Summary
Denne protokollen beskriver disseksjon og kulturen i skallen nevrale kam celler fra musemodeller, primært for studiet av celle migrasjon. Vi beskriver Live Imaging teknikker som brukes og analyse av hastighet og celle formendringer.
Abstract
I løpet av de siste ti årene har det vært en økt tilgjengelighet av genmodifiserte musemodeller brukes til å etterligne menneskelige patologi. Men evnen til å studere celle bevegelser og differensiering in vivo er fortsatt svært vanskelig. Neurocristopathies, eller lidelser av Neural Crest avstamning, er spesielt utfordrende å studere på grunn av mangel på tilgjengelighet av viktige embryonale stadier og vanskelighetene i å skille ut neural Crest mesenchyme fra tilstøtende mesodermal mesenchyme. Her har vi satt ut for å etablere en veldefinert, rutine protokoll for kulturen av primære skallen neural Crest celler. I vår tilnærming vi analysere ut musen neural plate grensen under den første neural Crest induksjon scenen. Den nevrale plate grensen regionen er eksplanterte og kultivert. Den neural Crest celler danner i et epitel ark rundt nevrale plate grensen, og ved 24 h etter explant, begynner å delaminate, gjennomgår en epitel-mesenchymal overgang (EMT) for å bli fullt aktive neural Crest celler. På grunn av vår to-dimensjonal dyrking tilnærming, kan den distinkte vev populasjoner (nevrale plate versus premigratory og trekk neural Crest) være lett skilles. Ved hjelp av Live Imaging tilnærminger, kan vi deretter identifisere endringer i neural Crest induksjon, EMT og trekk atferd. Kombinasjonen av denne teknikken med genetisk mutanter vil være en svært kraftig tilnærming for å forstå normal og patologisk neural Crest cellebiologi.
Introduction
The neural Crest (NC) avstamning er en forbigående, Multipotent og trekk befolkning av celler som vises utelukkende i virveldyr under tidlig embryoutvikling1,2. Neural Crest derivater er svært mangfoldig, og inkluderer glia, glatt muskel, melanocytter, neurons og kraniofacial bein og brusk3,4. Fordi neural Crest bidrar til funksjonen til mange organsystemer, er denne avstamning avgjørende for menneskelig embryogenesis. Avvikende NC utvikling er innblandet i et bredt spekter av de vanligste menneskelige fødselsskader (dvs. leppe og ganespalte)5, og også lidelser som Hirschsprung ' s sykdom (HSCR), Wardensburg syndrom (WS), charge syndrom og Williams syndrom6 ,7,8,9.
NC utvikling har blitt utforsket i en rekke ikke-pattedyr modellsystemer inkludert Xenopus, chick og sebrafisk modeller. I pattedyr, arbeid i mus modeller har identifisert noen av de viktigste genetiske hendelser underliggende neural Crest utvikling; men det har vært vanskeligere å følge cellen biologi av Neural Crest migrasjon, på grunn av utilgjengelighet av musen embryo (anmeldt andre steder10,11). Videre, mens studier i chick, Xenopus og sebrafisk har etablert et gen regulatoriske nettverk for NC, tap av funksjons studier i disse dyremodeller noen ganger ikke viser en sammenlignbar fenotype i musen. For eksempel, i Xenopus, sebrafisk og Chick, ikke-kanoniske wnt signalering er en av de cellulære mekanismer som gjør at NC å erverve sin trekk kapasitet12,13,14,15 . Men i musen, tap av ikke-kanoniske wnt signalering ser ikke ut til å påvirke migrasjon16. Som in vivo NC Migration har vært vanskelig å spore i lange perioder med musen, er det uklart om disse artene-forskjellene reflekterer ulike moduser av migrasjon, eller forskjeller i molekylær regulering.
Som bemerket, NC studier i musen har vært svært utfordrende fordi ex Utero kulturen av embryo er arbeidskrevende. Videre er NC konstant i intim kontakt med tilstøtende vev som mesoderm og neurectoderm. Nyere bruk av Neural Crest-spesifikke grobunn drivere eller eksogene fargestoffer har tillatt oss å fluorescensmerkete etiketten den vandrende NC; Imidlertid er disse tilnærmingene fortsatt begrenset. Til tross for flere rapporter som beskriver ulike teknikker for å visualisere NC migrasjon17,18, har det vært vanskelig å løse disse teknikkene i en enkel og rutinemessig prosedyre.
Det er klart at det er behov for teknikker som tillater håndtering og karakterisering av pattedyr NC. Vi fokuserte vår innsats på musen skallen NC som det er den primære modellen for å studere menneskelig kraniofacial utvikling og neurocristopathies. Vi har forbedret tilnærmingen vår basert på flere interessante rapporter som beskriver primær kulturen i NC-cellene19,20,21. Her beskriver vi grundig de optimale kultur teknikkene for explanting primære NC-celler. Vi demonstrerer Live Cell imaging metode og optimal bruk av ulike matriser til coat kulturen platene. Vår protokoll beskriver hvordan å fange migrering av levende NC celler ved hjelp av en invertert mikroskop, som er ment som en retningslinje for bruk med andre mikroskop, samt en detaljert oppsummering av våre cellulære analyser.
Det forventede resultatet fra explant bør være et vakkert anlagt fordeling av celler som er klart skilles under mikroskopet, hvor man kan se tre forskjellige populasjoner av celler som representerer (i) nevrale plate, (II) premigratory, og, (III) trekk neural Crest celler. Vi viser hvordan å analysere cellen atferd på grensen av premigratory befolkning av celler under epitel-mesenchymal overgangen. Vi har også fokusert vår innsats på å studere fullt trekk celler for cellehastighet, avstand og celle morfologi.
Protocol
Alle dyr arbeid har gjennomgått etisk godkjennelse av King ' s College London etisk gjennomgang Process og ble utført i samsvar med UK Home Office Project License P8D5E2773 (KJL).
1. tilberedning av reagenser
- Forbered generelle løsninger og verktøy, inkludert steril fosfat buffer saltvann (PBS), 70% etanol, disseksjon verktøy (pinsett og disseksjon kniver eller sterile nåler), plast plater eller glass lysbilder belagt med en kommersielt tilgjengelig ekstracellulære matrise ( ECM)-basert hydrogel eller fibronektin (se tabell over materialer), og neural Crest Media (se nedenfor).
- Forbered nevrale Crest basal medium ved hjelp Dulbecco ' s modifiserte Eagle ' s medium (DMEM, 4500 mg/L glukose), 15% fosterets storfe serum (FBS), 0,1 mM minimum essensielle middels unødvendige aminosyrer (MEM NEAA 100), 1 mM natrium pyruvat, 55 μM β-mercaptoethanol, 100 enheter/mL penicillin, 100 enheter/mL Streptomycin, og 2 mM L-glutamin.
- Tilstand mediene over natten ved hjelp av vekst-hemmet STO mater celler21.
- Forbered STO-celler (se materialfortegnelsen) for å inneholde DMEM supplert med 10% FBS og 100 u/ml penicillin, 100 U/ml Streptomycin. Vokse og utvide STO celler til samløpet i 25 cm2 flasker belagt med 0,1% gelatin. Påfør 5000 rad av gamma bestråling.
- Seed ca 3 x 106 vekst-hemmet celler på en 10 cm2 parabol eller 25 cm2 kolbe (fra trinn 1.2.1.1). Tilsett ca 10-12 mL av Neural Crest basal medium og ruge over natten.
Merk: seeded celler kan brukes til å produsere betinget medium i opptil 10 dager. Sjekk utseendet av celler regelmessig
- Filtrer mediet (0,22 μm pore størrelse), og supplere med 25 ng/mL grunnleggende Fibroblast vekstfaktor (bFGF) og 1000 U av leukemi inhibitor faktor (LIF).
Merk: oppbevares ved 4 ° c og brukes innen en måned eller oppbevares ved-20 ° c og brukes innen 3 måneder.
- Tilstand mediene over natten ved hjelp av vekst-hemmet STO mater celler21.
- Coat vevet kulturen overflater med ekstracellulære matrise.
Merk: avhengig av biologiske spørsmålet blir spurt, kan matrisen være belagt på glassbunn kultur retter, plast vev kultur retter eller glass deksel slips. Se nedenfor for ulike ECM-baserte hydrogel fortynninger avhengig av matrisen substrat. Fibronektin har blitt testet på glassbunn retter og deksel slips bare ved konsentrasjoner angitt nedenfor. Her vil vi henvise til substrat belagte overflater som "belagte plater".- Coat vevet kulturen overflater med ECM basert hydrogel.
Merk: Hold underlaget kaldt til plating, enten ved avkjøling av Media eller holde på isen.- Tin hydrogel ved 4 ° c over natten. Tilsett 5 mL 10% FBS i DMEM til 5 mL hydrogel for et endelig volum på 10 mL (se tabell over materialer).
- Lag 0,5 – 1 mL alikvoter som praktisk og oppbevar ved-20 ° c.
- Tin hydrogel alikvoter på is.
- Bruk en 1:20 fortynning av hydrogel lager til pels plast.
- Bruk en 1:5 fortynning av hydrogel lager til coat glass lysbilder og glassbunn vev kultur plater.
Merk: fortynne hydrogel i kaldt DMEM. - Påfør nok fortynnede hydrogel for å dekke det ønskede området på plater/sklier og ruge i 30 – 45 min ved 37 ° c.
- Bruk belagte plater/lysbilder umiddelbart eller lagre belagte lysbilder ved 4 ° c over natten.
- Fjern utskeielser og skyll lysbilder med høy glukose DMEM (valgfritt) før bruk.
- Coat vevet kulturen overflater med fibronektin.
- Lag alikvoter på 1 mg/mL fibronektin lagerløsning og oppbevar ved-80 ° c. Fortynne fibronektin med Dulbecco ' s PBS (dPBS) til en endelig konsentrasjon på 1 μg/mL.
- Påfør tilstrekkelig fibronektin for å dekke ønsket område og ruge ved romtemperatur i 15 min.
- Fjern rester av fibronektin og la glasset tørke i 30-45 min.
- Skyll brønner eller dekk sedler med høy glukose DMEM (valgfritt) før bruk.
- Coat vevet kulturen overflater med ECM basert hydrogel.
2. dag 1: Disseksjon av tidlig somite etappe embryo
Merk: Bruk sterile verktøy og sterile løsninger. Hvis genotyperingteknologi er nødvendig, samle liket av fosteret for DNA-ekstraksjon.
- Disseksjon av skallen neural plate er begrenset til embryo på 8,5 dager etter coitum (DPC). Velg embryo på somite-scenen på 5 – 8. Analysere livmoren i PBS og kutt mesometrium å skille hvert embryo (figur 1a). Den muskuløse veggen av livmoren kontrakter og decidual vev vil bli synlig (figur 1B).
Merk: Oppretthold embryo i livmoren i iskald PBS mens dissections utføres ett embryo om gangen. Flytte embryo med et glass Pasteur-pipette i frisk, steril PBS for å forbedre synligheten og redusere forurensning. - Slide tang mellom muskel lag og decidual vev og fjerne muskel lag med en andre par tang (figur 1C).
- Ved hjelp av tang, Pierce den deciduum på kantene av mesometrial Pol og med en andre par tang rive for å åpne vinkelrett til stangen.
- Vipp av decidual vevet med pinsett for å visualisere Reichert membran.
- Fjern Reichert membran nøye. The visceral eggeplomme SAC blir synlig og fosteret kan sees inne (figur 1d).
- Fjern visceral eggeplomme og amnion (figur 1e) og plasser fosteret for å visualisere hodet fold (figur 1F).
- Skjær hodet fold over hjertet og skrape bort den underliggende mesoderm bruker pinsett og/eller øyenvippe verktøy for å få en ren nevrale plate (NP) (figur 1h).
Merk: NP kan holdes hele eller delt ned anteroposterior aksen slik at hver side kan være belagt individuelt. Den nevrale plate grensen kan bli ytterligere trimmet bort fra nevrale plate for å minimere neuronal bidrag til explants. - Bruk et glass Pasteur pipette å overføre dissekert nevrale plate på en hydrogel parabol fylt med conditioned neural Crest Media.
- Forsiktig virvel parabolen å plassere NP i midten av brønnen. Dette er viktig for å maksimere fase kvaliteten for Live-celle Imaging (på dag 2).
- Ruge over natten (eller til ønsket tids punkt) ved 37 ° c i 5% CO2. Neural Crest celler bør være synlig migrerer ut av nevrale plate.
Merk: cellene festes vanligvis innen 6 – 8 timer. Etter explant festes, gi mer tid til å visualisere migrere celler. Vanligvis ved 24 h post explant, kan vi finne tre gjenkjennelige populasjoner av celler. Den første befolkningen, i sentrum av explant, er nevrale plate (NP). Den andre populasjonen, premigratory NC (pNC), omgir NP i et epitel ark med celler. Den tredje populasjonen, i utsiden ringen, er dannet av trekk NC (mNC), som er større i størrelse, og vises fullt mesenchymal (figur 2).
3. dag 2: Live celle avbildning av murine skallen nevrale kam celler
Merk: Imaging bør utføres ved 24 h post explanting til optimalt bilde og kvantifisere neural Crest celle migrasjon. NC induksjon Media trenger ikke å bli oppdatert før Live celle Imaging. Tilgang til et omvendt mikroskop, med en motorisert scene og et innarbeidet miljøkammer er nødvendig. Bruk multi-godt vev kultur retter egnet for Imaging (tabell av materialer).
-
Oppsett av mikroskop
- Sett miljøkammeret ved 37 ° c og 5% CO2.
- Pierce et hull i lokket på vevet kultur plate lokket for å tillate CO2 nål, koblet til co2 fukting kammer, å sitte i platen.
- Plasser vevet kultur rett i prøve holderen og tape ned plate lokket og CO2 nål for å hindre risting under multi-brønn oppkjøp.
- Slå på mikroskop kontrolleren, scene kontrolleren og bildebehandlingsprogrammet.
- Fokuser på skallen NC cellene på 10x forstørrelse (med matchende fase ring i kondensatoren valgt).
- Sett høy kvalitet fase-kontrast på mikroskopet ved å justere feltet Iris membran, blenderåpning Iris membran og sentrering teleskop, som angitt i mikroskopet satt opp manualen.
-
Fase kontrast levende celle bilde
- Angi mappen eller filplasseringen der tids forløps filene skal lagres.
- Angi eksponeringstid, binning og kamera område.
- Angi antall tids punkt, varighet for bildebehandling og tidsintervall mellom rammer.
- Hvis du vil beregne kapasitet for NC-celler, setter du mikroskopet til 10x forstørrelse, tar 1 bilde hver 5 min (217 ganger over 18 timer). For å kvantifisere celle morfologi, sett forstørrelse til 40x, ta 1 ramme/min (61 tid punkter over 1 time). Å kvantifisere lamellipodial dynamikk, sette forstørrelsen å 40x eller 60x forstørrelsen, tar 1 rammen enhver 10 s (over 10 min).
- For multi-Well Imaging, sette den mekaniske scenen for å flytte mellom utvalgte XY posisjoner av interesse. Bekreft at skallen NC cellene er i fokus og scenen stillingene er riktige.
- Bruk kommandoen Hent for å starte tidsforløp avbildning.
- Når tidsforløp avbildning er fullført, kan du se gjennom de flerdimensjonale dataene og eksportere. stk-filer for analyse.
Merk: stk er en TIFF stack-fil. - Avslutt programvaren, slå av datamaskinen og slå av scenen, kamera og mikroskop kontrollere.
4. Imaging analyse: kvantifisering av Neural Crest celle migrasjon
Merk: for å bedre definere mobilnettet atferd utstilt ved å migrere murine skallen nevrale kam celler, har vi analysert en rekke målbare trekk parametre, spesielt med fokus på vandrende kapasitet og celle form dynamikk. (1) migrasjon (akkumulert distanse) er den totale banelengden som er tatt av cellen (μm); (2) migrasjon (euklidsk avstand) er den lineære avstanden mellom første og siste posisjon i cellen (μm); (3) migrering (cellehastighet) er tilbakelagt distanse for celle per tidsenhet (μm/min); (4) celle form (celleområde) er den totale overflaten som dekkes av cellen. Angi piksel til mikron skala i henhold til bilde mikroskop. (A = Apx x Npx, der enpx = pixel området og Npx = antall piksler. Enheter: μm2; (5) celle form (celle sirkularitet) er avviket av celle form fra en perfekt sirkel som indikeres av en sirkularitet verdi på 1,0 (4Π (a/P2)) der a = areal og P = perimeter.
-
Enkel celle sporing
Merk: for å måle NC-celle migrering genereres XY-koordinater for enkeltceller på tvers av alle tidsforløp RAM mer. Dette gir mulighet for påfølgende analyse av avstand, hastighet og utholdenhet tiltak av celle migrasjon.- Åpne ImageJ og Importer data som TIFF stack-filer.
- Klikk analyser | Angi skalering for å kalibrere. stk-filer i henhold til mikroskop innstillingene, som arbeider i Pixel/μm.
- Klikk plugins | Sporing | Manuell sporing for å åpne image J manuell celle sporing plugin. Hvis du vil starte celle sporing, velger du Legg til spor.
- Spor celler gjennom alle rammer av tidsforløp filmer, ved hjelp av kjernen som et referansepunkt.
Merk: 10 – 20 celler skal spores per explant, og totalt 60 celler spores (n = 3). Celler som gjennomgår celledeling i løpet av tidsforløp, bør utelukkes fra analysen. - Lagre og Eksporter resultatene som en CSV-fil. Resultatene representerer individuelle celle spornummer, Slice-nummer og XY-koordinater over alle rammer.
-
Kvantifisering av nerve våpen celle trekk kapasitet
- Åpne enkelt celle sporingsdata (se ovenfor). Konvertere CSV-filer til txt-filformat.
- Åpne migrerings programvaren ( innholdsfortegnelsen). Klikk kategorien Importer data for å importere celle sporingsdata som en txt-fil.
- Under datasett | Initialisering, velger du antall skiver eller rammer som skal analyseres, og angi XY-kalibrering og tidsintervall mellom rammer. Velg Bruk Innstillinger for å lagre innstillingene.
- Velg plott data -symbolet for å danne bane plott. Velg statistikk symbol for å kvantifisere avstands-og hastighets mål.
- Lagre banen plott som bitmap (. bmp) filer, og avstand og hastighet tiltak som. txt-filer. Velg Fjern data -symbolet. Gjenta for andre tidsforløp filer.
Merk: bane plott kan brukes til å visualisere direkthet av individuelle celle baner for en gitt celle tilstand eller tilstand i løpet av tidsforløp filmer (figur 4a). Avstand og fart data lagret inne det. txt fil-størrelse kanne så bli brukt for fremme analyse.
-
Kvantifisering av nevrale kam celleområde og sirkularitet
- Åpne time-lapse. stk filer i ImageJ og kalibrere i henhold til mikroskop innstillinger, arbeider i Pixel/μm.
- Under analyser | Angi mål, klikk for å velge celle figur parametere: celleområde, perimeter og figur beskrivelse.
- Bruk verktøyet for fri hånds markering til å tegne rundt hver celle manuelt ved hjelp av grenser for celle membran som en hjelpelinje.
- Trykk CTRL + B taster på tastaturet for å opprettholde celle disposisjonen overlain på bildet. Gjenta for celler over hver ramme for tidsforløp.
- Bruk bildet | Overlegg | Til ROI Manager for å lagre verdiene.
- Når alle celler av interesse per ramme er skissert, klikker du mål. Lagre resultatene som en CSV-fil.
Merk: 10 – 20 celler per film skal være skissert, med totalt 30 – 60 celler analysert per betingelse (n = 3). Celle figurdata (CSV-filer) kan brukes til å kvantifisere hvordan dynamikken i celle figuren endres over tid (figur 4c), eller hvordan morfologi kan endres under forskjellige celle behandlinger.
Representative Results
Ved hjelp av prosedyren demonstrert her, mus embryo ble dissekert fra livmoren, og extraembryonic vev ble fjernet (figur 1A-D). Embryo ble somite iscenesatt (med bare embryo ved 5 – 8 somites (SS), figur 1E, F). Skallen neural plate ble så dissekert og neuroepithelium ble isolert. Mesodermal celler, identifisert som løse, sirkulære, mesenchymal celler, ble forsiktig børstet av (figur 1G-L). Den fremre nevrale plate kan være eksplanterte helhet, og da nevrale Crest vevet vil dukke sideveis og utvide radielt rundt explant, eller hver nevrale plate grensen (høyre og venstre) kan eksplanterte separat. Dette er spesielt nyttig når explanting fra genetisk mutanter.
Innen 24 h, en region av premigratory (epitel) skallen neural Crest kan tydelig ses rundt neural plate explant (figur 2b). Videre har en pasientpopulasjonen av nevrale kam celler gjennomgått epitel til mesenchymal overgang og vises fullt mesenchymal (figur 2). Dermed har vi flere konsentriske ringer av distinkte celler, med nevrale plate (NP) i midten, premigratory neural Crest (pNC) i den mellomliggende sirkelen, og en befolkning på trekk neural Crest (mNC) i utsiden ringen (figur 2b). For å spore NC-celler, er det mulig å bruke genmodifiserte musemodeller som vi viser i figur 2C. I dette tilfellet har vi brukt neural Crest spesifikke Wnt1:: grobunn; RosamTmG som resulterer i NC celler blir merket i grønt. I disse musene, celler uttrykke membran tomat (mT, i rødt) med mindre de uttrykker grobunn recombinase. Rekombinasjon fører til celler som uttrykker membran grønt fluorescerende protein (GFP, i grønt). De røde cellene som vises i midten av explant er nevrale plate celler. Noen rygg nevrale plate celler uttrykker også GFP; for langsiktig kultur, ville vi avgiftsdirektoratet alle cellene i sentrum. For vårt formål er renheten av explant tilstrekkelig til å spore de ulike nevrale Crest celle populasjoner. Der høyere renhet av Neural Crest er nødvendig, kan denne genetiske merkings strategien kombineres med fluorescerende aktivert celle sortering (FACS) for å sikre renhet av befolkningen. Alternativt er det mulig å feste explants og identifisere NC-populasjonen med antistoff merking.
Det var også tydelig av 24 h at de karakteristiske konsentriske ringene av premigratory og fullt trekk NC celler av explant kulturer ikke var avhengig eller styrt av Matrix valg (Figur 3). Explant kulturer belagt på både en ECM-basert hydrogel og fibronektin dannet sammenlignbare Explant strukturer, bestående av tre celle populasjoner, NP, pNC og mNC (Figur 3A, C). Neural Crest celle morfologi var også sammenlignbare mellom de belagt på ECM-baserte hydrogel og fibronektin (Figur 3B, D). Men explants belagt på fibronektin produserte celler med mer fremtredende lamellipodia på cellen forkanten, tilsynelatende mer polarisert i retning av migrasjon (Figur 3B, D).
Når en befolkning på trekk neural Crest celler er tydelig, kan Live celle Imaging være ferdig. Time-lapse mikroskopi er satt til 10x forstørrelse (18 t, 1 Frame/5 min) for senere analyse av NC celle migrasjon (figur 4a). ImageJ manuell sporing plug-in genererer XY koordinater for individuelle celler over alle rammer av tidsforløp filmer (figur 4b). Disse koordinatene kan behandles ved hjelp av migrerings programvaren. Denne programvaren gjør det mulig visualisering av individuelle celle spor over tid (figur 4b) og kan brukes til å kvantifisere akkumulert og euklidsk avstand, samt cellehastighet.
Time-lapse Imaging data gir også et vell av informasjon om celle morfologi under migrering av skallen nevrale kam celler (figur 4c). Ved å skissere individuelle cellemembraner, kan celle areal og perimeter målinger beregnes fra alle bilder av filmene (figur 4c). Disse målingene tillater den påfølgende kvantifisering av celle areal og sirkularitet (figur 4d). Figur 4c viser en analyse av celle figur endringer over 18 h. Legg merke til at når celler migrerer bort fra explant, øker celleområdet betydelig mens celle sirkularitet forblir relativt konstant (enveis Anova, Tukey flere sammenligninger test) ( Figur 4E,F). Dette tyder på at som celler avviker fra epitel kanten og mister celle-celle kontakter, viser de økt celle spredt område. Celle sirkularitet tiltak endret seg ikke vesentlig over tid. kortsiktige endringer i sirkularitet kan imidlertid sees hvis et økt antall tids punkter er kvantifisert. Cell sirkularitet tiltak kan også gi interessante data på celle form dynamikk i nærvær av en chemotactic stikkordet eller under trange forhold.
Figur 1: isolering av skallen neural Crest explants fra en e 8.5 embryo.
Bildene er stillbilder fra en video som dokumenterer mikro-disseksjon teknikk. (A – C) Disseksjon av embryo fra livmoren. (B – C) Ved hjelp av to skarpe pinsett, dra forsiktig fra hverandre muskellaget. Panel (D) viser embryo inne i visceral eggeplomme sac (gul linje). Pakk ut fosteret fra visceral eggeplomme SAC. (E) lateral utsikt over fosteret på scenen 8,5 lateral. (F) rygg syn på fosteret på scenen 8,5. Count somites (SS) for å bestemme alderen på embryo; vanligvis 5 – 8 ss (gule sirkler i F). (G) nærbilde se på skallen regionen på fosteret. Fjern extraembryonic membraner fra skallen regionen; somites er merket med en gul linje. (H) dissections av fremre nevrale plate utføres under den første brankialcyste buen (gul linje). (I) lateral visning av fremre nevrale plate disseksjon. Neural folder, hvor neural Crest celler oppstår, er merket med en gul linje. (J – L) Fjern mesodermal vev (fluffy mesenchymal celler) underliggende fremre neural folder så mye som mulig før plating NP på forberedt kultur retter. Filmen ble tatt ved hjelp av et stereo-mikroskop med en widefield apochromatic linse på 3,0 X zoom (se tabell over materialer). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: murine skallen neural Crest explant.
(A) skjematisk fremstilling av rygg syn på en e 8.5-mus embryo. Skallen regionen av fosteret er kuttet på den stiplede linjen. Den nevrale plate grensen (uthevet i rødt) er isolert fra omkringliggende mesoderm vev og kultivert for 24 h å la skallen neural Crest til å emigrere. Skjematisk tilpasset fra22,23. (B) venstre: representant lyse feltet bilde av en skallen neural Crest explant 24 timer etter plating. Tre populasjoner av celler er observert, som også er Schematized til høyre. NP = neural plate, pNC = pre-trekk neural Crest og mNC = trekk neural Crest. Scale bar = 250 μm. (C) høyere forstørrelse bilder av en explant fra genetisk merket mus (Wnt1:: grobunn; RosamTmG). Celler uten den grobunn sjåføren uttrykke membran tomat (mT) i rødt. Uttrykk for grobunn under kontroll av en neural Crest spesifikke Wnt1 promoter fører til fjerning av mT kassetten og uttrykk for membran GFP (mG) i grønt. Kjerner er farget med Hoescht (i blått). Scale bar = 200 μm. (d-d ' ') høyere forstørrelse bilder av trekk celler uttrykker membran GFP (D). (D') DNA er merket med Hoescht (blå). (D') Sammenslåing av D og D '. Scale bar = 20 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Explants kultivert på forskjellige underlag.
(A – B) Fase kontrast bilder av explants kultivert på kommersielle ECM-hydrogel. (C – D) Explants kultivert på 1 μg/mL fibronektin. Neural plate (NP), premigratory (pNC) og trekk (mNC) nevrale kam celler kan skilles av deres forskjellige celle morfologier. Scale bar = 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: kvantifisering av skallen nevrale Crest celle migrasjon og celle form dynamikk.
(A) fase-kontrast rammer fra time-lapse Imaging av explant kulturer kledde med enkelt nevrale Crest celle spor, ved hjelp av ImageJ/Fiji manuell celle sporing plug-in. ti representative mNC celler ble manuelt sporet over 18 t (217 rammer) og XY koordinatene ble eksportert. Data representeres som et overleggs punkt og linje plott. Celler ble belagt på 1 μg/mL fibronektin. Scale bar = 200 μm. (B) representative bane tomten på 10 mNC celler, generert ved hjelp av migrasjon programvare. (C) fase kontrast RAM mer tatt fra tidsforløp analyse av explant kulturer. Stiplede linjer omriss 8 representative trekk nevrale kam celler analysert for celle form dynamikk når belagt på 1 μg/mL fibronektin. Scale bar = 200 μm. (D) skjematisk fremstilling av beregningene som brukes til å kvantifisere celle areal og sirkularitet. Celle morfologi av skjematisk er at av cellen uthevet i blått (C). Apx = pixel området, Npx = pixel nummer, A = område, P = perimeter (1 piksel = 1,60772 μm2). (E – F) Kvantifisering av celleområdet og celle sirkularitet måler over tid. Data representerer gjennomsnittlig ± SEM. Hver prikk representerer en celle (n = 60), Hentet fra 3 uavhengige eksperimenter, og analysert ved 0 h, 6 h, 12 h og 18 h (ns ikke-signifikante, * p < 0,05, * * * * p < 0,0001 enveis ANOVA, Tukey ' s Multiple sammenligninger test). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Discussion
Studere pattedyr nevrale kam celler har vært en utfordring for forskere på grunn av i Utero natur pattedyr utvikling. In vivo studier er vanskelig å sette opp, som fosteret må manipuleres under forhold som etterligner livet i livmoren. I praksis er det nesten umulig å reproduserbar kulturen disse (E8 +) embryo i lengre enn 24 timer, spesielt for Live Imaging. Videre neural Crest induksjon og migrasjon skjer samtidig med neural tube nedleggelse og embryonale snu i musen; Dette er en viktig og stressende Morfogenetiske hendelse, som ofte svikter når embryo er kultivert ex Utero. Dermed er suksessen rate av ex Utero tilnærminger generelt lav. Bruken av udødeliggjort NC celler21 er et nyttig redskap for å redusere dyr bruk og det kan gi en bedre kilde til neural Crest celler for langsiktig analyse, transfeksjoner, og berikelse studier. Men det er helt klart et behov for å pålitelig kultur primære neural Crest celler. Vår metode gjelder for musen Knock-Out eller betingede genetiske modeller. En sammenlignbar metode til vår har blitt beskrevet for andre neural Crest bestander20; men vår metode beskriver grundig trinn-for-trinn isolering av murine skallen NC celler. Vi beskriver også bruken av ulike matriser samt migrasjon analyse prosedyre i detalj.
For å oppnå konsistente resultater, fant vi at spesiell oppmerksomhet mot staging under valg av embryo. Ikke overraskende antall somites samsvarer med ulike stadier i skallen NC utvikling. Derfor er kunnskapen om embryo anatomi svært viktig før du anskaffer noen eksperimentelle data. Denne tilnærmingen kan deretter tilpasses mot å isolere diskrete populasjoner av nevrale kam celler, avhengig av det biologiske spørsmålet og målcellene.
Når embryo er valgt og dissekert, mesodermal celler kan lett skilles og bør fjernes for å tillate bedre visualisering og for å redusere forurensning. For langsiktige kulturer, kan neural plate vev fjernes ved 24 h av plating for å hindre forurensning av nevrale vev. En ytterligere raffinement kan være bruk av fluorescerende avstamning merking (for eksempel ved hjelp av en Wnt1:: grobunn eller Sox10:: creERT drivere kombinert med fluorescerende journalister24,25) for å skille neural Crest celler fra annet vev som vist i figur 2C.
Tidligere rapporter har fremhevet potensialet i plating mus NC explant kulturer på ulike matriser, oftest på kommersielle ECM hydrogeler, fibronektin og kollagen jeg20,21,26. I våre hender, mus skallen NC explant kulturer er med hell vokst på alle tre matriser, i konsentrasjoner spesifisert i opprinnelige rapporter (data ikke vist). Den første raffinerte tilnærmingen vi tilpasset for våre NC explant kulturer brukte en kommersiell hydrogel som matrise av valget, som hovedsakelig besto av laminin og kollagen21(Figur 3A – B). Sammensetningen av denne hydrogel er imidlertid ikke klart definert, med ukjent vekstfaktor og proteininnhold. Som sådan har vi siden flyttet vår tilnærming til plating mus NC explant kulturer på fibronektin (Figur 3C-D). Fibronektin er godt definert og svært uttrykt i ECM og kjeller membraner langs hvilke NC celler migrerein vivo28,29,30. For å optimalisere en fibronektin matrise som best replikerer nevrale kam celle migrasjon og morfologi sett ved hjelp av hydrogel, sammenlignet vi NC celle atferd utstilt på hydrogel mot en titrering av 0,25-30 μg/mL fibronektin, og definert 1 μg/mL fibronektin som gir ideelle egenskaper (data ikke vist). Vi tror at dette foreløpige arbeidet kan bidra til å etablere et rammeverk for systematisk sammenligning av matriser, slik som fibronektin, mot de som tidligere er beskrevet, nemlig kollagen og laminin32,33,34. Det ville være spesielt interessant å sammenligne musen NC celle trekk kapasitet på fibronektin versus kollagen jeg, gitt at kollagen-IA1 er endogenously utskilles av mus, avian og menneskelige NC celler28,30,31,32. Kollagen jeg er derfor så relevant som fibronektin i hensynet til matrisen valg. Det er også verdt å erkjenne at biotilgjengeligheten av vekstfaktorer i Media kan endres av ulike matrise komponenter, spesielt på grunn av høyt serum innhold av våre medier. For å overkomme dette jobber vi for tiden med å produsere serum frie definerte kultur forhold. Disse definerte medier er med hell brukes i neural Crest induksjon protokoller i pluripotent stilk cellen feltet, men krever ytterligere optimalisering for våre NC explant kultur system33,34. Vårt arbeid kan også fungere som et utgangspunkt for raffinering forhold til andre typer NC celler som CARDIAC og trunk NC, og for senere studier av NC differensiering. Viktigst, tillater denne protokollen isolering av skallen NC celler for en rekke applikasjoner. Vi ser for oss studier på styrt migrasjon, 3-D migrasjon og invasjon. Celler isolert på denne måten kan behandlesin vitrofor en rekke analyser. Celler kan for eksempel lett behandles ved hjelp av forskjellige små molekyler for å målrette mot bestemte proteiner, de kan behandles på definerte tids punkt, og bleke eksperimenter kan utformes for å fastslå gjenoppretting av celle atferd (Figur 4). Lengre sikt kultur for transfeksjoner og differensiering analyser er mulig, samt passasje av celler (data ikke vist). Imidlertid bør levedyktigheten, kapasiteten på cellefornyelse og multipotency valideres etter passaging. Celler belagt på glass coverslips kan også brukes i immunofluorescent farging protokoller, etter Live Imaging. Til slutt, representerer denne tilnærmingen et enormt kraftig system for å studere migrasjon av NC fra genetiske musemodeller22,23,24,25.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
Vi er takknemlige til King ' s College London Biological Services Unit, spesielt Tiffany Jarvis og Lynsey Cashnella for deres fortsatte støtte. Vi takker Derek stemple, Mamoru Ishii og Robert Riise for råd og hjelp med reagenser under innledende etablering av denne protokollen. Vi takker Dheraj Taheem for hjelp med gamma-bestråling av STO celler. Vi takker Liu og Krause Labs, spesielt Tommy Pallet, for god støtte. Dette arbeidet ble finansiert av tilskudd fra BBSRC (BB/R015953/1 til KJL/MK), en studentship fra MRC doktorgrads opplæringsprogram (LD), newland Pedley Fund (ALM) og KRIPIS II, General sekretariatet for forskning og teknologi (GSRT), utdannings-og religions departementet Hellas og Fondation santé (til SGGM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bFGF | R&D systems | 233-FB | |
| b-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Tissue culture flasks | Corning | 430639 | 25cm2 culture flasks |
| DMEM (4500 mg/L glucose) | Sigma | D5671 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (dPBS) | Sigma | D8537 | |
| Ethanol | Fisher Chemicals | E/0650DF/C17 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | TFS AA 10-155 | |
| Fetal Bovine Serum (ES Cell FBS) | Gibco | 26140079/16141-079 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9382 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Glass-bottomed, multi-well 24-well tissue culture plate | Ibidi | 82406 | Glass-bottomed, No 1.5, 24-well tissue culture dish with black sides |
| Cell migration analysis tool | Ibidi | v2.0 | Manuals for this software can be found at: https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html. |
| Circularity Plug-in | ImageJ | v1.29 or later | The circularity plug-in is an extended version of ImageJ/Fiji’s Measure command, designed by Rasband, W., (2000) (wsr@nih.gov). |
| LIF | ESGRO by Millipore | ESG1106 | |
| Manual Cell Tracking Plug-in | ImageJ | v1.34k or later | ref Cordelieres F. Institut Curie, Orsay (France) 2005 |
| Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
| MEM non-essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-050 | |
| Matrigel (ECM-based Hydrogel) | Corning | 356234 | |
| Microscope | Olympus | 1X81 | Olympus 1X81 inverted microscope |
| Microscope camera | Photometrics | 512B | Photometrics Cascadell 512B camera (4x UPlanFL N, 10x UPlanFL N, 20x UPlanFL N, 40x UPlanFL N objectives) |
| Microscope controller | Olympus | 1X2-UCB | Olympus 1X2-UCB microscope controller |
| Microscope temperature controller | Solent Scientific | RS232 | Maintained at 37°C |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | A5955 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Statistics software | Graphpad Prism | v7.0 | |
| STO feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ | |
| XY microscope stage controller | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MS-4400 |
References
- Duband, J. L. Diversity in the molecular and cellular strategies of epithelium-to-mesenchyme transitions: Insights from the neural crest. Cell Adhesion & Migration. 4, 458-482 (2010).
- Mayor, R., Carmona-Fontaine, C. Keeping in touch with contact inhibition of locomotion. Trends in Cell Biology. 20, 319-328 (2010).
- Le Douarin, N., Kalcheim, C. The neural crest. 2nd edn. , Cambridge University Press. (1999).
- Trainor, P. A. Neural Crest Cells : Evolution, Development, and Disease. , Academic Press. (2014).
- Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: morphogenetic and molecular mechanisms. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 1152-1166 (2006).
- Ahola, J. A., et al. Increased incidence of Hirschsprung's disease in patients with hypoplastic left heart syndrome--a common neural crest-derived etiology? Journal of Pediatric Surgery. 44, 1396-1400 (2009).
- Bajpai, R., et al. CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation. Nature. 463, 958-962 (2010).
- Inoue, K., et al. Congenital hypomyelinating neuropathy, central dysmyelination, and Waardenburg-Hirschsprung disease: phenotypes linked by SOX10 mutation. Annals of Neurology. 52, 836-842 (2002).
- Kim, H., Kang, K., Ekram, M. B., Roh, T. Y., Kim, J. Aebp2 as an epigenetic regulator for neural crest cells. PloS one. 6, e25174 (2011).
- Barriga, E. H., Trainor, P. A., Bronner, M., Mayor, R. Animal models for studying neural crest development: is the mouse different? Development. 142, 1555-1560 (2015).
- Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: an overview. Developmental Biology. 366, 2-9 (2012).
- De Calisto, J., Araya, C., Marchant, L., Riaz, C. F., Mayor, R. Essential role of non-canonical Wnt signalling in neural crest migration. Development. 132, 2587-2597 (2005).
- Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456, 957-961 (2008).
- Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135, 1771-1780 (2008).
- Banerjee, S., et al. A novel role for MuSK and non-canonical Wnt signaling during segmental neural crest cell migration. Development. 138, 3287-3296 (2011).
- Pryor, S. E., et al. Vangl-dependent planar cell polarity signalling is not required for neural crest migration in mammals. Development. 141, 3153-3158 (2014).
- Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Vital dye analysis of cranial neural crest cell migration in the mouse embryo. Development. 116, 297-307 (1992).
- Kawakami, M., Umeda, M., Nakagata, N., Takeo, T., Yamamura, K. Novel migrating mouse neural crest cell assay system utilizing P0-Cre/EGFP fluorescent time-lapse imaging. BMC Developmental Biology. 11, 68 (2011).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Etchevers, H. Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells. Nature protocols. 6, 1568-1577 (2011).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21, 3069-3080 (2012).
- Gonzalez Malagon, S. G., Liu, K. J. ALK and GSK3: Shared Features of Neuroblastoma and Neural Crest Cells. Journal of Experimental Neuroscience. 12, 1179069518792499 (2018).
- Gonzalez Malagon, S. G., et al. Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus. Nature Communications. 9, 1126 (2018).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology : CB. 8, 1323-1326 (1998).
- Laranjeira, C., et al. Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury. Journal of Clinical Investigation. 121, 3412-3424 (2011).
- Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and culture of neural crest cells from embryonic murine neural tube. Journal Of Visualized Experiments : JoVE. , e4134 (2012).
- Sternberg, J., Kimber, S. J. The relationship between emerging neural crest cells and basement membranes in the trunk of the mouse embryo: a TEM and immunocytochemical study. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 98, 251-268 (1986).
- Sternberg, J., Kimber, S. J. Distribution of fibronectin, laminin and entactin in the environment of migrating neural crest cells in early mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 91, 267-282 (1986).
- George, E. L., Georges-Labouesse, E. N., Patel-King, R. S., Rayburn, H., Hynes, R. O. Defects in mesoderm, neural tube and vascular development in mouse embryos lacking fibronectin. Development. 119, 1079-1091 (1993).
- Henderson, D. J., Copp, A. J. Role of the extracellular matrix in neural crest cell migration. Journal of Anatomy. 191 (Pt 4), 507-515 (1997).
- Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Human Molecular Genetics. 17 (21), 3411-3425 (2008).
- Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Hewitt, T. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Developmental Biology. 87 (2), 259-266 (1981).
- Leung, A. W., et al. WNT/β-catenin signaling mediates human neural crest induction via a pre-neural border intermediate. Development. 143 (3), 398-410 (2016).
- Zhu, Q., Lu, Q., Gao, R., Cao, T. Prospect of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Crest Stem Cells in Clinical Application. Stem Cells International. 2016, 7695836 (2016).
