Summary
该协议描述了从小鼠模型颅神经峰细胞的解剖和培养，主要用于研究细胞迁移。我们描述了使用的实时成像技术，并分析了速度和细胞形状的变化。
Abstract
在过去的几十年里，用于模仿人类病理的转基因小鼠模型已经增加。然而，研究细胞运动和体内分化的能力仍然非常困难。神经神经神经病变，或神经峰系紊乱，是特别具有挑战性的研究，因为缺乏关键胚胎阶段的可及性，并难以分离出神经峰的中位体从相邻的中皮性中生。在这里，我们着手为原发性颅神经峰细胞的培养建立一个定义明确的常规协议。在我们的方法中，我们剖析了初始神经峰诱导阶段小鼠神经板边界。神经板边界区域被种植和培养。神经峰细胞形成在围绕神经板边界的上皮片中，在外植后24小时开始分层，经历上皮-中位体过渡（EMT），成为完全可活动的神经峰细胞。由于我们的二维培养方法，不同的组织群体（神经板与预迁移和迁移神经峰）很容易区分。然后，使用实时成像方法，我们可以识别神经峰诱导、EMT 和迁移行为的变化。该技术与基因突变体的结合将是理解正常和病理神经峰细胞生物学的一个非常有力的方法。
Introduction
神经峰（NC）系系是一种瞬态、多能和迁移的细胞群，在胚胎发育早期只出现在脊椎动物中1，2。神经峰衍生物是极其多样化的，包括胶质，平滑肌，黑色素细胞，神经元和颅骨和软骨3，4。由于神经峰有助于许多器官系统的功能，这种血统是人类胚胎生成的关键。异常NC发展涉及广泛的最常见的人类先天缺陷（即唇裂和唇裂）5，以及诸如赫希斯普龙氏病（HSCR）、沃登斯堡综合征（WS）、CHARGE综合征和威廉姆斯综合征6等疾病。 ，7，8，9.
NC开发已经在许多非哺乳动物模型系统中进行了探索，包括异种鱼、小鸡和斑马鱼模型。在哺乳动物中，小鼠模型的工作已经确定了神经峰发育背后的一些关键遗传事件;然而，由于小鼠胚胎无法进入，遵循神经峰迁移的细胞生物学变得更加困难（在其它部分10，11）。此外，虽然对小鸡、Xenopus和斑马鱼的研究已经建立了NC的基因调控网络，但这些动物模型中功能丧失的研究有时在小鼠中没有表现出类似的表型。例如，在Xenopus，斑马鱼和小鸡，非规范的Wnt信号是细胞机制之一，允许NC获得其迁移能力12，13，14，15.然而，在鼠标，非规范的Wnt信号丢失似乎不会影响迁移16。由于在体内NC迁移在小鼠中长期难以跟踪，因此不清楚这些物种差异是否反映了不同的迁徙模式，或分子调控的差异。
如上所述，对小鼠的NC研究一直非常具有挑战性，因为胚胎的子宫外培养非常费力。此外，NC 经常与相邻组织（如中皮和神经病）保持密切接触。最近使用神经峰特异性Cre驱动器或外源染料使我们能够荧光标记迁移NC;然而，这些方法仍然有限。尽管多个报告描述了不同的技术来可视化NC迁移17，18，但很难将这些技术解析为一个简单的常规过程。
显然，需要能够处理和鉴定哺乳动物NC的技术。我们专注于小鼠颅内NC，因为它是研究人类颅面发育和神经神经病变的主要模型。我们根据描述NC细胞19、20、21等主要培养的有趣报告来完善我们的方法。在这里，我们彻底描述了用于切除原NC细胞的最佳培养技术。我们演示了活细胞成像方法，以及不同基质涂覆培养板的最佳应用。我们的协议描述了如何使用倒置显微镜捕获活NC细胞的迁移，该显微镜旨在作为与其他显微镜一起使用的指南，以及我们细胞分析的详细摘要。
植物外移的预期结果应该是在显微镜下清晰分辨的细胞分布，在那里可以看到三个不同的细胞群，它们代表（i）神经板，（ii）预迁移，和（iii）迁移神经峰细胞。我们演示了如何分析上皮-中位过渡期间细胞前迁移群体边界的细胞行为。我们还致力于研究细胞速度、距离和细胞形态的完全迁移细胞。
Protocol
所有动物工作都经过伦敦国王学院道德审查流程的道德审查，并根据英国内政部项目许可证 P8D5E2773 （KJL） 进行。
1. 试剂制备
- 准备一般溶液和工具，包括无菌磷酸盐缓冲盐 （PBS）、70% 乙醇、解剖工具（钳子和解剖刀片或无菌针头）、塑料板或玻璃玻片，涂有市售的细胞外基质（）基于ECM）的水凝胶或纤维质（参见材料表）和神经峰介质（见下文）。
- 使用 Dulbecco 的改性 Eagle 培养基培养基培养基培养基（DMEM，4500 mg/L 葡萄糖）、15% 胎儿牛血清 （FBS）、0.1 mM 最小必需介质非必需氨基酸 （MEM NEAA 100X）、1 mM 焦化钠、55 μM β-美尔卡托乙醇、100单位/mL青霉素，100单位/mL链霉素，和2 mM L-谷氨酰胺。
- 使用生长抑制的STO进料细胞21调节介质过夜。
- 制备STO细胞（见材料表）介质，以含有10%FBS和100U/mL青霉素、100 U/mL链霉素补充剂的DMEM。在涂有0.1%明胶的25厘米2瓶中，生长和扩大STO细胞汇合。应用5000 rad的伽马辐照。
- 将大约 3 x 106生长抑制细胞播种到 10 厘米2盘或 25 厘米2烧瓶上（从步骤 1.2.1.1）。加入大约10~12 mL的神经峰基底介质，并在一夜之间孵育。
注：种子细胞可用于产生条件培养基长达10天。定期检查细胞的外观
- 过滤介质（0.22 μm孔径），并补充25纳克/mL基本成纤维细胞生长因子（bFGF）和1000 U的白血病抑制剂因子（LIF）。
注：储存在4°C，并在一个月内使用或在-20°C储存，并在3个月内使用。
- 使用生长抑制的STO进料细胞21调节介质过夜。
- 用细胞外基质涂覆组织培养表面。
注：根据所问的生物问题，基质可以涂覆在玻璃底培养皿、塑料组织培养皿或玻璃盖滑片上。有关基于基质基板的不同基于 ECM 的水凝胶稀释，请参阅下文。Fibronectin 已在玻璃底盘上进行了测试，并且仅在下面指定的浓度下盖滑。在此，我们将基板涂层表面称为"涂层板"。- 用基于ECM的水凝胶涂覆组织培养表面。
注：通过冷却介质或保持冰上，使基板保持冷却，直到电镀。- 在4°C下解冻水凝胶过夜。在 DMEM 中将 5 mL 的 10% FBS 添加到 5 mL 的水凝胶中，最终体积为 10 mL（参见材料表）。
- 使 0.5⁄1 mL 等分表示方便，并储存在 -20°C。
- 在冰上解冻水凝胶等分物。
- 使用 1：20 稀释水凝胶管用来涂覆塑料。
- 使用水凝胶库存的 1：5 稀释来涂覆玻璃玻片和玻璃底组织培养板。
注：在冷DMEM 中稀释水凝胶。 - 在板/滑板上涂抹足够的稀释水凝胶，覆盖所需区域，并在 37°C 下孵育 30-45 分钟。
- 立即使用涂层板/滑轨，或在 4°C 处将涂布的幻灯片存放过夜。
- 使用前，请去除过量，用高葡萄糖 DMEM（可选）冲洗幻灯片。
- 用纤维化肌覆盖组织培养表面。
- 制作1mg/mL纤维素库存溶液的等分，储存在-80°C。稀释纤维素与Dulbecco的PBS（dPBS）到最终浓度为1μg/mL。
- 涂抹足够的纤维化，覆盖所需区域，并在室温下孵育15分钟。
- 去除残留的纤维化，让玻璃干燥30-45分钟。
- 使用前，使用高葡萄糖 DMEM（可选）冲洗井或盖滑。
- 用基于ECM的水凝胶涂覆组织培养表面。
2. 第1天：早期索米特阶段胚胎的解剖
注：使用无菌工具和无菌溶液。如果需要基因分型，收集胚胎的身体进行DNA提取。
- 颅神经板的解剖仅限于胚胎在8.5天后（dpc）。在5~8个胚接阶段选择胚胎。将子宫分解成PBS，切开中体以分离每个胚胎（图1A）。子宫的肌肉壁收缩和二元组织将变得可见（图1B）。
注：在冰冷的PBS中保持子宫内胚胎，同时进行一次一个胚胎的解剖。用玻璃巴斯德移液器将胚胎移入新鲜无菌PBS，以提高可见度并减少污染。 - 在肌肉层和二元组织之间滑动钳子，用第二对钳子去除肌肉层（图1C）。
- 使用钳子，刺穿斜极边缘的二分体，并用第二对钳子撕裂，垂直地打开极点。
- 用钳子剥回二元组织，使赖歇特的膜可视化。
- 小心地取出赖歇特的膜。内脏蛋黄囊变得可见，胚胎可以看到内部 （图1D）。
- 取出内脏蛋黄囊和羊圈（图1E），并放置胚胎，以可视化头部褶皱（图1F）。
- 将头部折叠在心脏上方，使用钳子和/或睫毛工具刮去底层的中皮，以获得干净的神经板 （NP）（图 1H）。
注： NP 可以保持整体或向下分离前方轴，以便每侧可以单独镀。神经板边界可以进一步修剪远离神经板，以尽量减少神经元对外植的贡献。 - 使用玻璃巴斯德移液器将解剖的神经板转移到装有条件神经波峰介质的水凝胶涂层盘中。
- 轻轻旋转盘子，将 NP 置于井中间。这对最大化活细胞成像的相位质量非常重要（第 2 天）。
- 在 5% CO2中，在 37°C 下孵育过夜（或到所需时间点）。神经峰细胞应该明显从神经板迁移出来。
注：细胞通常在6~8小时内附着。在外植附加后，留出更多时间可视化迁移细胞。通常到24小时后，我们可以找到三个可区分的细胞群。第一个种群，在植物的中央，是神经板（NP）。第二个总体，即迁移前NC（pNC），在细胞的上皮片中环绕NP。第三个种群，在外环，由迁徙NC（mNC）组成，其大小较大，并且完全处于等位（图2）。
3. 第2天：鼠颅神经峰细胞的活细胞成像
注：成像应在24小时后进行切除，以最佳图像和量化神经峰细胞迁移。在活细胞成像之前，不需要刷新NC感应介质。需要使用倒置显微镜，带有电动舞台和内部环境室。使用适合成像的多井组织培养皿（材料表）。
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显微镜设置
- 将环境室设置为 37°C 和 5% CO2。
- 将一个孔插入组织培养板盖盖，让CO2针连接到CO2加湿室，坐在板内。
- 将组织培养皿放入试样支架中，并胶带向下胶带盖板盖和 CO2针，以防止在多孔采集过程中晃动。
- 打开显微镜控制器、舞台控制器和成像软件。
- 以 10 倍放大倍率聚焦颅内数控细胞（在冷凝器中选择匹配相位环）。
- 通过调整显微镜设置手册中指定的场虹膜膜片、光圈虹膜膜和居心望远镜，在显微镜上设置高质量的相位对比。
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相对比活细胞成像
- 设置将保存延时文件的目录或文件位置。
- 设置曝光时间、装箱和摄像机区域。
- 设置时间点数、成像持续时间和帧之间的时间间隔。
- 要量化NC细胞移位能力，将显微镜设置为10倍放大倍率，每5分钟取1帧（18小时多217个时间点）。要量化细胞形态，将放大倍率设置为 40 倍，取 1 帧/分钟（1 h 以上 61 个时间点）。要量化层压动力学，将放大倍率设置为 40 倍或 60 倍放大倍率，每 10 秒（超过 10 分钟）拍摄 1 帧。
- 对于多井成像，设置机械级以在选定的 XY 感兴趣位置之间移动。确认颅内NC细胞处于焦点，并且阶段位置正确。
- 使用"获取"命令开始延时成像。
- 完成延时成像后，查看多维数据并导出 .stk 文件进行分析。
注：.stk 是一个 TIFF 堆栈文件。 - 退出软件，关闭计算机并关闭舞台、相机和显微镜控制器。
4. 成像分析：神经峰细胞迁移的定量
注：为了更好地定义迁移小鼠颅神经峰细胞所表现出的细胞行为，我们分析了一系列可量化的迁移参数，特别是迁移能力和细胞形状动力学。（1）迁移（累积距离）是像元 （μm） 获取的总路径长度;（2）迁移（欧氏距离）是单元（μm）初始位置和最终位置之间的直线距离;（3）迁移（细胞速度）是按单位时间（μm/min）的细胞行驶距离;（4）细胞形状（细胞面积）是细胞覆盖的总表面。根据成像显微镜将像素设置为微米刻度。（A =px x Npx，其中 Apx = 像素面积和 Npx = 像素数。单位： μm2;（5）细胞形状（细胞圆度）是细胞形状与完美圆的偏差，由 A = 面积和 P = 周长的圆度值 1.0 （4°（A/P2）表示。
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单细胞跟踪
注： 要测量 NC 细胞迁移，将生成所有延时帧中单个单元的 XY 坐标。这允许后续分析细胞迁移的距离、速度和持久性测量。- 打开 ImageJ 并将数据导入为 TIFF 堆栈文件。
- 单击分析 |设置缩放以根据显微镜设置校准 .stk 文件，以像素/μm 为单位工作。
- 单击插件 |跟踪 |手动跟踪打开图像J手动细胞跟踪插件。要开始单元格跟踪，请选择"添加轨道"。
- 使用细胞核作为参考点，跟踪所有延时电影帧的细胞。
注：每个外植细胞应跟踪10~20个细胞，共跟踪60个细胞（n = 3）。在延时过程中经历细胞分裂的细胞应排除在分析之外。 - 将结果保存并导出为 .csv 文件。结果表示所有帧上的各个单元格轨道编号、切片编号和 XY 坐标。
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神经峰细胞迁移能力的定量
- 打开单个单元格跟踪数据（见上文）。将 .csv 文件转换为 .txt 文件格式。
- 打开迁移软件（材料表）。单击"导入数据"选项卡以将单元格跟踪数据作为 .txt 文件导入。
- 数据集下|初始化，选择要分析的切片或帧数，并设置 XY 校准和帧之间的时间间隔。选择"应用设置"以保存设置。
- 选择"绘图数据"符号以形成轨迹图。选择"统计"符号以量化距离和速度度量。
- 将轨迹图另存为位图 （.bmp） 文件，将距离和速度度量另存为 .txt 文件。选择"删除数据"符号。对其他延时文件重复上述步骤。
注： 轨迹图可用于可视化给定细胞条件或延时电影过程中状态的单个细胞路径的定向（图4A）。存储在 .txt 文件中的距离和速度数据可用于进一步分析。
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神经峰细胞面积和循环的定量
- 在 ImageJ 中打开延时 .stk 文件，并根据显微镜设置进行校准，以像素/μm 为单位工作。
- 下分析 |设置测量，单击以选择单元格形状参数：单元格区域、周长和形状描述符。
- 使用手绘选择工具，使用细胞膜边界作为参考，手动绘制每个细胞。
- 按键盘上的Ctrl + B键，以保持图像上的单元格轮廓。在每个延时帧上重复单元格。
- 使用图像 |叠加 |到 ROI 管理器来存储值。
- 概述了每个帧的所有感兴趣的单元格后，单击"测量"。将结果另存为 .csv 文件。
注：应勾勒出每部影片中10~20个细胞，每个条件（n = 3）总共分析30~60个细胞。细胞形状数据（.csv文件）可用于量化细胞形状动力学如何随时间变化（图4C），或形态在不同细胞处理下如何改变。
Representative Results
利用这里演示的程序，从子宫中解剖小鼠胚胎，并取出胚胎外组织（图1A+D）。胚胎被分期化（仅使用5-8个索米特（ss）的胚胎，图1E，F）。颅神经板随后被解剖，神经皮质被分离。被识别为松散、圆形、中位细胞的中皮细胞被轻轻刷掉（图1G-L）。前神经板可以整体外植，在这种情况下，神经峰组织将横向出现，并在外植周围径向扩张，或者每个神经板边框（右和左）可以单独外植。这在从基因突变体中切除时特别有用。
在24小时内，可以清楚地看到神经板外植周围的一个区域预迁移（上皮）颅神经峰（图2B）。此外，神经峰细胞的亚群经历了上皮到中位过渡，并出现完全的中位（图2）。因此，我们有几个不同细胞的同心环，中心有神经板（NP），中间圆中预迁移神经峰（pNC），外环中迁移神经峰（mNC）群（图2B）。为了追踪NC细胞，可以使用转基因小鼠模型，如图2C所示。在这种情况下，我们使用神经波峰特定的Wnt1：：Cre;RosamTmG，它导致NC细胞被标记为绿色。在这些小鼠中，细胞表达膜番茄（mT，红色），除非它们表达克雷重组酶。重组导致细胞表达膜绿色荧光蛋白（GFP，绿色）。在外植中心显示的红色细胞是神经板细胞。一些背神经板细胞也表达GFP;对于长期培养，我们会切除中心中的所有细胞。就我们而言，植物的纯度足以跟踪不同的神经峰细胞群。当需要更高的神经峰纯度时，这种基因标记策略可以与荧光活细胞分拣（FACS）相结合，以确保种群的纯度。或者，可以修复外植，并识别抗体标签的NC总体。
24小时也很明显，植物外培养物预迁移和完全迁移NC细胞的特征同心环不依赖或受矩阵选择控制（图3）。在ECM基水凝胶和纤维素上镀层的外植培养物形成了可比的外植结构，包括三个细胞群，NP，pNC和mNC（图3A，C）。神经峰细胞形态在ECM水凝胶和纤维素上镀层细胞形态也比较（图3B，D）。然而，在纤维素上镀的外植植物在细胞前缘产生具有更突出的拉梅利波迪亚的细胞，在迁移方向上似乎更加极化（图3B，D）。
一旦迁移神经峰细胞的种群明显，活细胞成像就可以完成。延时显微镜设置为 10 倍放大倍率（18 小时，1 帧/5 分钟），以便后续分析 NC 细胞迁移（图 4A）。ImageJ 手动跟踪插件在延时影片的所有帧上生成各个单元的 XY 坐标（图4B）。可以使用迁移软件处理这些坐标。该软件支持可视化单个细胞轨道随时间（图4B），并可用于量化累积和欧氏距离，以及细胞速度。
延时成像数据还提供了大量有关颅神经峰细胞迁移过程中的细胞形态的信息（图4C）。通过概述单个细胞膜、细胞面积和周长测量，可以从电影的所有帧中计算（图4C）。这些测量允许随后量化细胞面积和圆度（图4D）。图4C显示了对18 h细胞形状变化的分析。 请注意，随着细胞从外植株中迁移，细胞面积显著增加，而细胞循环保持相对稳定（单向方差分析，图基的多重比较测试） （图 4E，F.这表明，当细胞离开上皮边缘并失去细胞-细胞接触时，它们显示细胞扩散面积增加。细胞循环措施没有随时间而显著变化;但是，如果量化了增加的时间点数，则循环性的短期变化可能会有所变化。细胞循环测量还可以提供有趣的数据，在存在化学战术提示或有限条件下的细胞形状动力学。
图1：从e8.5胚胎中分离颅神经峰。
图像是从记录微解剖技术的视频中的静止图像。（A+C）从子宫中解剖胚胎。（B+C）使用两个锋利的钳子，轻轻地拉开肌肉层。面板（D）显示内脏蛋黄囊内的胚胎（黄线）。从内脏蛋黄囊中提取胚胎。（E）胚胎在阶段8.5横向的横向视图。（F）阶段8.5的胚胎的背观。计数，以确定胚胎的年龄;通常 5-8 ss（F 中的黄色圆圈）。（G）近距离观察胚胎的颅部区域。从颅内区域去除胚胎外膜;索米特用黄线标记。（H）前神经板的解剖在第一分支拱（黄线）下进行。（一）前神经板解剖的横向视图。神经褶皱，神经波峰细胞出现的地方，用黄线标记。（J+L）在将NP电镀到准备好的培养皿上之前，尽可能去除前神经褶皱的中皮组织（蓬松的中位细胞）。电影是使用立体显微镜拍摄的，其变焦为3.0倍，采用宽场异色透镜（见材料表）。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：毛里颅神经峰外泄。
（A） e8.5 小鼠胚胎背视图的图解表示。胚胎的颅部区域在虚线处被切割。神经板边界（以红色突出显示）与周围的中皮组织隔离，并培养24小时，使颅神经峰迁移。《图解》改编自22日，23日。（B）左图：电镀24小时后颅神经峰的代表性明亮场图像。观察三个细胞群，在右侧也进行图式化。NP = 神经板，pNC = 迁移前神经峰和 mNC = 移位神经峰。刻度条 = 250 μm。（C）基因标记小鼠的外植的放大倍率图像（Wnt1：：cre;罗莎mTmG）没有 Cre 驱动器的细胞以红色表示膜番茄 （mT）。在神经峰特异性Wnt1启动子的控制下，Cre的表达导致mT盒的切除和膜GFP（mG）在绿色中的表达。核被霍希特（蓝色）弄脏了。刻度条 = 200 μm.（D+D'）表达膜 GFP （D） 的迁移细胞放大倍率图像。（D'）脱氧核糖核酸（DNA）标有霍希特（蓝色）。（D''）D 和 D'的合并。比例尺 = 20 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：不同基材培养的外植。
（A+B）在商业ECM-水凝胶上培养的外植相对比图像。（C+D）在1μg/mL纤维化辛上培养的外植。神经板 （NP）、预迁移 （pNC） 和迁移 （mNC） 神经峰细胞可以通过它们不同的细胞形态来区分。刻度条 = 100 μm。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：颅神经峰细胞迁移和细胞形状动力学的量化。
（A）使用ImageJ/Fiji手动细胞跟踪插件插件，对覆盖在单个神经波峰细胞轨道的外植培养物进行延时成像的相对比帧。10个代表性的mNC细胞被手动跟踪超过18小时（217帧）和XY坐标导出。数据表示为叠加点和线图。细胞在1μg/mL纤维化辛上镀。刻度条 = 200 μm。（B）使用迁移软件生成的 10 个 mNC 单元的代表性轨迹图。（C）从植物外延分析中获取的相位对比帧。虚线轮廓 8 代表性的移位神经峰细胞分析细胞形状动力学时，镀在 1 μg/mL 纤维素。刻度条 = 200 μm。（D）用于量化细胞面积和圆周的计算的原理表示。原理图的细胞形态是以蓝色（C）突出显示的细胞的细胞形态。px = 像素面积，Npx = 像素数，A = 面积，P = 周长（1 像素 = 1.60772 μm2）。（E+F）细胞面积的定量和细胞循环测量随时间的。数据表示均值 = SEM。每个点表示一个单元 （n = 60），取自 3 个独立实验，并在 0 h、 6 h、12 h 和 18 h（ns 非显著性，= p<0.05， = p < 0.0001 单向方差分析，图基的多重比较测试）下进行分析。请点击此处查看此图的较大版本。
Discussion
由于哺乳动物发育的子宫性质，研究哺乳动物神经峰细胞一直是科学家面临的挑战。体内研究很难建立，因为胚胎必须在模仿子宫生命的条件下进行操作。在实践中，几乎不可能将这些（E8+）胚胎的再培养时间超过24小时，尤其是活成像。此外，神经峰诱导和迁移与小鼠神经管闭合和胚胎转动同时发生;这是一个关键和紧张的形态遗传事件，当胚胎在子宫外培养时，它常常失败。因此，子宫外方法的成功率一般较低。使用永生NC细胞21是减少动物使用的有用工具，它可以为长期分析、转染和富集研究提供更好的神经峰细胞来源。然而，显然需要可靠地培养原发神经峰细胞。我们的方法适用于小鼠敲除或有条件的遗传模型。对于其他神经峰群20，已经描述了一种与我们类似的方法。然而，我们的方法彻底描述了鼠颅NC细胞的分步分离。我们还详细介绍了不同矩阵的使用以及迁移分析过程。
为了达到一致的结果，我们发现在选择胚胎时特别注意分期。毫不奇怪，在颅控NC发育中，索米特的数量与不同的阶段相关。因此，在获取任何实验数据之前，胚胎解剖学的知识是非常重要的。然后，这种方法可以适应分离神经峰细胞的离散群体，这取决于生物学问题和目标细胞。
一旦选择和解剖胚胎，中皮细胞就很容易区分，应该去除，以便更好的可视化和减少污染。对于长期培养，神经板组织可以在24小时电镀时被去除，以防止神经组织污染。进一步改进可能是使用荧光系标记（例如，使用Wnt1：：：cre或Sox10：：：creERT驱动器与荧光报告器24、 25） 来区分神经峰细胞和其他组织如图2C所示。
以前的报告强调了电镀小鼠 NC 在不同基质上培养物的潜力，最常见的是商业 ECM 水凝胶、纤维蛋白和胶原蛋白 I20,21,26.在我们手中，小鼠颅内NC外植培养物在所有三个基质上成功生长，浓度在原始报告中指定（未显示数据）。我们适应NC外植培养的最初精制方法使用商业水凝胶作为首选矩阵，主要由层宁和胶原蛋白组成21(图 3A+B).然而，这种水凝胶的组成没有明确定义，生长因子和蛋白质含量未知。因此，我们自此改变了在纤维内丁上电镀小鼠 NC 外植培养物的方法（图 3C_D).纤维质在 NC 细胞迁移的 ECM 和基底膜中定义良好且高度表达in vivo28,29,30.为了优化纤维素基质，最好复制使用水凝胶看到的神经峰细胞迁移和形态，我们比较了水凝胶上表现出的NC细胞行为与0.25–30 μg/mL纤维素的滴定，并定义1μg/mL纤维素作为提供理想属性（未显示数据）。我们认为，这一初步工作可能有助于建立一个框架，系统地比较基质，如纤维蛋白，与那些前面描述，即胶原蛋白和拉米宁32,33,34.将小鼠NC细胞在纤维素与胶原蛋白I上的迁移能力进行比较会特别有趣，因为胶原蛋白-IA1是由小鼠、鸟类和人类NC细胞内分泌的28,30,31,32.因此，胶原蛋白I与纤维蛋白一样，在矩阵选择的考虑中一样相关。还值得承认，不同基质成分可能会改变介质中生长因子的生物利用度，特别是考虑到我们的介质血清含量高。为了克服这一点，我们目前正在努力生产无血清定义的培养条件。这些定义的培养基在多能干细胞领域的神经峰诱导协议中被成功应用，但需要进一步优化我们的NC外植培养系统33,34.我们的工作也可以作为一个起点，为其他类型的NC细胞，如心脏和躯干NC，以及后续的NC分化研究改善条件。最重要的是，该协议允许分离颅内NC细胞，适用于各种应用。我们设想对定向迁移、三维迁移和入侵进行研究。以这种方式分离的细胞可以治疗in vitro用于多种分析。例如，细胞可以很容易地使用不同的小分子来靶向特定蛋白质，它们可以在规定的时间点进行治疗，冲洗实验可以设计以确定细胞行为的恢复（图 4).转染和分化检测的长期培养是可能的，以及细胞的通过（未显示的数据）。然而，细胞更新的可行性、容量和多能性应在通过后得到验证。玻璃盖玻片上镀的细胞也可用于免疫荧光染色方案，随后进行实时成像。最后，这种方法代表了一个极其强大的系统，用于研究从基因小鼠模型迁移NC22,23,24,25.
Disclosures
作者没有利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢伦敦国王学院生物服务股，特别是蒂芙尼·贾维斯和林西·卡什内拉的继续支持。我们感谢德里克·斯坦普尔、马莫鲁·石井和罗伯特·马克森在初步建立该协议期间提供试剂方面的建议和帮助。我们感谢德赫拉伊·塔希姆对STO细胞伽马辐照的帮助。我们感谢刘和克劳斯实验室，特别是汤米·帕莱特的大力支持。这项工作由BBSRC（BB/R015953/1至KJL/MK）的资助，来自MRC博士培训方案（LD）、纽兰·佩德利基金（ALM）和KRIPIS II，研究和技术总秘书处、教育和宗教部的资助。事务，希腊和圣基金会（SGGM）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bFGF | R&D systems | 233-FB | |
| b-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Tissue culture flasks | Corning | 430639 | 25cm2 culture flasks |
| DMEM (4500 mg/L glucose) | Sigma | D5671 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (dPBS) | Sigma | D8537 | |
| Ethanol | Fisher Chemicals | E/0650DF/C17 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | TFS AA 10-155 | |
| Fetal Bovine Serum (ES Cell FBS) | Gibco | 26140079/16141-079 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9382 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Glass-bottomed, multi-well 24-well tissue culture plate | Ibidi | 82406 | Glass-bottomed, No 1.5, 24-well tissue culture dish with black sides |
| Cell migration analysis tool | Ibidi | v2.0 | Manuals for this software can be found at: https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html. |
| Circularity Plug-in | ImageJ | v1.29 or later | The circularity plug-in is an extended version of ImageJ/Fiji’s Measure command, designed by Rasband, W., (2000) (wsr@nih.gov). |
| LIF | ESGRO by Millipore | ESG1106 | |
| Manual Cell Tracking Plug-in | ImageJ | v1.34k or later | ref Cordelieres F. Institut Curie, Orsay (France) 2005 |
| Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
| MEM non-essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-050 | |
| Matrigel (ECM-based Hydrogel) | Corning | 356234 | |
| Microscope | Olympus | 1X81 | Olympus 1X81 inverted microscope |
| Microscope camera | Photometrics | 512B | Photometrics Cascadell 512B camera (4x UPlanFL N, 10x UPlanFL N, 20x UPlanFL N, 40x UPlanFL N objectives) |
| Microscope controller | Olympus | 1X2-UCB | Olympus 1X2-UCB microscope controller |
| Microscope temperature controller | Solent Scientific | RS232 | Maintained at 37°C |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | A5955 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Statistics software | Graphpad Prism | v7.0 | |
| STO feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ | |
| XY microscope stage controller | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MS-4400 |
References
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