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Developmental Biology

तंत्रिका क्रेस्ट सेल Delamination और प्रवास के अध्ययन के लिए माउस से प्राथमिक कपाल तंत्रिका क्रेस्ट कोशिकाओं का विच्छेदन, संस्कृति और विश्लेषण

Published: October 3, 2019 doi: 10.3791/60051
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 1, 1,3, 2,4, 3, 1
1Centre for Craniofacial and Regenerative Biology, King's College London, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, FORTH, Department of Biomedical Research, University of Ioannina, 3Randall Centre of Cell & Molecular Biophysics, King's College London, 4Department of Biological Applications and Technology, University of Ioannina
* These authors contributed equally

Summary

इस प्रोटोकॉल विच्छेदन और माउस मॉडल से कपाल तंत्रिका शिखर कोशिकाओं की संस्कृति का वर्णन, मुख्य रूप से सेल प्रवास के अध्ययन के लिए. हम लाइव इमेजिंग तकनीकका इस्तेमाल किया और गति और सेल आकार परिवर्तन के विश्लेषण का वर्णन.

Abstract

पिछले कई दशकों में मानव रोगों की नकल करने के लिए इस्तेमाल आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल की उपलब्धता में वृद्धि हुई है। हालांकि, कोशिका आंदोलनों और विवो में भेदभाव का अध्ययन करने की क्षमता अभी भी बहुत मुश्किल है. न्यूरोक्रिस्टोपैथीज, या तंत्रिका शिखर वंश के विकार, विशेष रूप से प्रमुख भ्रूण चरणों की पहुंच की कमी और आसन्न मेसोडरमल मेसेन्काइम से तंत्रिका शिखर मेसेन्काइम को अलग करने में कठिनाइयों के कारण अध्ययन करने के लिए चुनौतीपूर्ण हैं। यहाँ, हम प्राथमिक कपाल तंत्रिका शिखर कोशिकाओं की संस्कृति के लिए एक अच्छी तरह से परिभाषित, नियमित प्रोटोकॉल स्थापित करने के लिए बाहर सेट. हमारे दृष्टिकोण में हम प्रारंभिक तंत्रिका शिखर प्रेरण चरण के दौरान माउस तंत्रिका प्लेट सीमा बाहर विच्छेदन. तंत्रिका प्लेट सीमा क्षेत्र explanted और सुसंस्कृत है. तंत्रिका शिखर कोशिकाओं तंत्रिका प्लेट सीमा के आसपास एक उपकला शीट में फार्म, और द्वारा 24 एच explant के बाद, delaminate करने के लिए शुरू, एक उपकला-मेसेन्काइमल संक्रमण (EMT) के दौर से गुजर पूरी तरह से गतिशील तंत्रिका शिखर कोशिकाओं बनने के लिए. हमारे दो आयामी culturing दृष्टिकोण के कारण, अलग ऊतक आबादी (न्यूरल प्लेट बनाम premigratory और प्रवासी तंत्रिका शिखर) आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है. लाइव इमेजिंग दृष्टिकोण का उपयोग करना, हम तो तंत्रिका शिखर प्रेरण, EMT और प्रवासी व्यवहार में परिवर्तन की पहचान कर सकते हैं. आनुवंशिक उत्परिवर्ती के साथ इस तकनीक का संयोजन सामान्य और रोग तंत्रिका शिखर कोशिका जीव विज्ञान को समझने के लिए एक बहुत शक्तिशाली दृष्टिकोण होगा.

Introduction

तंत्रिका शिखर (एनसी) वंश कोशिकाओं की एक क्षणिक, बहुशक्ति और प्रवासी आबादी है जो प्रारंभिक भ्रूण विकास1,2के दौरान विशेष रूप से कशेरुकियों में दिखाई देती है . तंत्रिका शिखर डेरिवेटिव अत्यंत विविध होते हैं, और ग्लिया, चिकनी मांसपेशियों, मेलेनोसाइट्स, न्यूरॉन्स और craniofacial हड्डी और उपास्थि3,4शामिल हैं। क्योंकि तंत्रिका शिखर कई अंग प्रणालियों के समारोह में योगदान देता है, इस वंश मानव भ्रूणजनन के लिए आवश्यक है. Aberrant नेकां विकास सबसे आम मानव जन्म दोष की एक विस्तृत श्रृंखला में फंसा या नहीं है (यानी, फांक होंठ और तालू)5, और भी इस तरह के Hirschsprung रोग (HSCR), वार्डनबर्ग सिंड्रोम (WS), CHARGE सिंड्रोम और विलियम्स सिंड्रोम 6 के रूप में विकारों ,7,8,9.

नेकां विकास Xenopus,लड़की और ज़ेब्राफ़िश मॉडल सहित गैर-मलेरियन मॉडल प्रणालियों की एक संख्या में पता लगाया गया है। स्तनधारियों में, माउस मॉडल में काम तंत्रिका शिखर विकास अंतर्निहित प्रमुख आनुवंशिक घटनाओं में से कुछ की पहचान की है; हालांकि, यह अधिक कठिन हो गया है तंत्रिका शिखर प्रवास की कोशिका जीव विज्ञान का पालन करें, माउस भ्रूण की अगम्यता के कारण (कहीं और10,11की समीक्षा की). इसके अलावा, जबकि लड़की में अध्ययन, Xenopus और ज़ेब्राफ़िश नेकां के लिए एक जीन नियामक नेटवर्क की स्थापना की है, इन पशु मॉडल में समारोह के अध्ययन के नुकसान कभी कभी माउस में एक तुलनीय phenotype प्रदर्शन नहीं करते. उदाहरण के लिए, Xenopuएस, ज़ेब्राफ़िश और लड़की में, गैर-कैनोनिकल Wnt संकेतन सेलुलर तंत्र है कि नेकां अपनी प्रवासी क्षमता प्राप्त करने की अनुमति देता है में से एक है12,13,14,15 . हालांकि, माउस में, गैर-कैनोनिकल Wnt संकेतन की हानि प्रवास16को प्रभावित करने के लिए प्रतीत नहीं होता है। विवो नेकां प्रवास में के रूप में माउस में लंबी अवधि के लिए ट्रैक करने के लिए मुश्किल हो गया है, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या इन प्रजातियों मतभेद प्रवास के भिन्न तरीकों को प्रतिबिंबित, या आणविक विनियमन में मतभेद.

के रूप में उल्लेख किया, माउस में नेकां अध्ययन बहुत चुनौतीपूर्ण है क्योंकि भ्रूण के पूर्व utero संस्कृति कठिन है. इसके अलावा, नेकां लगातार मध्यजर्म और न्यूरेक्टोडरम जैसे आसन्न ऊतकों के साथ अंतरंग संपर्क में है। तंत्रिका शिखर-विशिष्ट क्रे ड्राइवरों या exogenous रंगों के हाल ही में उपयोग हमें फ्लोरोसेंट प्रवासी नेकां लेबल करने के लिए अनुमति दी गई है; हालांकि, इन दृष्टिकोण अभी भी सीमित हैं. नेकां प्रवास17,18की कल्पना करने के लिए विभिन्न तकनीकों का वर्णन करने वाली अनेक रिपोर्टों के बावजूद इन तकनीकों को एक सरल और नियमित प्रक्रिया में हल करना कठिन रहा है .

यह स्पष्ट है कि वहाँ तकनीक है कि हैंडलिंग और स्तनधारी नेकां की विशेषता की अनुमति के लिए एक की जरूरत है. हम माउस कपाल नेकां पर हमारे प्रयासों ध्यान केंद्रित के रूप में यह मानव craniofacial विकास और neurocristopathies के अध्ययन के लिए प्राथमिक मॉडल है. हमने नेकां कोशिकाओंकीप्राथमिक संस्कृति का वर्णन करने वाली अनेक रोचक रिपोर्टों के आधार पर अपने दृष्टिकोण को परिष्कृतकिया. यहाँ, हम अच्छी तरह से प्राथमिक नेकां कोशिकाओं explanting के लिए इष्टतम संस्कृति तकनीकों का वर्णन. हम लाइव सेल इमेजिंग विधि और संस्कृति प्लेटों कोट करने के लिए विभिन्न matrices के इष्टतम उपयोग का प्रदर्शन. हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे एक उल्टे माइक्रोस्कोप, जो अन्य माइक्रोस्कोप के साथ उपयोग के लिए एक दिशानिर्देश के रूप में करना है, साथ ही हमारे सेलुलर विश्लेषण का एक विस्तृत सारांश का उपयोग कर रहते नेकां कोशिकाओं के प्रवास पर कब्जा करने के लिए.

एक्सप्लांट से अपेक्षित परिणाम उन कोशिकाओं का एक खूबसूरती से निर्धारित वितरण होना चाहिए जो सूक्ष्मदर्शी के नीचे स्पष्ट रूप से प्रतिष्ठित हैं, जहां एक कोशिकाओं की तीन अलग-अलग आबादी को देख सकता है जो (i) तंत्रिका प्लेट का प्रतिनिधित्व करते हैं, (ii) पूर्वप्रवास, और, (पप) प्रवासी तंत्रिका शिखर कोशिकाओं. हम उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण के दौरान कोशिकाओं की premigratory आबादी की सीमा पर सेल व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए कैसे प्रदर्शित करते हैं। हम भी सेल गति, दूरी और कोशिका आकारिकी के लिए पूरी तरह से प्रवासी कोशिकाओं का अध्ययन करने पर हमारे प्रयास ध्यान केंद्रित किया.

Protocol

सभी पशु काम राजा कॉलेज लंदन नैतिक समीक्षा प्रक्रिया द्वारा नैतिक अनुमोदन आया है और ब्रिटेन के गृह कार्यालय परियोजना लाइसेंस P8D5E2773 (KJL) के अनुसार किया गया था.

1. अभिकर्मकों की तैयारी

  1. बाँझ फॉस्फेट बफर नमकीन (पीबीएस), 70% इथेनॉल, विच्छेदन उपकरण (बलप्स और विच्छेदन ब्लेड या बाँझ सुइयों), प्लास्टिक प्लेटें या कांच स्लाइड एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध extracellular मैट्रिक्स के साथ लेपित सहित सामान्य समाधान और उपकरण तैयार करें ( ECM) आधारित hydrogel या fibronectin (सामग्री की तालिकादेखें), और तंत्रिका शिखर मीडिया (नीचे देखें).
  2. तंत्रिका शिखर बेसल माध्यम Dulbecco के संशोधित ईगल के माध्यम का उपयोग कर तैयार (DMEM, 4500 mg/L ग्लूकोज), 15% भ्रूण गोवंश सीरम (FBS), 0.1 m न्यूनतम आवश्यक मध्यम अनावश्यक एमिनो एसिड (एमईएम NEA 100X), 1 एम सोडियम पायरीवेट, 55 डिग्री-mercaptoethanol, 100 इकाइयों/एमएल पेनिसिलिन, 100 इकाइयों/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, और 2 एम एम एल-ग्लूटामाइन।
    1. हालत मीडिया रात भर विकास बाधित STO फीडर कोशिकाओं21का उपयोग कर |
      1. एसटीओ कोशिकाओं को तैयार करें (सामग्री की तालिकादेखें ) मीडिया को डीएमईएम को 10% एफबीएस और 100 यू/एमएल पेनिसिलिन, 100 यू/एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन द्वारा पूरक शामिल करने के लिए। 0.1% जिलेटिन के साथ लेपित 25 सेमी2 फ्लास्क में संगम के लिए एसटीओ कोशिकाओं को बढ़ाएं और विस्तृत करें। गामा विकिरण के 5000 रेड लागू करें।
      2. बीज लगभग 3 x 106 वृद्धि-बाधित कोशिकाओं पर एक 10 सेमी2 पकवान या 25 सेमी2 फ्लास्क (चरण 1.2.1.1 से)। लगभग 10-12 एमएल न्यूरल क्रेस्ट बेसल मीडियम जोड़ें और रात भर इनक्यूबेट करें।
        नोट: सीडेड कोशिकाओं का उपयोग 10 दिनों तक सशर्त माध्यम बनाने के लिए किया जा सकता है। नियमित रूप से कोशिकाओं की उपस्थिति की जाँच करें
    2. माध्यम फ़िल्टर (0.22 $m pores आकार), और पूरक के साथ 25 ng/mL बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक (bFGF) और ल्यूकेमिया अवरोध करनेवाला कारक के 1000 यू (LIF).
      नोट: 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर और एक महीने के भीतर का उपयोग करें या -20 डिग्री सेल्सियस पर दुकान और 3 महीने के भीतर का उपयोग करें।
  3. ऊतक संस्कृति को अतिरिक्त कोशिकीय मैट्रिक्स के साथ कोट करें।
    नोट: जैविक सवाल के आधार पर पूछा जा रहा है, मैट्रिक्स कांच के नीचे संस्कृति व्यंजन, प्लास्टिक ऊतक संस्कृति व्यंजन या कांच कवर फिसल जाता है पर लेपित किया जा सकता है. मैट्रिक्स सब्सट्रेट पर निर्भर भिन्न ECM आधारित hydrogel कमजोर पड़ने के लिए नीचे देखें. फाइब्रोनेक्टिन का कांच के नीचे वाले व्यंजन पर परीक्षण किया गया है और नीचे निर्दिष्ट सांद्रता पर ही कवर स्लिप किया गया है। यहाँ पर, हम "कोट प्लेटें" के रूप में सब्सट्रेट लेपित सतहों का उल्लेख करेंगे।
    1. ECM आधारित hydrogel के साथ ऊतक संस्कृति सतहों कोट.
      नोट: चढ़ाना जब तक सब्सट्रेट ठंड रखें, या तो मीडिया ठंडा या बर्फ पर रखने के द्वारा.
      1. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर हाइड्रोजेल था। 10 एमएल के अंतिम खंड के लिए 5 एमएल हाइड्रोजेल में 10% एफबीएस का 5 एमएल जोड़ें (सामग्री की तालिकादेखें )।
      2. 0ण्5-1 एमएल एलिकोट्स को सुविधाजनक बनाएं और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      3. बर्फ पर हाइड्रोजेल एलिकोट्स को थपथपाओ।
      4. प्लास्टिक कोट करने के लिए hydrogel स्टॉक के एक 1:20 कमजोर पड़ने का प्रयोग करें.
      5. कांच स्लाइड और कांच के नीचे ऊतक संस्कृति प्लेटों कोट करने के लिए hydrogel स्टॉक के 1:5 कमजोर पड़ने का प्रयोग करें।
        नोट: ठंड DMEM में hydrogel को पतला.
      6. वांछित क्षेत्र को प्लेटों/स्लाइडों पर कवर करने के लिए पर्याप्त पतला हाइड्रोजेल लगाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर 30-45 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
      7. लेपित प्लेटों/स्लाइडों का तुरंत उपयोग करें या रात को 4 डिग्री सेल्सियस पर लेपित स्लाइडों को स्टोर करें।
      8. अतिरिक्त राशि निकालें और उपयोग करने से पहले उच्च ग्लूकोज DMEM (वैकल्पिक) के साथ स्लाइड कुल्ला.
    2. टिशू कल्चर को फाइब्रोनेक्टिन से कोट करें।
      1. 1 मिलीग्राम/एमएल फाइब्रोनेक्टिन स्टॉक समाधान के एलिकोट बनाएं और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। Dulbecco के पीबीएस (dPBS) के साथ एक अंतिम एकाग्रता के लिए 1 g/
      2. वांछित क्षेत्र को कवर करने के लिए पर्याप्त फाइब्रोनेक्टिन लागू करें और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर इनक्यूबेट करें।
      3. अवशिष्ट fibronectin निकालें और कांच 30-45 मिनट के लिए सूखने के लिए अनुमति देते हैं।
      4. उपयोग करने से पहले कुओं या कवर पर्चियों को उच्च ग्लूकोज डीएमईएम (वैकल्पिक) के साथ कवर करें।

2. दिन 1: जल्दी सोमाइट चरण भ्रूण का विच्छेदन

नोट: बाँझ उपकरण और बाँझ समाधान का उपयोग करें। यदि जीनोटाइपिंग की आवश्यकता है, डीएनए निष्कर्षण के लिए भ्रूण के शरीर को इकट्ठा.

  1. कपाल तंत्रिका प्लेट का विच्छेदन 8.5 दिनों के बाद coitum (dpc) पर भ्रूण के लिए प्रतिबंधित है. 5-8 कायअवस्था अवस्था में भ्रूणों का चयन की जाए। गर्भाशय को पीबीएस में काटें और प्रत्येक भ्रूण को अलग करने के लिए मध्याह्न को काट दीं (चित्र 1क) गर्भाशय के ठेकों की पेशीय दीवार तथा विदारक ऊतक दिखाई देंगे (चित्र 1 ख)
    नोट: बर्फ ठंडा पीबीएस में गर्भाशय में भ्रूण बनाए रखें, जबकि विच्छेदन एक समय में एक भ्रूण प्रदर्शन कर रहे हैं। दृश्यता में सुधार और संदूषण को कम करने के लिए ताजा बाँझ पीबीएस में एक ग्लास पेस्टर पिपेट के साथ भ्रूण ले जाएँ।
  2. मांसपेशी परत और डेसीड्यूल ऊतक के बीच स्लाइड बलप्स और संदंश की दूसरी जोड़ी के साथ मांसपेशियों की परत को हटा दें (चित्र 1C)।
  3. संदंश का प्रयोग करके मध्याश्रयध्रुव के किनारों पर डेसीड्यूम को भेदकर और दूसरी जोड़ी संदंश के साथ ध्रुव के लंबवत खुलने के लिए फाड़ दिया जाता है।
  4. रेकर्ट की झिल्ली की कल्पना करने के लिए संदंश के साथ decidual ऊतक वापस छील.
  5. Reichert की झिल्ली को ध्यान से निकालें। आंत की जर्दी थैली दिखाई देती है और भ्रूण अंदर देखा जा सकता है (चित्र 1D) .
  6. आंत की जर्दी थैली और मम्निया निकालें (चित्र 1ई) और सिर की तह की कल्पना करने के लिए भ्रूण को रख दें (चित्र 1 एफ) .
  7. हृदय के ऊपर सिर की परत काटें और एक स्वच्छ तंत्रिका प्लेट (एनपी) प्राप्त करने के लिए संद-याक उपकरणों का उपयोग करके अंतर्निहित मध्यजनों को दूर कर दें (चित्र 1एच)।
    नोट: एनपी को पूरी तरह रखा जा सकता है या एंट्रोपोस्टर अक्ष के नीचे विभाजित किया जा सकता है ताकि प्रत्येक पक्ष को अलग-अलग चढ़ाया जा सके। तंत्रिका प्लेट सीमा आगे explants के लिए न्यूरॉन योगदान को कम करने के क्रम में तंत्रिका प्लेट से दूर छंटनी की जा सकती है.
  8. वातानुकूलित तंत्रिका शिखर मीडिया से भरा एक hydrogel लेपित पकवान पर विच्छेदन तंत्रिका प्लेट स्थानांतरित करने के लिए एक गिलास पाश्चर पिपेट का प्रयोग करें।
  9. धीरे से अच्छी तरह के बीच में एनपी स्थिति के लिए पकवान घूमता है. यह लाइव-सेल इमेजिंग के लिए चरण की गुणवत्ता को अधिकतम करने के लिए महत्वपूर्ण है (दिन 2 पर)।
  10. 5% सीओ2में 37 डिग्री सेल्सियस पर रात भर (या वांछित समय-बिंदु के लिए) इनक्यूबेट करें। तंत्रिका शिखर कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से तंत्रिका प्लेट से बाहर पलायन किया जाना चाहिए।
    नोट: सेल आमतौर पर 6-8 ज के भीतर संलग्न हैं। एक्सप्लांट संलग्न करने के बाद, माइग्रेट कोशिकाओं को विज़ुअलाइज़ करने के लिए अधिक समय दें. आमतौर पर 24 एच के बाद explant द्वारा, हम कोशिकाओं के तीन अलग आबादी पा सकते हैं. पहली आबादी, एक्सप्लांट के केंद्र में, तंत्रिका प्लेट (एनपी) है। दूसरी आबादी, प्रवासी नेकां (पीएनसी), कोशिकाओं की एक उपकला शीट में एनपी को घेरे हुए है। तीसरी जनसंख्या, बाहर की अंगूठी में, प्रवासी नेकां (एमएनसी) से बनती है, जो आकार में बड़ी होती है, और पूरी तरह से मेसेन्किमल दिखाई देती है (चित्र 2)।

3. दिन 2: murine कपाल तंत्रिका शिखर कोशिकाओं की लाइव सेल इमेजिंग

नोट: इमेजिंग 24 एच पोस्ट explanting पर किया जाना चाहिए बेहतर छवि और मात्रा तंत्रिका शिखर सेल प्रवास. नेकां प्रेरण मीडिया लाइव सेल इमेजिंग से पहले ताजा करने की जरूरत नहीं है. एक उल्टे माइक्रोस्कोप तक पहुंच, एक मोटर चालित चरण और एक शामिल पर्यावरण कक्ष के साथ आवश्यक है। इमेजिंग(सामग्री की तालिका)के लिए उपयुक्त बहु-वेल ऊतक संस्कृति व्यंजन का उपयोग करें।

  1. माइक्रोस्कोप सेट-अप
    1. पर्यावरण कक्ष को 37 डिग्री सेल्सियस तथा 5% ब्व्2पर सेट करें।
    2. ऊतक संस्कृति प्लेट ढक्कन के ढक्कन में एक छेद पियर्स सीओ2 सुई की अनुमति देने के लिए, सीओ2 humidification कक्ष से जुड़े, थाली के भीतर बैठने के लिए.
    3. नमूने धारक में ऊतक संस्कृति पकवान प्लेस और प्लेट ढक्कन और सीओ2 सुई नीचे टेप बहु अच्छी तरह से अधिग्रहण के दौरान मिलाते हुए रोकने के लिए.
    4. माइक्रोस्कोप नियंत्रक, मंच नियंत्रक और इमेजिंग सॉफ्टवेयर पर स्विच करें।
    5. 10x आवर्धन पर कपाल NC कोशिकाओं पर ध्यान केंद्रित (चयनित संघनित्र में मिलान चरण अंगूठी के साथ).
    6. क्षेत्र आईरिस डायाफ्राम, एपर्चर आईरिस डायाफ्राम और सेंटरिंग दूरबीन का समायोजन करके माइक्रोस्कोप पर उच्च गुणवत्ता वाले चरण-कंट्रास्ट सेट करें, जैसा कि माइक्रोस्कोप सेट-अप मैनुअल में निर्दिष्ट किया गया है।
  2. चरण कंट्रास्ट लाइव-सेल इमेजिंग
    1. उस निर्देशिका या फ़ाइल स्थान को सेट करें जहाँ समय-चूक फ़ाइलें सहेजी जाएँगी.
    2. जोखिम समय, binning, और कैमरा क्षेत्र सेट करें।
    3. समय बिंदुओं की संख्या, फ़्रेम के बीच इमेजिंग की अवधि और समय अंतराल सेट करें.
      1. नेकां सेल प्रवासी क्षमता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, 10x आवर्धन करने के लिए माइक्रोस्कोप सेट, 1 फ्रेम हर 5 मिनट (217 समय अंक 18 ज से अधिक) ले रही है। कोशिका आकारिकी की मात्रा निर्धारित करने के लिए, 40x के लिए आवर्धन सेट, 1 फ्रेम / lamellipoddial गतिशीलता की मात्रा निर्धारित करने के लिए, 40x या 60x आवर्धन के लिए आवर्धन सेट, 1 फ्रेम हर 10 s (10 मिनट से अधिक) ले रही है.
    4. बहु अच्छी तरह से इमेजिंग के लिए, यांत्रिक चरण ब्याज की चयनित XY पदों के बीच ले जाने के लिए निर्धारित किया है। पुष्टि करें कि कपाल नेकां कोशिकाओं ध्यान में हैं और मंच की स्थिति सही हैं.
    5. समय चूक इमेजिंग प्रारंभ करने के लिए प्राप्त करें आदेश का उपयोग करें.
    6. एक बार समय चूक इमेजिंग पूरा हो गया है, बहुआयामी डेटा की समीक्षा करें और विश्लेषण के लिए .stk फ़ाइलों को निर्यात.
      नोट: .stk TIFF स्टैक फ़ाइल है।
    7. सॉफ्टवेयर से बाहर निकलें, कंप्यूटर को बंद कर दें और मंच, कैमरा और माइक्रोस्कोप नियंत्रकों को बंद कर दें।

4. इमेजिंग विश्लेषण: तंत्रिका शिखर सेल प्रवास का परिमाणीकरण

नोट: बेहतर murine कपाल तंत्रिका शिखर कोशिकाओं पलायन द्वारा प्रदर्शित सेलुलर व्यवहार को परिभाषित करने के लिए, हम विशेष रूप से प्रवासी क्षमता और सेल आकार गतिशीलता पर ध्यान केंद्रित परिमाणात्मक प्रवासी मापदंडों की एक श्रृंखला का विश्लेषण किया है। (1) प्रवासन (संचित दूरी) सेल द्वारा ली गई कुल पथ लंबाई है ($m); (2) प्रवासन (यूक्लिडियन दूरी) सेल के प्रारंभिक और अंतिम स्थिति के बीच सीधी रेखा की दूरी है ($m); (3) प्रवासन (सेल गति) समय की प्रति इकाई सेल द्वारा कूच दूरी है ($m/ (4) कोशिका आकृति (कोशिका क्षेत्र) कोशिका द्वारा आच्छादित कुल सतह है। इमेजिंग माइक्रोस्कोप के अनुसार माइक्रोन पैमाने पर पिक्सेल सेट करें। (एक ] एकpx x Npx, जहां एकpx ] पिक्सेल क्षेत्र और एनपिक्सल की संख्या ] पिक्सल की संख्या। इकाइयों: $m2; (5) कोशिका आकृति (कोशिका वृत्ताकारता) एक पूर्ण वृत्त से कोशिका आकृति का विचलन है जो 1ण्0 (4$ (ए/पी2)) के वृत्ताकारता मान द्वारा दर्शाया गया है, जहाँ एक क्षेत्र और च् $ परिमाप है।

  1. एकल सेल ट्रैकिंग
    नोट: नेकां सेल प्रवास को मापने के लिए, XY सभी समय चूक फ्रेम भर में अलग-अलग कोशिकाओं के निर्देशांक उत्पन्न कर रहे हैं। यह दूरी, गति और सेल प्रवास के दृढ़ता उपायों के बाद विश्लेषण के लिए अनुमति देता है.
    1. ImageJ खोलें और TIFF स्टैक फ़ाइलों के रूप में डेटा आयात करें।
    2. विश्लेषण करें क्लिक करें ] पिक्सेल/$m में कार्य करते हुए माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के अनुसार .stk फ़ाइलों को जांचने के लिए स्केल सेट करें.
    3. Plugins पर क्लिक करें | ट्रैकिंग ] मैनुअल ट्रैकिंग छवि जम्मू मैनुअल सेल ट्रैकिंग प्लगइन खोलने के लिए. कक्ष ट्रैकिंग शुरू करने के लिए, ट्रैक जोड़ेंका चयन करें.
    4. समय चूक फिल्मों के सभी फ्रेम के माध्यम से ट्रैक कोशिकाओं, एक संदर्भ बिंदु के रूप में नाभिक का उपयोग कर.
      नोट: 10-20 कोशिकाओं को प्रति एक्सप्लांट ट्रैक किया जाना चाहिए, कुल 60 कोशिकाओं को ट्रैक किया गया (एन जेड 3)। समय चूक के दौरान सेल विभाजन से गुजरना करने वाले कोशिकाओं को विश्लेषण से बाहर रखा जाना चाहिए।
    5. परिणामों को .csv फ़ाइल के रूप में सहेजें और निर्यात करें. परिणाम अलग-अलग सेल ट्रैक संख्या, टुकड़ा संख्या और XY सभी फ्रेम पर निर्देशांक का प्रतिनिधित्व करते हैं।
  2. तंत्रिका शिखर कोशिका प्रवासी क्षमता का परिमाणीकरण
    1. एकल कक्ष ट्रैकिंग डेटा खोलें (ऊपर देखें). .csv फ़ाइलों को .txt फ़ाइल स्वरूप में कनवर्ट करें.
    2. प्रवास सॉफ्टवेयर खोलें (सामग्री की तालिका)। कक्ष ट्रैकिंग डेटा को .txt फ़ाइल के रूप में आयात करने के लिए डेटा आयात करें टैब पर क्लिक करें.
    3. डेटासेट के अंतर्गत | प्रारंभिक,विश्लेषण किया जा करने के लिए स्लाइस या फ्रेम की संख्या का चयन करें और XY अंशांकन और फ्रेम के बीच समय अंतराल सेट. सेटिंग्स सहेजने के लिए सेटिंग्स लागू करें का चयन करें.
    4. प्रक्षेप पथ भूखंडों के रूप में प्लॉट डेटा प्रतीक का चयन करें। दूरी और गति उपायों की मात्रा निर्धारित करने के लिए सांख्यिकी प्रतीक का चयन करें।
    5. पथ पथ प्लॉट्स को बिटमैप (.bmp) फ़ाइलों के रूप में सहेजें, और दूरी और गति उपायों को .txt फ़ाइलों के रूप में सहेजें. डेटा निकालें प्रतीक का चयन करें. अन्य समय चूक फ़ाइलों के लिए दोहराएँ.
      नोट: प्रक्षेपक भूखंडों का उपयोग किसी दिए गए सेल की स्थिति या राज्य के लिए समय-समय पर होने वाली फिल्मों के दौरान अलग-अलग सेल पथों की प्रत्यक्षता की कल्पना करने के लिए किया जा सकता है (चित्र 4क)। .txt फ़ाइलों में संग्रहीत दूरी और गति डेटा का उपयोग आगे के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है.
  3. तंत्रिका शिखर कोशिका क्षेत्र और वृत्ताकारता का परिमाणीकरण
    1. ImageJ में समय चूक .stk फ़ाइलें खोलें और माइक्रोस्कोप सेटिंग्स के अनुसार जांचना, पिक्सेल में काम कर /
    2. विश्लेषण के अंतर्गत ] मापन सेट करें,कक्ष आकृति पैरामीटर का चयन करने के लिए क्लिक करें: कक्ष क्षेत्र, पेरीमीटर और आकृति वर्णनकर्ता.
    3. एक गाइड के रूप में सेल झिल्ली सीमाओं का उपयोग कर, मैन्युअल रूप से प्रत्येक सेल के आसपास आकर्षित करने के लिए फ्रीहैंड चयन उपकरण का उपयोग करें।
    4. छवि पर कक्ष बाह्यरेखा ओवरlain बनाए रखने के लिए कुंजीपटल पर Ctrl + B कुंजियाँ दबाएँ. हर समय चूक फ्रेम पर कोशिकाओं के लिए दोहराएँ.
    5. छवि का उपयोग करें | ओवरले ] मान संग्रहीत करने के लिए ROI प्रबंधक करने के लिए।
    6. एक बार प्रति फ़्रेम ब्याज के सभी कक्षों को रेखांकित कर दिया गया है, उपायक्लिक करें. परिणामों को .csv फ़ाइल के रूप में सहेजें.
      नोट: प्रति फिल्म 10-20 कोशिकाओं को रेखांकित किया जाना चाहिए, कुल 30-60 कोशिकाओं के साथ प्रति शर्त का विश्लेषण किया (द ] 3). सेल आकृति डेटा (.csv फ़ाइलें) का उपयोग यह निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है कि सेल आकृति गतिशीलता समय के साथ कैसे बदलती है (चित्र 4C) या विभिन्न सेल उपचारों के अंतर्गत आकृतिविज्ञान को कैसे बदला जा सकता है.

Representative Results

यहाँ प्रदर्शित प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, माउस भ्रूण गर्भाशय से विच्छेदित किए गए थे, और भ्रूणबाह्य ऊतकों को हटा दिया गया था(चित्र 1A-D)। भ्रूण का मंचन किया गया (केवल भ्रूणों का उपयोग 5-8 सोमियों (स) में किया गया था, चित्र 1ई, एफ)। कपाल तंत्रिका प्लेट तो विच्छेदन किया गया था और neuroepithelium अलग किया गया था. मेसोडरमल कोशिकाओं, ढीला, परिपत्र, mesenchymal कोशिकाओं के रूप में पहचान की, धीरे से बंद ब्रश किया गया (चित्र 1जी-एल). पूर्वकाल तंत्रिका प्लेट पूरे explanted किया जा सकता है, जो मामले में तंत्रिका शिखर ऊतक बाद में उभरने और explant के आसपास रेडियल विस्तार होगा, या प्रत्येक तंत्रिका प्लेट सीमा (दाएं और बाएँ) अलग से लगाया जा सकता है. यह विशेष रूप से उपयोगी है जब आनुवंशिक उत्परिवर्ती से explanting.

24 ज के भीतर, पूर्वप्रवास (एपिथेलियल) कपाल तंत्रिका शिखर का एक क्षेत्र स्पष्ट रूप से तंत्रिका प्लेट एक्सप्लांट के चारों ओर देखा जा सकता है (चित्र 2ख)। इसके अलावा, तंत्रिका शिखर कोशिकाओं की एक उपजनसंख्या मेसेन्काइमल संक्रमण के लिए उपकला से गुजरी है और पूरी तरह से मेसेनकाइमल दिखाई देती है (चित्र 2)। इस प्रकार, हमारे पास अलग-अलग कोशिकाओं के कई गाढ़ा छल्ले हैं, केंद्र में तंत्रिका प्लेट (एनपी) के साथ, मध्यवर्ती वृत्त में प्रवासी तंत्रिका शिखर (पीएनसी) और बाहर की अंगूठी में प्रवासी तंत्रिका शिखर (एमएनसी) की आबादी(चित्र 2ख)। नेकां कोशिकाओं का पता लगाने के लिए, आनुवंशिक रूप से संशोधित माउस मॉडल का उपयोग करना संभव है जैसा कि हम चित्र 2Cमें दिखाते हैं। इस मामले में, हम तंत्रिका शिखर विशिष्ट Wnt1 का इस्तेमाल किया है::Cre; रोजाएम टी एम जी जिसके परिणामस्वरूप नेकां कोशिकाओं को हरे रंग में लेबल किया जा रहा है। इन चूहों में, कोशिकाओं झिल्ली टमाटर व्यक्त (एमटी, लाल रंग में) जब तक वे Cre recombinase व्यक्त कर रहे हैं. पुनर्संयोजन झिल्ली हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त कोशिकाओं की ओर जाता है (GFP, हरे रंग में). एक्सप्लांट के केंद्र में दिखाई गई लाल कोशिकाएं न्यूरल प्लेट सेल हैं। कुछ पृष्ठीय तंत्रिका प्लेट कोशिकाओं को भी GFP व्यक्त; दीर्घकालिक संस्कृति के लिए, हम केंद्र में कोशिकाओं के सभी उत्पाद निकालना होगा. हमारे प्रयोजनों के लिए, explant की शुद्धता के लिए विभिन्न तंत्रिका शिखर कोशिका आबादी को ट्रैक करने के लिए पर्याप्त है. जहां तंत्रिका शिखर की उच्च शुद्धता आवश्यक है, इस आनुवंशिक लेबलिंग रणनीति को फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छँटाई (FACS) के साथ जोड़ा जा सकता है ताकि जनसंख्या की शुद्धता सुनिश्चित की जा सके। वैकल्पिक रूप से, यह explants को ठीक करने और एंटीबॉडी लेबलिंग के साथ नेकां आबादी की पहचान करने के लिए संभव है.

यह भी 24 ज द्वारा स्पष्ट किया गया था कि प्रवासी और पूर्णत: प्रवासी नेकां कोशिकाओं के प्रवासी संकेंद्री छल्ले मैट्रिक्स पसंद द्वारा निर्भर नहीं थे और न ही नियंत्रित थे (चित्र 3)। ईसीएम आधारित हाइड्रोगेल और फाइब्रोनेक्टिन दोनों पर चढ़ाए गए एक्सप्लांट कल्चर्स ने तुलनीय एक्सप्लांट संरचनाओं का गठन किया, जिसमें तीन कोशिका आबादी, एनपी, पीएनसी और एमएनसी (चित्र 3ए, सी)शामिल हैं। तंत्रिका शिखर कोशिका आकारिकी भी ईसीएम आधारित हाइड्रोजेल और फाइब्रोनेक्टिन पर चढ़ाया उन लोगों के बीच तुलनीय था (चित्र 3बी, डी)। तथापि, फाइब्रोनेक्टिन पर चढ़ाए गए एक्सप्लांट्स सेल अग्रणी किनारे पर अधिक प्रमुख लैमेलीपोडिया के साथ कोशिकाओं का उत्पादन करते हैं, जो प्रवास की दिशा में अधिक ध्रुवित प्रतीत होता है (चित्र 3ठ, D)।

एक बार प्रवासी तंत्रिका शिखर कोशिकाओं की आबादी स्पष्ट है, लाइव सेल इमेजिंग पूरा किया जा सकता है. समय-चूक माइक्रोस्कोपी को नेकां सेल प्रवास के अनुवर्ती विश्लेषण के लिए 10x आवर्धन (18 ज, 1 फ़्रेम/5 मिनट) पर सेट किया गया है (चित्र 4क)। ImageJ मैनुअल ट्रैकिंग प्लग में समय चूक फिल्मों के सभी फ्रेम पर व्यक्तिगत कोशिकाओं के XY निर्देशांक उत्पन्न करता है (चित्र 4B). इन निर्देशांकों को माइग्रेशन सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके संसाधित किया जा सकता है. इस सॉफ्टवेयर को समय के साथ अलग-अलग सेल पटरियों के दृश्य सक्षम बनाता है (चित्र 4B) और संचित और यूक्लिडियन दूरी, साथ ही सेल गति की मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

समय-चूक इमेजिंग डेटा भी कपाल तंत्रिका शिखर कोशिकाओं के प्रवास के दौरान सेल आकारिकी पर जानकारी का खजाना प्रदान करता है (चित्र 4C)। अलग-अलग कोशिका झिल्ली रूपरेखा द्वारा, कोशिका क्षेत्र और परिधि माप फिल्मों के सभी फ्रेम से गणना की जा सकती है (चित्र 4C) . ये माप सेल क्षेत्र के बाद परिमाणीकरण और वृत्ताकारता के लिए अनुमति देते हैं (चित्र 4D) चित्र 4C 18 ज से अधिक सेल आकृति परिवर्तनों का विश्लेषण दिखाता है, ध्यान दें कि जैसे-जैसे कोशिकाएं एक्सप्लांट से दूर स्थानांतरित होती हैं, सेल क्षेत्र में काफी वृद्धि होती है, जबकि सेल सर्कुलरिटी अपेक्षाकृत स्थिर रहती है (एक-तरफा ANOVA, Tukey की एकाधिक तुलना परीक्षण) () चित्र 4E,F) यह पता चलता है कि के रूप में कोशिकाओं उपकला किनारे से रवाना और सेल सेल संपर्क खो, वे वृद्धि हुई सेल प्रसार क्षेत्र दिखा. समय के साथ सेल परिपत्र उपायों में महत्वपूर्ण परिवर्तन नहीं हुआ; तथापि, परिपत्रमें में अल्पकालिक परिवर्तन ों को देखा जा सकता है यदि समय बिंदुओं की बढ़ी हुई संख्या निर्धारित की जाती है। सेल परिपत्र उपाय भी एक chemotactic क्यू की उपस्थिति में या सीमित परिस्थितियों में सेल आकार गतिशीलता पर दिलचस्प डेटा प्रदान कर सकते हैं.

Figure 1
चित्र ाााः कपालीय तंत्रिका कृष् ण का पृथक्णन एक म्8ण्5 भ्रूण से क्षत-पूर्वार्णम् ।
छवियाँ माइक्रो विच्छेदन तकनीक का दस्तावेजीकरण एक वीडियो से अभी भी कर रहे हैं. (ए-सी) गर्भाशय से भ्रूण का विच्छेदन. (बी-सी) दो तेज बलप का उपयोग करना, धीरे मांसपेशियों की परत के अलावा खींच. पैनल (डी) आंत की जर्दी थैली (पीली रेखा) के अंदर भ्रूण से पता चलता है. आंत की जर्दी थैली से भ्रूण निकालें. (ई) 8ण्5 पार्श्व अवस्था में भ्रूण के पार्श्वीय विचार। (च) चरण 8-5 पर भ्रूण का डोर्सल दृश्य। भ्रूण की उम्र निर्धारित करने के लिए सोमाइट्स (एस एस) की गणना करें; आमतौर पर 5-8 एस (एफ में पीले घेरे)। (छ) भ्रूण के कपालीय क्षेत्र को निकट से देखें। कपाल क्षेत्र से अतिरिक्त भ्रूण झिल्ली निकालें; सोमाइट पीले रंग की रेखा से चिह्नित हैं। (एच) पूर्वकाल तंत्रिका प्लेट के विच्छेदन प्रथम क्लोम चाप (पीली रेखा) के अंतर्गत निष्पादित किए जाते हैं। (i) पूर्वकाल तंत्रिका प्लेट विच्छेदन का पार्श्व दृश्य। तंत्रिका परतों, जहां तंत्रिका शिखर कोशिकाओं उठता है, एक पीले रंग की रेखा के साथ चिह्नित कर रहे हैं. (जे-एल) तैयार संस्कृति व्यंजनों पर एनपी चढ़ाना से पहले जितना संभव हो उतना पूर्वकाल तंत्रिका परतों अंतर्निहित मध्यचर्म ऊतक (फ्लफमे मेसेन्काइमल कोशिकाओं) निकालें। मूवी 3.0X ज़ूम पर एक widefield apochromatic लेंस के साथ एक स्टीरियो-माइक्रोस्कोप का उपयोग कर लिया गया था (सामग्री की मेजदेखें). कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र2: Murine कपाल तंत्रिका शिखर explant.
(क) एक ई8-5 माउस भ्रूण के पृष्ठीय दृश्य का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। भ्रूण का कपालीय क्षेत्र डैश्ड लाइन पर काटा जाता है। तंत्रिका प्लेट सीमा (लाल रंग में प्रकाश डाला) आसपास के mesoderm ऊतक से अलग है और 24 एच के लिए सुसंस्कृत कपाल तंत्रिका शिखर उत्प्रवास करने के लिए अनुमति देने के लिए. 22,23से अनुकूलित स्केमेटिक . (बी) वाम: एक कपाल तंत्रिका शिखर के प्रतिनिधि उज्ज्वल क्षेत्र छवि चढ़ाना के बाद 24 घंटे. कोशिकाओं की तीन आबादी देखी जाती है, जो दाईं ओर भी योजनाबद्ध होती हैं। एनपी - तंत्रिका प्लेट, पीएनसी - पूर्व प्रवासी तंत्रिका शिखर और mNC - प्रवासी तंत्रिका शिखर. स्केल बार $ 250 डिग्री मी. (C) आनुवंशिक रूप से लेबल माउस से एक explant के उच्च आवर्धन छवियों(Wnt1::cre; रोजाएम टी एम जी)। क्रे ड्राइवर के बिना कोशिकाओं लाल रंग में झिल्ली टमाटर (एमटी) एक्सप्रेस. एक तंत्रिका शिखर विशिष्ट Wnt1 प्रमोटर के नियंत्रण में Cre की अभिव्यक्ति एम टी कैसेट और हरे रंग में झिल्ली GFP (एमजी) की अभिव्यक्ति के उच्छेदन की ओर जाता है. Nuclei Hoescht (नीले रंग में) के साथ दाग रहे हैं. स्केल बार ] 200 डिग्री मी. (डी-डी') झिल्ली GFP (D) व्यक्त प्रवासी कोशिकाओं के उच्च आवर्धन छवियों. (डी') डीएनए Hoescht (नीला) के साथ लेबल है. (डी') डी और डी का मर्ज. स्केल बार ] 20 डिग्री मी. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्र 3: विभिन्न substrates पर सुसंस्कृत पौधों को बाहर निकालना.
(ए-बी) explants के चरण विपरीत छवियों वाणिज्यिक ECM-hydrogel पर सुसंस्कृत. (सी-डी) एक्सप्लांट्स 1 ग्राम/एमएल फाइब्रोनेक्टिन पर सुसंस्कृत होते हैं। तंत्रिका प्लेट (एनपी), प्रवासी (पीएनसी) और प्रवासी (एमएनसी) तंत्रिका शिखर कोशिकाओं को उनके भिन्न सेल मॉर्फोलोजी द्वारा प्रतिष्ठित किया जा सकता है। स्केल बार ] 100 डिग्री मी. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: कपाल तंत्रिका शिखर कोशिका प्रवास और सेल आकार गतिशीलता का परिमाणीकरण|
(क) ImageJ/फिजी मैनुअल सेल ट्रैकिंग प्लग-इन का उपयोग करते हुए, एकल तंत्रिका शिखर सेल ट्रैकिंग के साथ मढ़ा हुआ एक्सप्लांट संस्कृतियों के समय-अंतराल इमेजिंग से चरण-विपरीत फ्रेम। दस प्रतिनिधि एमएनसी कोशिकाओं को मैन्युअल रूप से 18 ज (217 फ्रेम) और XY पर ट्रैक किया गया था निर्देशांक निर्यात किए गए। डेटा को ओवरले डॉट और लाइन प्लॉट्स के रूप में प्रदर्शित किया जाता है. कोशिकाओं को 1 ग्राम/एमएल फाइब्रोनेक्टिन पर चढ़ाया गया था। स्केल बार ] 200 डिग्री मी. (बी) माइग्रेशन सॉफ्टवेयर का उपयोग करके उत्पन्न 10 एमएनसी कोशिकाओं का प्रतिनिधि प्रक्षेप पथ भूखंड। (ग) एक्सप्लांट संस्कृतियों के समय-चूक विश्लेषण से ली गई चरण-विपरीत फ्रेम। डैश्ड लाइनों 8 प्रतिनिधि प्रवासी तंत्रिका शिखर कोशिकाओं सेल आकार गतिशीलता के लिए विश्लेषण की रूपरेखा जब 1 g/mL fibronectin पर चढ़ाया. स्केल बार ] 200 डिग्री मी. (घ) सेल क्षेत्र और वृत्ताकारता की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रयुक्त परिकलनों का योजनाबद्ध निरूपण। योजनाबद्ध की कोशिका आकृति विज्ञान नीले (ग)में हाइलाइट किए गए कोशिका की है। एकpx [ पिक्सेल क्षेत्र, Npx ] पिक्सेल संख्या, एक $ क्षेत्र, P ] परिधि (1 पिक्सेल $ 1.60772 $m2). (ई-एफ) समय के साथ सेल क्षेत्र और सेल परिपत्र उपायों का परिमाणीकरण। डेटा मतलब का प्रतिनिधित्व करता है - SEM. प्रत्येक बिंदु एक सेल का प्रतिनिधित्व करता है (n $ 60), 3 स्वतंत्र प्रयोगों से लिया, और 0 एच, 6 एच, 12 एच और 18 एच (एन ्स गैर महत्वपूर्ण, * पी एंड एलटी;0.05, * * * * एक तरह से ANOVA, Tukey के कई तुलना परीक्षण पर विश्लेषण किया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

स्तनधारी तंत्रिका शिखर कोशिकाओं का अध्ययन स्तनधारी विकास के utero प्रकृति की वजह से वैज्ञानिकों के लिए एक चुनौती रहा है. विवो अध्ययन में स्थापित करने के लिए मुश्किल है, के रूप में भ्रूण शर्तों है कि गर्भाशय में जीवन की नकल के तहत हेरफेर किया जाना चाहिए. व्यवहार में, यह reproducibly संस्कृति इन (E8+) भ्रूण 24 एच से अधिक समय के लिए, विशेष रूप से लाइव इमेजिंग के लिए लगभग असंभव है. इसके अलावा, तंत्रिका शिखर प्रेरण और प्रवास एक साथ तंत्रिका ट्यूब बंद करने और माउस में भ्रूण मोड़ के साथ होते हैं; यह एक महत्वपूर्ण और तनावपूर्ण morphogenetic घटना है, जो अक्सर विफल रहता है जब भ्रूण सुसंस्कृत पूर्व uteroहैं. इस प्रकार, पूर्व utero दृष्टिकोण की सफलता दर आम तौर पर कम है. अमर नेकां कोशिकाओं का उपयोग21 पशु उपयोग को कम करने के लिए एक उपयोगी उपकरण है और यह लंबी अवधि के विश्लेषण, transfection, और संवर्धन अध्ययन के लिए तंत्रिका शिखर कोशिकाओं का एक बेहतर स्रोत प्रदान कर सकते हैं. हालांकि, वहाँ स्पष्ट रूप से मज़बूती से प्राथमिक तंत्रिका शिखर कोशिकाओं संस्कृति की जरूरत है. हमारी विधि माउस नॉक आउट या सशर्त आनुवंशिक मॉडल के लिए लागू है. हमारे लिए एक तुलनीय विधि अन्य तंत्रिका शिखर आबादी20के लिए वर्णित किया गया है ; हालांकि, हमारी विधि अच्छी तरह से murine कपाल नेकां कोशिकाओं के कदम दर कदम अलगाव का वर्णन करता है. हम विभिन्न मैट्रिक्स के उपयोग के साथ-साथ विस्तार से माइग्रेशन विश्लेषण प्रक्रिया का भी वर्णन करते हैं।

लगातार परिणाम प्राप्त करने के लिए, हमने पाया कि भ्रूण के चयन के दौरान मंचन की दिशा में विशेष ध्यान दिया. आश्चर्य नहीं कि सोमियों की संख्या कपाल नेकां के विकास में विभिन्न चरणों से संबंधित है। इसलिए, भ्रूण शरीर रचना विज्ञान का ज्ञान किसी भी प्रयोगात्मक डेटा प्राप्त करने से पहले बहुत महत्वपूर्ण है. इस दृष्टिकोण तो तंत्रिका शिखर कोशिकाओं के असतत आबादी अलग करने की दिशा में अनुकूलित किया जा सकता है, जैविक सवाल और लक्ष्य कोशिकाओं पर निर्भर करता है.

एक बार भ्रूण का चयन किया और विच्छेदन कर रहे हैं, mesodermal कोशिकाओं को आसानी से प्रतिष्ठित किया जा सकता है और बेहतर दृश्य की अनुमति देने के लिए और संदूषण को कम करने के लिए हटाया जाना चाहिए. लंबी अवधि की संस्कृतियों के लिए, तंत्रिका प्लेट ऊतक तंत्रिका ऊतकों द्वारा संदूषण को रोकने के क्रम में चढ़ाना के 24 एच पर हटाया जा सकता है। एक और शोधन फ्लोरोसेंट वंश लेबलिंग का उपयोग हो सकता है (उदाहरण के लिए, एक Wnt1 का उपयोग कर::cre या Sox10::creERT ड्राइवरों फ्लोरोसेंट पत्रकारों के साथ संयुक्त24,25) तंत्रिका शिखर कोशिकाओं से भेद करने के लिए चित्र 2Cमें दर्शाए अनुसार अन्य ऊतक।

पिछली रिपोर्ट विभिन्न matrices पर माउस नेकां explant संस्कृतियों चढ़ाना की क्षमता पर प्रकाश डाला है, सबसे अधिक वाणिज्यिक ECM hydrogels पर, fibronectin और कोलेजन मैं20,21,26. हमारे हाथों में, माउस कपाल नेकां explant संस्कृतियों सफलतापूर्वक सभी तीन matrices पर बड़े हो रहे हैं, मूल रिपोर्ट में निर्दिष्ट सांद्रता पर (डेटा नहीं दिखाया). प्रारंभिक परिष्कृत दृष्टिकोण हम अपने नेकां explant संस्कृतियों के लिए अनुकूलित पसंद के मैट्रिक्स के रूप में एक वाणिज्यिक hydrogel इस्तेमाल किया, जो मुख्य रूप से लेमिन और कोलेजन से मिलकर21(चित्र 3ए-बी). हालांकि, इस hydrogel की संरचना स्पष्ट रूप से परिभाषित नहीं है, अज्ञात विकास कारक और प्रोटीन सामग्री के साथ. जैसे, हम के बाद से फाइब्रोनेक्टिन पर माउस नेकां explant संस्कृतियों चढ़ाना करने के लिए हमारे दृष्टिकोण स्थानांतरित कर दिया है (चित्र 3सी-डी). फाइब्रोनेक्टिन अच्छी तरह से परिभाषित किया गया है और अत्यधिक ईसीएम और तहखाने झिल्ली में व्यक्त किया जाता है जिसके साथ नेकां कोशिकाएं माइग्रेट करती हैंin vivo28,29,30. एक फाइब्रोनेक्टिन मैट्रिक्स का अनुकूलन करने के लिए जो सबसे अच्छा न्यूरल शिखर सेल प्रवास और आकृति विज्ञान को प्रतिरूपक बनाता है जैसा कि हाइड्रोजेल का उपयोग करते हुए देखा गया है, हमने नेकां सेल व्यवहार की तुलना हाइड्रोजेल पर 0.25-30 ग्राम/एमएल फाइब्रोनेक्टिन के लिए किया गया है, और परिभाषित 1 g/ आदर्श गुण प्रदान (डेटा नहीं दिखाया गया). हमें विश्वास है कि इस प्रारंभिक काम में मदद मिल सकती है matrices की व्यवस्थित तुलना के लिए एक रूपरेखा स्थापित, ऐसे fibronectin के रूप में, उन पहले से वर्णित के खिलाफ, अर्थात् कोलेजन और laminin32,33,34. यह विशेष रूप से फाइब्रोनेक्टिन बनाम कोलेजन मैं पर माउस नेकां सेल प्रवासी क्षमता की तुलना करने के लिए दिलचस्प होगा, यह देखते हुए कि कोलेजन-IA1 अंतर्जात माउस, एवियन और मानव नेकां कोशिकाओं द्वारा स्रावित होता है28,30,31,32. कोलेजन मैं इसलिए मैट्रिक्स पसंद के विचार में fibronectin के रूप में के रूप में प्रासंगिक है. यह भी स्वीकार करने योग्य है कि मीडिया में विकास कारकों की जैव उपलब्धता विभिन्न मैट्रिक्स घटकों द्वारा बदला जा सकता है, विशेष रूप से हमारे मीडिया के उच्च सीरम सामग्री दी. इस पर काबू पाने के लिए, हम वर्तमान में सीरम मुक्त परिभाषित संस्कृति की स्थिति का उत्पादन काम कर रहे हैं. इन परिभाषित मीडिया सफलतापूर्वक pluripotent स्टेम सेल क्षेत्र में तंत्रिका शिखर प्रेरण प्रोटोकॉल में उपयोग किया जाता है, लेकिन हमारे नेकां explant संस्कृति प्रणाली के लिए आगे अनुकूलन की आवश्यकता33,34. हमारा काम हृदय और ट्रंक नेकां जैसे अन्य प्रकार की नेकां कोशिकाओं के लिए स्थिति को परिष्कृत करने के लिए और नेकां भेदभाव के बाद के अध्ययनों के लिए भी एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में काम कर सकता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल अनुप्रयोगों की एक किस्म के लिए कपाल नेकां कोशिकाओं के अलगाव की अनुमति देता है. हम निर्देशित प्रवास, 3-डी प्रवास और आक्रमण पर अध्ययन की कल्पना करते हैं। इस तरीके से अलग कोशिकाओं का इलाज किया जा सकता हैin vitroविश्लेषण के एक नंबर के लिए. उदाहरण के लिए, कोशिकाओं को आसानी से विशिष्ट प्रोटीन को लक्षित करने के लिए विभिन्न छोटे अणुओं का उपयोग कर इलाज किया जा सकता है, वे निर्धारित समय बिंदुओं पर इलाज किया जा सकता है, और washout प्रयोगों सेल व्यवहार की वसूली निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया जा सकता है (चित्र 4). transfection और भेदभाव परख के लिए लंबी अवधि की संस्कृति संभव है, साथ ही कोशिकाओं के पारित होने (डेटा नहीं दिखाया). तथापि, व्यवहार्यता, सेल नवीकरण और multipotency की क्षमता passaging के बाद मान्य किया जाना चाहिए. ग्लास कवरलिप्स पर चढ़ाया कोशिकाओं को भी लाइव इमेजिंग के बाद, इम्यूनोफ्लोरेसेंट धुंधला प्रोटोकॉल में इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, इस दृष्टिकोण आनुवंशिक माउस मॉडल से नेकां के प्रवास का अध्ययन करने के लिए एक काफी शक्तिशाली प्रणाली का प्रतिनिधित्व करता है22,23,24,25.

Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है.

Acknowledgments

हम राजा कॉलेज लंदन जैविक सेवा इकाई के लिए आभारी हैं, विशेष रूप से टिफ़नी जार्विस और Lynsey Cashnella उनके निरंतर समर्थन के लिए. हम सलाह और इस प्रोटोकॉल के प्रारंभिक स्थापना के दौरान अभिकर्मकों के साथ मदद के लिए डेरेक Stemple, Mamoru Ishii और रॉबर्ट Maxson धन्यवाद. हम STO कोशिकाओं के गामा विकिरण के साथ मदद के लिए धेराज ताहीम धन्यवाद. हम महान समर्थन के लिए लियू और Krause प्रयोगशालाओं, विशेष रूप से टॉमी Pallett, धन्यवाद. इस कार्य को बीबीएसआरसी (BB/R015953/1 से KJL/MK), एमआरसी डॉक्टरेट प्रशिक्षण कार्यक्रम (एलडी), न्यूलैंड पेडले फंड (एएलएम) और केआरआईपीआईएस द्वितीय, अनुसंधान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय (जीएसआरटी), शिक्षा और धार्मिक मंत्रालय से एक छात्र के लिए अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। मामलों, ग्रीस और Fondation सेंट (SGGM करने के लिए).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bFGF R&D systems 233-FB
b-mercaptoethanol Gibco 31350-010
Tissue culture flasks Corning 430639 25cm2 culture flasks
DMEM (4500 mg/L glucose) Sigma D5671
Dulbecco's phosphate-buffered saline (dPBS) Sigma D8537
Ethanol Fisher Chemicals E/0650DF/C17
Fetal Bovine Serum Sigma TFS AA 10-155
Fetal Bovine Serum (ES Cell FBS) Gibco 26140079/16141-079
Fibronectin bovine plasma Sigma F1141
Gelatin from bovine skin Sigma G9382
L-glutamine Sigma G7513
Glass-bottomed, multi-well 24-well tissue culture plate Ibidi 82406 Glass-bottomed, No 1.5, 24-well tissue culture dish with black sides
Cell migration analysis tool Ibidi v2.0 Manuals for this software can be found at: https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html.
Circularity Plug-in ImageJ v1.29 or later The circularity plug-in is an extended version of ImageJ/Fiji’s Measure command, designed by Rasband, W., (2000) (wsr@nih.gov).
LIF ESGRO by Millipore ESG1106
Manual Cell Tracking Plug-in ImageJ v1.34k or later ref Cordelieres F. Institut Curie, Orsay (France) 2005
Microscope Image Analysis Software Universal Imaging Corporation 6.3r7 MetaMorph Software Series 6.3r7
MEM non-essential aminoacids 100X Gibco 11140-050
Matrigel (ECM-based Hydrogel) Corning 356234
Microscope Olympus 1X81 Olympus 1X81 inverted microscope
Microscope camera Photometrics 512B Photometrics Cascadell 512B camera (4x UPlanFL N, 10x UPlanFL N, 20x UPlanFL N, 40x UPlanFL N objectives)
Microscope controller Olympus 1X2-UCB Olympus 1X2-UCB microscope controller
Microscope temperature controller Solent Scientific RS232 Maintained at 37°C
Penicillin/streptomycin Sigma A5955
Sodium Pyruvate Sigma S8636
Statistics software Graphpad Prism v7.0
STO feeder cells ATCC CRL-1503
Stereomicroscope Nikon SMZ
XY microscope stage controller Applied Scientific Instrumentation (ASI) MS-4400

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References

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Gonzalez Malagon, S. G., Dobson, L., Muñoz, A. M. L., Dawson, M., Barrell, W., Marangos, P., Krause, M., Liu, K. J. Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration. J. Vis. Exp. (152), e60051, doi:10.3791/60051 (2019).

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