Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

שימוש ב- Drosophila ילה S2 תאים עבור הדמיה חיה של חטיבת התא

Published: August 23, 2019 doi: 10.3791/60049
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of New Mexico

Summary

חטיבות התא ניתן לדמיין בזמן אמת באמצעות חלבונים מתויגים פלואורוסקופים ומיקרוסקופ זמן לשגות. בעזרת הפרוטוקול המוצג כאן, המשתמשים יכולים לנתח את דינמיקת התזמון של החטיבה הסלולרית, הרכבת הmitotic צירים והפרדה בין כרומוזום ובידוד. פגמים באירועים אלה בעקבות הפרעות RNA (RNAi)-תיווך גנים הסתרה ניתן להעריך ולכמת.

Abstract

דרוסופילה התאים S2 הם כלי חשוב במחקר מיטוזה בתרבות רקמות, מתן תובנות מולקולריות לתוך תהליך זה הסלולר בסיסי באופן מהיר והתפוקה גבוהה. התאים S2 הוכיחו קלה הן יישומים קבוע-ו-לחיות ליצירת הדמיה. בעיקר, תא חי הדמיה יכול להניב מידע רב ערך על איך אובדן או מאבד של גן יכול להשפיע על קינטיקה ודינמיקה של אירועים מרכזיים במהלך חלוקת התא, כולל mitotic צירים הרכבה, כרומוזום הקונגרפת, והפרדה, כמו גם עיתוי כללי של מחזור התא. כאן אנו מנצלים תאים S2 באופן מאוד מבוקר עם מתויג fluorescently mCherry: α-לסמן את ציר mitotic ו-GFP: CENP-A (המכונה "CID" גן ב- Drosophila ילה) כדי לסמן את צנטרומר כדי לנתח את ההשפעות של הגנים mitotic המפתח על העיתוי של חלוקת תאים מתוך prophase (במיוחד בפירוק מעטפות גרעיניות; NEBD) עד תחילתה של אנאפה. פרוטוקול דימות זה מאפשר גם להדמיה של מיקרוטוכדורית ולדינמיקה של כרומוזום ברחבי מיטוזיס. להלן, אנו שואפים לספק פרוטוקול פשוט אך מקיף שיאפשר לקוראים להתאים בקלות תאים S2 עבור ניסויים בהדמיה חיה. התוצאות שהתקבלו מניסויים כאלה צריכים להרחיב את הבנתנו את הגנים המעורבים בחלוקת התא על ידי הגדרת תפקידם במספר אירועים בו זמנית ודינמיים. תצפיות שבוצעו במערכת זו של תרבות התא ניתן לאמת ולחקור בvivo באמצעות ערכת הכלים המרשימה של גישות גנטיות בזבובים.

Introduction

החטיבה התא הוא תהליך קריטי לכל האורגניזמים הרב-תאיים, הן בהתפתחות הומאוסטזיס1. Drosophila ילה כבר משמש מודל למחקר של חלוקת תאים, עם ניסויים בסוגים שונים רקמות ותנאים גנטיים מתן תובנות מפתח לתוך התהליך. בעוד רבים של תובנות אלה באים מתנאי תא קבוע, החטיבה התא הוא הליך דינמי עם חלקים נעים רבים, ביצוע ויזואליזציה של תאים חיים אינטגרלי להערכת RNAi או השפעות הסתרה גנטית על חלקים רבים של חלוקת תאים, כולל מערך צירים, כרומוזום הקונגרס וההפרדה הציטוקינזה.

פרוטוקולים רבים פותחו ונוצלו במהלך השנים כדי להמחיש את דיוויזיות התאים של דרוזוהילה בvivo. בקבוצות שונות יש טכניקות מעובדות לחטיבות התמונה בשני דיסקים של הזחל והמוח זחל2,3,4,5,6,7,8 . טכניקות אלה, בעוד שימושי עבור הדמיה ברקמות ספציפיות, מוגבלות תפוקה ולעתים קרובות דורשים הדור ותחזוקה של מניות גנטיות כדי ליצור רכיבי פלורסנט ולשנות את הביטוי של גנים של עניין. תאים S2 מתורבת מ- Drosophila ילה לספק חלופה תפוקה גבוהה יותר כדי לבדוק במהירות את ההשפעות של גנים שונים בחלוקת התא. יתר על כן, עם היכולת transfect חלבונים שונים פלורסנט, התאים S2 ניתן לשנות במהירות כדי לקבוע את ההשפעות של הסתרה RNAi למטה על מרכיבים רבים של החטיבה התא. פלואור שתייגת גנים של עניין יכול להיות גם נצפתה בחלוקת התא, המאפשר אפיון דינמי של תפקידם9.

כאן אנו מספקים פרוטוקול מפורט עבור הדמיה חיה של תאים mitotic S2 באמצעות שיטות שתיארנו לאחרונה10. השיטה שלנו משתמשת בתאים מזוהמים למדי עם סמנים פלורסנט עבור microtubules ו צנטורמרים אשר הביטוי שלהם תחת שליטה של מקדם נחושת-inducible (מטתיוזה; pMT). מתודולוגיה זו יכולה לשמש את ציר התמונה ואת הדינמיקה כרומוזום בכל השלבים של מיטוזה ניצול מיקרוסקופ פלורסנט פשוט יחסית עם תוכנת דימות בסיסי. זה יכול להיות מותאם יותר להתאים לצרכים מחקר בודדים, עם העברה ארעית RNAi מציע אפשרויות מורחבת לקביעת התפקיד של גנים המועמדים ב mitosis. בגלל הפשטות היחסית של הפרוטוקול, זה יכול לשמש למסכים בקנה מידה קטן אובדן של פונקציה כדי לזהות גנים שעבורם לימוד נוסף vivo יהיה מועיל, ומאפשר מאמצים ממוקדים יותר ויעילות עם גנטי הבאים מניפולציה בזבובים.

Protocol

1. הכנת תאים S2 לטיפול עם RNAi

  1. מתוך תרבות של מניות של confluent pMT: GFP: CID ו-pMT: mCherry: α-טובולין באופן שוטף תאים S2 (~ 80% קיימא; גדל ב 24-28 ° c), תאים זרע ב 6 היטב הלוח התרבות סטרילי בצפיפות של 1 x 106 תאים/mL ב טרי, מחומם, 10% סרום שור עוברי באמצעות מדיית החרקים (SIM) של שניידר.
    הערה:     ניתן להפיק תאים S2 בלתי מוכרים על-ידי ביצוע פרוטוקול ממרכז הסינון דרוסופילה RNAI (drsc) (https://dgrc.bio.indiana.edu/Protocols?tab=cells). למרות קו S2 מסוים יציבה משמש במקום זה מנצל GFP ו-mCherry, חלופות רבות קיימות הן בתוך ספקטרום פלורסנט, כמו גם אחרים. דיון מפורט של חלבונים אלה הוא מעבר להיקף של פרוטוקול זה, אבל המאפיינים שלהם ויתרונות פוטנציאליים/חסרונות שנבדקו במומחיות במקומות אחרים 11.
    1. באמצעות מונה תאים או הומוציטומטר, יש לקבוע את צפיפות מלאי התאים הקונשוטפת.
    2. לקבוע את נפח ההשעיה של התא confluent הדרוש כדי להשיג 1 x 106 תאים/mL בנפח כולל של 4 מ ל (למשל, ~ 4 x 106 הכולל תאים). הוסף נפח זה של מלאי תאים לנפח של SIM טרי כדי להפוך את הנפח 4 מ ל/כל הטוב. לקבוע את צפיפות מלאי התא (תאים/mL) על ידי דילול 100 μL של תאים ישירות מתוך בקבוקון המניות עם 100 μL של מדיה ולספור את זה 1:2 דילול באופן ידני עם היפוך או עם מונה תאים אוטומטי אם זמין.
      הערה: אם השימוש בתאים S2 לא באופן מספק, שיטת החצייה חולף עם מתויג פלואורוסקופים (GFP, mCherry, וכו ') α-או β-טובולין, ו סמן DNA (CENP-A, Histone H2B, וכו ') ניתן לבצע. יתר על כן, קווים ניידים באופן מבוקר עם ציר mitotic שונים סמנים DNA זמינים ממרכז המשאבים הגנטיקה Drosophila ילה שעשוי להתאים את הצרכים הניסיוניים המדויקים של המשתמש (https://dgrc.bio.indiana.edu/cells/Catalog).
    3. מניחים תאים טריים הנזרע לתוך 24-28 מעלות צלזיוס בחממה עבור 36-48 h.

2. טיפול בתאים מזרע עם dsRNA נגד גנים (s) של עניין

הערה: הדוגמה הבאה ומקטע התוצאות ישתמשו בבלם (Shot), סוכן המקשר בין המיקרו-כדורית, כגן העניין. השתמש בטיפול מבוים ללא dsRNA או עם dsRNA בבימויו של גן לא רלוונטי (למשל, ביתא-גלטוסיידאז, lacz) כשליטה שלילית.

  1. מדיית החרקים החמה של שניידר לא התבצעה עם FBS (מדיה חופשית בסרום; SFM) בחממה 24-28 ° c.
  2. העבר תאים מתוך שנזרע בעבר (משלב 1.1.2) לתוך שפופרת סטרילי 15 mL, וציין את הנפח הכולל של תאים שהועברו.
    1. שמירה על נפח קטן של תאים (~ 100 μL) לספירה במונה תאים או בהמעי.
  3. בעדינות גלולה התאים על ידי תפרידו ב 1,000 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.
    1. בעוד תפרידו תאים, לקבוע את הריכוז של תאים לכל mL באמצעות מונה תא או הומוציטומטר. הכפל מספר זה לפי אמצעי האחסון הכולל שcentrifuged (שצוין ב-1.2.2.) כדי לקבל את המספר הכולל של תאים.
  4. . מתוך התאים הפלגנים
  5. השהה מחדש את התאים ב-SFM החומם כדי לקבל ריכוז של 3x 10 תאים /mL.
    1. העבר 1 מ ל של תאים מושעה לבאר חדשה בצלחת 6 היטב.
  6. הוסף 10-50 μg של dsRNA (מדולל ב 100 μL of RNAase-מים ללא תשלום) נגד Shot (או גן היעד של עניין) ישירות לתאים ומערבולת את הצלחת לערבב. מודקת את הצלחת עבור 1 h בחממה 24-28 ° c כדי לאפשר ספיגת dsRNA ישירה לתאים.
  7. במהלך הדגירה 1 h, חם 10% FBS שנוספו SIM בחממה 24-28 ° c.
  8. לאחר שהדגירה של תאים עם dsRNA עבור 1 h, להוסיף 2 מ"ל של 10% FBS שיושלם SIM ישירות לבאר בלי להסיר את 1 mL של מדיה.
  9. מניחים תאים לתוך החממה 24-28 ° c במשך 3-7 ימים.
    הערה: כמו עם ריכוז dsRNA, זמן הטיפול הכולל עשוי להיות ממוטב עבור הגן היעד הרצוי. כדי להעריך את היעילות RNAi, לבצע כתם מערבי על כל ליטים התא באמצעות נוגדן נגד הגן היעד. אם רצף היעד dsRNA ההתחלתי מוכיח ביעילות, עיצוב Dsrna חלופי המיועד לרצפים ייחודיים בתוך הגן היעד.

3. אינדוקציה של חלבון פלורסנט ביטוי והכנת תאים להדמיה

  1. אם תאים מזוהמים באופן ממושך נוצרו באמצעות הפלפמיד pMT (המכיל inducible מטת'מיםםמיםםמיםםמיםםמיםםמיםםמיםםמיםםםםםםםםםםםםםםםםםםםםםםםםםםםםם 500 μM עבור 24-36 h לפני הדמיה ו 4 ימים לאחר הטיפול RNAi. שימוש בבחינה חוקתית כגון ברית אינו דורש אינדוקציה נחושת.
  2. הכן תאים להדמיה
    1. חמם את 10% FBS שיושלם SIM בחממה 24-28 ° c עבור 1 h.
    2. העבר תאים לתוך שפופרת סטרילי 15 מ"ל, וציין את הנפח הכולל של תאים שהועברו.
      1. שמירה על נפח קטן של תאים (~ 100 μL) לספירה במונה תאים או בהמעי.
    3. בעדינות גלולה התאים על ידי תפרידו ב 1,000 x g עבור 3 דקות בטמפרטורת החדר.
      1. בעוד תפרידו תאים, לקבוע את הריכוז (תאים/mL) באמצעות מונה תא או הומוציטוטומטר. הכפל מספר זה לפי אמצעי האחסון הכולל שcentrifuged (שצוין ב-2.2.2.) כדי לקבל את המספר הכולל של תאים.
    4. . מתוך התאים הפלגנים
    5. להשעות מחדש את התאים טריים, מחומם 10% FBS בתוספת SIM כדי לקבל ריכוז של 2 x 106 תאים/mL. הוסף כמות מתאימה של CuSO4 כדי לשמור על ריכוז 500 μm.
    6. העברת 200-500 μL של מחדש הושעה תאים אחד טוב של תא מרובת היטב התא לחיות ומקום על מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה. אפשר לתאים להתיישב בחדר במשך 15-30 דקות לפני ניסויים בהדמיה.
      הערה: בארות התאים החיים יכול להיות מצופה מראש עם פולי-L-ליזין עבור הדבקות נוספת.

4. הגדרת תוכנית לדימות תאים בשידור חי

הערה: הדמיית תאים חיים בניסוי זה בוצעה באמצעות מערכת הדמיה הפוכה התוכנה המשויכת שלה (למשל, Olympus IX83 עם חבילת התוכנה מידות cellSens). פרטים יהיו שונים על ידי יצרן מיקרוסקופ וחבילת תוכנה; כך מפורטים ההנחיות הכלליות והפעולות המפורטות להלן.

  1. באמצעות התוכנה המפעילה את מיקרוסקופ פלורסנט הפוכה, להכין תוכנית לדימות תא (או תאים) לאורך זמן.
    1. פתח את התוכנה על-ידי לחיצה כפולה על סמל שולחן העבודה של התוכנה.
    2. צור קובץ ניסיוני חדש על-ידי לחיצה על קובץ, ולאחר מכן קובץ ניסיוני חדש.
    3. ראשית, להוסיף לולאה הפקיעה זמן שבו תמונות יילקחו. עשה זאת על-ידי לחיצה על סמל סטופר (סמל לולאהבזמן קפיצה ) מסרגל הסמלים. הגדר את המרווח ב- s בכרטיסיה מנהל הניסוי ולאחר מכן הגדר את מספר המחזורים באותה כרטיסיה על-ידי חלוקת אורך הניסוי הכולל (ב-s) לפי מרווח הזמן. אפשר ללולאה לחזור על התקופה הרצויה של הזמן הכולל.
      הערה: בדרך כלל, תמונות נלקחים כל 30-60 s על פני תקופה של 3-4 h.
    4. בתוך הזמן שכבת לולאה הפקיעה, להוסיף בדיקת מיקוד אינפרא אדום כדי לשמור על המוקד של המטרה (אם זמין). לשם כך, הוסף את הצעד פיצוי Z-הסחף (ZDC) בתוך שכבת לולאה בזמן קפיצה על-ידי לחיצה על הריבוע עם סמל שני החצים (הזזת סמל XY) ובחירת פיצוי Z-דריפט מהתפריט הנפתח.
      הערה: המונח בדיקת מיקוד אינפרא-אדום מתייחס למערכת שבה משתמשים בפולס אינפרא-אדום כדי לשמור על מרחק קבוע בין המטרה לבין חדר השקופיות/ההדמיה. מיקרוסקופים רבים יש מערכת כזו, כל אחד עם מינוח קנייני משלהם. על הקוראים להתייעץ עם מדריך התפעול או הנציג שלהם לקבלת פרטים ספציפיים למתן שמות.
    5. לאחר בדיקת המיקוד אינפרא-אדום, להוסיף צעד בתוכנית לקחת תמונה רב-ערוצית (למשל, FITC עבור GFP ו TRITC עבור mCherry) על 3-5 z-ערימות על ידי הכנסת הראשון צעד מחסנית z, ולאחר מכן ציון הערוץ. בצע זאת על-ידי הוספת שכבת קבוצת רב-ערוצי בתוך שכבת הלולאה של הקפיצה בזמן על-ידי לחיצה על סמל גלגל הצבעים (סמלקבוצה רב-ערוצי ). לאחר מכן, הוסף שכבת לולאה מסוג Z של מחסנית בתוך שכבת קבוצת רב-ערוצי על-ידי לחיצה על הסמל התלת-שכבתי (סמללולאת Z-סטאק ). הגדר את גודל השלב הרצוי ואת מספר הפרוסות בכרטיסיה מנהל הניסוי והגדר את החשיפה של כל ערוץ נמוך ככל האפשר כדי למזער את הלבנת התמונות.
      הערה: מרווח הזמן של מחסנית z, זמן החשיפה ומדידת האחוזים עבור נוריות יכולים להשתנות. אופייני בניסויים אלה, להשתמש שלושה z-ערימות שנלקחו מעל טווח של 3 יקרומטר, מתן מרווח של 1 יקרומטר בין כל מחסנית. הגדרת מרכז התא במקום העליון והתחתון נוטה להוביל את התוצאות הטובות ביותר. התמונות נאספים לאחר מכן עבור כל ערוץ (ים) בחשיפה של 50 ms ו-% הנחה של 50% עם מסנני דחיסות נייטרלית (ND) לא מופעל.

5. תמונה מחלוקת תאים באמצעות תוכנית הדמיה של תא חי

הערה: תאים S2 אינם דורשים CO2 ולצמוח בצורה אופטימלית ב 23-27 ° c. כל ההדמיה בוצעה בטמפרטורת הסביבה בחדר שבשליטת היטב.

  1. באמצעות oculars, למצוא את הפינה העליונה (או התחתון) של הבאר ולמקד את המטרה (40-60x טבילה שמן) על התאים באמצעות הערוץ mCherry (α-טובולין).
  2. סרוק לאורך החלק העליון (או התחתון) של הבאר כדי להתרחק המפריד היטב אנכי.
    הערה: הדמיה קרובה מדי לחוצצים היטב עלולה להפריע לבדיקות המיקוד באינפרא-אדום.
  3. מצא תא (או תאים) שנמצאים בשלהי G2 או בשלב M המוקדם (prophase).
    הערה: תאים אלה יכולים להיות מזוהים בצורה הטובה ביותר על ידי קיומו של בדיוק שני ' כוכבים כמו ' מבנים מיקרו (centrosomes) וגרעין שלם (המצוין על ידי אזור מעגלי של אור שהופעל בתוך התא), הן בולט בקלות באמצעות α-טובולין (אדום) מסנן עירור. בחירת תאים בשלב מוקדם יותר, הבולטים על ידי אחד או אפס בקלות מסנטזומים גלויים, יכול לגרום לזמן מבוזבז עקב השהיה ב G2/M התקדמות. לעומת זאת, מבחר של תאים לאחר NEBD תמנע חישוב מדויק של עיתוי mitotic והדמיה של הרכבת צירים מוקדמת ודינמיקה כרומוזום. כמו כן, תאים S2 לעתים קרובות מכילים > 2 סנטרוזומים. למרות אלה בדרך כלל אשכולות לתוך ציר דו קוטבית12, מומלץ למשתמשים הימנעות תאים אלה, אלא אם כן רצוי אחרת עבור העיצוב הניסיוני. תמונות ודיון של תאים מתאימים לבחירה ניתן למצוא בסעיף תוצאות הנציג .
  4. לחץ על לחצן הצג חי כדי להתחיל להציג תאים במסך התוכנה. באמצעות כפתור המיקוד העדין של המיקרוסקופ, למקד את התא (או התאים) של עניין. הגדר את בדיקת המיקוד באינפרא-אדום על-ידי לחיצה על לחצן קבע מיקוד
  5. הפעל את תוכנית הדימות של הזמן על-ידי לחיצה על לחצן התחל. כוונן את ההיסטגרמות לפי הצורך על-ידי בחירת הערוץ הרצוי והתאמת עוצמות הפיקסלים הממוצע כדי לראות את התא (או התאים) של עניין באופן ברור.
  6. אפשר לתוכנית לפעול, בדיקת התא לאחר 15-20 דקות כדי להבטיח את התפלגות המעטפה הגרעינית (NEBD) התרחשה, אשר נקבעת על ידי היעלמות החושך העגול, נקודה שבירה ליד מרכז התא.
  7. המשך לאפשר לתוכנית לפעול, בודק לסירוגין (כל 15-20 דקות) כדי לקבוע את התחלתה של אנאפיום. הפסק את התוכנית בשלב זה אם נותר זמן רב יותר בפרק הזמן הכולל ושמור את הקובץ. לחלופין, אם אירועים במהלך telophase ו ציטוקינזה הם מעניינים, לאפשר לתוכנית להפעיל זמן מספיק כדי לצלם תהליכים אלה גם כן.
  8. ביצוע ניתוח של NEBD כדי אנאפא עיתוי התחלתה על ידי לציין את הזמן של NEBD (tnebd) בדקות ובזמן שלהפרדת כרומוזום הראשונית (התחלתה של התפרצות) ב דקות והחסרה tnebd מ-tאנאפה בתחילתה כדי להשיג את NEBD כדי אנאפא זמן התחלתה של תא נתון.
    1. עשה זאת על ידי לחיצה על לחצן מסגרת למעלה ולציין את המסגרות בהן nebd ו-אנאפה התפרצות להתרחש, חיסור אלה כדי לקבוע את המספר הכולל של מסגרות מחלוף, והכפלת זה לפי מרווח הזמן בין מסגרות הדמיה.
  9. המשך בסריקת תאים מראש כדי להשיג מספר n של מצב נתון. תאים ניתן לתמונה בתא לחיות התאים היטב עד 12 שעות לאחר ההסדר הראשוני שלהם.

Representative Results

שיטות שנתאר לעיל תגרום לזיהוי והדמיה של תאי הדרוזוהילה S2 שעברו חלוקת תאים. תאים העומדים להתחלק (כלומר, רק לפני כניסת M-שלב) יכול להיות ממוקד על ידי נוכחות של שני סנטרוזומים וגרעין שלם המצוין על ידי אור שבור ומקום כהה יותר בתוך התא כאשר צפו בערוץ α-טובולין (איור 1, משמאל לוחות, ערוץ אדום; ראש חץ באיור 1A). אנו מעריכים כי כ 2-5% של תאים ליפול בקטגוריה זו, ובין ניסויים הדמיה, אנחנו בדרך כלל לבלות מקסימום של 2-3 דקות סריקה עבור תא מוסמך אחר. NEBD יכול להיות מדמיין דרך היעלמותו של נקודה זו כהה, וכתוצאה מכך צביעה אחיד של ציטופלסמה (איור 1, פאנלים מסומנים "00:00", אדום). לאחר NEBD, הזמן כל תא לוקח ליצור את ציר, כרומוזומים הקונגרס, וכרומוזומים השערי ניתן למדוד פשוט על ידי לציין את נקודות הזמן של אירועים אלה ביחס NEBD.

אנו לנצל את המחלקות האלה כדי להעריך את העיתוי mitotic, במיוחד של NEBD לתחילת אנאפא, לציין את הנקודה שבה כרומוזומים מתחילים להפריד. רוב (~ 90%) של תאים המושרה נחושת, הביע הן mCherry: α-טובולין ו-GFP: CID. אחוז קטן של תאים (~ 10%) הביע רק סמן אחד או לא. תאים אלה נמנעו במהלך בחירת התא. בדרך כלל, תאים S2 להציג NEBD כדי אנאפה הופעת עיתוי של בין 20-30 דקות (איור 1A, בקרה). אנו התייחסו לתאים הבאים עם dsRNA ממוקד נגד בלם (Shot), חלבון actin-מיקרוקטדורית המקשר שנחשדו עלול להשפיע על הדינמיקה של מחזור התא. אכן, בעקבות Shot ירו תאים הציגו עיכוב mitotic משמעותי (איור 1B, השהיה shotrnai), עם הרבה תאים מעצר במטא-פאזה ולעולם לא מעבר אנאפיום במהלך הניסוי כולו 2-3 שעות הדמיה (איור 1b, מעצר שוטרנאי). החלטנו שהעיכוב/המעצר הזה יכול להיות בגלל הפעלת מחסום ההרכבה של הציר (כלומר, מחסום הפאזה M). כדי לבדוק ישירות את ההשערה הזאת, אנו מטפלים בתאים שלנו עם dsRNA נגד Shot ו העסקה קשה (מוט), מרכיב חשוב של מחסום זה13. זה הוביל לדיכוי של מעצר פנוטיפ, וכתוצאה מכך NEBD כדי אנאפס פעמים דומה לשליטה (איור 1C, שוטרנאי + rodrnai). כך, זה פרוטוקול הדמיה חיה איפשר לנו להסיק כי ירו נדרש להתקדמות מזמן M-פאזה וכי הפסד שלה מוביל הפעלה במחסום כי עיכובים או מעצרים mitotic תאים.

Figure 1
איור 1: הדמיה חיה מגלה פגמים במחזור התא בשל הפעלת המחסום mitotic בתאי S2.
בכל מקרה, הדמיה של תא חי התבצע על התאים S2 באופן בלתי נשכח עם inducible GFP: CID ו mCherry: αTubulin כפי שמתואר להלן. (א) קריקטורות להמחיש ציוני דרך חשובים במהלך mitosis, ותמונות המקביל מוצגים מתוך סרטים מייצגים של גנוטיפים מצוינים עם נקודות זמן ביחס nebd (t = 00:00) המצוין. בקרת תאים בדרך כלל התקדמות אנאפיום בתוך 20-30 דקות. ששונאי-התאים מטופלים להציג NEBD-אנאפאה העיכוב (ב) ולעתים קרובות עוברים מעצר מטא-פאזה, אף פעם לא נכנס אנאפיום בתוך הניסוי הדמיה (D). שיתוף הטיפול בתאים עם ShotRNAi ו RodRNAi, מרכיב של מחסום ההרכבה ציר, מדכא את הזריקה המובילה בתחילת אנאפיום התפרצות קינטיקה דומה לתאי בקרה (C). החצים ב-(א) מציינים את מבנה הכוכבים "כמו כוכב", וראש החץ הגדול מציין את הגרעין. כל סרגל בקנה מידה מייצג 5 מיקרון. דמות זו מותאמת ומתפרסמות ממנו בהיתר מ-10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

וידאו 1: סרט בזמן פקיעה של חטיבת הבקרה של תא S2. וידאו מראה סרט נציג של חטיבת התאים S2 ב-גנוטיפ ' בקרה '. הסרט מתאים לאיור 1A. וידאו זה מותאם ומפורסם שוב עם הרשאה מ-10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 2: זמן קפיצה הסרט של מתעכב ' ShotRNAi ' S2 החטיבה התא. וידאו מראה סרט מייצג של חטיבת התאים S2 בתוך ' שוטרינאי ' המוביל לעיכוב mitotic פנוטיפ. הסרט מתאים לאיור 1B. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 3: סרט פקיעה זמן של ' שוטרנאי + רודרנאי ' מחלקת תא S2. וידאו מציג סרט מייצג של חטיבת התאים S2 ב שוטרנאי + הגנוטיפ של רודרנאי. הסרט מתאים לאיור 1C. וידאו זה מותאם ומפורסם שוב עם הרשאה מ-10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

וידאו 4: זמן מעידה סרט של שנעצרה ' שוטר ' תא S2 החטיבה. וידאו מראה סרט מייצג של חטיבת התאים S2 בתוך ' שוטרינאי ' המוביל למעצר mitotic פנוטיפ. הסרט מתאים לאיור 1D. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Discussion

זיהוי תא מתאים

מפתח הדמיה בחלוקת תאים S2 תחילה לאתר את התא הנכון. הזמן יכול להיות מבוזבז תאים הדמיה כי הם חשבו בטעות להיות מוכנים לחלק אבל לא לעשות זאת בפרק זמן סביר. יש לזהות את התאים המכילים שני מבני מרכז גלויים ובעלי מראות וגרעין שלם. לסנטרוזומים בטח יש סיבים זעירים. שמקורם בהם, ונותנים להם מראה של כוכבים גרעין שלם שופך אור בעת התאמת המיקוד, וגם עושה את המרכז המשוער של התא כהה יותר במראה. הגרעין יכלול גם את GFP: CID "נקודות", עוד תכונה הבחנה כדי לסייע בזיהויו. תאים עם > 2 סנטרוזומים, טובולין דקדטה ללא טובולין סיבים שמקורם בהם, או תאים עם מסנטאחד בלבד יש להימנע. בנוסף, אם שני סנטרוזומים גלויים, אבל הגרעין אינו, NEBD כבר התרחשה ואת התא הוא מתקדם מדי בחלוקה שלה להיות התמונה אם ניתוח מלאה M-שלב רצוי. פעם תא המתאים נמצא, מהירות התחלת הדמיה היא חיונית כמו NEBD מתרחשת במהירות (בדרך כלל בתוך 3-5 דקות) ו עיכוב התחלת הדמיה יכול להוביל הזדמנויות החמיץ. למקד את התא בתוכנת הדמיה במהירות כגון הסנטזומים הם גלויים, או אם centrosomes הם מחוץ למטוס אחד עם השני, להגדיר את נקודת המוקד בין השניים, כך שכל אחד יכול להילכד כאשר הערימות Z נאספים מעל ומתחת למרכז המוגדר נקודה. לאחר ההתמקדות, הגדר מיד את ההיסט בין השלב למשטח התא החי באמצעות בדיקת המיקוד באינפרא-אדום (אם היא זמינה) והתחל בתוכנית ההדמיה. למרות הפרוטוקול המוצג כאן מותאם במיוחד עבור ניסויים הערכת NEBD-אל-אנאפא דינמיקה, שינויים פשוטים יכול להתאים לקוראים ללמוד אירועים mitotic חלופיים. עבור NEBD-to-מטשלב ו אנאפה-ל-telophase הדמיה, אנו מציעים 10 מרווחי תמונה לכידת תמונות כמו תהליכים אלה הם דינמיים מאוד להתרחש במהירות בתאי S2 (5-10 דקות). מעבר מטשלב-אל-אנאפא (המוקד הניסיוני טיפוסי שלנו) הוא תהליך ארוך יותר (20-30 דקות) בתאים S2, ואנחנו אוספים תמונות במרווחי זמן של 30. לבסוף, telophase-דרך-ציטוקינזה מתרחשת די לאט בתאים S2, ואנו מציעים 60 s מרווחי הספק מספיק ברזולוציה עבור תהליך זה במשך שעה משוער.

שמירה על הפוקוס בכל תוכנית ההדמיה

אם התקן בדיקת מיקוד אינפרא-אדום אינו זמין, הקפד להימנע מלהיתקל במיקרוסקופ או בשולחן שעליו הוא יושב, מאחר שפעולה זו עלולה לגרום לתא היוצא ממיקוד במהלך תוכנית ההדמיה, המוביל לתוצאות דו-משמעיות בטבלה שלא ניתן לתרגם. ציפוי מראש תא חי בארות עם פולי-L-ליזין יכול לעזור הדבקות בתאים, אשר יכול לעזור להימנע תנועה תא והוא שימושי במיוחד עבור הגדרות ללא בדיקות מיקוד אינפרא אדום. בנוסף, הגדרות כולל זעזועים קליטת פלטפורמות או שולחנות האוויר יכול עוד לעזור למנוע תאים זזים מחוץ לפוקוס. לבסוף, תוכנות מסוימות יש פונקציות הפסקה המאפשר למשתמש למקד ולחדש את התוכנית.

הדמיה של תאים מרובים

מועיל להצטברות נתונים היא שלעתים קרובות ניתן למקם תאים מרובים מוכנים לחילוק בתוך אותו שדה תצוגה לדימות. זה יכול להיות שימושי במיוחד עבור ניסויים שבו לתאים יש משכי זמן ארוך-שלב או מעצר ממושך (למשל, התנאים הלגרום הפעלה של SAC). עבור תאים אלה, אנו בדרך כלל התמונה עד התאים מולבן (כ 2-3 h), אבל העיתוי המלא של תאים שנעצרו צריך להיות על פי שיקול דעתה של החוקר. לפעמים התאים מרובים מראש מחלק יכול להיות במישורים מוקד שונים, ובמקרה זה עשוי להיות שימושי כדי להוסיף z-ערימות להכיל את כל התאים. הוספת ערימות z נוספת יכולה לסייע גם בשיפור הרזולוציה. שים לב יש לנקוט בפעולה זו, עם זאת, כפי שהוא יחשוף את התאים לקרינה יותר להוביל הלבנה מהירה יותר, כמו גם להוביל לגודלי קבצים גדולים על התקני אחסון בדיסק הקשיח.

הימנעות מצילום הלבנה ורעילות

השיטה שלנו מתארת הגדרות מסוימות עבור זמני חשיפה, מרווחי הדמיה, ערימות z, ו אחוז מעבר עבור מקור אור LED שלנו שבדרך כלל עובד עבור ההתקנה הניסיונית שלנו ואת התוצאות הרצויות. כמו מיקרוסקופים ומטרות ניסיוני עשוי להשתנות, מה יכול לעבוד היטב עבור המערכת שלנו עשוי להוביל הלבנת מוקדם או פוטורעילות באחרים. הצילום עלול להיות מחסור בתנועת צירים, בפיצול כדורית, מיקרודינמיקה פגומה והפעלת במחסום צירים ממושכת. שיטה פוטנציאלית אחת כדי למנוע מלכודות כאלה היא להגביל את זמן החשיפה. מצלמות המודרנית ביותר כעת בעלי טווחים דינמיים רחבים, ו היסטגרמות ניתן לכוונן להמחיש מבנים אפילו בחשיפות נמוכות מאוד. טכניקה נוספת היא להגדיל את מרווח ההדמיה (למשל, למספר דקות בין תמונות), כך שמספר הפעמים שהתא נחשף לאור לאורך מרווח הגבייה הכולל מופחת. זה יתרון במיוחד הדמיה לפרקי זמן ארוכים (שעות רבות), והוא יכול בנוסף לסייע בהפחתת גודל הקובץ של ניסויים כאלה. הגבלת מספר המחסניות z שצולמו יכולה גם לעזור להפחית את חשיפת האור, באמצעות 2 או אפילו רק 1 במקום 3. יתר על כך, התאמת אחוז הסיוע של אור (עבור מקורות אור LED), או ניצול דחיסות נייטרלית (ND) מסננים (עבור מנורת הלוגן והן מקורות אור LED) תפחית את עוצמת האור וביחד עם זמן חשיפה ארוכה יכול לשמר את הניראות . על ידי בחירת תאים עם centrosomes כבר מופרדים, חשיפה כוללת יכול להיות מוגבל כי תאים אלה בדרך כלל להזין מיטוזה במהירות (בתוך דקה או שתיים) לאחר תחילת ההדמיה. ניתן גם להגביל את הזמן שתאים מותרים לדימות לפני NEBD. המעבדה שלנו בדרך כלל קובע הפעם ב 10 דקות, אבל מגבלה שמרנית יותר ניתן בקלות להטיל על ידי המשתמש. בנוסף, יותר ' פולשני ' מדידה אנו ממליצים הוא טיפול עם dsRNA ממוקד נגד רכיב של SAC (כגון רוד או Mad2). אם מעצר פנוטיפ נובע מפגיעה לא ספציפית בתאים (למשל, השפעות מיקרו-כדורית פגומות), טיפול כזה פחות סביר לדכא את המעצר בהשוואה להשפעה בתום הרצון של גן העניין בניסוי המקורי.

הנחיות לעתיד

השיטה המתוארת כאן יכולה להיות מנוצל על מיקרוסקופ אפיסנטי פשוט יחסית לתמונה במהירות לחיות מחלקות תאים והוא יכול להתאים בקלות לעיצוב ניסיוני מסוים של החוקר ומטרות. מספר שיטות מצוינות עבור culturing, rnai מפדאון גישות, העברה ארעית, ו מיקרוסקופ פלואורסצנטית פורסמו עבור S2 ואחרים בתאי הילה9,14,15, מיכל בן 16 , 17. הפרוטוקול שלנו מציע כמה יתרונות. (1) השימוש קו תא יציב כפול (GFP: CID, mCherry: α-טובולין) בו מסמן שני מבנים mitotic מפתח, נמנע את הטרחה וסיבוכים פוטנציאליים של הזיהום חולף, ומבטיח כי כמעט כל התאים יהיה לבטא סמנים פלורסנט כמו מועמדים פוטנציאליים להדמיה. (2) הסתגלות מיטוזיס מוסיפה לפרוטוקולים שפורסמו בדיקת הדינמיקה השלד בתוך motile, תאים שאינם מפרידים ומרחיב לבדיקת אירועים mitotic בזמן אמת. בעוד אנו מאמינים שלנו היא טכניקה רבת עוצמה המוסיפה לרפרטואר של אחרים, תמיד ניתן לעשות שיפורים. שטח מסוים אחד של חלוקת תאים שמצאנו קשה לתדמית הוא מחלקה המרכזית. זה קורה לפני NEBD וקשה לקבוע מתי מסנטרוכמה אחד מוכן להפריד לשניים. שימוש בסמני מחזור תא פלורסנט (ציקלב A ו ציקלב ב) יכול לעזור לפתור בעיה זו, אך מגיע על חשבון הערוצים שיכולים לשמש להמחיש רכיבים של חלוקת תאים. האסטרטגיה הטובה ביותר שלנו בניסיון להמחיש את החטיבה המרכזית היא להוסיף רכישה מרובת נקודות לתוכנית ההדמיה (הגדרת נקודות שונות במישור XY לתמונה), אבל זה יכול לגרום לקבצים גדולים, והוא יכול גם לדרוש (בהתאם למספר הנקודות) הגדלת המרווח בין אוסף התמונות, הקטנת רזולוציית הזמן של הסרט המתקבל. פתרון אחר יכול להיות סנכרון של תאים בשלב הרצוי מחזור התא באמצעות תרופות היעד הרגולטורים מחזור התא ואחריו כשלון הבאים לפני הדמיה, למרות שיטות אלה לא יכול להיות אמין בתאים S2 במיוחד.

הפרוטוקול המוצג כאן מספק בסיס ליישומים עתידיים גם בדימות תאים חיים. עם טכנולוגיית הדמיה ותוכנה משופרת, עיבודים באמת גבוהה התפוקה של פרוטוקול זה באמצעות קיבולת גבוהה יותר, לוחות מרובי הצ יכול להיות אפשרי. חידושים כאלה יהיה להפוך מסכי rnai בקנה מידה גדול, כגון אלה שכבר השיגו ההכנות קבוע12,18, יותר צייתן בפורמט תא חי. מולקולה קטנה מסכי הסמים יכול להיות גם בחזה כאמצעי לזיהוי תרכובות הרומן מיקוד תהליכים חלוקת התא. שיפור של fluorophores ומסננים אופטיים יכול גם להוביל לדימות של רכיבים mitotic מרובים (לא רק את השניים שאנחנו מתארים), המאפשר דימות של הרגולטורים mitotic ספציפיים ואת האינטראקציות שלהם עם DNA ו/או ציר. לדוגמה, יצירת תאים עם כתבים פלורסנט לבטא בעקבות נזק DNA או במהלך אפופטוזיס יהיה כלים שימושיים כדי לזהות גנים חדשניים המעורבים בתהליכים אלה. גישות דומות ניתן להשתמש כדי לבחון את הדינמיקה של מחזור התא באמצעות ביטוי של מתויג fluorescently19.

Disclosures

. למחברים אין מה להצהיר

Acknowledgments

עבודה זו ממומנת על ידי המכון הלאומי לבריאות (R01 GM108756). אנחנו אסירי תודה על גארי Karpen (אוניברסיטת קליפורניה, ברקלי) לספק לנו בנדיבות עם GFP: סיד מלאי קו S2 תא שממנו GFP שלנו: CID/mCherry: αTubulin line נוצר10.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bright-Line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA for cell counting
cellSens imaging software Olympus
CELLSTAR Cell Culture Flask, 50 mL, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10 PCS/BAG Greiner Bio-One 690175
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed Greiner Bio-One 657160
Centrifuge 5804 R eppendorf Cat. 022623508
Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% Sigma-Aldrich C3036-250G
Corning Fetal Bovine Serum Fisher Scientific MT35015CV
Effectene Transfection Reagent 1 mL Qiagen 301425 for transient transfection
IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope Olympus
LabTek Chambered Slide Insert Applied Scientific Instruments I-3016
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific AM1334 For dsRNA production
MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit ORFLO MXZ001 for cell counting
MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller Applied Scientific Instruments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well Thermo Fisher Scientific 155409
Orca-Flash 4.0 LT Camera Hammamatsu Photonics K.K. C11440-42U
pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector Thermo Fisher Scientific V412020
Poly-L-Lysine Cultrex 3438-100-01
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 302310000
Schneider's insect medium Sigma-Aldrich S0146-100ML
Spectra Tub Centrifuge Tubes VWR 470224-998
Uner Counter BOD Incubator Sheldon manufacturing (VWR) 89409-346
X-CITE 120 LED ExcelitasTechnologies Led light source
Z -Drift Compensator (ZDC) Olympus infrared focus check

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ragkousi, K., Gibson, M. C. Cell division and the maintenance of epithelial order. Journal of Cell Biology. 207 (2), 181-188 (2014).
  2. Aldaz, S., Escudero, L. M., Freeman, M. Live imaging of Drosophila imaginal disc development. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 107 (32), 14217-14222 (2010).
  3. Cabernard, C., Doe, C. Q. Live imaging of neuroblast lineages within intact larval brains in Drosophila. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), 970-977 (2013).
  4. Lerit, D. A., Plevock, K. M., Rusan, N. M. Live imaging of Drosophila larval neuroblasts. Journal of Visualized Experiments. (89), (2014).
  5. Morris, L. X., Spradling, A. C. Long-term live imaging provides new insight into stem cell regulation and germline-soma coordination in the Drosophila ovary. Development. 138 (11), 2207-2215 (2011).
  6. Prasad, M., Jang, A. C., Starz-Gaiano, M., Melani, M., Montell, D. J. A protocol for culturing Drosophila melanogaster stage 9 egg chambers for live imaging. Nature Protocols. 2 (10), 2467-2473 (2007).
  7. Restrepo, S., Zartman, J. J., Basler, K. Cultivation and Live Imaging of Drosophila Imaginal Discs. Methods in Molecular Biology. 1478, 203-213 (2016).
  8. Tsao, C. K., Ku, H. Y., Lee, Y. M., Huang, Y. F., Sun, Y. H. Long Term Ex Vivo Culture and Live Imaging of Drosophila Larval Imaginal Discs. PLoS One. 11 (9), e0163744 (2016).
  9. Rogers, S. L., Rogers, G. C. Culture of Drosophila S2 cells and their use for RNAi-mediated loss-of-function studies and immunofluorescence microscopy. Nature Protocols. 3 (4), 606-611 (2008).
  10. Dewey, E. B., Johnston, C. A. Diverse mitotic functions of the cytoskeletal cross-linking protein Shortstop suggest a role in Dynein/Dynactin activity. Molecular Biology of the Cell. 28 (19), 2555-2568 (2017).
  11. Rodriguez, E. A., et al. The Growing and Glowing Toolbox of Fluorescent and Photoactive Proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2017).
  12. Kwon, M., et al. Mechanisms to suppress multipolar divisions in cancer cells with extra centrosomes. Genes and Development. 22 (16), 2189-2203 (2008).
  13. Basto, R., Gomes, R., Karess, R. E. Rough deal and Zw10 are required for the metaphase checkpoint in Drosophila. Nature Cell Biology. 2 (12), 939-943 (2000).
  14. Currie, J. D., Rogers, S. L. Using the Drosophila melanogaster D17-c3 cell culture system to study cell motility. Nature Protocols. 6 (10), 1632-1641 (2011).
  15. Lu, W., Del Castillo, U., Gelfand, I. V. Organelle transport in cultured Drosophila cells: S2 cell line and primary neurons. Journal of Visualized Experiments. (81), e50838 (2013).
  16. Yang, J., Reth, M. Drosophila S2 Schneider cells: a useful tool for rebuilding and redesigning approaches in synthetic biology. Methods in Molecular Biology. 813, 331-341 (2012).
  17. Zhou, R., Mohr, S., Hannon, G. J., Perrimon, N. Inducing RNAi in Drosophila cells by soaking with dsRNA. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (5), (2014).
  18. Goshima, G., et al. Genes required for mitotic spindle assembly in Drosophila S2 cells. Science. 316 (5823), 417-421 (2007).
  19. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132 (3), 487-498 (2008).

Tags

גנטיקה סוגיה 150 Drosophila ילה בתאי S2 mitosis מחזור תאים הדמיה של תא חי Mitotic ציר כרומוזום דינמיקה mcherry: α-טובולין GFP: Cenp-A סיד
שימוש ב- <em>Drosophila ילה</em> S2 תאים עבור הדמיה חיה של חטיבת התא
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dewey, E. B., Parra, A. S.,… More

Dewey, E. B., Parra, A. S., Johnston, C. A. Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division. J. Vis. Exp. (150), e60049, doi:10.3791/60049 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter