanningen en efficiëntie mogelijk zijn met daaropvolgende genetische manipulatie in vliegen.
Protocol
1. bereiding van S2-cellen voor behandeling met RNAi
-
Uit een voorraad kweek van Confluent Health pMT: GFP: CID en pMT: mCherry: α-tubulin stabiel getransfunteerde S2-cellen (~ 80% levensvatbaar; geteeld bij 24-28 °C), zaadcellen in een 6 goed steriele kweek plaat met een dichtheid van 1 x 106 cellen/ml in vers, opgewarmd, 10% foetaal runderserum (FBS) de insect media (SIM) van Schneider aangevuld.
Opmerking: stabiel Getransfunde S2-cellen kunnen worden gegenereerd door een protocol te volgen van het Drosophila RNAi screening Center (drsc) (https://DGRC.bio.Indiana.edu/protocols?tab=Cells). Hoewel de specifieke stabiele S2-lijn die hierin wordt gebruikt GFP en mCherry maakt, bestaan er talrijke alternatieven zowel binnen deze fluorescerende Spectra als anderen. Een gedetailleerde bespreking van deze fluorescerende eiwitten valt buiten het toepassingsgebied van dit protocol, maar hun eigenschappen en mogelijke voor-en nadelen zijn elders beoordeeld 11.- Bepaal met behulp van een celteller of hemocytometer de dichtheid van de confluente celkolf.
- Bepaal het volume van de confluente celsuspensie die nodig is om 1 x 106 cellen/ml te bereiken in een totaal volume van 4 ml (bijv. ~ 4 x 106 totaal cellen). Voeg dit volume van de celvoorraad toe aan een volume verse SIM om 4 mL/goed totaal volume te maken. Bepaal de dichtheid van de celkolf (cellen/mL) door het rechtstreeks verdunnen van 100 μL cellen uit de kolf met 100 μL media en het tellen van deze 1:2 verdunning handmatig met een hemocytometer of met een automatische celteller indien beschikbaar.
Opmerking: Als het gebruik van S2-cellen niet stabiel is, kan een voorbijgaande transfectie test met fluorescently gelabeld (GFP, mCherry, enz.) α-of β-tubulin en een DNA-marker (CENP-A, Histone H2B, enz.) worden uitgevoerd. Verder zijn stabiel getransfuneerde cellijnen met verschillende mitotische spindel en DNA-markers beschikbaar in het Drosophila genetica Resource Center dat beter kan passen bij de exacte experimentele behoeften van de gebruiker (https://DGRC.bio.Indiana.edu/Cells/Catalog). - Plaats vers geseede cellen in een incubator van 24-28 °C voor 36-48 uur.
2. behandeling van Geseede cellen met dsRNA tegen gen (s) van belang
Opmerking: Het volgende voorbeeld en resultaat sectie zal gebruik maken van Shortstop (shot), een actin-microtubule crosslinking agent als het gen van belang. Gebruik een mock-behandeling zonder dsRNA of met dsRNA gericht tegen een irrelevant gen (bijv. beta-galactosidase, lacz) als een negatieve controle.
- Warm Schneider insecten media niet aangevuld met FBS (serum vrije media; SFM) in een incubator van 24-28 °C.
-
Breng cellen over van de eerder geseede put (van stap 1.1.2) in een 15 mL steriele buis, waarbij het totale volume van de overgedragen cellen wordt opgemerkt.
- Bewaar een klein volume cellen (~ 100 μL) voor het tellen in een cel teller of hemocytometer.
- Zachte pellet cellen door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Bij het centrifugeren van cellen, bepalen van de concentratie van cellen per mL met behulp van een cel teller of hemocytometer. Vermenigvuldig dit getal met het totale volume dat wordt gecentrifugeerd (genoteerd in 1.2.2.) om het totale aantal cellen te verkrijgen.
- Aspireren de supernatant uit de cellen van de gepileerde.
-
Resuspendeer de cellen in opgewarmd SFM om een concentratie van 3 x 106 cellen/ml te verkrijgen.
- Breng 1 mL van de geresuspendeerde cellen over naar een nieuwe put in een 6-put.
- Voeg 10-50 μg dsRNA (verdund in 100 μL RNAase-vrij water) toe tegen schot (of het beoogde gen van belang) direct aan de cellen en draai de plaat om te mengen. Incueren de plaat voor 1 uur in de 24-28 ° c incubator om directe dsRNA-opname in cellen mogelijk te maken.
- Verwarm tijdens de incubatieperiode van 1 uur de 10% FBS, aangevuld met SIM in de 24-28 °C-incubator.
- Na het inbroed van de cellen met dsRNA voor 1 h, voeg 2 mL 10% FBS aangevuld met SIM rechtstreeks aan de put zonder de 1 mL van de media te verwijderen.
- Plaats cellen in een incubator van 24-28 °C voor 3-7 dagen.
Opmerking: Net als bij de dsRNA-concentratie moet de totale behandelingstijd mogelijk worden geoptimaliseerd voor het gewenste doel gen. Om de werkzaamheid van RNAi te evalueren, voert u een Western-vlek uit op de hele celllysates met behulp van een antilichaam tegen het doel gen. Als de initiële dsRNA-doel volgorde niet effectief blijkt te zijn, is het ontwerpen van alternatieve Dsrna's gericht op unieke sequenties binnen het doel gen.
3. inductie van fluorescerende eiwit expressie en voorbereiding van cellen voorbeeld vorming
- Indien stabiel transport cellen werden gegenereerd met behulp van de bet plasmide (bevattende een induceerbaar metallothioneïneproductie promotor) zoals hier beschreven, induceren van fluorescerende eiwitten door het behandelen van cellen met kopersulfaat (CuSO4) in een uiteindelijke concentratie van 500 μM voor 24-36 h voorafgaand aan de beeldvorming en 4 dagen na behandeling met RNAi. Het gebruik van constitutieve uitdrukkings plasmiden zoals pAct vereist geen koper inductie.
-
Cellen voorbereiden op Imaging
- Warm de 10% FBS aangevuld SIM in de 24-28 ° c incubator voor 1 uur.
- Breng cellen over in een steriele 15 mL buis, waarbij het totale volume van de overgedragen cellen wordt opgemerkt.
- Bewaar een klein volume cellen (~ 100 μL) voor het tellen in een cel teller of hemocytometer.
- Zachte pellet cellen door centrifugeren bij 1.000 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Bij het centrifugeren van cellen, bepalen van de concentratie (cellen/mL) met behulp van een cel teller of hemocytometer. Vermenigvuldig dit getal met het totale volume dat wordt gecentrifugeerd (genoteerd in 2.2.2.) om het totale aantal cellen te verkrijgen.
- Aspireren de supernatant uit de cellen van de gepileerde.
- Respendeer de cellen in verse, verwarmde 10% FBS aangevuld SIM om een concentratie van 2 x 106 cellen/ml te verkrijgen. Voeg een geschikte hoeveelheid CuSO4 toe om de concentratie van 500 μM te behouden.
- Breng 200-500 μL van hersuspendeerde cellen over in een put van een multi-well Live Cell Chamber en plaats deze op de omgekeerde fluorescerende Microscoop. Laat de cellen zich in de kamer vestigen voor 15-30 min voorafgaand aan Imaging experimenten.
Opmerking: Levende cel kamer putten kunnen worden voorgecoat met poly-L-lysine voor extra hechting.
4. een Live Cell Imaging-programma instellen
Opmerking: Live-Celbeeldvorming in dit experiment werd uitgevoerd met behulp van een geïnverteerd beeldvormings systeem en de bijbehorende software (bijvoorbeeld Olympus IX83 met het cellSens Dimensions-softwarepakket). Details zullen verschillen per Microscoop fabrikant en softwarepakket; Daarom worden de algemene richtlijnen en bewerkingen hieronder weergegeven.
-
Gebruik de software die de omgekeerde fluorescerende Microscoop uitvoert en bereid een programma voor om een cel (of cellen) in de loop van de tijd te Imaging.
- Open de software door te dubbelklikken op het pictogram Software Desktop.
- Maak een nieuw experimenteel bestand door te klikken op bestanden vervolgens op nieuw experimenteel bestand.
- Voeg eerst een timelapse-lus in waarop beelden zullen worden genomen. Doe dit door te klikken op het stopwatch pictogram (time-lapse loop icoon) van de icoon balk. Stel het interval in s in op het tabblad experiment Manager en stel het aantal cycli op hetzelfde tabblad in door de gewenste totale experiment lengte (in s) te delen door het interval. Laat de lus te herhalen over de gewenste totale tijdsperiode.
Opmerking: Typisch, beelden worden genomen elke 30-60 s over een periode van 3-4 h. - Voeg binnen de laag time lapse loop een infrarood focus controle in om de focus van de doelstelling te behouden (indien beschikbaar). Om dit te doen, voeg een Z-drift compensatie (ZDC) stap binnen de time-lapse lus laag door te klikken op het vierkant met twee pijlen pictogram (verplaatsen XY pictogram) en het selecteren van z-drift compensatie uit het dropdown menu.
Opmerking: De term infrarood focus controle verwijst naar een systeem waarmee een infrarood puls wordt gebruikt om een constante afstand tussen de doelstelling en de Slide/Imaging kamer te behouden. Veel microscopen hebben een dergelijk systeem, elk met hun eigen eigendoms nomenclatuur. Lezers moeten hun gebruiksaanwijzing of vertegenwoordiger raadplegen voor specifieke naamgevingsgegevens. - Nadat u de infrarood focus hebt gecontroleerd, voegt u een stap in het programma toe om een meerkanaals afbeelding (bijvoorbeeld FITC voor GFP en TRITC voor mCherry) over een 3-5 z-stacks te nemen door eerst een z-stack stap in te voegen en vervolgens het kanaal op te geven. Doe dit door een Meerkanaalgroeplaag toe te voegen binnen de time-lapse loop-laag door op het pictogram van het kleurenwiel te klikken (pictogram voormeerkanaals groep ). Voeg vervolgens een Z-stack loop laag toe binnen de multichannel Groepslaag door te klikken op het 3-gelaagde icoon (z-stack loop icoon). Stel de gewenste stapgrootte en het aantal segmenten in op het tabblad experiment beheer en stel de belichting van elk kanaal zo laag mogelijk in om fotobleaching te minimaliseren.
Opmerking: Het z-stack-interval, de belichtingstijd en de procentuele doorlatendheid van LEDs kunnen variëren. Typisch in deze experimenten, gebruik maken van drie z-stapels genomen over een bereik van 3 μm, het geven van een interval van 1 μm tussen elke stapel. Het definiëren van het midden van de cel in plaats van de boven-en onderzijde neigt naar de beste resultaten te leiden. Vervolgens worden afbeeldingen verzameld voor elk kanaal (s) bij een blootstelling van 50 MS en een procentuele doorlatendheid van 50% zonder dat er een filter met neutrale dichtheid (ND) is ingeschakeld.
5. beeld scheidings cellen met behulp van Live Cell Imaging Program
Opmerking: S2-cellen vereisen geen CO2 en groeien optimaal op 23-27 °c. Alle beeldvorming werd uitgevoerd bij omgevingstemperatuur in een goed gecontroleerde ruimte.
- Zoek met behulp van de oculars de bovenste (of onderste) hoek van de put en concentreer de doelstelling (40-60x olie onderdompeling) op de cellen met behulp van het mCherry (α-tubulin) kanaal.
- Scan langs de bovenkant (of onderkant) van de put om weg te gaan van de verticale put-verdeler.
Opmerking: Imaging te dicht bij de well Dividers kan interfereren met infrarood focus controles. - Zoek een cel (of cellen) die in de late G2 of vroege M-fase (Prophase).
Opmerking: Deze cellen kunnen het best worden geïdentificeerd door het bestaan van exact twee ' ster achtige ' microtubulenstructuren (centroomen) en een intacte kern (aangegeven door een cirkelvormig gebied van het gerefracteerde licht in de cel), beide gemakkelijk te onderscheiden met behulp van de α-tubulin (rood) excitatie filter. Selectie van cellen in eerdere interfase, opmerkelijk door een of nul gemakkelijk zichtbare centrosomes, kan resulteren in verspilde tijd als gevolg van een vertraging in G2/M progressie. Omgekeerd zal selectie van cellen na NEBD voorkomen dat nauwkeurige berekening van mitotische timing en beeldvorming van vroege spindel assemblage en chromosoom dynamiek. Ook bevatten S2-cellen vaak > 2 centrosomes. Hoewel deze meestal clusters in een bipolaire spindel12, het is aangeraden dat gebruikers het vermijden van deze cellen, tenzij anders gewenst voor het experimentele ontwerp. Afbeeldingen en discussie over geschikte cellen om te selecteren, u vinden in de sectie representatieve resultaten . - Klik op de knop Live View om te beginnen met het bekijken van cellen in het software scherm. Met behulp van de fijne focus knop van de Microscoop, focus de cel (of cellen) van belang. Stel de infrarood focus controle in door op de knop focus instellen te klikken.
- Start het time lapse Imaging-programma door op de knop begin te klikken. Pas de histogrammen zo nodig aan door het gewenste kanaal te selecteren en de gemiddelde pixel intensiteiten aan te passen om de cel (of cellen) van belangstelling duidelijk te zien.
- Laat het programma uit te voeren, het controleren van de cel na 15-20 min om ervoor te zorgen nucleaire envelop afbraak (NEBD) is opgetreden, die wordt bepaald door het verdwijnen van de ronde donker, een refracteerde plek in de buurt van de cel Center.
- Blijven toestaan dat het programma uit te voeren, af en toe controleren (elke 15-20 min) om te bepalen wanneer anafhase begin is opgetreden. Stop het programma op dit moment als er meer tijd overblijft in de totale tijdsperiode en sla het bestand op. Als de gebeurtenissen tijdens telophase en cytokinese van belang zijn, u het programma ook voldoende tijd geven om deze processen ook te kunnen afbeelen.
-
Voer een analyse van NEBD uit naar de anafhase begin timing door de tijd van NEBD (tNEBD) in min en de tijd van de initiële chromosoom scheiding (tanafhase onset) in min te vermelden en het tNEBD af te trekken van het begin van deanafhase om de NEBD tot anafhase begintijd voor een bepaalde cel.
- U doet dit door te klikken op de knop frame omhoog en de frames op te halen waar de NEBD en de anafhase ontstaan, waarbij deze worden afgetrokken om het totale aantal verlopen frames te bepalen en dit te vermenigvuldigen met het tijdsinterval tussen afbeeldingskaders.
- Ga verder met scannen voor vooraf verdelen van cellen om meerdere n te verkrijgen voor een bepaalde voorwaarde. Cellen kunnen tot 12 uur na hun initiële bezinking in de levende cel worden afgebeeld.
Representative Results
Methoden die we hierboven beschrijven, resulteren in de identificatie en beeldvorming van Drosophila S2-cellen die celdeling ondergaan. Cellen die op het punt staan te verdelen (d.w.z. vlak voor het betreden van de M-fase), kunnen worden getarget door de aanwezigheid van twee nucleotiderende en een intacte kern die wordt aangegeven door een geredigeerd licht en een donkerdere vlek in de cel wanneer ze worden bekeken in het α-tubulinkanaal (Figuur 1, linkse panelen, rode kanaal; pijlpunt 1a). We schatten dat ongeveer 2-5% van de cellen in deze categorie valt, en tussen Imaging-experimenten besteden we meestal een maximum van 2-3 minuten aan het scannen naar een andere gekwalificeerde cel. NEBD kan worden gevisualiseerd door het verdwijnen van deze donkere vlek, resulterend in de uniforme kleuring van het cytoplasma (Figuur 1, panelen gemarkeerd "00:00", rood). Na NEBD kan de tijd die elke cel neemt om de spil te vormen, het Congres chromosomen en de scheiden-chromosomen worden gemeten door simpelweg de tijdspunten van deze gebeurtenissen te vermelden ten opzichte van NEBD.
We gebruiken deze divisies om de mitotische timing te beoordelen, met name van NEBD tot een anafhase aanvang, waarbij wordt gewezen op het punt waarop chromosomen beginnen te scheiden. Een meerderheid (~ 90%) van koper-geïnduceerde cellen, uitgedrukt zowel mCherry: α-tubulin en GFP: CID. Een klein percentage cellen (~ 10%) slechts één marker of geen van beide uitgedrukt. Deze cellen werden vermeden tijdens celselectie. Typisch, S2 cellen weergeven NEBD aan anafhase begin timing van tussen 20-30 minuten (Figuur 1a, controle). We volgende behandelde cellen met dsRNA gericht tegen Short stop (shot), een actin-microtubulus crosslinking eiwit dat we vermoeden kunnen beïnvloeden celcyclus dynamiek. Inderdaad, na shot knockdown cellen vertoonden een significante mitotische vertraging (Figuur 1b, shotrnai delay), met veel cellen te arresteren bij metafase en nooit overstappen op anafhase tijdens het hele 2-3-uur Imaging experiment (figuur 1d, ShotRNAi-arrestatie). We redeneren dat dit uitstel/arrestatie fenotype waarschijnlijk te wijten is aan de activering van de spil assemblage controlepunt (d.w.z. de M-fase controlepunt). Om deze hypothese direct te testen, cobehandelden we cellen met dsRNA tegen shot en Rough deal (Rod), een belangrijk onderdeel van dit controlepunt13. Dit leidde tot een onderdrukking van de arrestatie fenotype, resulterend in NEBD tot anafhase tijden vergelijkbaar met de controle (figuur 1c, shotrnai + RodRNAi). Zo stelde dit live Imaging protocol ons in staat om te concluderen dat schot nodig is voortijdige M-fase progressie en dat het verlies leidt tot Checkpoint activatie die de mitotische cellen vertraagt of arresteren.
Figuur 1: Live Imaging onthult celcyclus defecten als gevolg van mitotische controlepunt activering in S2-cellen.
In alle omstandigheden werd live-celbeeldvorming uitgevoerd op S2-cellen, stabiel samen met een induceerbaar GFP: CID en mCherry: αTubulin zoals hierin beschreven. (A) cartoons illustreren belangrijke bezienswaardigheden tijdens mitose, en bijbehorende beelden worden getoond uit representatieve films van aangegeven genotypen met tijdpunten ten opzichte van NEBD (t = 00:00) aangegeven. Regel cellen komen doorgaans voor op anafhase binnen 20-30 min. shotrnai-behandelde cellen weergeven NEBD-anafhase delay (B) en frequent ondergaan metafase stilstand, nooit het invoeren van anafase binnen het Imaging experiment (D). Co-behandeling van cellen met ShotRNAi en RodRNAi, een onderdeel van de spil assemblage controlepunt, onderdrukt het schot fenotype leidt tot anafhase onset kinetica vergelijkbaar met de controle cellen (C). De pijlen in (a) duiden de ' ster achtige ' centrosoom structuren aan en de grote pijlpunt geeft de Nucleus aan. Elke schaalbalk vertegenwoordigt 5 micron. Dit cijfer wordt aangepast en opnieuw gepubliceerd met toestemming van10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Video 1: timelapse-film van ' Control ' s2 Cell Division. Video toont een representatieve film van S2 celdeling in ' Control ' genotype. Deze film komt overeen met Figuur 1a. Deze video is aangepast en opnieuw gepubliceerd met toestemming van10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: timelapse-film van vertraagde ' ShotRNAi ' s2 Cell Division. Video toont een representatieve film van S2 celdeling in ' ShotRNAi ' genotype dat leidt tot een fenotypische mitotische vertraging. Deze film komt overeen met Figuur 1b. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 3: timelapse-film van ' ShotRNAi + RodRNAi ' s2 Cell Division. Video toont een representatieve film van S2 celdeling in ' ShotRNAi + RodRNAi ' genotype. Deze film komt overeen met figuur 1c. Deze video is aangepast en opnieuw gepubliceerd met toestemming van10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). Klik hier om deze video te downloaden.
Video 4: timelapse-film van gearresteerd ' ShotRNAi ' s2 Cell Division. Video toont een representatieve film van S2 celdeling in ' ShotRNAi ' genotype dat leidt tot een fenotypische mitotische arrestatie. Deze film komt overeen met figuur 1d. Klik hier om deze video te downloaden.
Discussion
Een geschikte cel identificeren
Sleutel tot Imaging verdelen S2 cellen is eerst het lokaliseren van de juiste cel. Tijd kan worden verspild beeld cellen die ten onrechte gedacht te zijn klaar om te verdelen, maar niet om dit te doen binnen een redelijke termijn. Cellen moeten worden geïdentificeerd met twee verschillende en zichtbare nucleotiderende en een intacte kern. Centrosomes moeten microtubulus vezels hebben die van hen uitgaan, waardoor ze een "sterachtig" uiterlijk hebben. Een intact Nucleus breekt licht bij het aanpassen van de focus, en maakt ook het geschatte midden van de cel donkerder in uiterlijk. De Nucleus zal ook de GFP: CID "dots" bevatten, een ander onderscheidend kenmerk om te helpen bij de identificatie. Cellen met > 2 centromosomen, tubuline puncta zonder tubulinevezels afkomstig van hen, of cellen met slechts één centrosoom moet worden vermeden. Bovendien, als twee nucleotiderende zichtbaar zijn, maar een kern niet, is NEBD al opgetreden en is de cel te ver gevorderd in zijn divisie om te worden afgebeeld als een volledige M-fase analyse gewenst is. Zodra een geschikte cel is gevonden, is de snelheid bij het starten van beeldvorming cruciaal omdat NEBD snel optreedt (meestal binnen 3-5 min) en het uitstellen van de start van Imaging kan leiden tot gemiste kansen. Concentreer de cel snel in de beeldvormings software zodanig dat beide nucleotiderende zichtbaar zijn, of als centroomen met elkaar buiten het vliegtuig zijn, stel het brandpunt tussen de twee in, zodat elk kan worden vastgelegd wanneer Z-stapels boven en onder het gedefinieerde centrum worden verzameld Punt. Zodra de focus is gelegd, stelt u onmiddellijk de verschuiving in tussen het werkgebied en het oppervlak van de levende cel met behulp van de infrarood scherpstel controle (indien beschikbaar) en start u het beeldvormings programma. Hoewel het hier gepresenteerde protocol specifiek is afgestemd op experimenten die NEBD-to-anaphase dynamiek beoordelen, kunnen eenvoudige aanpassingen passen bij lezers die alternatieve mitotische gebeurtenissen bestuderen. Voor NEBD-to-metaphase en anaphase-to-telophase Imaging, raden we 10 s-interval voor het vastleggen van afbeeldingen aan, aangezien deze processen zeer dynamisch zijn en snel optreden in S2-cellen (5-10 min). Metafase-naar-anafhase transitie (onze typische experimentele focus) is een langer proces (20-30 min) in S2-cellen, en we verzamelen beelden op 30 s-intervallen. Tenslotte, telophase-through-cytokinesis komt vrij langzaam in S2 cellen, en we raden 60 s intervallen bieden voldoende resolutie voor dit geschatte uur-lange proces.
Focus behouden in het Imaging-programma
Als een apparaat met infrarood focus controle niet beschikbaar is, moet u ervoor zorgen dat u de Microscoop of de tabel waarop het zich bevindt niet stoten, omdat dit kan resulteren in de focus van de cel tijdens het beeldvormings programma, wat leidt tot dubbelzinnige, niet-interpreteerbare resultaten. Pre-coating de levende cel kamer putten met poly-L-lysine kan helpen in de hechting van de cel, die kan helpen voorkomen dat de celbeweging en is vooral handig voor opstellingen zonder infrarood focus controles. Bovendien, opstellingen met schokabsorberende platformen of lucht tafels kunnen verder helpen voorkomen dat cellen verplaatsen uit de focus. Ten slotte hebben sommige software-Programma's pauze functies waardoor de gebruiker opnieuw kan scherpstellen en het programma hervat.
Meerdere cellen Imaging
Handig voor accumulatie van gegevens is dat vaak meerdere cellen die klaar zijn om te verdelen in hetzelfde gezichtsveld voor Imaging kunnen worden geplaatst. Dit kan met name nuttig zijn voor experimenten waarbij cellen lange M-fase duur of langdurige arrestatie hebben (bijvoorbeeld condities die activering van de SAC induceren). Voor deze cellen, we meestal beeld totdat de cellen zijn fotogebleekt (ongeveer 2-3 h), maar de volledige timing van de gearresteerde cellen moet worden naar goeddunken van de onderzoeker. Soms kunnen de meerdere voorscheidings cellen zich in verschillende focal vlakken bevinden, in welk geval het nuttig kan zijn om z-stacks toe te voegen om alle cellen geschikt te maken. Het toevoegen van meer z-stapels kan ook helpen bij het verbeteren van de resolutie. Voorzichtigheid moet worden betracht door dit te doen, echter, omdat het cellen zal blootstellen aan meer straling en leiden tot sneller photobleaching, evenals leiden tot grote bestandsgroottes op harde schijfopslag apparaten.
Het vermijden van Fotobleaching en fototoxiciteit
Onze methode beschrijft specifieke instellingen voor belichtingstijden, beeldvormings intervallen, z-stacks en procentuele doorlatendheid voor onze LED-lichtbron die over het algemeen werken voor onze experimentele opstelling en gewenste uitkomsten. Aangezien microscopen en experimentele doelen kunnen variëren, kan wat goed werken voor ons systeem leiden tot vroegtijdige fotobleaching of fototoxiciteit in andere. Foto schade kan een gebrek aan spil beweging, microtubulus fragmentatie, defecte microtubulus dynamiek en verlengde spil controlepunt activering vertonen. Een mogelijke methode om dergelijke valkuilen te voorkomen is het beperken van de blootstellingstijd. De meeste moderne camera's beschikken nu over breed dynamisch bereik, en histogrammen kunnen worden aangepast om structuren te visualiseren, zelfs bij zeer lage belichtingen. Een andere methode is het vergroten van het beeldvormings interval (bijvoorbeeld tot enkele minuten tussen afbeeldingen), zodat het aantal keren dat een cel wordt blootgesteld aan licht over een totaal verzamelings interval wordt verlaagd. Dit is met name voordelig bij beeldvorming voor langere tijd (vele uren), en kan bovendien helpen bij het verkleinen van de bestandsgrootte van dergelijke experimenten. Het beperken van het aantal genomen z-stapels kan ook helpen bij het verminderen van de licht blootstelling, met behulp van 2 of zelfs slechts 1 in plaats van 3. Het aanpassen van de procentuele transmissie van licht (voor LED-lichtbronnen) of het gebruik van filters met neutrale dichtheid (voor zowel halogeen lamp als LED-lichtbronnen) zal de lichtintensiteit verminderen en gepaard gaan met langere belichtingstijden, kan de zichtbaarheid behouden . Door cellen met nucleotiderende al gescheiden te kiezen, kan de algehele blootstelling worden beperkt in die zin dat deze cellen meestal snel (binnen een minuut of twee) in mitose worden ingevoerd na het begin van de beeldvorming. Men kan ook de tijd beperken dat cellen voor NEBD mogen worden afgebeeld. Ons lab stelt deze tijd meestal in op 10 min, maar een meer conservatieve limiet kan eenvoudig door de gebruiker worden opgelegd. Bovendien, een meer ' invasieve ' maatregel die wij aanbevelen is behandeling met dsRNA gericht tegen een component van de SAC (zoals Rod of Mad2). Als een arrestatie fenotype te wijten is aan niet-specifieke celbeschadiging (bijv. een defecte microtubulus dynamiek), is een dergelijke behandeling minder geneigd om de arrestatie te onderdrukken in vergelijking met een bonafide effect van het gen van belang in het oorspronkelijke experiment.
Toekomstige richtingen
De hier beschreven methode kan worden gebruikt op een relatief eenvoudige epifluorescerende Microscoop snel beeld Live cel divisies en kan gemakkelijk worden aangepast aan het specifieke experimentele ontwerp en de doelstellingen van een onderzoeker passen. Verschillende uitstekende methoden voor het kweken, RNAi knockdown benaderingen, voorbijgaande transfectie en fluorescentiemicroscopie zijn gepubliceerd voor S2 en andere Drosophila cellen9,14,15, 16 , 17. ons protocol biedt een aantal voordelen. (1) het gebruik van een dubbele stabiele cellijn (GFP: CID, mCherry: α-Tubulin) markeert tegelijkertijd twee belangrijke mitotische structuren, vermijdt de rompslomp en mogelijke complicaties van voorbijgaande transfectie en zorgt ervoor dat bijna alle cellen fluorescerende markers zullen uitdrukken als potentiële kandidaten voor Imaging. (2) de aanpassing aan mitose voegt toe aan gepubliceerde protocollen die de cytoskelet dynamiek in motiel, niet-scheidings cellen onderzoeken en strekt tot het onderzoeken van mitotische gebeurtenissen in real time. Hoewel we geloven dat het een krachtige techniek is die bijdraagt aan het repertoire van anderen, kunnen er altijd verbeteringen worden aangebracht. Een bepaald gebied van celdeling dat we moeilijk te beeld hebben gevonden is centrosoom Division. Dit gebeurt vóór NEBD en het is moeilijk om te bepalen wanneer een enkele centrosoom klaar is om te scheiden in twee. Het gebruik van fluorescerende celcyclus markeringen (Cyclin A en Cyclin B) kan helpen bij het oplossen van dit probleem, maar komt ten koste van kanalen die kunnen worden gebruikt om componenten van de celdeling te visualiseren. Onze beste strategie voor het visualiseren van centrosoom Division is het toevoegen van multipoint-acquisitie aan het Imaging-programma (het definiëren van verschillende punten in het xy-vlak naar afbeelding), maar dit kan resulteren in grote bestanden, en kan ook vereisen (afhankelijk van het aantal punten) het interval tussen de afbeeldings verzameling vergroten, waardoor de tijdsresolutie van de resulterende film afneemt. Een andere oplossing zou kunnen zijn synchronisatie van cellen in een gewenste cel cyclus fase met behulp van geneesmiddelen die gericht zijn op celcyclus regulatoren gevolgd door daaropvolgende wegwassende werking voorafgaand aan Imaging, hoewel deze methoden mogelijk niet betrouwbaar zijn in S2 cellen specifiek.
Het hier gepresenteerde protocol biedt ook een basis voor toekomstige toepassingen in Live-celbeeldvorming. Met verbeterde beeld-en software technologie, kunnen echt hoge doorvoerbewerkingen van dit protocol met behulp van hogere capaciteit, multi-Chambered platen mogelijk zijn. Dergelijke innovaties zouden grootschalige RNAi-schermen maken, zoals die al zijn bereikt in vaste preparaten12,18, meer Tractable in een live-celformaat. Kleine molecuul drug schermen kunnen ook worden voorgesteld als een middel om nieuwe verbindingen die gericht zijn op celdelings processen te identificeren. Verbetering van de fluor Foren en optische filters kunnen ook leiden tot beeldvorming van meerdere mitotische componenten (niet alleen de twee beschrijven we), waardoor beeldvorming van specifieke mitotische regulatoren en hun interacties met DNA en/of spil. Het genereren van cellen met fluorescerende verslaggevers die de DNA-beschadiging of tijdens apoptosis uitdrukken, zou bijvoorbeeld nuttige hulpmiddelen zijn om nieuwe genen te identificeren die bij deze processen betrokken zijn. Vergelijkbare benaderingen kunnen worden gebruikt om de celcyclus dynamiek te onderzoeken met behulp van de uitdrukking van fluorescently Tagged cyclinen19.
Disclosures
De auteurs hebben niets te verklaren.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health (R01 GM108756). We zijn Gary Karpen (University of California, Berkeley) dankbaar voor het royaal verstrekken van een GFP: CID S2-cellijn voorraad waaruit onze GFP: CID/mCherry: αTubulin-lijn10is gegenereerd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | for cell counting |
| cellSens imaging software | Olympus | ||
| CELLSTAR Cell Culture Flask, 50 mL, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10 PCS/BAG | Greiner Bio-One | 690175 | |
| CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Centrifuge 5804 R | eppendorf | Cat. 022623508 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% | Sigma-Aldrich | C3036-250G | |
| Corning Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35015CV | |
| Effectene Transfection Reagent 1 mL | Qiagen | 301425 | for transient transfection |
| IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope | Olympus | ||
| LabTek Chambered Slide Insert | Applied Scientific Instruments | I-3016 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | For dsRNA production |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit | ORFLO | MXZ001 | for cell counting |
| MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller | Applied Scientific Instruments | ||
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
| Orca-Flash 4.0 LT Camera | Hammamatsu Photonics K.K. | C11440-42U | |
| pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets | Labconco | 302310000 | |
| Schneider's insect medium | Sigma-Aldrich | S0146-100ML | |
| Spectra Tub Centrifuge Tubes | VWR | 470224-998 | |
| Uner Counter BOD Incubator | Sheldon manufacturing (VWR) | 89409-346 | |
| X-CITE 120 LED | ExcelitasTechnologies | Led light source | |
| Z -Drift Compensator (ZDC) | Olympus | infrared focus check |
References
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Cell division and the maintenance of epithelial order. Journal of Cell Biology. 207 (2), 181-188 (2014).
- Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (32), 14217-14222 (2010).
- Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
- Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
- Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
- Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
- Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Imaginal Discs. Methods in Molecular Biology. 1478, 203-213 (2016).
- Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).
- Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).
- Dewey, E. B., Johnston, C. A. Diverse mitotic functions of the cytoskeletal cross-linking protein Shortstop suggest a role in Dynein/Dynactin activity. Molecular Biology of the Cell. 28 (19), 2555-2568 (2017).
- Rodriguez, E. A., et al. The Growing and Glowing Toolbox of Fluorescent and Photoactive Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).
- Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes and Development. 22 (16), 2189-2203 (2008).
- Basto, R., Gomes, R., Karess, R. E. Rough deal and Zw10 are required for the metaphase checkpoint in Drosophila. Nature Cell Biology. 2 (12), 939-943 (2000).
- Currie, J. D., Rogers, S. L. Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility. Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).
- Lu, W., Del Castillo, U., Gelfand, I. V. Organelle transport in cultured Drosophila cells: S2 cell line and primary neurons. Journal of Visualized Experiments. (81), e50838 (2013).
- Yang, J., Reth, M. Drosophila S2 Schneider cells: a useful tool for rebuilding and redesigning approaches in synthetic biology. Methods in Molecular Biology. 813, 331-341 (2012).
- Zhou, R., Mohr, S., Hannon, G. J., Perrimon, N. Inducing RNAi in Drosophila cells by soaking with dsRNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (5), (2014).
- Goshima, G., et al. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316 (5823), 417-421 (2007).
- Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).
