Summary
細胞分裂は、蛍光タグ付きタンパク質とタイムラプス顕微鏡を使用してリアルタイムで可視化することができます。ここで提示されるプロトコルを使用して、ユーザーは細胞分裂タイミングダイナミクス、ミトチックスピンドルアセンブリ、および染色体の議会と分離を分析することができます。RNA干渉(RNAi)媒介遺伝子ノックダウン後のこれらの事象の欠陥を評価し、定量することができる。
Abstract
ショウジョウバエS2細胞は、組織培養における有人化を研究する上で重要なツールであり、この基本的な細胞プロセスに対する分子的洞察を迅速かつ高スループットの方法で提供します。S2細胞は、固定細胞およびライブセルイメージングアプリケーションの両方に対応できることが実証されています。特に、生細胞イメージングは、遺伝子の損失またはノックダウンが、有糸分裂スピンドルアセンブリ、染色体議会、分離、および分離を含む細胞分裂中の主要な事象の運動学およびダイナミクスにどのように影響するかについての貴重な情報を得ることができます。全体的な細胞周期のタイミング。ここでは、蛍光タグ付きmCherry:α-チューブリンを使用して有光スピンドルとGFP:CENP-A(ショウジョウバエの「CID」遺伝子と呼ばれる)をマークし、主要な有人性遺伝子がタイミングに及ぼす影響を分析するために、セントロメアをマークします。細胞分裂、プロフェーズ(特に核封筒内訳;NEBD)がアナフェイズの発症に。このイメージングプロトコルはまた、微小管および染色体ダイナミクスの可視化を可能にする。本明細書では、読者がS2細胞をライブイメージング実験に容易に適応させるシンプルで包括的なプロトコルを提供することを目指す。このような実験から得られた結果は、いくつかの同時および動的事象における役割を定義することによって、細胞分裂に関与する遺伝子の理解を深めるべきである。この細胞培養システムで行われた観察は、ハエの遺伝的アプローチの印象的なツールキットを使用して、生体内で検証され、さらに調査することができます。
Introduction
細胞分裂は、その発達と恒常性1の両方において、すべての多細胞生物にとって重要なプロセスである。ショウジョウバエは、長い間、細胞分裂の研究のモデルとして使用され、様々な組織の種類や遺伝的条件の実験がプロセスに重要な洞察を提供しています。これらの洞察の多くは固定細胞条件から得られますが、細胞分裂は多くの可動部分を持つ動的な手順であり、RNAiの評価や細胞分裂の多数の部分に対する遺伝的ノックアウト効果を評価するために生細胞の可視化を行います。スピンドル形成、染色体の議会と分離、およびサイトカインシス。
多くのプロトコルは、生体内のショウジョウバエ細胞分裂を可視化するために長年にわたって開発され、利用されてきました。様々なグループは、幼虫の想像力ディスクと幼虫の脳2、3、4、5、6、7、8の両方で分裂をイメージする技術を培ってきた.これらの技術は、特定の組織でのイメージングに有用であるが、スループットに限界があり、蛍光成分を生成し、目的とする遺伝子の発現を変化させるために遺伝子ストックの生成および維持を必要とする。ショウジョウバエ由来の培養S2細胞は、細胞分裂における様々な遺伝子の効果を迅速にテストする、より高いスループットの代替手段を提供する。さらに、様々な蛍光タンパク質をトランスフェクトする能力を持つS2細胞は、RNAiノックダウンが細胞分裂の多数の成分に及ぼす影響を決定するために迅速に改変することができる。目的の蛍光タグ付き遺伝子は細胞分裂においても観察され、その機能9の動的な特徴付けを可能にする。
ここでは、最近説明した方法を用いて、水虫S2細胞のライブイメージングのための詳細なプロトコルを提供する10.我々の方法は、銅誘導運動運動(メタロチオニン;pMT)の制御下にある微小管およびセントロメア用の蛍光マーカーを用いて安定的にトランスフェクトされた細胞を利用する。この方法論は、基本的なイメージングソフトウェアを用いて比較的単純な蛍光顕微鏡を利用して、有光化のすべての段階でスピンドルおよび染色体ダイナミクスを画像化するために使用することができる。それは、一時的なトランスフェクションとRNAiが人骨の候補遺伝子の役割を決定するための拡張された可能性を提供して、個々の研究ニーズに合わせてさらにカスタマイズすることができます。プロトコルの相対的な単純さのために、それは生体内のさらなる研究が有益であろう遺伝子を識別するために、小規模な機能喪失スクリーンに使用することができ、その後の遺伝的でより集中的な努力と効率を可能にするハエの操作。
Protocol
1. RNAiによる治療用S2細胞の調製
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コンフルエントpMTのストック培養物から:GFP:CIDとpMT:mCherry:α-tubulin安定的にトランスフェクトされたS2細胞(〜80%生存可能、24-28°Cで増殖)、新鮮な、温暖な、10%の胎児の密度で6ウェル無菌培養プレートの種子細胞シュナイダーの昆虫メディア(SIM)を補完した。
注:安定的にトランスフェクトされたS2細胞は、ショウジョウバエRNAiスクリーニングセンター(DRSC)(https://dgrc.bio.indiana.edu/Protocols?tab=cells)からのプロトコルに従って生成することができる。本明細中で使用される特定の安定なS2ラインはGFPおよびmCherryを利用するが、これらの蛍光スペクトルの中にも他のものであり、多数の選択肢が存在する。これらの蛍光タンパク質の詳細な議論は、このプロトコルの範囲を超えていますが、その特性と潜在的な利点/欠点は、他の場所で専門的に検討されています11.- 細胞カウンタまたはヘモサイトメーターを使用して、コンフルエント細胞ストックの密度を決定する。
- 4 mLの総体積で1 x 106細胞/mLを達成するために必要なコンフルエントセル懸濁液の体積を決定する(例えば、〜4 x 106の総細胞)。このセルストックのボリュームを新鮮なSIMのボリュームに追加し、4 mL/ウェルの総容積を作ります。100 μL の培地を持つストックフラスコから直接セルの 100 μL を希釈し、この 1:2 希釈をヘモサイトメーターで手動でカウントするか、使用可能な場合は自動セル カウンタでセル ストック (セル/mL) の密度を決定します。
注:安定的にトランスフェクトされないS2細胞を用いた場合、蛍光タグ付きの一過性トランスフェクションアッセイ(GFP、mCherry等)αまたはβチューブリン、およびDNAマーカー(CENP-A、ヒストンH2B等)を行うことができる。さらに、様々な有人紡錘およびDNAマーカーを用いて安定的にトランスフェクトされた細胞株は、ユーザーの正確な実験ニーズに適する可能性のあるショウジョウバエ遺伝学リソースセンターから入手可能である(https://dgrc.bio.indiana.edu/cells/Catalog)。 - 新鮮な種子細胞を24-28 °Cインキュベーターに36-48時間置きます。
2. 目的の遺伝子に対するdsRNAを用いる播種細胞の治療
注:次の例と結果セクションでは、目的の遺伝子としてアクチン微小管架橋剤であるショートストップ(Shot)を使用します。dsRNAを使用しないか、または無関係な遺伝子(例えば、β-ガラクトシダーゼ、lacZ)に対してdsRNAを照会して陰性対照として使用する。
- ウォームシュナイダーの昆虫メディアはFBS(血清フリーメディア;SFM)24〜28°Cインキュベーター内。
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以前に播種されたウェル(ステップ1.1.2から)から15 mLの滅菌チューブに細胞を移し、転写された細胞の総体積に注意する。
- 細胞カウンターまたはヘモサイトメーターで数える場合は、少量の細胞(〜100 μL)を保持します。
- 室温で3分間1,000xgで遠心分離することにより、細胞を穏やかにペレット化する。
- 遠心分離細胞をしながら、細胞カウンターまたはヘモサイトメーターを用いてmL当たりの細胞濃度を決定する。この数値に遠心分離量の合計を掛け(1.2.2.で示す)、セルの合計数を取得します。
- ペレット細胞から上清を吸引する。
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温めたSFMで細胞を再中断し、3 x 106細胞/mLの濃度を得た。
- 再懸濁した細胞の1mLを6ウェルプレートの新しいウェルに移す。
- ショット(または目的とする標的遺伝子)に対して10-50 μGのdsRNA(RNAaseフリー水の100μLで希釈)を細胞に直接加え、プレートを旋回して混合します。24-28 °Cインキュベーターでプレートを1時間インキュベートし、細胞への直接dsRNA取り込みが可能になります。
- 1時間インキュベーションの間に、24-28°Cインキュベーターで10%FBS補充SIMを温める。
- dsRNAで細胞を1時間インキュベートした後、1mLの培温を取り除かずに直接ウェルに10%FBS補充SIMの2mLを加える。
- 細胞を24~28°Cのインキュベーターに3~7日間置きます。
注:dsRNA濃度と同様に、所望の標的遺伝子に対して総治療時間を最適化する必要がある場合があります。RNAiの有効性を評価するには、標的遺伝子に対する抗体を用いて細胞全体のライサーションにウェスタンブロットを行う。初期dsRNA標的配列が効果がないことが判明した場合、標的遺伝子内の一意の配列を標的とする代替dsRNAを設計する。
3. 蛍光タンパク質発現の誘導とイメージング用細胞の調製
- ここで説明するpMTプラスミド(誘導性メタロチオネインプロモーターを含む)を用いて安定的にトランスフェクトされた細胞を生成した場合、最終的な濃度で硫酸銅(CuSO4)で細胞を処理することにより蛍光タンパク質の発現を誘導する。イメージング前の24-36hおよびRNAi処置の4日後のための500 μM。pActのような構成式プラスミドの使用は銅誘導を必要としない。
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イメージング用のセルの準備
- 10%FBS補充SIMを24-28°Cインキュベーターで1時間温める。
- 細胞を15 mL無菌チューブに移し、移動した細胞の総体積に注意する。
- 細胞カウンターまたはヘモサイトメーターで数える場合は、少量の細胞(〜100 μL)を保持します。
- 室温で3分間1,000xgで遠心分離することにより、細胞を穏やかにペレット化する。
- 遠心分離細胞を、細胞カウンターまたは血球計を用いて濃度(細胞/mL)を決定する。この数値に遠心分離量の合計を掛け(2.2.2.で示す)、セルの合計数を取得します。
- ペレット細胞から上清を吸引する。
- 新鮮で温めた10%FBS補充SIMで細胞を再中断し、2 x 106細胞/mLの濃度を得た。500 μM 濃度を維持するために、適切な量の CuSO4を追加します。
- 再懸濁細胞の200-500 μLをマルチウェル生細胞室の1つのウェルに移し、反転蛍光顕微鏡上に置きます。細胞が画像化実験の前に15〜30分間チャンバーに落ち着くことを許可する。
注:ライブ細胞チャンバーウェルは、追加の付着のためにポリL-リジンで事前にコーティングすることができます。
4. ライブセルイメージングプログラムの設定
注:この実験におけるライブ細胞イメージングは、反転イメージングシステムおよびその関連ソフトウェア(例えば、cellSens Dimensionsソフトウェアパッケージを用いたオリンパスIX83)を用いて行った。詳細は顕微鏡メーカーとソフトウェアパッケージによって異なります。したがって、一般的なガイドラインと操作を以下に示します。
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反転蛍光顕微鏡を実行するソフトウェアを使用して、時間の経過とともに細胞(または細胞)をイメージングするためのプログラムを準備する。
- ソフトウェアのデスクトップ アイコンをダブルクリックして、ソフトウェアを開きます。
- [ファイル] をクリックして新しい実験ファイルを作成し、[新しい実験ファイル]をクリックします。
- まず、画像を撮影するタイムラプスループを挿入します。これを行うには、アイコンバーからストップウォッチアイコン(タイムラプスループアイコン)をクリックします。[実験マネージャ]タブで s の間隔を設定し、目的の実験時間全体を間隔で割って、同じタブのサイクル数を設定します。目的の合計期間にわたってループを繰り返します。
注:通常、画像は3-4時間の期間にわたって30〜60sごとに撮影されます。 - タイムラプスループレイヤー内に、目的の焦点を維持するために赤外線フォーカスチェックを挿入します(可能な場合)。これを行うには、2つの矢印アイコン(XYアイコンを移動)の正方形をクリックし、ドロップダウンメニューからZドリフト補正を選択して、タイムラプスループレイヤー内にZドリフト補正(ZDC)ステップを追加します。
注:赤外線フォーカスチェックという用語は、目的とスライド/イメージングチャンバとの間の一定の距離を維持するために赤外線パルスを使用するシステムを指します。多くの顕微鏡は、独自の命名法を持つ、このようなシステムを持っています。特定の命名の詳細については、操作マニュアルまたは担当者に問い合う必要があります。 - 赤外線フォーカスチェックの後、プログラムにステップを追加して、最初にzスタックステップを挿入し、次にチャネルを指定して、3-5 zスタック上のマルチチャンネル画像(例えば、GFP用FITCとTRITC for mCherry)を取ります。これを行うには、カラー ホイールアイコン (マルチチャネル グループアイコン) をクリックして、タイム ラプス ループ レイヤー内にマルチチャネル グループ レイヤーを追加します。次に、3層アイコン(Z スタック ループ アイコン) をクリックして、マルチチャネル グループ レイヤー内にZ スタック ループレイヤーを追加します。[実験マネージャ]タブで目的のステップ サイズとスライス数を設定し、各チャンネルの露出をできるだけ低く設定して、光の漂白を最小限に抑えます。
注:Z スタック間隔、露光時間、および LED の透過率はさまざまです。これらの実験では、3 μm の範囲にわたって 3 つの Z スタックを使用し、各スタック間に 1 μm の間隔を与えます。セルの中心を上下ではなく定義すると、最良の結果が生じがちです。その後、画像は、中性密度(ND)フィルタなしで50ミリ秒の露出と50%の透過率で各チャンネルに対して収集されます。
5. 生細胞イメージングプログラムを用いて細胞を分割する画像
注:S2細胞はCO2を必要とせず、23~27°Cで最適に増殖します。すべてのイメージングは、よく制御された部屋で周囲温度で行われました。
- 眼を使用して、ウェルの上部(または下部)の角を見つけ、mCherry(α-チューブリン)チャネルを使用して目的(40-60x油浸漬)を細胞に集中させる。
- 井戸の上部(または下部)に沿ってスキャンして、垂直井戸仕切りから離れます。
注:ウェルディバイダーに近すぎるイメージングは、赤外線フォーカスチェックを妨げる可能性があります。 - 後期G2または初期M相(プロフェーズ)にある細胞(または細胞)を見つける。
注:これらの細胞は、正確に2つの「星状」微小管構造(セントロソーム)と無傷の核(細胞内の屈折光の円形領域によって示される)の存在によって最もよく同定され、いずれもα-チューブリン(赤色)を用いて容易に区別できる。励起フィルター。早期相間の細胞の選択は、1つまたは0で容易に目に見えるセントロソームによって顕著であり、G2/M進行の遅れによる無駄な時間をもたらす可能性がある。逆に、NEBD後の細胞の選択は、初期のスピンドルアセンブリと染色体ダイナミクスの結距離タイミングとイメージングの正確な計算を防ぐことができます。また、S2細胞には>2セントロソームが含まれていることが多い。これらは典型的にはバイポーラスピンドル12に集積するが、実験計画のために別途望ましくない限り、これらの細胞を避けることをユーザが勧める。選択する適切なセルの画像と説明は、[代表的な結果]セクションにあります。 - [ライブビュー] ボタンをクリックして、ソフトウェア画面でセルの表示を開始します。顕微鏡の細かい焦点のノブを使用して、目的の細胞(または細胞)に焦点を合わせます。[フォーカスの設定] ボタンをクリックして、赤外線フォーカス チェックを設定します。
- [スタート]ボタンをクリックして、タイム ラプス イメージング プログラムを開始します。必要に応じてヒストグラムを調整するには、目的のチャネルを選択し、平均ピクセル強度を調整して、目的のセル(またはセル)を明確に確認します。
- プログラムの実行を許可し、15-20分後にセルをチェックして核エンベロープの故障(NEBD)が発生したことを確認します。
- プログラムの実行を続行し、アナフェーズの発症が発生した後に確認するために断続的に (15 ~ 20 分ごと) をチェックします。合計期間に残り時間が多い場合は、この時点でプログラムを停止し、ファイルを保存します。あるいは、テロ相およびサイトカインシス中の事象が関心がある場合は、プログラムがこれらのプロセスをイメージするために十分な時間を実行できるようにします。
-
NEBD(tNEBD)の時間を分けで、初期染色体分離(tアナフェイズ発症)の時間をminで記録し、t ANaphase発症からtNEBDを引くことを得ることにより、アナセズ発症タイミングへのNEBDの分析を行うNEBDは、所定のセルのアナフェーズ発症時間をアナフェーズする。
- これを行うには、フレームアップボタンをクリックし、NEBD とアナフェーズの発症が発生するフレームを注意し、これらを減算して経過フレームの合計数を決定し、イメージング フレーム間の時間間隔を掛けます。
- 事前に分割されたセルのスキャンを続行して、特定の条件に対して複数の n を取得します。細胞は、初期の沈降後最大12時間の生細胞室内で画像化することができる。
Representative Results
上記で説明した方法は、細胞分裂を受けるショウジョウバエS2細胞の同定とイメージングをもたらす。分裂しようとしている細胞(すなわち、M相に入る直前)は、α-チューブリンチャネルで見たときに屈折した光と細胞内の暗いスポットによって示される2つのセントロソームと無傷の核の存在によって標的とすることができる(図1、左端パネル、赤チャンネル。図 1Aの矢印)。細胞の約2~5%がこのカテゴリーに分類され、イメージング実験の間に、通常、別の適格細胞のスキャンに最大2~3分を費やします。NEBDは、この暗いスポットの消失を通して可視化することができ、その結果、細胞質の均一な着色(図1、パネルは「00:00」、赤色)。NEBDの後、各細胞がスピンドル、議会染色体、および分離染色体を形成するのにかかる時間は、NEBDに対するこれらの事象の時間点を記録することによって単に測定することができる。
これらの分裂を利用して、特にNEBDのアナセブ発症に対する有分裂タイミングを評価し、染色体が分離し始める点に注目する。過半数(約90%)銅誘発細胞の両方を発現したmCherry:α-チューブリンとGFP:CID。細胞の小さな割合(約10%)マーカーを 1 つだけ表すか、どちらも表しません。これらの細胞は細胞選択中に回避された。典型的には、S2細胞は20〜30分のアナセオンセットタイミングにNEBDを表示する(図1A、制御)。次に、ショートストップ(Shot)を標的としたdsRNAを用いた細胞を、細胞周期ダイナミクスに影響を与える可能性があると疑われるアクチン微小管架橋タンパク質を標的にした細胞を治療した。実際、ショットノックダウン細胞は有意な微動遅延を示した(図1B、ShotRNAi遅延)が、多くの細胞がメタフェイズで停止し、2~3時間のイメージング実験中にアナフェイズに移行することは決してない(図1D、ショットルネ逮捕)。この遅延/逮捕表現型は、スピンドルアセンブリチェックポイント(すなわちM相チェックポイント)の活性化が原因である可能性があると推論しました。この仮説を直接テストするために、我々は、このチェックポイント13の重要な構成要素であるショットおよびラフディール(Rod)に対してdsRNAと細胞を共処理した。これにより、逮捕表現型の抑制が行われ、NEBDはコントロールと同様のアナフェーズ時間に至った(図1C、ShotRNAi+RodRNAi)。したがって、このライブイメージングプロトコルは、ショットがタイムリーなM相進行に必要であり、その損失が水位細胞を遅らせるか、または逮捕するチェックポイント活性化につながると結論付けることを可能にしました。
図1:ライブイメージングは、S2細胞における水端チェックポイント活性化による細胞周期の欠陥を明らかにする。
すべての条件において、本明細書に記載される誘導性GFP:CIDおよびmCherry:αTubulinと共生したS2細胞に対して生細胞イメージングを行った。(A) 漫画は、人芽生の際の重要なランドマークを示し、対応する画像は、NEBD(t=00:00)に対する時間ポイントを持つ示されたゲノムタイプの代表的なムービーから示されている。対照細胞は通常、20〜30分以内にアナフェイズに進行するShotRNAi処理細胞はNEBD-アナフェイズ遅延(B)を示し、しばしばメタ相停止を受け、画像化実験(D)内のアナフェイズに入ることはない。スピンドルアセンブリチェックポイントの構成要素であるShotRNAiとRodRNAiとの細胞の共処理は、コントロール細胞(C)と同様のアナセオンセット運動性につながるショット表現型を抑制する。(A)の矢印は「星のような」中心構造を示し、大きな矢印は核を示します。各スケールバーは5ミクロンを表します。この図は、10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors) の許可を得て、適応され、再発行されます。この図のより大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。
ビデオ1:「コントロール」S2細胞分裂のタイムラプスムービー。ビデオは「コントロール」遺伝子型におけるS2細胞分裂の代表的なムービーを示す。このムービーは図1Aに対応しています。このビデオは、10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors)の許可を得て、適応され、再公開されます。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ2:遅延'ショットRNAi'S2細胞分割のタイムラプスムービー。ビデオは、表現型の結び線状遅延につながる「ShotRNAi」遺伝子型におけるS2細胞分裂の代表的なムービーを示しています。このムービーは図1Bに対応しています。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ3:「ショットルネイ+ロドRNAi」S2細胞分裂のタイムラプスムービー。ビデオは「ショットナーライ+ロドRNAi」遺伝子型におけるS2細胞分裂の代表的なムービーを示しています。このムービーは図1Cに対応しています。このビデオは、10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors)の許可を得て、適応され、再公開されます。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
ビデオ4:逮捕された「ショットルネ」S2細胞分裂のタイムラプスムービー。ビデオは、表現型のツオチミツの逮捕につながる「ShotRNAi」遺伝子型におけるS2細胞分裂の代表的な映画を示しています。このムービーは図1Dに対応しています。このビデオをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
適切なセルの識別
S2細胞を分割するイメージングの鍵は、まず適切な細胞を見つけることです。時間は、誤って分割する準備ができていると考えられているが、合理的な時間枠でそうすることができないイメージング細胞を無駄にすることができます。細胞は、2つの異なる目に見えるセントロソームと無傷の核を持つ細胞を同定する必要があります。セントロソームは微小管状の繊維を発し、星のような外観を与える必要があります。無傷の核は、フォーカスを調整する際に光を屈折させ、また、細胞のおおよその中心を見た目が暗くなります。核はまた、GFP:CID「ドット」、その同定に役立つ別の特徴が含まれます。>2セントロソームを有する細胞、それらから発せられるチューブリン繊維のないチューブリン穿刺、または1セントロソームのみの細胞は避けるべきである。さらに、2つのセントロソームが見えるが核が見えない場合、NEBDは既に発生しており、完全なM相解析が望まれる場合には、その分裂において細胞が高度すぎて画像化できない。適切な細胞が見つかると、NEBDが迅速に(通常は3〜5分以内に)発生し、イメージングの開始を遅らせることで機会を逃す可能性があるため、イメージングを開始する速度が重要になります。両方のセントロソームが見えるようにイメージングソフトウェアのセルをすばやくフォーカスするか、セントロソームが互いに平面から外れている場合は、定義された中心の上下にZスタックが収集されたときに各々をキャプチャできるように、2つの間の焦点を設定します。ポイント。一度焦点を合わせ、赤外線フォーカスチェック(可能な場合)を使用してステージとライブセルチャンバ表面の間のオフセットを直ちに設定し、イメージングプログラムを開始します。ここで提示されるプロトコルは、NEBD-アナフェーズダイナミクスを評価する実験に特化していますが、単純な変更は、代替のマイトティックイベントを研究する読者に適している可能性があります。NEBD-メタフェイズおよびアナフェイズからテロ相へのイメージングでは、これらのプロセスが非常に動的であり、S2細胞(5〜10分)で迅速に発生する10秒の画像キャプチャ間隔を提案します。メタフェイズ間相転移(私たちの典型的な実験焦点)は、S2細胞の長いプロセス(20〜30分)であり、我々は30秒間隔で画像を収集します。最後に、テロ相からサイトカイン症はS2細胞で非常にゆっくりと起こり、このおよそ1時間のプロセスに十分な分解能を提供する60秒間隔を示唆する。
イメージング・プログラム全体を通じてフォーカスを維持する
赤外線フォーカスチェック装置が利用できない場合は、イメージングプログラム中に細胞が焦点を合わなくなる可能性があるため、座っている顕微鏡やテーブルにぶつからないようにしてください。ポリL-リジンで生細胞室ウェルを事前コーティングすることは、細胞の付着に役立ち、細胞の動きを避けるのに役立ち、赤外線フォーカスチェックのないセットアップに特に役立ちます。さらに、衝撃吸収プラットフォームやエアテーブルなどのセットアップは、セルが焦点を合わせないようにすることができます。最後に、一部のソフトウェアプログラムは、ユーザーがプログラムに再焦点を合わせ、再開することを可能にする一時停止機能を持っています。
複数のセルのイメージング
データの蓄積に役立つのは、多くの場合、分割する準備ができている複数のセルをイメージング用の同じ視野内に配置できることです。これは、細胞が長いM相持続時間または長期停止(例えば、SACの活性化を誘導する条件)を有する実験に特に有用でありうる。これらの細胞については、通常、細胞が光漂白されるまで画像化しますが(約2〜3時間)、逮捕された細胞の完全なタイミングは研究者の裁量で行う必要があります。複数の分割前のセルが異なる焦点面に含まれる場合があります。z スタックを追加すると、解像度を向上させるのにも役立ちます。ただし、セルをより多くの放射線にさらすため、より迅速な光漂白につながり、ハード ディスク ストレージ デバイス上でファイル サイズが大きくなります。
光漂白と光毒性の回避
この方法では、一般的に実験セットアップと望ましい結果に適した LED 光源の露出時間、イメージング間隔、z スタック、およびパーセント透過率の特定の設定について説明します。顕微鏡や実験目標はさまざまですから、私たちのシステムに適したものは、他のシステムで早期の光漂白や光毒性につながる可能性があります。光損傷は、スピンドル運動、微小管断片化、欠陥微小管ダイナミクス、および長時間のスピンドルチェックポイント活性化の欠如を示す可能性があります。このような落とし穴を回避する 1 つの潜在的な方法は、露出時間を制限することです。現代のカメラの多くは広いダイナミックレンジを持ち、ヒストグラムは非常に低い露出でも構造を視覚化するように調整できます。もう1つの技術は、画像化間隔を大きくし(例えば、画像間で数分に)、細胞が総収集間隔にわたって光にさらされる回数が減少するようにする。これは、特に長時間(多時間)のイメージングに有利であり、さらにそのような実験のファイルサイズの減少に役立ちます。撮影されるzスタックの数を制限すると、3の代わりに2または1だけを使用して、光の露出を減らすのに役立ちます。さらに、光の透過率を調整する(LED光源の場合)、または中性密度(ND)フィルタ(ハロゲンランプとLED光源の両方)を利用すると、光強度が低下し、露出時間が長くなるので、視認性を維持できます。.既に分離されたセントロソームを持つ細胞を選択することにより、全体的な曝露は、通常、イメージングを開始した後、すぐに(1〜2分以内に)有人化に入る点で、全体的な曝露を制限することができる。また、NEBD の前にセルをイメージ化できる時間を制限することもできます。私たちのラボは通常、この時間を10分に設定しますが、より保守的な制限は、ユーザーが簡単に課すことができます。さらに、我々が推奨するより「侵襲的な」尺度は、SACの成分(RodまたはMad2など)に対して標的化されたdsRNAによる治療です。逮捕表現型が非特異的細胞損傷(例えば、欠陥微小管ダイナミクス)に起因する場合、そのような治療は、元の実験における目的の遺伝子のボナフィデス効果と比較して逮捕を抑制する可能性が低い。
今後の方向性
ここで説明する方法は、比較的単純なエピ蛍光顕微鏡で利用して、生細胞分裂を迅速に画像化し、研究者の特定の実験設計および目標に合わせて容易に適合させることができる。培養のためのいくつかの優れた方法, RNAiノックダウンアプローチ, 一過性トランスフェクション, 蛍光顕微鏡は、S2および他のショウジョウバエ細胞9,14,15,16歳,17.私たちのプロトコルは、いくつかの利点を提供しています。(1)二重安定細胞株(GFP:CID、mCherry:α-Tubulin)の使用は、2つの主要な有糸体構造を同時にマークし、過渡透過の面倒および潜在的な合併症を回避し、ほぼすべての細胞が蛍光マーカーを発現することを保証するイメージングの潜在的な候補。(2)有人化への適応は、動態、非分裂細胞における細胞骨格ダイナミクスを調べる公開されたプロトコルに追加され、リアルタイムで有線事象を調べることにまで及ぶ。私たちは、私たちが他の人のレパートリーを追加する強力な技術であると信じていますが、常に改善が行われます。我々が画像化しにくい細胞分裂の特定の領域の1つは、セントロソーム分裂である。これは NEBD の前に発生し、単一のセントロソームが 2 に分割する準備ができているタイミングを判断することは困難です。蛍光細胞サイクルマーカー(サイクリンAおよびサイクリンB)を使用すると、この問題を解決するのに役立ちますが、細胞分裂成分の可視化に使用できるチャネルを犠牲にして発生します。セントロソーム分割を視覚化するための最善の戦略は、イメージングプログラムにマルチポイント集録を追加することです(XY平面内の異なるポイントを画像に定義します)が、これは大きなファイルが発生する可能性があり、(ポイント数に応じて)必要に応じてイメージ コレクションの間隔を長くし、結果として得られるムービーの時間分解能を低下させます。別の解決策は、細胞周期調節を標的とする薬物を用いて、その後のイメージング前の洗浄を用いて、所望の細胞周期段階での細胞の同期であり得るが、これらの方法はS2細胞において特異的に信頼できない場合がある。
ここで示すプロトコルは、ライブセルイメージングにおける将来のアプリケーションの基盤も提供します。改善されたイメージングおよびソフトウェア技術によって、より大容量を使用してこのプロトコルの本当に高いスループットの適応は可能である、多部屋の版は可能である。このような技術革新は、既に固定製剤12、18で達成されているような大規模なRNAiスクリーンを、ライブセル形式でより扱いやすいものにするだろう。低分子薬物スクリーンは、細胞分裂プロセスを標的とする新しい化合物を同定する手段としても考えられる。蛍光光フィルターや光学フィルターの改良は、複数の人工的成分(我々が説明する2つだけでなく)のイメージングにもつながり、特定の人工的な調節器のイメージングやDNAおよび/またはスピンドルとの相互作用を可能にする可能性があります。例えば、DNA損傷やアポトーシス中に発現する蛍光レポーターを用いて細胞を生成することは、これらのプロセスに関与する新しい遺伝子を同定するのに有用なツールとなるでしょう。同様のアプローチは、蛍光タグ付きサイクリン19の発現を用いて細胞周期ダイナミクスを調べるために使用することができる。
Disclosures
著者は宣言するものが何もありません。
Acknowledgments
この研究は、国立衛生研究所(R01 GM108756)によって資金提供されました。私たちは、ゲイリー・カーペン(カリフォルニア大学バークレー校)にGFP:CID S2セルラインストックを寛大に提供してくださったことに感謝しています:CID/mCherry:αTubulinラインは10を生成しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bright-Line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | for cell counting |
| cellSens imaging software | Olympus | ||
| CELLSTAR Cell Culture Flask, 50 mL, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10 PCS/BAG | Greiner Bio-One | 690175 | |
| CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed | Greiner Bio-One | 657160 | |
| Centrifuge 5804 R | eppendorf | Cat. 022623508 | |
| Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% | Sigma-Aldrich | C3036-250G | |
| Corning Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35015CV | |
| Effectene Transfection Reagent 1 mL | Qiagen | 301425 | for transient transfection |
| IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope | Olympus | ||
| LabTek Chambered Slide Insert | Applied Scientific Instruments | I-3016 | |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | For dsRNA production |
| MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit | ORFLO | MXZ001 | for cell counting |
| MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller | Applied Scientific Instruments | ||
| Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
| Orca-Flash 4.0 LT Camera | Hammamatsu Photonics K.K. | C11440-42U | |
| pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
| Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
| Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets | Labconco | 302310000 | |
| Schneider's insect medium | Sigma-Aldrich | S0146-100ML | |
| Spectra Tub Centrifuge Tubes | VWR | 470224-998 | |
| Uner Counter BOD Incubator | Sheldon manufacturing (VWR) | 89409-346 | |
| X-CITE 120 LED | ExcelitasTechnologies | Led light source | |
| Z -Drift Compensator (ZDC) | Olympus | infrared focus check |
References
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