Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Hücre Bölünmesi Canlı Görüntüleme için Drosophila S2 Hücrelerinin Kullanımı

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/60049
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of New Mexico

Summary

Hücre bölünmeleri floresan etiketli proteinler ve zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak gerçek zamanlı olarak görüntülenebilir. Burada sunulan protokolü kullanarak, kullanıcılar hücre bölünmesi zamanlama dinamiklerini, mitotik mil montajını ve kromozom kongresini ve segregasyonlarını analiz edebilirler. RNA girişimini (RNAi) aracılı gen nakavtı sonrası bu olaylardaki kusurlar değerlendirilebilir ve ölçülebilir.

Abstract

Drosophila S2 hücreleri doku kültüründe mitoz çalışmada önemli bir araçtır, hızlı ve yüksek iş lenme şekilde bu temel hücresel sürecin moleküler anlayışlar sağlayan. S2 hücreleri hem sabit hem de canlı hücre görüntüleme uygulamalarına uygun olduğunu kanıtlamıştır. Özellikle, canlı hücre görüntülemesi, bir genin kaybolması veya yıkılmasının hücre bölünmesi sırasında kinetiği ve dinamiklerini nasıl etkileyebileceği hakkında değerli bilgiler verebilir, mitotik mil montajı, kromozom kongresi ve segregasyon gibi genel hücre döngüsü zamanlaması. Burada, mitotik iğ ve GFP:CENP-A (Drosophila'da'CID' geni olarak anılacaktır) işaretlemek için floresan etiketli mCherry:α-tubulin ile transfeced S2 hücrelerini kullanıyoruz. hücre bölünmeleri, profazdan (özellikle Nükleer Zarf Dökümünde; NEBD) anafaz başlangıcına. Bu görüntüleme protokolü aynı zamanda mitoz boyunca iğ mikrotübülve kromozom dinamiğinin görüntülenmesi için izin verir. Burada, okuyucuların Canlı görüntüleme deneyleri için S2 hücrelerini kolayca uyarlamalarına olanak sağlayacak basit ama kapsamlı bir protokol sağlamayı amaçlıyoruz. Bu tür deneylerden elde edilen sonuçlar, eşzamanlı ve dinamik olaylardaki rollerini tanımlayarak hücre bölünmesinde yer alan genleri anlamamızı genişletmelidir. Bu hücre kültür sisteminde yapılan gözlemler, sineklerde genetik yaklaşımların etkileyici araç seti kullanılarak in vivo olarak doğrulanabilir ve araştırılabilir.

Introduction

Hücre Bölünmesi tüm çok hücreli organizmalar için kritik bir süreçtir,hem gelişim leri hem de homeostaz1. Drosophila uzun hücre bölünmesi çalışmaları için bir model olarak kullanılmıştır, çeşitli doku tipleri ve genetik koşullar süreci içine anahtar anlayışlar sağlayan deneyler ile. Bu öngörülerin çoğu sabit hücre koşullarından gelirken, hücre bölünmesi birçok hareketli parçaile dinamik bir işlemdir, canlı hücrelerin görselleştirilmesini rnai veya genetik nakavt etkilerini hücre bölünmesinin çeşitli bölümleri üzerinde değerlendirmek için entegre hale getirir, iğ oluşumu, kromozom kongre ve segregasyon ve sitokinez.

Drosophila hücre bölünmelerini in vivo görselleştirmek için yıllar içinde birçok protokol geliştirilmiş ve kullanılmıştır. Çeşitli gruplar hem larva imaginal diskler ve larva beyinleri2,3,4,5,6,7,8 görüntü bölümleri için teknikler ekili var . Bu teknikler, belirli dokularda görüntüleme için yararlı olsa da, üretim sınırlıdır ve genellikle floresan bileşenleri oluşturmak ve ilgi genlerin ifadesini değiştirmek için genetik stokların üretimi ve bakımı gerektirir. Drosophila'dan kültürlü S2 hücreleri, hücre bölünmesindeki çeşitli genlerin etkilerini hızla test etmek için daha yüksek bir üretim alternatifi sağlar. Ayrıca, çeşitli floresan proteinler transfect yeteneği ile, S2 hücreleri hızlı bir şekilde hücre bölünmesi çok sayıda bileşenleri üzerinde RNAi knockdown etkilerini belirlemek için değiştirilebilir. Floresan etiketli genler de hücre bölünmesi gözlenebilir, onların fonksiyonudinamik karakterizasyonu için izin9.

Burada mitotik S2 hücrelerinin canlı görüntülemesi için detaylıbir protokol salıyoruz. Yöntemimiz, ekspresyonu bakır indükleyici bir promotor (metallothionein; pMT) kontrolü altında olan mikrotübüller ve sentromerler için floresan belirteçleri olan stably transfected hücreleri kullanır. Bu metodoloji, temel görüntüleme yazılımı ile nispeten basit bir floresan mikroskobu kullanarak mitozun tüm evrelerinde mil ve kromozom dinamiklerini görüntülemek için kullanılabilir. Geçici transfeksiyon ve RNAi mitozda aday genlerin rolünü belirlemek için genişletilmiş olanaklar sunarak, bireysel araştırma ihtiyaçlarına uyacak şekilde daha da özelleştirilebilir. Protokolün göreceli basitliği nedeniyle, daha ileri çalışmalarda in vivo yararlı olacak genleri belirlemek için küçük ölçekli fonksiyon kaybı ekranlar için kullanılabilir, sonraki genetik ile daha odaklı çaba ve verimlilik için izin sinekmanipülasyon.

Protocol

1. RNAi ile Tedavi için S2 Hücrelerinin Hazırlanması

  1. Enakıcı pMT:GFP:CID ve pMT:mCherry:α-tubulin stable transfected S2 hücreleri bir stok kültüründen (~ 80% canlı; 24-28 °C'de yetiştirilen), taze, ısınmış, % 10 fetal sığır serumu (FBS) bir yoğunlukta 6 iyi steril kültür plakası tohum hücreleri 1 x 106 hücre/ mL yoğunlukta Schneider'ın böcek medya (SIM) takviye.
    NOT:     Drosophila RNAi Tarama Merkezi'nden (DRSC) (https://dgrc.bio.indiana.edu/Protocols?tab=cells) bir protokol izleyerek transfected S2 hücreleri oluşturulabilir. Burada kullanılan belirli kararlı S2 hattı GFP ve mCherry kullansa da, bu floresan spektrumların yanı sıra diğerleri içinde de çok sayıda alternatif bulunmaktadır. Bu floresan proteinlerin ayrıntılı bir tartışma bu protokol kapsamı dışındadır, ancak özellikleri ve potansiyel avantajları / dezavantajları ustaca başka bir yerde gözden geçirilmiştir 11.
    1. Bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak, confluent hücre stokunun yoğunluğunu belirleyin.
    2. Toplam 4 mL hacimde (örneğin~ 4 x 106 toplam hücre) 1 x 106 hücre/mL elde etmek için gerekli olan konfluent hücre süspansiyonunun hacmini belirleyin. 4 mL/iyi toplam hacim yapmak için taze SIM hacmine hücre stoku bu hacmi ekleyin. Hücre stokunun (hücre/mL) yoğunluğunu, 100 μL media ile doğrudan stok şişesinden 100 μL'lik hücreyi seyrelterek ve varsa el ile 1:2 seyreltme sayarak belirleyin.
      NOT: S2 hücreleri kullanılarak, floresan etiketli (GFP, mCherry, vb.) α veya β-tubulin ve DNA belirteci (CENP-A, Histone H2B, vb.) ile geçici bir transfeksiyon testi yapılabilir. Ayrıca, çeşitli mitotik mil ve DNA belirteçleri ile stably transfected hücre hatları daha iyi kullanıcının tam deneysel ihtiyaçlarına uygun olabilir Drosophila Genetik Kaynak Merkezi mevcuttur (https://dgrc.bio.indiana.edu/cells/Catalog).
    3. Taze tohumlu hücreleri 36-48 saat boyunca 24-28 °C inkübatöre yerleştirin.

2. Tohumlu Hücrelerin DsRNA Ile Gen(ler) Karşı İlgi

NOT: Aşağıdaki örnek ve Sonuçlar bölümünde, bir aktin-mikrotübül çapraz bağlama maddesi olan Shortstop (Shot) ilgi geni olarak kullanılacaktır. DsRNA'sız veya alakasız bir gene (örneğin, beta-galaktozidaz, lacZ)karşı yönlendirilmiş dsRNA ile negatif kontrol olarak sahte bir tedavi kullanın.

  1. Sıcak Schneider böcek medya FBS ile desteklenmez (Serum ücretsiz medya; SFM) 24-28 °C inkübatör.
  2. Daha önce tohumlanmış kuyudan (adım 1.1.2) hücreleri 15 mL steril bir tüpe aktarın ve aktarılan hücrelerin toplam hacmine dikkat edin.
    1. Bir hücre sayacında veya hemositometrede saymak için küçük bir hücre hacmini (~100 μL) koruyun.
  3. Oda sıcaklığında 3 dk için 1.000 x g santrifüj ederek yavaşça pelet hücreleri.
    1. Hücreleri santrifüj ederken, bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak mL başına hücre konsantrasyonu belirlemek. Toplam hücre sayısını elde etmek için bu sayıyı santrifüj edilen (1.2.2.2.) ile çarpın.
  4. Peletli hücrelerden süpernatant aspire.
  5. 3 x 106 hücre/mL konsantrasyonu elde etmek için ısıtılmış SFM'deki hücreleri yeniden askıya alın.
    1. Askıya alınan hücrelerin 1 mL'sini 6 kuyuluktaki yeni bir kuyuya aktarın.
  6. Shot'a (veya ilgi çekici hedef gen) doğrudan hücrelere karşı 10-50 μg dsRNA (100 μL RNAase içermeyen su ile seyreltilmiş) ekleyin ve plakayı karıştırmak için döndürün. 24-28 °C inkübatörde 1 saat boyunca plakayı kuluçkaya yatırarak hücrelere doğrudan dsRNA alımı na izin verin.
  7. 1 saat kuluçka sırasında, 24-28 °C inkübatörde %10 FBS takviyeli SIM'i ısıtın.
  8. Hücreleri 1 saat dsRNA ile kuluçkaya yattıktan sonra, 1 mL'lik ortamı çıkarmadan 2 mL % 10 FBS destekli SIM'i doğrudan kuyuya ekleyin.
  9. Hücreleri 3-7 gün boyunca 24-28 °C'lik kuvöze yerleştirin.
    NOT: dsRNA konsantrasyonu nda olduğu gibi, toplam tedavi süresinin istenilen hedef gen için optimize edilmesi gerekebilir. RNAi etkinliğini değerlendirmek için, hedef gen karşı bir antikor kullanarak tüm hücre lysates üzerinde batı llot gerçekleştirin. Eğer ilk dsRNA hedef dizisi etkisiz kalırsa, hedef gendeki benzersiz dizilere yönelik alternatif dsRNA'lar tasarlanır.

3. Floresan Protein Ekspresyonunun İndüksiyonu ve Hücrelerin Görüntülemeye Hazırlanması

  1. Burada açıklandığı gibi pMT plazmid (indüklanabilir metallothionein promotor içeren) kullanılarak stably transfected hücreler üretilirse, bakır sülfat (CuSO4)ile hücreleri tedavi ederek floresan proteinlerin ekspresyonuna neden Görüntüleme den önce ve RNAi tedavisinden 4 gün sonra 24-36 saat için 500 μM. pAct gibi kurucu ifade plazmidlerinin kullanımı bakır indüksiyonu gerektirmez.
  2. Hücreleri Görüntülemeye Hazırlayın
    1. 24-28 °C inkübatörde %10 FBS takviyeli SIM'i 1 saat ısıtın.
    2. Aktarılan hücrelerin toplam hacmini belirterek hücreleri 15 mL'lik steril bir tüpe aktarın.
      1. Bir hücre sayacında veya hemositometrede saymak için küçük bir hücre hacmini (~100 μL) koruyun.
    3. Oda sıcaklığında 3 dk için 1.000 x g santrifüj ederek yavaşça pelet hücreleri.
      1. Hücreleri santrifüj ederken, bir hücre sayacı veya hemositometre kullanarak konsantrasyonu (hücre/mL) belirleyin. Toplam hücre sayısını elde etmek için bu sayıyı santrifüj edilen (2.2.2.2.) toplam hacmiyle çarpın.
    4. Peletli hücrelerden süpernatant aspire.
    5. Taze hücreleri resuspend, ısıtılmış 10% FBS sim takviyeli bir konsantrasyon elde etmek için 2 x 106 hücre/mL. 500 μM konsantrasyonu korumak için uygun miktarda CuSO4 ekleyin.
    6. 200-500 μL'lik yeniden askıya alınmış hücreleri çok iyi canlı hücre odasının bir kuyusuna aktarın ve ters floresan mikroskobun üzerine yerleştirin. Hücrelerin görüntüleme deneylerine kadar 15-30 dk için odaya yerleşmesine izin verin.
      NOT: Canlı hücre odası kuyuları ek yapışma için poli-L-lizin ile önceden kaplanabilir.

4. Canlı Hücre Görüntüleme Programı Kurmak

NOT: Bu deneyde Canlı Hücre Görüntüleme ters görüntüleme sistemi ve ilgili yazılım (örneğin, Olympus IX83 cellSens Dimensions yazılım paketi ile) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ayrıntılar mikroskop üreticisi ve yazılım paketine göre farklılık gösterir; bu nedenle, genel kurallar ve işlemler aşağıda listelenmiştir.

  1. Ters floresan mikroskobu çalıştıran yazılımı kullanarak, zaman içinde bir hücreyi (veya hücreleri) görüntülemeiçin bir program hazırlayın.
    1. Yazılımı masaüstü simgesine çift tıklayarak yazılımı açın.
    2. Dosya,sonra Yeni deneysel dosyayı tıklatarak yeni bir deneysel dosya oluşturun.
    3. İlk olarak, hangi görüntülerin çekilecek üzerine bir zaman atlamalı döngü ekleyin. Bunu simge çubuğundan Stopwatch simgesine(Hızlandırılmış Döngü simgesi) tıklayarak yapın. Deney Yöneticisi sekmesinde s'deki aralığı ayarlayın ve ardından istenen genel deneme uzunluğunu (s) aralığına bölerek aynı sekmedeki döngü sayısını ayarlayın. Döngünün istenilen toplam zaman diliminde tekrarlayabilmesini bekleyin.
      NOT: Tipik olarak, görüntüler 3-4 saat bir süre içinde her 30-60 s alınır.
    4. Zaman atlamalı döngü katmanı içinde, hedefin odağı korumak için bir kızılötesi odak denetimi ekleyin (varsa). Bunu yapmak için, İki Ok simgesiyle Kare'ye tıklayarak ve açılır menüden Z-Drift Telafisi'ni seçerek Zaman Atlama Döngüsü katmanına bir Z-drift Telafisi (ZDC) adımı ekleyin.
      NOT: Kızılötesi odak kontrolü terimi, hedef ile slayt/görüntüleme odası arasında sabit bir mesafeyi korumak için kızılötesi darbenin kullanıldığı bir sistemi ifade eder. Birçok mikroskoplar böyle bir sistem var, her biri kendi tescilli adlandırma ile. Okuyucular, belirli adlandırma ayrıntıları için kullanım kılavuzuna veya temsilcilerine başvurmalıdır.
    5. Kızılötesi odak denetiminden sonra, önce bir z yığını adımı ekleyerek, ardından kanalı belirterek 3-5 z-yığınları üzerinde çok kanallı bir görüntü (örneğin, mCherry için GFP ve TRITC için FITC) almak için programa bir adım ekleyin. Bunu, Renk Çarkı simgesine (Çok KanallıGrup simgesi) tıklayarak Zaman atlamalı döngü katmanına Çok Kanallı Grup katmanı ekleyerek yapın. Ardından, 3 katmanlı simge (Z-stack döngü simgesi) tıklayarak Çok Kanallı Grup katmanı içinde bir Z-StackLoop katmanı ekleyin. Deney Yöneticisi sekmesinde istenilen Adım Boyutunu ve Dilim Sayısını ayarlayın ve fotobeyaztma işlemini en aza indirmek için her kanalın pozlamasını mümkün olduğunca düşük olarak ayarlayın.
      NOT: LED'ler için z-yığın aralığı, pozlama süresi ve yüzde iletimi değişebilir. Bu denemelerde tipik olarak, her yığın arasında 1 μm'lik bir aralık vererek 3 μm aralığından alınan üç z-destekullanın. Üst ve alt yerine hücrenin merkezini tanımlamak en iyi sonuçlara yol açma eğilimindedir. Görüntüler daha sonra her kanal(lar) için 50 ms ve nötr yoğunluk (ND) filtresi devreye girmeden %50'lik bir iletimde toplanır.

5. Canlı Hücre Görüntüleme Programı Kullanarak Hücreleri Bölen Görüntü

NOT: S2 hücreleri CO2 gerektirmez ve 23-27 °C'de en iyi şekilde büyürler. Tüm görüntüleme ler iyi kontrol edilen bir odada ortam sıcaklığında yapıldı.

  1. Oküler kullanarak, kuyunun üst (veya alt) köşesini bulun ve mCherry (α-tubulin) kanalını kullanarak objektif (40-60x yağ daldırma) hücrelerin üzerine odaklayın.
  2. Dikey kuyu bölücüden uzaklaşmak için kuyunun üst (veya alt kısmı) boyunca tazyik.
    NOT: Kuyu bölücülerine çok yakın görüntüleme kızılötesi odak kontrollerini etkileyebilir.
  3. Geç G2 veya erken M fazı (profaz) olan bir hücre (veya hücre) bulun.
    NOT: Bu hücreler en iyi iki 'yıldız benzeri' mikrotübül yapıları (centrozsomes) ve bozulmamış bir çekirdek (hücre içinde kırılan ışık dairesel bir bölge ile gösterilir) varlığı ile tespit edilebilir, her ikisi de kolayca α-tubulin kullanılarak ayırt (kırmızı) uyarma filtresi. Daha önceki interfazlarda, bir veya sıfır kolayca görülebilen centrozomlar ile dikkat çeken hücrelerin seçimi, G2/M ilerlemesindeki bir gecikme nedeniyle zaman kaybına neden olabilir. Tersine, NEBD'den sonra hücrelerin seçilmesi mitotik zamanlamanın doğru hesaplanmasını ve erken mil montajı ve kromozom dinamiğinin görüntülanmasını önleyecektir. Ayrıca, S2 hücreleri genellikle içerir >2 centrozsomes. Bu genellikle bir bipolar mil içine kümeler rağmen12, Aksi takdirde deneysel tasarım için istenmedikçe kullanıcıların bu hücrelerden kaçınarak tavsiye edilir. Seçilecek uygun hücrelerin görüntüleri ve tartışması Temsilci Sonuçları bölümünde bulunabilir.
  4. Yazılım ekranındaki hücreleri görüntülemeye başlamak için Canlı görünüm düğmesini tıklatın. Mikroskobun ince odak tonlarını kullanarak, ilgi çeken hücreyi (veya hücreleri) odakla. Odak La düğmesini tıklatarak kızılötesi odak denetimini ayarlayın.
  5. Başlat düğmesini tıklatarak zaman atlamalı görüntüleme programını başlatın. İstenilen kanalı seçerek ve ortalama piksel yoğunluklarını ayarlayarak histogramları gerektiği gibi ayarlayın ve ilgi çeken hücreyi (veya hücreleri) net bir şekilde görün.
  6. Programın çalışmasına izin verin, 15-20 dk sonra hücre kontrol nükleer zarf arıza (NEBD) oluştu sağlamak için, yuvarlak karanlık, hücre merkezi yakınında bir kırılan nokta kaybolması ile belirlenir.
  7. Anafaz başlangıcı oluştuktan sonra belirlemek için aralıklı olarak (her 15-20 dakikada bir) programın çalışmasına izin vermeye devam edin. Toplam zaman diliminde daha fazla zaman kalıyorsa programı bu noktada durdurun ve dosyayı kaydedin. Alternatif olarak, telokinez sırasındaki olaylar ilgi çekiciyse, programın bu süreçleri de görüntülemek için yeterli zamanı çalıştırmasını sağlar.
  8. NeBD'nin anafaz başlangıçlı zamanlamaya analizini, min'deki NEBD (tNEBD)saatini ve min'de ilk kromozom ayırma saatini (tanafazbaşlangıcı) belirterek ve tNEBD'yi tanafaz başlangıcından çıkararak NEBD belirli bir hücre için anafaz başlangıç lı zaman.
    1. Bunu çerçeve yi tıklatarak ve NEBD ve anafaz başlangıcının oluştuğu kareleri belirterek, toplam elapse kare sayısını belirlemek için bunları çıkararak ve bunu görüntüleme kareleri arasındaki zaman aralığıyla çarparak yapın.
  9. Belirli bir durum için birden çok n elde etmek için önceden bölen hücreleri taramaya devam edin. Hücreler ilk yerleşmelerinden sonra 12 saate kadar canlı hücre odasında görüntülenebilir.

Representative Results

Yukarıda açıkladığımız yöntemler, drosophila S2 hücrelerinin tanımlanması ve görüntülenmesi ile sonuçlanacaktır. Bölmek üzere olan hücreler (yani, M-fazına girmeden hemen önce) iki centrozom ve kırılmamış ışık ve hücre içinde daha koyu bir nokta ile gösterilen sağlam bir çekirdeğin varlığı ile hedeflenebilir (Şekil 1, sol-en paneller, kırmızı kanal; şekil1A'da ok ucu ). Hücrelerin yaklaşık %2-5'inin bu kategoriye girdiğini tahmin ediyoruz ve görüntüleme deneyleri arasında genellikle başka bir kalifiye hücreyi taramak için en fazla 2-3 dakika harcıyoruz. NEBD bu karanlık noktanın kaybolması ile görüntülenebilir, sitoplazmanın düzgün renklendirmesi ile sonuçlanır (Şekil1, "00:00" işaretli paneller, kırmızı). NEBD'den sonra, her hücrenin mili, kongre kromozomlarını ve ayrıştırıcı kromozomları oluşturması için gereken süre, sadece nebd'e göre bu olayların zaman noktaları na dikkat edilerek ölçülebilir.

Bu bölünmeleri mitotik zamanlamayı değerlendirmek için kullanırız, özellikle NEBD'nin anafaz başlangıcına, kromozomların ayrılma noktasına dikkat çekmek için. Çoğunluk (~90%) bakır kaynaklı hücrelerin, hem mCherry:α-tubulin ve GFP:CID ifade. Hücrelerin küçük bir yüzdesi (~10%) yalnızca bir işaretçi veya ne ifade etti. Bu hücreler hücre seçimi sırasında kaçınılmalıdır. Tipik olarak, S2 hücreleri 20-30 dakika (Şekil1A, Kontrol) arasında anafaz başlangıçlı zamanlama ya da NEBD görüntüler. Daha sonra, hücre döngüsü dinamiklerini etkileyebileceğinden şüphelendiğimiz bir aktin-mikrotübül çapraz bağlama proteini olan Shortstop 'a (Shot) karşı hedeflenen dsRNA'lı hücreleri tedavi ettik. Gerçekten de, Shot knockdown hücreleri aşağıdaki önemli bir mitotik gecikme sergiledi (Şekil1B, ShotRNAi gecikme), metafazda tutuklama birçok hücre ile ve tüm 2-3 saatlik görüntüleme deneyi sırasında anafaza geçiş asla (Şekil 1D, ShotRNAi tutuklama). Bu gecikme/tutuklama fenotipinin mil montaj kontrol noktasının (yani M fazlı kontrol noktasının) aktivasyonundan kaynaklanabileceği gerekçesiyle. Doğrudan bu hipotezi test etmek için, biz shot ve Kaba anlaşma (Rod), bu kontrol noktası13önemli bir bileşeni karşı dsRNA ile birlikte hücreleri tedavi . Bu durum tutuklama fenotipinin bastırılmasına yol açmış ve NEBD'nin Control'e benzer anafaz sürelerine (Şekil1C, ShotRNAi+RodRNAi) yol açmıştır. Böylece, bu canlı görüntüleme protokolü shot zamanında M-faz ilerlemesi için gerekli olduğu sonucuna izin verdi ve kaybı geciktirir veya mitotik hücreleri geciktirmek veya tutuklamaları kontrol noktası aktivasyonu yol açar.

Figure 1
Şekil 1: Canlı görüntüleme, S2 hücrelerinde mitotik kontrol noktası aktivasyonuna bağlı hücre döngüsü kusurlarını ortaya çıkarır.
Her koşulda, burada açıklandığı gibi indüklen GFP:CID ve mCherry:αTubulin ile birlikte transfece edilmiş S2 hücrelerinde canlı hücre görüntülemesi yapılmıştır. (A) Karikatürler mitoz sırasında önemli işaretleri göstermektedir ve ilgili görüntüler NEBD göre zaman noktaları ile belirtilen genotiplerin temsili filmgösterilir (t=00:00) gösterilir. Kontrol hücreleri genellikle 20-30 dk. ShotRNAi ile tedavi edilen hücreler NEBD-anafaz gecikmesi (B) gösterir ve sık sık metafaz arrestine uğrar, görüntüleme deneyi (D) içinde anafaza girmez. ShotRNAi ve RodRNAi, mil montaj kontrol noktası bir bileşeni olan hücrelerin co-tedavi, Kontrol hücreleri benzer anafaz başlangıçlı kinetik yol açan Shot fenotip bastırır (C). (A)'dekioklar 'yıldız benzeri' centrozsome yapılarını, büyük ok ucu ise çekirdeği gösterir. Her ölçek çubuğu 5 mikron temsil eder. Bu rakam10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors) izni ile uyarlanır ve yeniden yayımlanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Video 1: 'Control' S2 hücre bölümünün hızlandırılmış filmi. Video 'Kontrol' genotip S2 hücre bölümü temsili bir film gösterir. Bu film Şekil 1A'yakarşılık gelir. Bu video10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors) izni ile uyarlanır ve yeniden yayımlanır. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 2: Gecikmeli 'ShotRNAi' S2 hücre bölünmesi hızlandırılmış film. Video bir fenotipik mitotik gecikmeyol açan 'ShotRNAi' genotip S2 hücre bölünmesi temsili bir film gösterir. Bu film Şekil 1B'yekarşılık gelir. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 3: 'ShotRNAi+RodRNAi' S2 hücre bölümünün hızlandırılmış filmi. Video 'ShotRNAi + RodRNAi' genotip S2 hücre bölünmesi temsili bir film gösterir. Bu film Şekil 1C'yekarşılık gelir. Bu video10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors) izni ile uyarlanır ve yeniden yayımlanır. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Video 4: Tutuklanan 'ShotRNAi' S2 hücre bölümü hızlandırılmış film. Video bir fenotipik mitotik tutuklama yol açan 'ShotRNAi' genotip S2 hücre bölünmesi temsili bir film gösterir. Bu film Şekil 1D'yekarşılık gelir. Bu videoyu indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Uygun Bir Hücreyi Tanımlama

S2 hücrelerini bölen görüntülemenin anahtarı ilk olarak uygun hücreyi bulmaktır. Zaman yanlışlıkla bölmeye hazır olduğu düşünülen ancak makul bir zaman diliminde bunu başaramayan görüntüleme hücreleri boşa harcanan olabilir. İki farklı ve görünür centrozom ve sağlam bir çekirdeği olan hücreler tanımlanmalıdır. Centrosomes mikrotübül lifleri onlardan yayılan olmalıdır, onlara bir "yıldız gibi" bir görünüm veren. Sağlam bir çekirdek, odağı ayarlarken ışığı kırarak hücrenin yaklaşık merkezini görünüm olarak daha koyu hale getirir. Çekirdek aynı zamanda GFP:CID "nokta", tanımlama yardımcı olmak için başka bir ayırt edici özelliği içerecektir. >2 centrozomlu hücreler, tübüsün liflerinden çıkan tübüsün pensaları veya sadece bir santrozomlu hücrelerden kaçınılmalıdır. Ayrıca, iki centrozsomes görünür, ancak bir çekirdek değilse, NEBD zaten oluştu ve hücre tam bir M-faz analizi istenirse görüntülenecek kendi bölümünde çok gelişmiştir. Uygun bir hücre bulunduktan sonra, NEBD hızlı bir şekilde (genellikle 3-5 dk içinde) oluştuğu ndan ve görüntülemenin başlamasını geciktirme kaçırılan fırsatlara yol açabileceğinden, görüntülemeye başlama hızı çok önemlidir. Her iki centrozsomes görünür, ya da centrozsomes birbirleri ile düzlem dışında ise, her z yığınları yukarıda ve tanımlanan merkezi altında toplandığında her biri yakalanabilir şekilde, böylece görüntüleme yazılımı nda hızlı bir şekilde hücre odaklanın Nokta. Bir kez odaklanmış, hemen kızılötesi odak kontrolü (varsa) kullanarak sahne ve canlı hücre odası yüzeyi arasında ofset ayarlayın ve görüntüleme programı başlar. Burada sunulan protokol, NEBD-anafaz dinamiklerini değerlendiren deneyler için özel olarak tasarlanmış olsa da, basit değişiklikler alternatif mitotik olayları inceleyen okuyuculara uygun olabilir. NEBD-metafaz ve anafazdan telofaz görüntülemede, bu süreçler son derece dinamik olduğundan ve S2 hücrelerinde (5-10 dk) hızlı bir şekilde meydana geldiğinden 10 s görüntü yakalama aralıkları öneriyoruz. Metafaz-anafaz geçişi (tipik deneysel odak) S2 hücrelerinde daha uzun bir süreçtir (20-30 dk) ve görüntüleri 30 s aralıklarla toplarız. Son olarak, telofaz-through-sitokinez S2 hücrelerinde oldukça yavaş oluşur, ve biz 60 s aralıkları bu yaklaşık bir saat süren süreç için yeterli çözünürlük sağlayan öneririz.

Görüntüleme Programı Boyunca OdağıN Korunması

Kızılötesi odak lama kontrol aygıtı kullanılamıyorsa, hücrenin görüntüleme programı sırasında odak tan uzaklaşmasına ve belirsiz, yorumlanamayan sonuçlara yol açabileceğinden, mikroskobu veya üzerine oturduğu tabloyu çarpmaktan kaçındığından emin olun. Canlı hücre odası kuyularının Poli-L-lizin ile önceden kapılması hücre yapışmasında yardımcı olabilir, bu da hücre hareketini önlemeye yardımcı olabilir ve özellikle kızılötesi odak kontrolü olmayan kurulumlar için yararlıdır. Ayrıca, şok emici platformlar veya hava tabloları da dahil olmak üzere kurulumlar, hücrelerin odak dışında hareket ettiğini önlemeye yardımcı olabilir. Son olarak, bazı yazılım programları, kullanıcının programı yeniden odaklamasını ve devam etmesini sağlayan duraklatma işlevlerine sahiptir.

Birden Fazla Hücre Görüntüleme

Veri birikmesi için yararlı genellikle birden fazla hücre bölmek için hazır görüntüleme için görüş aynı alan içinde yerleştirilebilir olmasıdır. Bu durum, özellikle hücrelerin uzun M faz sürelerine veya uzun süreli tutuklamaya sahip olduğu deneyler için yararlı olabilir (örneğin, SAC'Nin aktivasyonuna neden olan durumlar). Bu hücreler için, genellikle hücreler fotobeyazlama kadar görüntü (yaklaşık 2-3 saat), ancak tutuklanan hücrelerin tam zamanlaması araştırmacının takdirine bağlı olmalıdır. Bazen birden çok önceden bölen hücreler farklı odak düzlemlerinde olabilir, bu durumda tüm hücreleri barındıracak z yığınları eklemek yararlı olabilir. Daha fazla z yığınları eklemek de çözünürlüğü geliştirmeye yardımcı olabilir. Ancak, hücreleri daha fazla radyasyona maruz bırakacağı ve daha hızlı fotobeyazrlamaya yol açacağı ve sabit disk depolama aygıtlarında büyük dosya boyutlarına yol açacağı için, bunu yaparken dikkatli olunmalıdır.

Fotobeyaztma ve Fototoksisiteden Kaçınma

Yöntemimiz, genellikle deneysel kurulumumuz ve istenen sonuçlar için çalışan LED ışık kaynağımız için pozlama süreleri, görüntüleme aralıkları, z yığınları ve yüzde iletimi için belirli ayarları açıklar. Mikroskoplar ve deneysel hedefler değişebildikçe, sistemimiz için iyi nelerin işe yarayacağı, diğerlerinde erken fotobeyazrlama veya fototoksisiteye yol açabilir. Fotohasar, mil hareketi, mikrotübül parçalanması, kusurlu mikrotübül dinamiği ve uzun süreli mil kontrol noktası aktivasyonu eksikliğini ortaya çıkabilir. Bu tür tuzakları önlemek için bir potansiyel yöntem pozlama süresini sınırlamaktır. Modern fotoğraf makinelerinin çoğu artık geniş dinamik aralıklara sahiptir ve histogramlar çok düşük pozlamalarda bile yapıları görselleştirecek şekilde ayarlanabilir. Başka bir teknik, bir hücrenin toplam toplama aralığı boyunca ışığa maruz kalma sayısının azaldığı görüntüleme aralığını (örn. görüntüler arasında birkaç dakikaya) artırmaktır. Bu, özellikle daha uzun süreler (birkaç saat) görüntüleme açısından avantajlıdır ve ayrıca bu tür denemelerin dosya boyutunun azaltılmasına yardımcı olabilir. Alınan z yığınlarının sayısını sınırlamak, 3 yerine 2 hatta sadece 1 kullanarak ışığa maruz kalmanın azaltılmasına da yardımcı olabilir. Ayrıca, ışığın yüzde iletimini ayarlamak (LED ışık kaynakları için) veya nötr yoğunluklu (ND) filtrelerinin kullanılması (halojen lamba ve LED ışık kaynakları için) ışık yoğunluğunu azaltacak ve daha uzun pozlama süreleri ile birleştiğinde görüş mesafesi korunabilir . Centrozomlar zaten ayrılmış hücreleri seçerek, genel maruz kalma genellikle hızlı bir şekilde mitoz girin sınırlı olabilir (bir veya iki dakika içinde) görüntüleme başladıktan sonra. Bir de hücrelerin NEBD önce görüntülenebilir izin verilen süreyi sınırlayabilirsiniz. Bizim laboratuvar genellikle 10 dakika bu kez ayarlar, ancak daha muhafazakar bir sınır kolayca kullanıcı tarafından empoze edilebilir. Ayrıca, tavsiye ettiğimiz daha 'invaziv' bir tedbir SAC bileşeni (Rod veya Mad2 gibi) karşı hedeflenen dsRNA ile tedavi edilir. Eğer bir tutuklama fenotipnon non-spesifik hücre hasarı (örneğin, kusurlu mikrotübül dinamikleri) nedeniyle ise, böyle bir tedavi orijinal deneyde ilgi geninin iyi niyetli bir etkisi ile karşılaştırıldığında tutuklama bastırmak için daha az olasıdır.

Gelecek Yönler

Burada açıklanan yöntem, canlı hücre bölünmelerini hızla görüntülemek için nispeten basit bir epifloresan mikroskopta kullanılabilir ve bir araştırmacının özel deneysel tasarımına ve hedeflerine kolayca uyarlanabilir. Culturing için çeşitli mükemmel yöntemler, RNAi knockdown yaklaşımlar, geçici transfeksiyon, ve floresan mikroskopi S2 ve diğer Drosophila hücreleri için yayınlanmıştır9,14,15, 16.02.20 , 17- Protokolümüz birkaç avantaj sunar. (1) Çift kararlı hücre hattı (GFP:CID, mCherry:α-Tubulin) kullanımı aynı anda iki temel mitotik yapıyı işaretler, geçici transfeksiyonun güçlük ve olası komplikasyonlarını önler ve hemen hemen tüm hücrelerin floresan belirteçleri görüntüleme için potansiyel adaylar. (2) Mitoz bölünmeye adaptasyon, hareketli, bölünmeyen hücrelerdeki sitoskeletal dinamikleri inceleyen yayınlanmış protokollere katkıda bulunur ve mitotik olayların gerçek zamanlı olarak incelenmesine kadar uzanır. Biz bizim başkalarının repertisi ekler güçlü bir teknik olduğuna inanıyoruz, her zaman iyileştirmeler yapılabilir. Hücre bölünmesinin görüntülenmede zor bulduğumuz belirli bir alanı da centrozsome bölümüdür. Bu NEBD önce oluşur ve tek bir centrozsome ikiye ayırmaya hazır olup olmadığını belirlemek zordur. Floresan hücre döngüsü işaretleyicileri (Cyclin A ve Cyclin B) kullanarak bu sorunu çözmeye yardımcı olabilir, ancak hücre bölünmesi bileşenleri görselleştirmek için kullanılabilecek kanalların pahasına gelir. Centrozsome bölümü görselleştirmek için denemek için en iyi strateji görüntüleme programına çok noktalı edinimi eklemektir (görüntü xy düzleminde farklı noktaları tanımlayan), ama bu büyük dosyalar neden olabilir, ve aynı zamanda (puan sayısına bağlı olarak) gerektirebilir görüntü toplama arasındaki aralığı artırmak, ortaya çıkan filmin zaman çözünürlüğünü azaltmak. Başka bir çözüm, hücre döngüsü regülatörlerini hedef alan ve görüntüleme den önce sonraki yıkamayı takip eden ilaçlar kullanılarak istenilen hücre döngüsü aşamasında hücrelerin senkronizasyonu olabilir, ancak bu yöntemler özellikle S2 hücrelerinde güvenilir olmayabilir.

Burada sunulan protokol, canlı hücre görüntülemede de gelecekteki uygulamalar için bir temel sağlamaktadır. Gelişmiş görüntüleme ve yazılım teknolojisi ile, daha yüksek kapasiteli bu protokolün gerçekten yüksek iş getiriyi uyarlamaları ile, çok odalı plakalar mümkün olabilir. Bu tür yenilikler büyük ölçekli RNAi ekranlar yapacak, bu zaten sabit hazırlıklar elde gibi12,18, canlı hücre formatında daha fazla çekilebilir. Küçük moleküllü ilaç ekranları da hücre bölünmesi süreçlerini hedefleyen yeni bileşiklerin belirlenmesi için bir araç olarak öngörülebilir. Florofororların ve optik filtrelerin iyileştirilmesi, belirli mitotik regülatörlerin ve bunların DNA ve/veya mil ile etkileşimlerinin görüntülenmesine olanak sağlayarak birden fazla mitotik bileşenin (sadece tanımladığımız iki bileşenin değil) görüntülenmesine de yol açabilir. Örneğin, DNA hasarı nın ardından veya apoptoz sırasında ifade floresan muhabirler ile hücre üreten bu süreçlerde yer alan yeni genleri tanımlamak için yararlı araçlar olacaktır. Benzer yaklaşımlar floresan etiketli siklinler19ifadesini kullanarak hücre döngüsü dinamikleri incelemek için kullanılabilir.

Disclosures

Yazarların beyan etmek için hiçbir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (R01 GM108756) tarafından finanse edilmiştir. Biz Gary Karpen (University of California, Berkeley) cömertçe bir GFP: CID S2 hücre hattı stok hangi bizim GFP: CID / mCherry:αTubulin hattı10oluşturuldu bize sağladığı için minnettarız.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bright-Line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA for cell counting
cellSens imaging software Olympus
CELLSTAR Cell Culture Flask, 50 mL, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10 PCS/BAG Greiner Bio-One 690175
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed Greiner Bio-One 657160
Centrifuge 5804 R eppendorf Cat. 022623508
Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% Sigma-Aldrich C3036-250G
Corning Fetal Bovine Serum Fisher Scientific MT35015CV
Effectene Transfection Reagent 1 mL Qiagen 301425 for transient transfection
IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope Olympus
LabTek Chambered Slide Insert Applied Scientific Instruments I-3016
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific AM1334 For dsRNA production
MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit ORFLO MXZ001 for cell counting
MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller Applied Scientific Instruments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well Thermo Fisher Scientific 155409
Orca-Flash 4.0 LT Camera Hammamatsu Photonics K.K. C11440-42U
pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector Thermo Fisher Scientific V412020
Poly-L-Lysine Cultrex 3438-100-01
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 302310000
Schneider's insect medium Sigma-Aldrich S0146-100ML
Spectra Tub Centrifuge Tubes VWR 470224-998
Uner Counter BOD Incubator Sheldon manufacturing (VWR) 89409-346
X-CITE 120 LED ExcelitasTechnologies Led light source
Z -Drift Compensator (ZDC) Olympus infrared focus check

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ragkousi, K., Gibson, M. C. Cell division and the maintenance of epithelial order. Journal of Cell Biology. 207 (2), 181-188 (2014).
  2. Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (32), 14217-14222 (2010).
  3. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
  4. Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  5. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
  6. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
  7. Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Imaginal Discs. Methods in Molecular Biology. 1478, 203-213 (2016).
  8. Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).
  9. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).
  10. Dewey, E. B., Johnston, C. A. Diverse mitotic functions of the cytoskeletal cross-linking protein Shortstop suggest a role in Dynein/Dynactin activity. Molecular Biology of the Cell. 28 (19), 2555-2568 (2017).
  11. Rodriguez, E. A., et al. The Growing and Glowing Toolbox of Fluorescent and Photoactive Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).
  12. Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes and Development. 22 (16), 2189-2203 (2008).
  13. Basto, R., Gomes, R., Karess, R. E. Rough deal and Zw10 are required for the metaphase checkpoint in Drosophila. Nature Cell Biology. 2 (12), 939-943 (2000).
  14. Currie, J. D., Rogers, S. L. Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility. Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).
  15. Lu, W., Del Castillo, U., Gelfand, I. V. Organelle transport in cultured Drosophila cells: S2 cell line and primary neurons. Journal of Visualized Experiments. (81), e50838 (2013).
  16. Yang, J., Reth, M. Drosophila S2 Schneider cells: a useful tool for rebuilding and redesigning approaches in synthetic biology. Methods in Molecular Biology. 813, 331-341 (2012).
  17. Zhou, R., Mohr, S., Hannon, G. J., Perrimon, N. Inducing RNAi in Drosophila cells by soaking with dsRNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (5), (2014).
  18. Goshima, G., et al. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316 (5823), 417-421 (2007).
  19. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).

Tags

Genetik Sayı 150 Drosophila S2 hücreleri Mitoz Hücre döngüsü Canlı hücre görüntüleme Mitotik iğ Kromozom dinamiği mCherry:α-tubulin GFP:CENP-A CID
Hücre Bölünmesi Canlı Görüntüleme için <em>Drosophila</em> S2 Hücrelerinin Kullanımı
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dewey, E. B., Parra, A. S.,… More

Dewey, E. B., Parra, A. S., Johnston, C. A. Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division. J. Vis. Exp. (150), e60049, doi:10.3791/60049 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter