Summary
Dit protocol beschrijft de dissectie en de cultuur van craniale neurale Crest cellen van muismodellen, voornamelijk voor de studie van de Celmigratie. We beschrijven de gebruikte technieken voor Live Imaging en de analyse van veranderingen in snelheid en celvorm.
Abstract
In de afgelopen decennia is er een toegenomen beschikbaarheid van genetisch gemodificeerde Muismodellen die worden gebruikt om menselijke pathologieën na te bootsen. Het vermogen om celbewegingen en differentiatie in vivo te bestuderen is echter nog steeds erg moeilijk. Neurocristopathies, of aandoeningen van de neurale Crest lineage, zijn bijzonder uitdagend om te studeren als gevolg van een gebrek aan toegankelijkheid van de belangrijkste embryonale stadia en de moeilijkheden bij het scheiden van de neurale kuif mesenchym van aangrenzende mesodermale mesenchym. Hier hebben we een goed gedefinieerd, routine protocol opgesteld voor de cultuur van primaire craniale neurale Crest-cellen. In onze aanpak ontleden we de rand van de muis neurale plaat tijdens de initiële neurale Crest inductiefase. Het grensgebied van de neurale plaat is explanted en gekweekt. De neurale Crest cellen vormen in een epitheliale plaat rond de grens van de neurale plaat, en door 24 h na explant, beginnen te delamineren, ondergaat een epitheliale-mesenchymale overgang (EMT) om volledig beweeglijke neurale Crest cellen geworden. Door onze tweedimensionale kweek benadering kunnen de afzonderlijke weefsel populaties (neurale plaat versus premigrerend en migrerend neurale embleem) gemakkelijk worden onderscheiden. Met behulp van Live Imaging benaderingen, kunnen we vervolgens identificeren veranderingen in neurale Crest inductie, EMT en migratie gedrag. De combinatie van deze techniek met genetische mutanten zal een zeer krachtige benadering zijn voor het begrijpen van normale en pathologische neurale Crest celbiologie.
Introduction
De neurale Crest (NC) Lineage is een voorbijgaande, multipotente en migrerende populatie van cellen die uitsluitend voorkomt in gewervelde dieren tijdens de vroege embryonale ontwikkeling1,2. Neurale Crest derivaten zijn zeer divers, en omvatten glia, gladde spieren, melanocyten, neuronen en craniofaciale bot en kraakbeen3,4. Omdat de neurale kam bijdraagt aan de functie van veel orgel systemen, is deze afstamming essentieel voor menselijke embryogenese. Aberrant NC ontwikkeling is betrokken bij een breed scala van de meest voorkomende menselijke aangeboren afwijkingen (d.w.z. gespleten lip en gehemelte)5, en ook aandoeningen zoals de ziekte van Hirschsprung (hscr), Wardensburg SYNDROOM (WS), Charge Syndrome en Williams Syndrome6 ,7,8,9.
NC ontwikkeling is onderzocht in een aantal niet-zoogdier modelsystemen, waaronder Xenopus, Chick en zebravis modellen. In zoogdieren, werk in muismodellen heeft geïdentificeerd enkele van de belangrijkste genetische voorvallen onderliggende neurale Crest ontwikkeling; echter, het is moeilijker om de celbiologie van neurale Crest migratie volgen, als gevolg van de ontoegankelijkheid van de muis embryo (herzien elders10,11). Bovendien, terwijl studies in Chick, Xenopus en zebravis een genregulerend netwerk voor NC hebben opgericht, vertonen verlies van functie studies in deze diermodellen soms geen vergelijkbaar fenotype in de muis. Bijvoorbeeld, in xenopus, zebravis en Chick, niet-canonieke WNT signalering is een van de cellulaire mechanismen die het mogelijk maakt de NC te verwerven van de migratie capaciteit12,13,14,15 . Echter, in de muis, verlies van niet-canonieke WNT signalering lijkt niet te beïnvloeden migratie16. Zoals in vivo NC migratie is moeilijk te volgen voor lange perioden in de muis, het is onduidelijk of deze soorten verschillen weerspiegelen verschillende vormen van migratie, of verschillen in de moleculaire regulering.
Zoals opgemerkt, NC studies in muis zijn zeer uitdagend, omdat de ex-utero cultuur van embryo's is bewerkelijk. Bovendien is de NC voortdurend in intiem contact met aangrenzende weefsels zoals mesoderm en neurectoderm. Recent gebruik van neurale Crest-specifieke CRE -Stuurprogramma's of exogene kleurstoffen heeft ons de mogelijkheid gelaten de migratie-NC te laten labelen; deze benaderingen zijn echter nog steeds beperkt. Ondanks meerdere rapporten waarin verschillende technieken worden beschreven om de NC-migratie te visualiseren17,18, is het moeilijk om deze technieken op te lossen in een eenvoudige en routinematige procedure.
Het is duidelijk dat er behoefte is aan technieken die de hantering en karakterisering van zoogdier NC mogelijk maken. We richtten onze inspanningen op de muis craniale NC omdat het het primaire model is voor het bestuderen van menselijke craniofaciale ontwikkeling en neurocristopathies. We hebben onze aanpak verfijnd op basis van verschillende interessante rapporten waarin de primaire cultuur van NC-cellen19,20,21wordt beschreven. Hier beschrijven we grondig de optimale cultuur technieken voor het explanteren van primaire NC-cellen. We demonstreren de Live Cell imaging-methode en het optimale gebruik van verschillende matrices om de cultuur platen te Coat. Ons protocol beschrijft hoe de migratie van levende NC-cellen wordt vastgelegd met behulp van een omgekeerde Microscoop, die bedoeld is als richtsnoer voor gebruik met andere microscopen, evenals een gedetailleerde samenvatting van onze cellulaire analyses.
Het verwachte resultaat van de explant moet een prachtig aangelegde verdeling zijn van cellen die duidelijk worden onderscheiden onder de Microscoop, waarbij men drie verschillende populaties cellen kan zien die (i) neurale plaat vertegenwoordigen, (II) voortrek kende, en, (III) migratie neurale Crest cellen. We laten zien hoe het Celgedrag aan de grens van de migratie populatie van cellen wordt geanalyseerd tijdens de epitheel-mesenchymale overgang. We concentreerden ons ook op het bestuderen van volledig migrerende cellen voor celsnelheid, afstand en celmorfologie.
Protocol
Alle dieren werk heeft een ethische goedkeuring ondergaan door het King's College London ethische review proces en werd uitgevoerd in overeenstemming met UK Home Office Project License P8D5E2773 (KJL).
1. bereiding van de reagentia
- Bereid algemene oplossingen en gereedschappen voor met inbegrip van steriele fosfaatbuffer Saline (PBS), 70% ethanol, dissectie gereedschappen (Tang en dissectie bladen of steriele naalden), kunststof platen of glaasjes bekleed met een in de handel verkrijgbare extracellulaire matrix ( Op ECM) gebaseerde hydrogel of fibronectine (Zie de tabel met materialen) en neurale Crest-media (zie hieronder).
- Bereid de neurale Crest basal medium met behulp van Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM, 4500 mg/L glucose), 15% foetaal runderserum (FBS), 0,1 mM minimaal essentieel medium niet-essentiële aminozuren (MEM NEAA 100X), 1 mM natrium pyruvate, 55 μM β-mercaptoethanol, 100 eenheden/mL penicillaire, 100 eenheden/mL streptomycine, en 2 mM L-glutamine.
- Conditie van de media 's nachts met behulp van groei-geremd STO feeder cellen21.
- Bereid STO-cellen voor (Zie de Inhoudsopgave) media om DMEM te bevatten, aangevuld met 10% FBS en 100 u/ml penicillaire, 100 U/ml streptomycine. Groeien en uit te breiden STO cellen naar samenvloeiing in 25 cm2 kolven gecoat met 0,1% gelatine. Breng 5000 Rad van gamma bestraling aan.
- Zaad ongeveer 3 x 106 groei-geremd cellen op een 10 cm2 schotel of 25 cm2 kolf (uit stap 1.2.1.1). Voeg ongeveer 10 – 12 mL Neural Crest basal medium toe en inincuberen 's nachts.
Opmerking: geseede cellen kunnen tot 10 dagen worden gebruikt om voorwaardelijk medium te produceren. Controleer de weergave van cellen regelmatig
- Filtreer het medium (grootte van 0,22 μm porie) en vul aan met 25 ng/mL basis fibroblast groeifactor (bFGF) en 1000 U van leukemie factor (LIF).
Opmerking: bewaren bij 4 °C en binnen een maand gebruiken of bewaren bij-20 °C en binnen 3 maanden gebruiken.
- Conditie van de media 's nachts met behulp van groei-geremd STO feeder cellen21.
- Mantel de weefselkweek oppervlakken met extracellulaire matrix.
Let op: afhankelijk van de biologische vraag die wordt gesteld, kan de matrix worden gecoat op cultuur gerechten met glazen bodem, plastic weefselkweek gerechten of glazen afdek stroken. Zie hieronder voor verschillende op de ECM gebaseerde hydrogel verdunningen afhankelijk van het matrix substraat. Fibronectin is op de hieronder vermelde concentraties getest op gerechten met glazen bodem en afdek stroken. Hier zullen we verwijzen naar de ondergrond gecoate oppervlakken als "gecoate platen".- Coat de weefselkweek oppervlakken met de op ECM gebaseerde hydrogel.
Opmerking: Houd het substraat koud tot het beplating, hetzij door het koelen van de media of het houden op ijs.- De hydrogel bij 4 °C 's nachts ontdooien. Voeg 5 mL 10% FBS in DMEM toe aan 5 mL hydrogel voor een eindvolume van 10 mL (Zie de tabel met materialen).
- Maak 0,5 – 1 mL aliquots als handig en bewaar bij-20 °C.
- De hydrogel aliquots op ijs ontdooien.
- Gebruik een 1:20 verdunning van de hydrogel kolf om plastic te Coat.
- Gebruik een 1:5 verdunning van de hydrogel kolf om glazen glaasjes en weefselkweek platen met glazen bodem te maken.
Opmerking: Verdun de hydrogel in koude DMEM. - Breng voldoende verdunde hydrogel aan om het gewenste gebied op platen/glijbanen te bedekken en inbroed 30 – 45 minuten bij 37 °C.
- Gebruik de gecoate platen/dia's onmiddellijk of bewaar de glijbanen bij 4 °C 's nachts.
- Verwijder excessen en spoel dia's met hoge glucose-DMEM (optioneel) voor gebruik.
- Coating de weefselcultuur oppervlakken met fibronectin.
- Maak aliquots van 1 mg/mL fibronectin stockoplossing en bewaar bij-80 °C. Verdun fibronectine met de PBS van Dulbecco (dPBS) tot een eindconcentratie van 1 μg/mL.
- Breng voldoende fibronectine aan om het gewenste gebied te bedekken en inincuberen bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Verwijder het resterende fibronectine en laat het glas drogen 30-45 min.
- Spoel putten of afdek stroken met hoge glucose-DMEM (optioneel) voor gebruik.
- Coat de weefselkweek oppervlakken met de op ECM gebaseerde hydrogel.
2. dag 1: dissectie van vroege pereoniet stadium embryo's
Opmerking: gebruik steriele gereedschappen en steriele oplossingen. Als genotypering nodig is, verzamelt u het lichaam van het embryo voor DNA-extractie.
- Dissectie van de craniale neurale plaat is beperkt tot embryo's op 8,5 dagen na coitum (DPC). Selecteer embryo's bij de 5 – 8 pereoniet stage. Ontleden de baarmoeder in PBS en snijd het mesometrium om elk embryo te scheiden (Figuur 1a). De gespierde wand van de baarmoeder contracten en het deciduale weefsel zal zichtbaar worden (Figuur 1b).
Let op: behoud embryo's in de baarmoeder in ijskoude PBS terwijl dissecties één embryo tegelijk worden uitgevoerd. Verplaats embryo's met een glazen Pasteur pipet in een verse steriele PBS om de zichtbaarheid te verbeteren en verontreiniging te verminderen. - Schuif de Tang tussen de spierlaag en decidubbel weefsel en verwijder de spierlaag met een tweede paar Tang (figuur 1c).
- Gebruik de Tang, prik de deciduum aan de randen van de mesometrial paal en met een tweede paar Tang traan om loodrecht op de paal te openen.
- Trek het deciduale weefsel met de Tang terug om het membraan van de Reichert te visualiseren.
- Verwijder het membraan van Reichert voorzichtig. De viscerale dooierzak wordt zichtbaar en het embryo kan binnenin worden gezien (figuur 1d).
- Verwijder de viscerale dooierzak en de amnion (Figuur 1e) en plaats het embryo om de hoofd plooi te visualiseren (Figuur 1f).
- Snijd de kop vouw boven het hart en schrae de onderliggende mesoderm met behulp van een tang en/of wimper gereedschap om een schone neurale plaat (NP) te verkrijgen (afbeelding 1h).
Opmerking: de NP kan geheel worden gehouden of de anteroposterieure as worden verdeeld, zodat elke zijde afzonderlijk kan worden geplateerd. De grens van de neurale plaat kan verder worden afgesneden van de neurale plaat om neuronale bijdragen aan de Explants te minimaliseren. - Gebruik een glazen Pasteur-pipet om de ontleed neurale plaat over te brengen op een met waterstof beklede schotel gevuld met geconditioneerde neurale Crest-media.
- Zwenk het gerecht zachtjes om de NP in het midden van de put te positioneren. Dit is belangrijk voor het maximaliseren van de fase kwaliteit voor Live-celbeeldvorming (op dag 2).
- Incuberen 's nachts (of op gewenst tijdstip) bij 37 °C in 5% CO2. Neurale Crest cellen moeten zichtbaar migreren uit de neurale plaat.
Opmerking: cellen worden meestal binnen 6 – 8 uur bevestigd. Nadat de explant is bevestigd, u meer tijd geven om migratie cellen te visualiseren. Meestal door 24 h post explant, kunnen we drie te onderscheiden populaties van cellen te vinden. De eerste populatie, in het midden van de explant, is de neurale plaat (NP). De tweede populatie, de voortrek kende NC (pNC), omringt de NP in een epitheel bladcellen. De derde populatie, in de buitenring, is gevormd uit trekkende NC (mNC), die groter zijn in grootte, en lijken volledig mesenchymale (Figuur 2).
3. dag 2: Live-cel beeldvorming van Murine craniale neurale Crest cellen
Opmerking: Imaging moet worden uitgevoerd op 24 h post explanting om de migratie van neurale Crest cellen optimaal te kunnen beeld en kwantificeren. NC-inductie media hoeft niet te worden vernieuwd voordat Live-celbeeldvorming. Toegang tot een omgekeerde Microscoop, met een gemotoriseerde fase en een geïntegreerde omgevings kamer is vereist. Gebruik multi-well weefselcultuur gerechten geschikt voor Imaging (tabel van materialen).
-
Microscoop-opstelling
- Stel de omgevings kamer in op 37 °C en 5% CO2.
- Doorboren in de deksel van de weefselkweek plaat deksel, zodat de CO2 naald, aangesloten op de co2 bevochtiging kamer, om te zitten in de plaat.
- Plaats de weefselkweek schotel in de preparaathouder en plak de deksel van de plaat en CO2 naald om schudden te voorkomen tijdens multi-well overname.
- Schakel de Microscoop controller, de stage controller en de imaging software in.
- Concentreer u op de craniale NC-cellen bij 10x vergroting (met bijpassende fasering in de geselecteerde condensor).
- Stel hoge kwaliteit fase-contrast op de Microscoop door het aanpassen van het veld iris diafragma, diafragma iris diafragma en centreer telescoop, zoals gespecificeerd in de Microscoop set-up handleiding.
-
Fase contrast Live-celbeeldvorming
- Stel de map of bestandslocatie in waar de timelapse-bestanden worden opgeslagen.
- Stel de belichtingstijd, de binning en het camera gebied in.
- Stel het aantal tijdspunten, de duur van de Imaging en het tijdsinterval tussen frames in.
- Om NC-Celmigratie capaciteit te kwantificeren, stelt u de Microscoop in op 10x vergroting, waarbij 1 frame elke 5 min (217 tijdpunten boven 18 uur) wordt genomen. Om celmorfologie te kwantificeren, stel vergroting in op 40x, waarbij 1 frame/min (61 tijdpunten meer dan 1 uur). Om de dynamiek van lamellipodial te kwantificeren, stelt u de vergroting in op 40x of 60x vergroting, waarbij 1 frame elke 10 s (meer dan 10 min) wordt gebruikt.
- Voor multi-well Imaging stelt u de mechanische fase in om tussen geselecteerde XY-posities te bewegen. Bevestig dat de craniale NC-cellen scherp zijn en dat de positie van de stage correct is.
- Gebruik de opdracht verwerven om timelapse-beeldvorming te starten.
- Nadat de time-lapse-installatiekopie is voltooid, controleert u de multidimensionale gegevens en exporteert. stk-bestanden voor analyse.
Opmerking:. stk is een TIFF-stack bestand. - Sluit de software af, sluit de computer af en schakel de podium-, camera-en Microscoop-controllers uit.
4. Imaging analyse: kwantificering van neurale Crest Celmigratie
Opmerking: we hebben een reeks kwantificeerbare migratie parameters geanalyseerd, die specifiek gericht zijn op migratie capaciteit en celvorm dynamiek, om het cellulaire gedrag dat wordt tentoongesteld door migrerende Murine craniale neurale Crest-cellen beter te definiëren. (1) migratie (geaccumuleerde afstand) is de totale padlengte genomen door de cel (μm); (2) migratie (Euclidische afstand) is de rechte lijnafstand tussen de initiële en definitieve positie van de cel (μm); (3) migratie (celsnelheid) is de afstand die per tijdseenheid door de cel is afgelegd (μm/min); (4) Celvorm (celgebied) is het totale oppervlak dat door de cel wordt bedekt. Stel pixel in op micron schaal volgens Imaging Microscoop. (A = eenpx x Npx, waarbij eenpx = pixelgebied en Npx = aantal pixels. Eenheden: μm2; (5) celvorm (celcirculariteit) is de afwijking van de celvorm van een perfecte cirkel die wordt aangegeven door een circulariteit waarde van 1,0 (4Π (a/P2)), waarbij a = gebied en P = omtrek.
-
Volgen van één cel
Opmerking: voor het meten van NC-Celmigratie worden XY-coördinaten van afzonderlijke cellen in alle timelapse-frames gegenereerd. Dit zorgt voor een latere analyse van de afstand, snelheid en persistentie maatregelen van de Celmigratie.- Open ImageJ en importeer gegevens als TIFF-stack bestanden.
- Klik op analyseren | Stel schaal in om de. stk-bestanden te kalibreren volgens de Microscoop-instellingen, werkend in pixels/μm.
- Klik op plugins | Tracking | Handmatige tracking om image J Manual Cell tracking plugin te openen. Selecteer track toevoegenom het bijhouden van cellen te starten.
- Volg cellen door alle frames van timelapse-films, waarbij de Nucleus als referentiepunt wordt gebruikt.
Opmerking: 10 – 20 cellen moeten per explant worden bijgehouden, waarbij in totaal 60 cellen worden bijgehouden (n = 3). Cellen die in de loop van de timelapse ondergaan celdeling moeten worden uitgesloten van de analyse. - Sla de resultaten op en exporteer ze als CSV-bestand. De resultaten vertegenwoordigen het individuele nummer van de cel, het Segmentnummer en de XY-coördinaten voor alle frames.
-
Kwantificering van neurale Crest Celmigratie capaciteit
- Open de trackinggegevens van één cel (zie hierboven). Converteer CSV-bestanden naar de. txt-bestandsindeling.
- Open de migratie software (de tabel met materialen). Klik op het tabblad gegevens importeren om de celvolggegevens als een. txt-bestand te importeren.
- Onder gegevenssets | Initialisatie, selecteer het aantal segmenten of frames dat moet worden geanalyseerd en stel de xy-kalibratie en het tijdsinterval tussen de frames in. Selecteer instellingen toepassen om de instellingen op te slaan.
- Selecteer het symbool gegevens plot om traject plots te vormen. Selecteer het statistiek symbool om afstand en snelheidsmetingen te kwantificeren.
- Sla het traject plots op als bitmap (. bmp) bestanden, en afstands-en snelheidsmetingen als. txt bestanden. Selecteer het symbool gegevens verwijderen . Herhaal dit voor andere timelapse-bestanden.
Opmerking: traject plots kunnen worden gebruikt om de directheid van individuele celpaden te visualiseren voor een bepaalde celconditie of staat in de loop van time-lapse-films (figuur 4a). Gegevens over afstand en snelheid die zijn opgeslagen in de. txt-bestanden kunnen vervolgens worden gebruikt voor verdere analyse.
-
Kwantificering van neurale Crest celgebied en circulariteit
- Open de time-lapse. stk-bestanden in ImageJ en Kalibreer deze volgens de Microscoop-instellingen, werkend in pixels/μm.
- Onder analyseren | Stel metingen in, klik om de celvorm parameters te selecteren: celgebied, omtrek en vorm descriptor.
- Gebruik het gereedschap selectie van vrije hand om elke cel handmatig te tekenen door grenzen van celmembraan als richtlijn te gebruiken.
- Druk op CTRL + B toetsen op het toetsenbord om de celomtrek altijd op de afbeelding te behouden. Herhaal dit voor cellen over elk time-lapse-frame.
- De afbeelding gebruiken | Overlay | Naar ROI Manager om de waarden op te slaan.
- Klik op metenzodra alle interesse cellen per frame zijn aangegeven. Sla de resultaten op als CSV-bestand.
Opmerking: 10 – 20 cellen per film moeten worden geschetst, met in totaal 30 – 60 geanalyseerde cellen per aandoening (n = 3). Gegevens van celvorm (. CSV-bestanden) kunnen worden gebruikt om te kwantificeren hoe de celvorm dynamiek in de loop van de tijd verandert (figuur 4c) of hoe morfologie kan worden gewijzigd onder verschillende celbehandelingen.
Representative Results
Met behulp van de hier gedemonteerde procedure werden muizen embryo's uit de baarmoeder ontleed en werden extraembryonale weefsels verwijderd (Figuur 1A – D). Embryo's werden Somiet geënsceneerd (met alleen embryo's van 5 – 8 somieten (SS), Figuur 1E, F). De craniale neurale plaat werd vervolgens ontleed en het neuroepitheel werd geïsoleerd. Mesodermale cellen, geïdentificeerd als losse, circulaire, mesenchymale cellen, werden voorzichtig afgekoegd (Figuur 1G-L). De voorste neurale plaat kan in zijn geheel worden verspreid, in welk geval het zenuw kuif weefsel lateraal zal uitkomen en radiaal rond de explant uitvouwt, of elke rand van een neurale plaat (rechts en links) kan afzonderlijk worden explanted. Dit is vooral nuttig bij de uitleg van genetische mutanten.
Binnen 24 uur kan een gebied van voortrek kende (epitheliale) craniale neurale kuif duidelijk worden gezien rond de neurale plaat explant (Figuur 2b). Bovendien, een subpopulatie van neurale Crest cellen hebben epitheel tot mesenchymale overgang ondergaan en lijken volledig mesenchymale (Figuur 2). Dus, we hebben verschillende concentrische ringen van verschillende cellen, met de neurale plaat (NP) in het midden, de premigrerend neurale Crest (pNC) in de tussenliggende cirkel, en een populatie van migratie neurale Crest (mNC) in de buitenring (Figuur 2b). Om NC-cellen te traceren, is het mogelijk om genetisch gemodificeerde Muismodellen te gebruiken zoals we in figuur 2claten zien. In dit geval hebben we gebruikt de neurale Crest specifieke Wnt1:: CRE; RosaMtmg wat resulteert in NC cellen wordt gelabeld in het groen. In deze muizen, cellen Express membraan tomaat (mT, in het rood) tenzij ze uitdrukken CRE of. Recombinatie leidt tot cellen die membraan groen fluorescerende eiwitten (GFP, in het groen) uitdrukken. De rode cellen weergegeven in het midden van de explant zijn neurale plaat cellen. Sommige dorsale neurale plaat cellen ook Express GFP; voor de lange termijn cultuur, zouden we alle cellen in het centrum accijnzen. Voor onze doeleinden, de zuiverheid van de explant is voldoende om de verschillende neurale Crest celpopulaties volgen. Waar een hogere zuiverheid van de neurale kuif nodig is, kan deze genetische etiketterings strategie worden gecombineerd met fluorescerende geactiveerde celsortering (FACS) om de zuiverheid van de populatie te waarborgen. Als alternatief is het mogelijk om de explantaten vast te stellen en de NC populatie te identificeren met antilichaam labeling.
24 uur per dag was ook duidelijk dat de karakteristieke concentrische ringen van voortrek kende en volledig migrerende NC-cellen van de explant culturen niet afhankelijk waren van de matrix keuze (Figuur 3). Explant culturen verguld op zowel een ECM-gebaseerde hydrogel als fibronectine vormden vergelijkbare explant structuren, bestaande uit de drie celpopulaties, NP, pNC en mNC (Figuur 3A, C). De morfologie van neurale kuif cellen was ook vergelijkbaar tussen die op de ecu-gebaseerde hydrogel en fibronectin (Figuur 3B, D). Echter, explantaten verguld op fibronectin produceerde cellen met prominentere lamellipodia op de celleidende rand, schijnbaar meer gepolariseerd in de richting van de migratie (Figuur 3B, D).
Zodra een populatie van migratie neurale Crest cellen duidelijk is, kan Live-celbeeldvorming worden voltooid. Time-lapse microscopie is ingesteld op 10x vergroting (18 h, 1 frame/5 min) voor latere analyse van NC Cell migratie (figuur 4a). ImageJ-invoegtoepassing voorhand matige tracering genereert XY-coördinaten van afzonderlijke cellen over alle frames van de time-lapse-films (figuur 4b). Deze coördinaten kunnen worden verwerkt met behulp van de migratie software. Deze software maakt visualisatie van individuele celsporen na verloop van tijd mogelijk (figuur 4b) en kan worden gebruikt om geaccumuleerde en Euclidische afstand te kwantificeren, evenals celsnelheid.
Time-lapse Imaging gegevens bieden ook een schat aan informatie over celmorfologie tijdens de migratie van craniale neurale Crest-cellen (figuur 4c). Door het schetsen van individuele celmembranen, kunnen celgebied-en omtrek metingen worden berekend uit alle frames van de films (figuur 4c). Deze metingen maken de daaropvolgende kwantificering van het celgebied en de circulariteit mogelijk (figuur 4D). Figuur 4c toont een analyse van veranderingen in de celvorm van 18 uur. Houd er rekening mee dat als cellen zich buiten de explant bevinden, het celgebied aanzienlijk toeneemt, terwijl de celcirculariteit relatief constant blijft (one-way ANOVA, tukey's meervoudige vergelijkingen test) ( Figuur 4E,F). Dit suggereert dat als cellen afwijken van de epitheliale rand en cel-cel contacten verliezen, ze tonen verhoogde cel spread gebied. Celcirculariteit maatregelen in de loop van de tijd niet significant veranderd; kortdurende veranderingen in circulariteit kunnen echter worden gezien als een toename van het aantal tijdspunten wordt gekwantificeerd. Celcirculariteit metingen kunnen ook interessante gegevens opleveren over de dynamiek van de celvorm in de aanwezigheid van een Chemotactische Cue of onder beperkte omstandigheden.
Figuur 1: isolatie van craniale neurale kuif explanten uit een e 8.5 embryo.
Beelden zijn stills uit een video die de micro-dissectie techniek documenteert. (a – C) Dissectie van het embryo uit de baarmoeder. (B – C) Met behulp van twee scherpe Tang, voorzichtig uit elkaar te trekken de gespierde laag. Panel (D) toont embryo in de viscerale dooierzak (gele lijn). Haal het embryo uit de viscerale dooierzak. E) laterale weergaven van het embryo in fase 8,5 laterale. F) rugzicht van het embryo in fase 8,5. Graaf somieten (SS) om de leeftijd van de embryo's te bepalen; meestal 5 – 8 SS (gele cirkels in F). G) Bekijk de schedel streek van het embryo. Extraembryonale membranen uit de schedel streek verwijderen; somieten zijn gemarkeerd met een gele lijn. H) dissecties van anterieure neurale plaat worden uitgevoerd onder de eerste branchiale boog (gele lijn). I) laterale weergave van de anterieure neurale plaat dissectie. Neurale plooien, waar neurale Crest cellen ontstaan, zijn gemarkeerd met een gele lijn. (J – L) Verwijder mesodermale weefsel (pluizige mesenchymale cellen) onderliggende anterieure neurale plooien zo veel mogelijk vóór het beplating van NP op bereide cultuur gerechten. Film werd genomen met behulp van een stereo-microscoop met een Widefield Apochromatische lens bij 3,0 X zoom (Zie de tabel van de materialen). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Murine craniale neurale kuif explant.
A) schematische weergave van de rugzicht van een e 8.5 muis embryo. De craniale regio van het embryo wordt op de stippellijn gesneden. De grens van de neurale plaat (rood gemarkeerd) is geïsoleerd van het omringende mesoderm weefsel en gekweekt gedurende 24 uur om de schedel zenuw kam te laten emigren. Schematisch aangepast vanaf22,23. B) links: representatief helderveld beeld van een craniale neurale kuif explant 24 uur na het beplating. Drie populaties van cellen worden waargenomen, die ook worden geschematiseerde aan de rechterkant. NP = neurale plaat, pNC = pre-migratie neurale Crest en mNC = migratie neurale Crest. Schaalbalk = 250 μm. C) grotere vergrotings beelden van een explant van genetisch gelabelde muis (Wnt1:: CRE; RosaMtmg). Cellen zonder de CRE driver Express membraan tomaat (mT) in het rood. Expressie van CRE onder de controle van een neurale Crest specifieke Wnt1 promotor leidt tot excisie van de mT cassette en expressie van membraan GFP (mG) in het groen. Nuclei zijn gekleurd met Hoescht (in blauw). Schaalbalk = 200 μm. (d – d ' ') hogere vergrotings beelden van Trek cellen die membraan GFP (d) uitdrukken. (D ') DNA is gelabeld met Hoescht (blauw). (D ' ') Samenvoeging van D en D '. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Explants gekweekt op verschillende ondergronden.
(a – B) Fase contrast beelden van explantaten gekweekt op commerciële ECM-hydrogel. (C-D) Explants gekweekt op 1 μg/mL fibronectine. Neurale plaat (NP), premigrerend (pNC) en migrerend (mNC) neurale Crest cellen kunnen worden onderscheiden door hun verschillende celmorfologieën. Schaalbalk = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: kwantificering van craniale neurale Crest Celmigratie en celvorm dynamiek.
(A) fase-contrast frames van timelapse-beeldvorming van explant culturen die zijn overgelegd met enkelvoudige neurale Crest-celsporen, met behulp van de imagej/Fiji Manual Cell tracking plug-in. tien representatieve mnc-cellen werden handmatig bijgehouden over 18 h (217 frames) en de xy coördinaten werden geëxporteerd. Gegevens worden weergegeven als een overlay-stip en lijn plots. Cellen werden geplateerd op 1 μg/mL fibronectine. Schaalbalk = 200 μm. B) representatieve traject plot van 10 mnc-cellen, gegenereerd met behulp van migratie software. (C) fase-contrast frames uit de timelapse-analyse van explant culturen. Onderbroken lijnen schetsen 8 representatieve migratie neurale Crest cellen geanalyseerd voor celvorm dynamiek wanneer geplateerd op 1 μg/mL fibronectin. Schaalbalk = 200 μm. D) schematische weergave van de berekeningen die worden gebruikt om het celgebied en de circulariteit te kwantificeren. Celmorfologie van het schematisch is die van de cel gemarkeerd in blauw (C). Eenpx = pixelgebied, Npx = pixel nummer, a = gebied, P = omtrek (1 pixel = 1,60772 μm2). (E – F) Kwantificering van celgebied en celcirculariteit maatregelen in de loop van de tijd. Gegevens staat voor gemiddelde ± SEM. Elke stip vertegenwoordigt één cel (n = 60), genomen uit 3 onafhankelijke experimenten, en geanalyseerd op 0 h, 6 h, 12 h en 18 h (NS niet-significante, * p < 0.05, * * * * p < 0,0001 one-way ANOVA, Tukey's meervoudige vergelijkingen test). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Discussion
Het bestuderen van de neurale Crest-cellen in zoogdieren is voor wetenschappers een uitdaging geweest vanwege de in utero aard van de ontwikkeling van zoogdieren. In vivo studies zijn moeilijk op te zetten, omdat het embryo moet worden gemanipuleerd onder omstandigheden die het leven in de baarmoeder nabootsen. In de praktijk is het bijna onmogelijk om deze (E8 +) embryo's langer dan 24 uur te reproducen, vooral voor Live beeldvorming. Bovendien, neurale Crest inductie en migratie optreden gelijktijdig met neurale buis sluiting en embryonale draaien in de muis; Dit is een cruciale en stressvolle morfogenetische gebeurtenis, die vaak faalt wanneer embryo's worden gekweekt ex utero. Zo is het succespercentage van ex-utero -benaderingen over het algemeen laag. Het gebruik van vereeuwigd NC-cellen21 is een nuttig hulpmiddel om dierlijk gebruik te verminderen en het kan een betere bron van neurale Crest-cellen bieden voor langetermijnanalyse, transfectie en verrijkings studies. Echter, er is duidelijk een behoefte om betrouwbare cultuur primaire neurale Crest cellen. Onze methode is van toepassing op de muis knock-out of voorwaardelijke genetische modellen. Een vergelijkbare methode voor de onze is beschreven voor andere neurale kuif populaties20; echter, onze methode grondig beschrijft de stap-voor-stap isolatie van Murine craniale NC cellen. We beschrijven ook het gebruik van verschillende matrices en de migratie-analyseprocedure in detail.
Om tot consistente resultaten te komen, constateerden we dat bijzondere aandacht werd besteed aan het klaarzetten tijdens de selectie van embryo's. Niet verrassend, het aantal somieten correleert met verschillende stadia in craniale NC ontwikkeling. Daarom is de kennis van de embryo anatomie zeer belangrijk voordat er experimentele gegevens worden verworven. Deze aanpak kan vervolgens worden aangepast naar het isoleren van discrete populaties van neurale Crest cellen, afhankelijk van de biologische vraag en de doelcellen.
Zodra de embryo's zijn geselecteerd en ontleed, kunnen mesodermale cellen gemakkelijk worden onderscheiden en moeten ze worden verwijderd om een betere visualisatie mogelijk te maken en verontreiniging te verminderen. Voor langere-termijn culturen, de neurale plaat weefsel kan worden verwijderd bij 24 h van plating om besmetting door zenuwweefsel te voorkomen. Een verdere verfijning zou kunnen zijn het gebruik van fluorescerende Lineage labeling (bijvoorbeeld met behulp van een Wnt1:: CRE of Sox10:: creert drivers in combinatie met fluorescerende verslaggevers24,25) om te onderscheiden van neurale Crest cellen van andere weefsels zoals weergegeven in figuur 2c.
Eerdere rapporten hebben gewezen op het potentieel van plating muis NC explant culturen op verschillende matrices, meestal op commerciële ECM hydrogels, fibronectin en collageen I20,21,26. In onze handen worden muis craniale NC-explant culturen met succes geteeld op alle drie de matrices, in concentraties die in originele rapporten zijn gespecificeerd (gegevens worden niet weergegeven). De initiële verfijnde aanpak die we hebben aangepast voor onze NC-explant culturen gebruikten een commerciële hydrogel als de matrix van keuze, die voornamelijk bestond uit laminine en collageen21(Figuur 3A – B). Echter, de samenstelling van deze hydrogel is niet duidelijk gedefinieerd, met onbekende groeifactor en eiwitgehalte. Als zodanig hebben we sindsdien onze aanpak verschoven naar plating muis NC explant culturen op fibronectin (Figuur 3C – D). Fibronectin is goed gedefinieerd en sterk uitgedrukt in de ECM-en kelder membranen waarlangs NC-cellen migrerenin vivo28,29,30. Om een fibronectin-matrix te optimaliseren die het beste de neurale Crest-Celmigratie en-morfologie repliceert zoals gezien met behulp van de hydrogel, hebben we NC-celgedragingen vergeleken die werden tentoongesteld op de hydrogel tegen een titratie van 0,25 – 30 μg/mL fibronectine, en 1 μg/mL fibronectin gedefinieerd als het verstrekken van ideale eigenschappen (gegevens niet weergegeven). Wij zijn van mening dat dit voorbereidende werk kan bijdragen tot de totstandbrenging van een kader voor de systematische vergelijking van matrices, zoals fibronectine, tegen de eerder beschreven, namelijk collageen en laminine32,33,34. Het zou vooral interessant zijn om de muis NC-Celmigratie capaciteit op fibronectin versus collageen I te vergelijken, gezien het feit dat collageen-IA1 endogeen wordt uitgescheiden door de muis, aviaire en menselijke NC-cellen28,30,31,32. Collageen I is daarom even relevant als fibronectin bij de afweging van matrix keuze. Het is ook de moeite waard te erkennen dat de biologische beschikbaarheid van groeifactoren in de media kan worden gewijzigd door verschillende matrix componenten, vooral gezien het hoge serum gehalte van onze media. Om dit te overwinnen, werken we momenteel aan het produceren van serum vrije gedefinieerde cultuuromstandigheden. Deze gedefinieerde media worden met succes gebruikt in neurale Crest-inductie protocollen in het pluripotente stamcel veld, maar vereisen verdere optimalisatie voor ons NC explant cultuur systeem33,34. Ons werk kan ook dienen als uitgangspunt voor de raffinage van andere soorten NC-cellen zoals hart-en romp-NC, en voor latere studies van NC-differentiatie. Het belangrijkste is dat dit protocol de isolatie van craniale NC-cellen voor een verscheidenheid aan toepassingen mogelijk maakt. We voor ogen studies over gerichte migratie, 3D-migratie en invasie. Cellen die op deze manier zijn geïsoleerd, kunnen worden behandeldin vitrovoor een aantal analyses. Cellen kunnen bijvoorbeeld gemakkelijk worden behandeld met verschillende kleine moleculen om specifieke eiwitten te targeten, ze kunnen op gedefinieerde tijdstippen worden behandeld en wegwassende werking-experimenten kunnen worden ontworpen om het herstel van het Celgedrag te bepalen (Figuur 4). Langere termijn cultuur voor transfectie en differentiatie assays is mogelijk, evenals passage van cellen (gegevens niet weergegeven). De levensvatbaarheid, de capaciteit van de celvernieuwing en de multi potentie moeten echter na het doorvoeren worden gevalideerd. De op glas dekstroken geplateerde cellen kunnen ook worden gebruikt in immunofluorescentie kleurings protocollen, na Live beeldvorming. Ten slotte vertegenwoordigt deze aanpak een enorm krachtig systeem voor het bestuderen van migratie van NC van genetische Muismodellen22,23,24,25.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten.
Acknowledgments
We zijn de King's College London Biological Services unit dankbaar, met name Tiffany Jarvis en Lynsey Cashnella voor hun voortdurende steun. We danken Derek Stemple, Mamoru Ishii en Robert Maxson voor advies en hulp met reagentia tijdens de eerste oprichting van dit protocol. We danken Dheraj Taheem voor hulp bij gamma-bestraling van STO-cellen. Wij danken de Liu en Krause Labs, vooral Tommy Pallett, voor de grote steun. Dit werk werd gefinancierd door subsidies van de BBSRC (BB/R015953/1 tot KJL/MK), een student van het MRC doctoraatsprogramma (LD), Newland Pedley Fund (ALM) en KRIPI'S II, algemeen secretariaat van onderzoek en technologie (GSRT), ministerie van onderwijs en religieuze Zaken, Griekenland en Fondation Santé (naar SGGM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bFGF | R&D systems | 233-FB | |
| b-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Tissue culture flasks | Corning | 430639 | 25cm2 culture flasks |
| DMEM (4500 mg/L glucose) | Sigma | D5671 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (dPBS) | Sigma | D8537 | |
| Ethanol | Fisher Chemicals | E/0650DF/C17 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | TFS AA 10-155 | |
| Fetal Bovine Serum (ES Cell FBS) | Gibco | 26140079/16141-079 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9382 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Glass-bottomed, multi-well 24-well tissue culture plate | Ibidi | 82406 | Glass-bottomed, No 1.5, 24-well tissue culture dish with black sides |
| Cell migration analysis tool | Ibidi | v2.0 | Manuals for this software can be found at: https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html. |
| Circularity Plug-in | ImageJ | v1.29 or later | The circularity plug-in is an extended version of ImageJ/Fiji’s Measure command, designed by Rasband, W., (2000) (wsr@nih.gov). |
| LIF | ESGRO by Millipore | ESG1106 | |
| Manual Cell Tracking Plug-in | ImageJ | v1.34k or later | ref Cordelieres F. Institut Curie, Orsay (France) 2005 |
| Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
| MEM non-essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-050 | |
| Matrigel (ECM-based Hydrogel) | Corning | 356234 | |
| Microscope | Olympus | 1X81 | Olympus 1X81 inverted microscope |
| Microscope camera | Photometrics | 512B | Photometrics Cascadell 512B camera (4x UPlanFL N, 10x UPlanFL N, 20x UPlanFL N, 40x UPlanFL N objectives) |
| Microscope controller | Olympus | 1X2-UCB | Olympus 1X2-UCB microscope controller |
| Microscope temperature controller | Solent Scientific | RS232 | Maintained at 37°C |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | A5955 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Statistics software | Graphpad Prism | v7.0 | |
| STO feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ | |
| XY microscope stage controller | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MS-4400 |
References
- Duband, J. L. Diversity in the molecular and cellular strategies of epithelium-to-mesenchyme transitions: Insights from the neural crest. Cell Adhesion & Migration. 4, 458-482 (2010).
- Mayor, R., Carmona-Fontaine, C. Keeping in touch with contact inhibition of locomotion. Trends in Cell Biology. 20, 319-328 (2010).
- Le Douarin, N., Kalcheim, C. The neural crest. 2nd edn. , Cambridge University Press. (1999).
- Trainor, P. A. Neural Crest Cells : Evolution, Development, and Disease. , Academic Press. (2014).
- Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: morphogenetic and molecular mechanisms. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 1152-1166 (2006).
- Ahola, J. A., et al. Increased incidence of Hirschsprung's disease in patients with hypoplastic left heart syndrome--a common neural crest-derived etiology? Journal of Pediatric Surgery. 44, 1396-1400 (2009).
- Bajpai, R., et al. CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation. Nature. 463, 958-962 (2010).
- Inoue, K., et al. Congenital hypomyelinating neuropathy, central dysmyelination, and Waardenburg-Hirschsprung disease: phenotypes linked by SOX10 mutation. Annals of Neurology. 52, 836-842 (2002).
- Kim, H., Kang, K., Ekram, M. B., Roh, T. Y., Kim, J. Aebp2 as an epigenetic regulator for neural crest cells. PloS one. 6, e25174 (2011).
- Barriga, E. H., Trainor, P. A., Bronner, M., Mayor, R. Animal models for studying neural crest development: is the mouse different? Development. 142, 1555-1560 (2015).
- Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: an overview. Developmental Biology. 366, 2-9 (2012).
- De Calisto, J., Araya, C., Marchant, L., Riaz, C. F., Mayor, R. Essential role of non-canonical Wnt signalling in neural crest migration. Development. 132, 2587-2597 (2005).
- Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456, 957-961 (2008).
- Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135, 1771-1780 (2008).
- Banerjee, S., et al. A novel role for MuSK and non-canonical Wnt signaling during segmental neural crest cell migration. Development. 138, 3287-3296 (2011).
- Pryor, S. E., et al. Vangl-dependent planar cell polarity signalling is not required for neural crest migration in mammals. Development. 141, 3153-3158 (2014).
- Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Vital dye analysis of cranial neural crest cell migration in the mouse embryo. Development. 116, 297-307 (1992).
- Kawakami, M., Umeda, M., Nakagata, N., Takeo, T., Yamamura, K. Novel migrating mouse neural crest cell assay system utilizing P0-Cre/EGFP fluorescent time-lapse imaging. BMC Developmental Biology. 11, 68 (2011).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Etchevers, H. Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells. Nature protocols. 6, 1568-1577 (2011).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21, 3069-3080 (2012).
- Gonzalez Malagon, S. G., Liu, K. J. ALK and GSK3: Shared Features of Neuroblastoma and Neural Crest Cells. Journal of Experimental Neuroscience. 12, 1179069518792499 (2018).
- Gonzalez Malagon, S. G., et al. Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus. Nature Communications. 9, 1126 (2018).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology : CB. 8, 1323-1326 (1998).
- Laranjeira, C., et al. Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury. Journal of Clinical Investigation. 121, 3412-3424 (2011).
- Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and culture of neural crest cells from embryonic murine neural tube. Journal Of Visualized Experiments : JoVE. , e4134 (2012).
- Sternberg, J., Kimber, S. J. The relationship between emerging neural crest cells and basement membranes in the trunk of the mouse embryo: a TEM and immunocytochemical study. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 98, 251-268 (1986).
- Sternberg, J., Kimber, S. J. Distribution of fibronectin, laminin and entactin in the environment of migrating neural crest cells in early mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 91, 267-282 (1986).
- George, E. L., Georges-Labouesse, E. N., Patel-King, R. S., Rayburn, H., Hynes, R. O. Defects in mesoderm, neural tube and vascular development in mouse embryos lacking fibronectin. Development. 119, 1079-1091 (1993).
- Henderson, D. J., Copp, A. J. Role of the extracellular matrix in neural crest cell migration. Journal of Anatomy. 191 (Pt 4), 507-515 (1997).
- Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Human Molecular Genetics. 17 (21), 3411-3425 (2008).
- Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Hewitt, T. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Developmental Biology. 87 (2), 259-266 (1981).
- Leung, A. W., et al. WNT/β-catenin signaling mediates human neural crest induction via a pre-neural border intermediate. Development. 143 (3), 398-410 (2016).
- Zhu, Q., Lu, Q., Gao, R., Cao, T. Prospect of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Crest Stem Cells in Clinical Application. Stem Cells International. 2016, 7695836 (2016).
