Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Dissektion, kultur och analys av primära kraniella neurala krön celler från musen för studiet av neurala Crest cell delaminering och migration

Published: October 3, 2019 doi: 10.3791/60051
Automatic Translation
*1,2, *1,3, 1, 1, 1,3, 2,4, 3, 1
1Centre for Craniofacial and Regenerative Biology, King's College London, 2Institute of Molecular Biology and Biotechnology, FORTH, Department of Biomedical Research, University of Ioannina, 3Randall Centre of Cell & Molecular Biophysics, King's College London, 4Department of Biological Applications and Technology, University of Ioannina
* These authors contributed equally

Summary

Detta protokoll beskriver dissektion och kultur av kranial neurala krön celler från musmodeller, främst för studier av cell migration. Vi beskriver de levande avbildningstekniker som används och analysen av hastighet och cell formförändringar.

Abstract

Under de senaste decennierna har det skett en ökad tillgång till genetiskt modifierade musmodeller som används för att efterlikna människans patologier. Emellertid, förmågan att studera cell rörelser och differentiering in vivo är fortfarande mycket svårt. Neurocristopathies, eller sjukdomar i neurala Crest härstamning, är särskilt utmanande att studera på grund av bristande tillgänglighet av viktiga embryonala stadier och svårigheterna att separera ut neurala Crest Mesenchyme från angränsande mesodermala Mesenchyme. Här, vi ut för att etablera en väldefinierad, rutinmässiga protokoll för kulturen i primära kraniala neurala krön celler. I vårt förhållningssätt vi dissekera mus neurala plattan gränsen under den första neurala Crest induktion skede. Den neurala plattan gränsregionen är explanterad och odlade. Den neurala Crest celler form i en epitelial blad kring neurala plattan gränsen, och med 24 h efter explant, börja delaminate, genomgår en epitelial-mesenkymala övergång (EMT) att bli helt rörliga neurala krön celler. På grund av vår tvådimensionella odlingsmetod, den distinkta vävnad populationer (neurala plattan kontra premigratory och flyttande neurala Crest) kan lätt särskiljas. Med hjälp av Live Imaging metoder kan vi sedan identifiera förändringar i neurala Crest induktion, EMT och migrations beteenden. Kombinationen av denna teknik med genetiska mutanter kommer att vara en mycket kraftfull metod för att förstå normal och patologisk neurala krönet cellbiologi.

Introduction

Den neurala Crest (NC) härstamning är en övergående, multipotenta och flyttande population av celler som visas uteslutande på ryggradsdjur under tidig embryonal utveckling1,2. Neural crest derivat är mycket varierande, och inkluderar glia, glatt mus kula, melanocyter, nervceller och kraniofacial ben och brosk3,4. Eftersom neural crest bidrar till funktionen av många organsystem, är denna härstamning avgörande för mänsklig embryogenes. Aberrant NC utveckling är inblandad i ett brett spektrum av de vanligaste mänskliga missbildningar (dvs., läpp och gom)5, och även störningar såsom Hirschsprungs sjukdom (hscr), Wardensburg syndrom (WS), Charge syndrom och Williams syndrom6 ,7,8,9.

NC utveckling har undersökts i ett antal icke-däggdjurs modellsystem inklusive Xenopus, chick och zebrafiskar modeller. Hos däggdjur, arbete i musmodeller har identifierat några av de viktigaste genetiska händelserna underliggande neurala Crest utveckling; Det har dock varit svårare att följa cellbiologi neurala Crest migration, på grund av otillgänglighet av mus embryot (granskas på annat håll10,11). Dessutom, medan studier på chick, Xenopus och zebrafisk har etablerat ett nätverk gen reglerande för NC, förlust av funktionen studier i dessa djurmodeller ibland inte uppvisar en jämförbar fenotyp i mus. Till exempel, i xenopus, zebrafiskar och chick, icke-Canonical WNT signalering är en av de cellulära mekanismer som gör det möjligt för NC att förvärva sin migrations kapacitet12,13,14,15 . Men i musen, förlust av icke-kanoniska WNT signalering verkar inte påverka migration16. Som in vivo NC migration har varit svårt att spåra under långa perioder i mus, det är oklart om dessa Art-skillnader återspeglar olika former av migration, eller skillnader i molekylär reglering.

Som nämnts, NC studier i mus har varit mycket utmanande eftersom ex Utero kulturen av embryon är mödosam. Dessutom är NC ständigt i intim kontakt med angränsande vävnader såsom mesoderm och neurectoderm. Den senaste användningen av neurala Crest-specifika CRE förare eller exogena färgämnen har tillåtit oss att Fluorescent etikett flyttande NC; dessa metoder är dock fortfarande begränsade. Trots flera rapporter som beskriver olika tekniker för att visualisera NC migration17,18, har det varit svårt att lösa dessa tekniker i en enkel och rutinmässig procedur.

Det är tydligt att det finns ett behov av tekniker som gör det möjligt att hantera och karakterisera däggdjurs NC. Vi fokuserade våra ansträngningar på musen kranial NC eftersom det är den primära modellen för att studera mänskliga kraniofacial utveckling och neurocristopathies. Vi förfinade vår strategi baserat på flera intressanta rapporter som beskriver primärkulturen i NC-celler19,20,21. Här beskriver vi grundligt den optimala kulturen tekniker för explanting primära NC-celler. Vi demonstrerar den levande cell avbildnings metoden och den optimala användningen av olika matriser för att belägga kultur plattorna. Vårt protokoll beskriver hur man fångar migrationen av levande NC-celler med hjälp av ett inverterat Mikroskop, som är avsett som en riktlinje för användning med andra Mikroskop, samt en detaljerad sammanfattning av våra cellulära analyser.

Det förväntade resultatet från explanten bör vara en vackert lagd distribution av celler som är klart särskiljas under mikroskopet, där man kan se tre olika populationer av celler som representerar (i) neurala plattan, (II) premigratorisk, och, (III) flyttande neural crest celler. Vi visar hur man analyserar cell beteenden vid gränsen till den premigratoriska populationen av celler under epitelial-mesenkymala övergången. Vi fokuserade också vår satsning på att studera helt flytt celler för cellhastighet, avstånd och cellmorfologi.

Protocol

Allt djur arbete har genomgått etiskt godkännande av King ' s College London etisk granskning process och utfördes i enlighet med UK Home Office Project License P8D5E2773 (KJL).

1. beredning av reagenser

  1. Förbered allmänna lösningar och verktyg inklusive steril fosfatbuffert saltlösning (PBS), 70% etanol, dissekationsverktyg (tång och dissektion blad eller sterila nålar), plastplattor eller glas diabilder belagda med en kommersiellt tillgänglig extracellulär matris ( ECM)-baserade hydrogel eller Fibronektin (se tabellen av material), och neural crest media (se nedan).
  2. Förbered neural crest basal medium med hjälp av Dulbecco modifierade Eagle ' s medium (DMEM, 4500 mg/L glukos), 15% foster bovint serum (FBS), 0,1 mM minsta essentiella medelstora icke-essentiella aminosyror (MEM NEAA 100X), 1 mM natrium pyruvat, 55 μM β-merkaptoetanol, 100 enheter/mL penicillin, 100 enheter/mL streptomycin, och 2 mM L-glutamin.
    1. Villkora medierna över natten med hjälp av tillväxt-hämmade STO Feeder celler21.
      1. Förbered STO celler (se tabellen av material) media för att innehålla DMEM kompletteras med 10% FBS och 100 u/ml penicillin, 100 U/ml streptomycin. Växa och expandera STO celler till sammanflödet i 25 cm2 flaskor belagda med 0,1% gelatin. Applicera 5000 rad Gammabestrålning.
      2. Utsäde cirka 3 x 106 tillväxt-hämmade celler på en 10 cm2 skålen eller 25 cm2 kolv (från steg 1.2.1.1). Tillsätt cirka 10 – 12 mL av neurala Crest basal medium och inkubera över natten.
        Anmärkning: seedade celler kan användas för att producera villkorlig medium i upp till 10 dagar. Kontrollera utseendet på celler regelbundet
    2. Filtrera mediet (porstorlek 0,22 μm), och komplettera med 25 ng/mL grundläggande fibroblasttillväxtfaktor (bFGF) och 1000 U av leukemi inhibitor faktor (LIF).
      Obs: Förvara vid 4 ° c och Använd inom en månad eller förvara vid-20 ° c och Använd inom 3 månader.
  3. Täck vävnaden kulturen ytor med extracellulär matris.
    Obs: beroende på den biologiska fråga som ställs, matrisen kan vara belagda på glas bottnat kultur rätter, plast vävnad kultur rätter eller glas täcker glider. Se nedan för olika ECM-baserade hydrogel utspädningar beroende på Matrix substrat. Fibronectin har testats på glas bottnade rätter och täckrör endast vid de koncentrationer som anges nedan. Här på kommer vi att hänvisa till de substrat belagda ytorna som "belagda plattor".
    1. Täck vävnaden kultur ytor med ECM-baserade hydrogel.
      Obs: Håll underlaget kallt tills plätering, antingen genom att kyla media eller hålla på is.
      1. Tina Hydrogelen vid 4 ° c över natten. Tillsätt 5 mL 10% FBS i DMEM till 5 mL hydrogel för en slutlig volym på 10 mL (se tabell över material).
      2. Gör 0.5-1 mL-aliquoterna så bekväma och förvara vid-20 ° c.
      3. Tina upp hydrogel-aliquoterna på is.
      4. Använd en 1:20 utspädning av hydrogel lager för att belägga plast.
      5. Använd en 1:5 utspädning av hydrogel lager för att belägga glas rutschbanor och glas bottnat vävnad kultur plattor.
        Obs: Späd Hydrogelen i kallt DMEM.
      6. Applicera tillräckligt med utspädd hydrogel för att täcka det önskade området på plattor/diabilder och inkubera i 30 – 45 min vid 37 ° c.
      7. Använd omedelbart belagda plattor/diabilder eller förvara belagda diabilder vid 4 ° c över natten.
      8. Ta bort överdrifter och skölj diabilder med hög glukos DMEM (tillval) före användning.
    2. Täck vävnaden kultur ytor med fibronectin.
      1. Gör alikvoter av 1 mg/ml Fibronektin lagerlösning och förvara vid-80 ° c. Späd Fibronektin med Dulbecco ' s PBS (dpbs) till en slutlig koncentration på 1 μg/ml.
      2. Applicera tillräckligt med Fibronektin för att täcka det önskade området och inkubera i rumstemperatur i 15 min.
      3. Ta bort kvarvarande Fibronektin och låt glaset torka i 30-45 min.
      4. Skölj brunnar eller Täck halvor med hög glukos DMEM (tillval) före användning.

2. dag 1: dissektion av embryon från tidiga somitiska stadier

Obs: Använd sterila verktyg och sterila lösningar. Om genotypning behövs, samla in kroppen av embryot för DNA-extraktion.

  1. Dissektion av kranial neurala plattan är begränsad till embryon vid 8,5 dagar efter coitum (DPC). Välj embryon vid 5 – 8 somite-stadiet. Dissekera livmodern i PBS och skär mesometrium att separera varje embryo (figur 1a). Den muskulösa väggen i livmodern kontrakt och decidual vävnad kommer att bli synlig (figur 1b).
    Notera: Behåll embryon i livmodern i iskallt PBS medan dissektioner utförs ett embryo i taget. Flytta embryon med en glas Pastinpipett till färsk steril PBS för att förbättra synligheten och minska kontaminering.
  2. Skjut tång mellan muskellagret och decidual vävnad och ta bort muskellagret med ett andra par tång (figur 1c).
  3. Med hjälp av pinuper, tränga igenom deciduumet vid kanterna av mesometrial stången och med ett andra par tång tår att öppna vinkelrätt till stolpen.
  4. Dra tillbaka den deciduala vävnaden med tång för att visualisera Reicherts membran.
  5. Ta försiktigt bort Reicherts membran. Den viscerala äggula säcken blir synlig och embryot kan ses inuti (figur 1d).
  6. Avlägsna den viscerala äggula säcken och Amnion (figur 1e) och placera embryot för att visualisera huvudluckan (figur 1f).
  7. Skärhuvudet luckan ovanför hjärtat och skrapa bort den underliggande mesoderm med hjälp av tång och/eller ögonfrans verktyg för att få en ren neurala plattan (NP) (figur 1H).
    Obs: NP kan hållas hela eller delas ner anteroposterior axeln så att varje sida kan pläteras individuellt. Den neurala plattan gränsen kan ytterligare trimmas bort från neural plattan för att minimera neuronala bidrag till explants.
  8. Använd ett glas Pasteur pipett för att överföra dissekerade neurala plattan på en hydrogel-belagda skålen fylld med konditionerade neurala Crest media.
  9. Snurra skålen försiktigt för att placera NP i mitten av brunnen. Detta är viktigt för att maximera fas kvaliteten för Live-cell Imaging (dag 2).
  10. Inkubera över natten (eller till önskad tidspunkt) vid 37 ° c i 5% CO2. Neurala Crest celler bör synligt migrera ut ur den neurala plattan.
    ANMÄRKNINGAR: celler brukar fästa inom 6 – 8 h. Efter explantat fäster, ge mer tid att visualisera migrera celler. Vanligtvis med 24 h post explant, kan vi hitta tre distinguishable populationer av celler. Den första befolkningen, i mitten av explant, är den neurala plattan (NP). Den andra populationen, den premigratoriska NC (pNC), omger NP i en epitelial cellark. Den tredje befolkningen, i utsidan ringen, bildas av flyttande NC (mNC), som är större i storlek, och verkar helt mesenkymala (figur 2).

3. dag 2: levande cell avbildning av murina kranial neurala krön celler

Anmärkning: avbildning bör utföras vid 24 h efter explanting till optimalt bild och kvantifiera neurala Crest cell migration. NC induktion Media behöver inte uppdateras innan Live cell Imaging. Tillgång till ett inverterat Mikroskop, med en motoriserad scen och en inbyggd miljökammare krävs. Använd Multi-well vävnad kultur rätter som lämpar sig för avbildning (tabell över material).

  1. Mikroskop set-up
    1. Ställ in miljö kammaren vid 37 ° c och 5% CO2.
    2. Tränga in ett hål i locket på vävnads odlingsplattan locket så att CO2 nålen, ansluten till co2 befuktnings kammaren, att sitta i plattan.
    3. Placera vävnaden kultur skålen i preparathållaren och tejpa ner plattan locket och CO2 nål för att förhindra skakning under multi-well förvärv.
    4. Slå på Mikroskop styrenheten, scenkontrollanten och bildhanteringsprogrammet.
    5. Fokusera på kraniala NC-celler vid 10X förstoring (med matchande fas ring i kondensorn vald).
    6. Ställ hög kvalitet fas-kontrast på mikroskopet genom att justera fältet Iris membran, bländare Iris membran och centrering teleskop, som anges i mikroskopet set-up handbok.
  2. Faskontrast Live-cell Imaging
    1. Ange katalog-eller filplatsen där tidsfördröjningsfiler ska sparas.
    2. Ställ in exponeringstid, Binning och kamera område.
    3. Ange antal tidspunkter, varaktighet för avbildning och tidsintervall mellan bildrutor.
      1. För att kvantifiera NC cell migrations kapacitet, ställa in mikroskopet till 10X förstoring, med 1 bildruta var 5 min (217 tid punkter över 18 h). För att kvantifiera cellmorfologi, ställa förstoring till 40x, med 1 bildruta/min (61 tid punkter över 1 h). För att kvantifiera lamellipodial dynamik, ställa förstoring till 40x eller 60x förstoring, med 1 bildruta varje 10 s (över 10 min).
    4. För multi-well Imaging, Ställ in den mekaniska scenen för att flytta mellan valda XY-positioner av intresse. Kontrollera att de kraniala NC-cellerna är i fokus och att scen positionerna är korrekta.
    5. Använd kommandot förvärva för att starta fotografering med tidsfördröjning.
    6. När fotografering med tidsfördröjning är slutförd granskar du de flerdimensionella data-och export. STK-filerna för analys.
      Obs:. STK är en TIFF-stackfil.
    7. Avsluta programvaran, stänga av datorn och stänga av scenen, kamera och Mikroskop styrenheter.

4. Imaging analys: kvantifiering av neurala Crest cell migration

Notera: för att bättre definiera de cellulära beteenden utställda genom att migrera murina kranial neurala Crest celler, har vi analyserat en rad kvantifierbara flytt parametrar, särskilt med fokus på migrations kapacitet och cellform dynamik. (1) migration (ackumulerat avstånd) är den totala Banlängden som tas av cellen (μm), (2) migration (euklidiska distansen) är det raka avståndet mellan cellens initial-och slutposition (μm). (3) migration (cellhastighet) är tillryggalagd sträcka med cell per tidsenhet (μm/min). (4) cellform (cellområde) är den totala ytan som täcks av cellen. Ställ pixel till micron skala enligt Imaging Mikroskop. (A = enpx x Npx, där ettpx = pixelområde och Npx = antal pixlar. Enheter: μm2; (5) cell form (cell cirkularitet) är avvikelsen av cell formen från en perfekt cirkel som indikeras av ett cirkularitet värde av 1,0 (4Π (a/P2)) där a = område och P = omkrets.

  1. Enkel cell spårning
    Anmärkning: för att mäta NC-cellmigrering genereras XY-koordinater för enskilda celler över alla tids fördröjnings ramar. Detta möjliggör efterföljande analys av avstånd, hastighet och persistens åtgärder för cell migration.
    1. Öppna ImageJ och importera data som TIFF-stackfiler.
    2. Klicka på analysera | Ställ in skala för att kalibrera. STK-filerna enligt Mikroskop inställningar, arbeta i pixel/μm.
    3. Klicka på plugins | Spårning | Manuell spårning för att öppna bild J manuell cell spårning plugin. Om du vill börja cell spårningen väljer du Lägg till spår.
    4. Spåra celler genom alla bildrutor i Time-lapse filmer, med hjälp av kärnan som en referenspunkt.
      Obs: 10 – 20 celler ska spåras per explant, med totalt 60 celler spåras (n = 3). Celler som genomgår celldelning under loppet av tidsfördröjning bör uteslutas från analys.
    5. Spara och exportera resultaten som en CSV-fil. Resultaten representerar enskilda cell spårnummer, segmentnummer och XY-koordinater över alla ramar.
  2. Kvantifiering av neurala Crest cell migrations kapacitet
    1. Öppna data för enkel cell spårning (se ovan). Konvertera CSV-filer till. txt-filformat.
    2. Öppna migreringsprogramvaran (tabellen med material). Klicka på fliken Importera data om du vill importera cell spårningsdata som en txt-fil.
    3. Under datauppsättningar | Initiering, Välj antalet segment eller ramar som ska analyseras och ange XY-kalibrering och tidsintervall mellan bildrutor. Välj tillämpa Inställningar för att spara inställningarna.
    4. Välj Plot data symbol för att bilda bana tomter. Välj statistik symbolen för att kvantifiera avstånds-och hastighets måtten.
    5. Spara banor som bitmappfiler (. bmp) och avstånds-och hastighets mått som. txt-filer. Välj symbolen ta bort data . Upprepa för andra tidsfördröjningsfiler.
      Obs: bollbana tomter kan användas för att visualisera direkthet enskilda cell Sök vägar för ett visst cell villkor eller tillstånd under loppet av Time-lapse filmer (figur 4a). Distans-och hastighetsdata som lagras i. txt-filerna kan sedan användas för vidare analys.
  3. Kvantifiering av neurala Crest cell Area och loopkontroll
    1. Öppna tidsfördröjning. STK filer i ImageJ och kalibrera enligt Mikroskop inställningar, arbetar i pixel/μm.
    2. Under analysera | Ange mått, klicka för att Markera cell formens parametrar: cellområde, perimeter och formbeskrivare.
    3. Använd verktyget FreeHand Selection för att manuellt rita runt varje cell med hjälp av cellmembranets gränser som en guide.
    4. Tryck på CTRL + B tangenter på tangentbordet för att bibehålla cell dispositionen överlain på bilden. Upprepa för celler över varje tids fördröjnings ram.
    5. Använd bilden | Överlagring | Till ROI-hanteraren för att lagra värdena.
    6. När alla celler av intresse per ram har beskrivits klickar du på mått. Spara resultaten som en CSV-fil.
      Notera: 10 – 20 celler per film ska beskrivas, med sammanlagt 30 – 60 celler analyserade per tillstånd (n = 3). Cellformdata (. csv-filer) kan användas för att kvantifiera hur cellformsdynamiken förändras över tid (figur 4c) eller hur morfologin kan förändras under olika cell behandlingar.

Representative Results

Med hjälp av det förfarande som visas här, var mus embryon dissekeras från livmodern, och extraembryonala vävnader avlägsnades (figur 1A – D). Embryona var somite iscensatta (med endast embryon vid 5 – 8 somiter (SS), figur 1E, F). Den kraniala neurala plattan var sedan dissekeras och neuroepitel isolerades. Mesodermal celler, identifierade som lösa, cirkulära, mesenkymala celler, var försiktigt borstade bort (figur 1G-L). Den främre neurala plattan kan explanterad hela, i vilket fall den neurala krön vävnaden kommer att dyka upp i sidled och expandera radiellt runt explant, eller varje neurala plattan gränsen (höger och vänster) kan explanterad separat. Detta är särskilt användbart när explanting från genetiska mutanter.

Inom 24 h, en region av premigratory (epitelial) kraniala neurala Crest kan tydligt ses kring neurala plattan explantat (figur 2b). Vidare, en subpopulation av neurala krön celler har genomgått epitelial till mesenkymala övergång och verkar helt mesenkymala (figur 2). Således har vi flera koncentriska ringar av distinkta celler, med neurala plattan (NP) i centrum, den premigratory neurala Crest (pNC) i den mellanliggande cirkeln, och en population av flyttande neurala Crest (mNC) i utsidan ringen (figur 2b). För att spåra NC-celler, är det möjligt att använda genetiskt modifierade musmodeller som vi visar i figur 2C. I detta fall har vi använt neural crest specifika Wnt1:: CRE; RosaMtmg vilket resulterar i NC-celler som är märkta i grönt. I dessa möss, celler Express membran tomat (mT, i rött) om de inte uttrycker CRE driver. Rekombination leder till celler som uttrycker membran grönt fluorescerande protein (GFP, i grönt). De röda cellerna som visas i mitten av explantat är neurala plattor celler. Vissa dorsala neurala plattan celler också uttrycka GFP; för långsiktig kultur, skulle vi punktskatter alla celler i centrum. För våra ändamål, renhet explantat är tillräckligt för att spåra olika neurala Crest cellpopulationer. Där högre renhet av neurala Crest är nödvändigt, denna genetisk märkning strategi kan kombineras med fluorescerande aktiverad cell sortering (FACS) för att säkerställa renhet av befolkningen. Alternativt, det är möjligt att fastställa djur och identifiera NC befolkningen med antikropp märkning.

Det framgick också av 24 h att de karakteristiska koncentriska ringarna av explantkulturernas premigratoriska och helt flyttande NC-celler inte var beroende av eller styrs av matrisens val (figur 3). Explantat kulturer pläterade på både en ECM-baserade hydrogel och Fibronektin bildade jämförbara explantat strukturer, bestående av de tre cellpopulationer, NP, PNC och MNC (figur 3A, C). Neural crest cell morfologi var också jämförbar mellan de pläterade på ECM-baserade hydrogel och Fibronektin (figur 3B, D). Men, djur pläterade på Fibronektin producerade celler med mer framträdande lamellipodia vid cellens framkant, till synes mer polariserad i riktning mot migration (figur 3B, D).

När en population av flyttande neurala Crest celler är uppenbart, levande cell avbildning kan slutföras. Time-lapse mikroskopi är inställd på 10X förstoring (18 h, 1 ram/5 min) för efterföljande analys av NC cell migration (figur 4a). ImageJ Manuell spårning plug-in genererar XY-koordinater för enskilda celler över alla bildrutor i Time-lapse filmer (figur 4b). Dessa koordinater kan bearbetas med hjälp av migreringsprogrammet. Denna programvara möjliggör visualisering av enskilda cell spår över tid (figur 4b) och kan användas för att kvantifiera ackumulerade och euklidiska avstånd, samt cellhastighet.

Time-lapse Imaging data ger också en mängd information om cellmorfologi vid migration av kraniala neurala krön celler (figur 4c). Genom att beskriva enskilda cellmembran kan cell områdes-och områdes mätningar beräknas från alla bildrutor i filmerna (figur 4c). Dessa mätningar möjliggör den påföljande kvantifieringen av cellområdet och cirkularitet (figur 4D). Figur 4c visar en analys av förändringar i cell formen över 18 timmar. Observera att när celler migrerar bort från explant, ökar cellområdet markant medan cell cirkularitet är relativt konstant (enkelriktad ANOVA, Tukey multipla jämförelser test) ( Figur 4E,F). Detta tyder på att som celler avvika från epitelial kanten och förlora cell-Cellkontakter, de visar ökad cell spridning område. Åtgärder för cell cirkularitet ändrades inte nämnvärt över tid. kortsiktiga förändringar i cirkularitet kan dock ses om ett ökat antal tidspunkter kvantifieras. Cell cirkularitet åtgärder kan också ge intressanta data om cellform dynamik i närvaro av en kemotaktisk Cue eller under begränsade förhållanden.

Figure 1
Figur 1: isolering av kranialneurala växter från ett e 8.5 embryo.
Bilderna är stillbilder från en video som dokumenterar mikro-dissekationstekniken. (a – C) Dissektion av embryot från livmodern. (B – C) Med hjälp av två vassa tång, dra försiktigt isär muskellagret. Panel (D) visar embryot inuti den viscerala äggula säcken (gul linje). Extrahera embryot från den viscerala äggula SAC. E lateral syn på embryot vid etapp 8,5 i sidled. F) dorsala syn på embryot i etapp 8,5. Count thoraxsegmenten (SS) för att bestämma åldern av embryon; vanligtvis 5 – 8 SS (gula cirklar i F). G) närmare titt på embryots kraniala område. Avlägsna extraembryonala membran från kranialregionen; thoraxsegmenten är markerade med en gul linje. (H) dissektioner av främre neurala plattan utförs under den första gäl-båge (gul linje). (I) lateral bild av främre neurala plattan dissektion. Neurala veck, där neurala krön celler uppstår, är markerade med en gul linje. (J – L) Ta bort mesodermala vävnad (fluffiga mesenkymala celler) underliggande främre neurala veck så mycket som möjligt innan plätering NP på förberedda kultur rätter. Filmen togs med hjälp av en stereo-Mikroskop med en widefield apokromatiska linsen på 3,0 X Zoom (se tabellen av material). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: murina kraniella neurala Crest explant.
(A) schematisk representation av dorsala syn på ett e 8.5 mus embryo. Den kraniala regionen av embryot skärs på streckad linje. Den neurala plattan gränsen (markerad i rött) är isolerad från den omgivande mesoderm vävnad och odlade för 24 h att tillåta kraniala neurala Crest att emigrera. Schematiskt anpassad från22,23. (B) vänster: representativa ljusa fältet bild av en kranial neurala Crest explantat 24 timmar efter plätering. Tre populationer av celler observeras, som också schematiserade till höger. NP = neurala plattan, pNC = pre-flyttande neurala Crest och mNC = flyttande neurala Crest. Skalstapel = 250 μm. C) högre förstorings bilder av en explantat från genetiskt märkt mus (Wnt1:: CRE; RosaMtmg). Celler utan CRE föraren Express membran tomat (mT) i rött. Uttryck för CRE under kontroll av en neural crest specifik Wnt1 promotor leder till excision av mT kassett och uttryck av membran GFP (mG) i grönt. Kärnor färgas med Hoescht (i blått). Scale bar = 200 μm. (d-d ' ') högre förstoring bilder av flyttande celler uttrycker membran GFP (D). (D') DNA är märkt med Hoescht (blå). (D' ') Sammanslagning av D och D. Scale bar = 20 μm. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Explants odlade på olika substrat.
(a – B) Faskontrast bilder av djur odlade på kommersiella ECM-hydrogel. (C – D) Explants odlade på 1 μg/mL fibronectin. Neural Plate (NP), premigratory (pNC) och flyttande (mNC) neurala Crest celler kan särskiljas genom deras olika cellmorfologier. Skalstapel = 100 μm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: kvantifiering av kranial neurala krön cell migration och cellform dynamik.
(A) faskontrast ramar från Time-lapse Imaging av explantat kulturer överläggs med enda neurala Crest cell spår, med hjälp av imagej/Fiji manuell cell spårning plug-in. tio representativa MNC-celler spårades manuellt över 18 h (217 ramar) och XY- koordinaterna exporterades. Data representeras som en Överlagrings punkt och rad diagram. Celler var pläterade på 1 μg/mL fibronectin. Skalstapel = 200 μm. B representativ bana med 10 MNC-celler, genererad med hjälp av migrationsprogram. C) faskontrast ramar tagna från tids fördröjnings analys av explantkulturer. Streckade linjer disposition 8 representativa flyttande neurala Crest celler analyseras för cellform dynamik när den pläteras på 1 μg/mL fibronectin. Skalstapel = 200 μm. D schematisk representation av de beräkningar som används för att kvantifiera cellområdet och cirkularitet. Cellmorfologin av den schematiska är att cellen markeras i blått (C). Ettpx = pixel-område, Npx = pixel nummer, A = område, P = omkrets (1 pixel = 1,60772 μm2). (E – F) Kvantifiering av åtgärder för cellområdes-och cell cirkularitet över tid. Data representerar medelvärdet ± SEM. Varje punkt representerar en cell (n = 60), tagen från 3 oberoende experiment, och analyseras vid 0 h, 6 h, 12 h och 18 h (NS icke-signifikanta, * p < 0,05, * * * * p < 0,0001 enkelriktad ANOVA, Tukey multipla jämförelser test). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Studera däggdjurs neurala krön celler har varit en utmaning för forskarna på grund av den in utero karaktär däggdjurs utveckling. In vivo studier är svåra att inrätta, eftersom embryot måste manipuleras under förhållanden som efterliknar livet i livmodern. I praktiken är det nästan omöjligt att reproducerbart odla dessa (E8 +) embryon för längre än 24 h, särskilt för levande avbildning. Dessutom, neurala Crest induktion och migration sker samtidigt med neuralrörsstängning och embryonala vrida i musen; Detta är en avgörande och stressande morfogenetiska händelse, som ofta misslyckas när embryon odlas ex Utero. Således är andelen framgångsrika ex Utero -strategier generellt låg. Användningen av förevigade NC-celler21 är ett användbart verktyg för att minska användningen av djur och det kan ge en bättre källa till neurala Crest celler för långsiktig analys, transfektion, och berikande studier. Det finns dock uppenbarligen ett behov av att på ett tillförlitligt sätt odla primära neurala krön celler. Vår metod är tillämplig på mus knock-out eller villkorlig genetiska modeller. En jämförbar metod för vår har beskrivits för andra neurala Crest populationer20; men vår metod beskriver grundligt steg-för-steg isolering av murina kraniala NC-celler. Vi beskriver också användningen av olika matriser samt migrations analysförfarandet i detalj.

För att uppnå konsekventa resultat fann vi att särskild uppmärksamhet ägnas åt iscensättning under valet av embryon. Inte överraskande, korrelerar antalet thoraxsegmenten med olika stadier i kraniala NC utveckling. Därför är kunskapen om embryoanatomin mycket viktig innan man förvärvar några experimentella data. Detta tillvägagångssätt kan sedan anpassas till att isolera diskreta populationer av neurala krön celler, beroende på den biologiska frågan och målcellerna.

När embryona väljs och dissekeras, mesodermala celler kan lätt särskiljas och bör avlägsnas för att möjliggöra bättre visualisering och minska kontaminering. För längre sikt kulturer, kan den neurala plattan vävnad avlägsnas vid 24 h av plätering för att förhindra kontaminering av neurala vävnader. En ytterligare förfining kan vara användningen av fluorescerande härstamning märkning (till exempel med hjälp av en Wnt1:: CRE eller Sox10:: creert förare i kombination med fluorescerande reportrar24,25) att skilja neurala Crest celler från vävnader som visas i figur 2C.

Tidigare rapporter har belyst potentialen av plätering mus NC explantat kulturer på olika matriser, oftast på kommersiella ECM hydrogels, Fibronektin och kollagen I20,21,26. I våra händer, mus kraniala NC explantat kulturer framgångsrikt odlas på alla tre matriser, vid koncentrationer som anges i original rapporter (data visas inte). Den ursprungliga förfinade metoden vi anpassade för våra NC explantat kulturer använde en kommersiell hydrogel som matrisen val, som främst bestod av laminin och kollagener21(Figur 3A – B). Sammansättningen av denna hydrogel är dock inte tydligt definierad, med okänd tillväxtfaktor och proteinhalt. Som sådan har vi sedan skiftat vårt förhållningssätt till plätering mus NC explantat kulturer på Fibronektin (Figur 3C – D). Fibronectin är väl definierad och mycket uttrycks i ECM och basalmembran längs vilka NC-celler migrerarin vivo28,29,30. För att optimera en Fibronektin matris som bäst replikerar neurala Crest cell migration och morfologi som ses med hjälp av hydrogel, jämförde vi NC cell beteenden uppvisade på hydrogel mot en titrering av 0,25-30 μg/ml Fibronektin, och definierade 1 μg/ml Fibronektin som ger idealiska egenskaper (data visas inte). Vi anser att detta preliminära arbete kan bidra till att skapa en ram för systematisk jämförelse av matriser, såsom fibronectin, mot de som tidigare beskrivits, nämligen kollagen och laminin32,33,34. Det skulle vara särskilt intressant att jämföra mus NC cell migrations kapacitet på Fibronektin kontra kollagen I, med tanke på att kollagen-IA1 är endogent utsöndras av mus, aviär och mänskliga NC-celler28,30,31,32. Kollagen i är därför lika relevant som Fibronektin vid övervägande av matrisens val. Det är också värt att erkänna att biotillgängligheten av tillväxtfaktorer i medierna kan ändras av olika matriskomponenter, särskilt med tanke på den höga serum halt i våra medier. För att övervinna detta arbetar vi för närvarande med att producera serum fria definierade odlingsförhållanden. Dessa definierade medier är framgångsrikt används i neurala Crest induktion protokoll i pluripotenta stamcells fältet, men kräver ytterligare optimering för vårt NC explantat kultur system33,34. Vårt arbete kan också fungera som en utgångspunkt för raffinering villkor för andra typer av NC-celler såsom hjärt-och bål NC, och för efterföljande studier av NC differentiering. Viktigast av allt, detta protokoll tillåter isolering av kranial NC-celler för en mängd olika tillämpningar. Vi Envision studier om riktad migration, 3-D migration och invasion. Celler som isolerats på detta sätt kan behandlasin vitroför ett antal analyser. Till exempel, celler kan lätt behandlas med olika små molekyler för att rikta specifika proteiner, de kan behandlas vid definierade tidpunkter, och Wash-out experiment kan utformas för att avgöra återhämtning av cell beteenden (Figur 4). Mer långsiktig kultur för transfektion och differentiering analyser är möjligheten, as well as passage av celler (data som inte visas). Emellertid, lönsamheten, kapaciteten för cellförnyelse och multipotens bör valideras efter passaging. Celler pläterade på glas täckband kan också användas i Immunofluorescerande färgning protokoll, efter levande avbildning. Slutligen, detta tillvägagångssätt är ett oerhört kraftfullt system för att studera migration av NC från genetiska musmodeller22,23,24,25.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Vi är tacksamma för King ' s College London Biological Services enhet, särskilt Tiffany Jarvis och Lynsey Cashnella för deras fortsatta stöd. Vi tackar Derek Stemple, Mamoru Ishii och Robert Maxson för råd och hjälp med reagenser under den första etableringen av detta protokoll. Vi tackar Dheraj Taheem för hjälp med gamma-bestrålning av STO celler. Vi tackar LiU och Krause Labs, särskilt Tommy Pallett, för stort stöd. Detta arbete finansierades genom bidrag från BBSRC (BB/R015953/1 till KJL/MK), ett student skepp från MRC doktorand utbildningsprogram (LD), newland Pedley Fund (ALM) och KRIPIS II, generalsekretariatet för forskning och teknik (GSRT), Undervisningsministeriet och religiösa Frågor, Grekland och Fondation santé (till SGGM).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
bFGF R&D systems 233-FB
b-mercaptoethanol Gibco 31350-010
Tissue culture flasks Corning 430639 25cm2 culture flasks
DMEM (4500 mg/L glucose) Sigma D5671
Dulbecco's phosphate-buffered saline (dPBS) Sigma D8537
Ethanol Fisher Chemicals E/0650DF/C17
Fetal Bovine Serum Sigma TFS AA 10-155
Fetal Bovine Serum (ES Cell FBS) Gibco 26140079/16141-079
Fibronectin bovine plasma Sigma F1141
Gelatin from bovine skin Sigma G9382
L-glutamine Sigma G7513
Glass-bottomed, multi-well 24-well tissue culture plate Ibidi 82406 Glass-bottomed, No 1.5, 24-well tissue culture dish with black sides
Cell migration analysis tool Ibidi v2.0 Manuals for this software can be found at: https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html.
Circularity Plug-in ImageJ v1.29 or later The circularity plug-in is an extended version of ImageJ/Fiji’s Measure command, designed by Rasband, W., (2000) (wsr@nih.gov).
LIF ESGRO by Millipore ESG1106
Manual Cell Tracking Plug-in ImageJ v1.34k or later ref Cordelieres F. Institut Curie, Orsay (France) 2005
Microscope Image Analysis Software Universal Imaging Corporation 6.3r7 MetaMorph Software Series 6.3r7
MEM non-essential aminoacids 100X Gibco 11140-050
Matrigel (ECM-based Hydrogel) Corning 356234
Microscope Olympus 1X81 Olympus 1X81 inverted microscope
Microscope camera Photometrics 512B Photometrics Cascadell 512B camera (4x UPlanFL N, 10x UPlanFL N, 20x UPlanFL N, 40x UPlanFL N objectives)
Microscope controller Olympus 1X2-UCB Olympus 1X2-UCB microscope controller
Microscope temperature controller Solent Scientific RS232 Maintained at 37°C
Penicillin/streptomycin Sigma A5955
Sodium Pyruvate Sigma S8636
Statistics software Graphpad Prism v7.0
STO feeder cells ATCC CRL-1503
Stereomicroscope Nikon SMZ
XY microscope stage controller Applied Scientific Instrumentation (ASI) MS-4400

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Duband, J. L. Diversity in the molecular and cellular strategies of epithelium-to-mesenchyme transitions: Insights from the neural crest. Cell Adhesion & Migration. 4, 458-482 (2010).
  2. Mayor, R., Carmona-Fontaine, C. Keeping in touch with contact inhibition of locomotion. Trends in Cell Biology. 20, 319-328 (2010).
  3. Le Douarin, N., Kalcheim, C. The neural crest. 2nd edn. , Cambridge University Press. (1999).
  4. Trainor, P. A. Neural Crest Cells : Evolution, Development, and Disease. , Academic Press. (2014).
  5. Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: morphogenetic and molecular mechanisms. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 1152-1166 (2006).
  6. Ahola, J. A., et al. Increased incidence of Hirschsprung's disease in patients with hypoplastic left heart syndrome--a common neural crest-derived etiology? Journal of Pediatric Surgery. 44, 1396-1400 (2009).
  7. Bajpai, R., et al. CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation. Nature. 463, 958-962 (2010).
  8. Inoue, K., et al. Congenital hypomyelinating neuropathy, central dysmyelination, and Waardenburg-Hirschsprung disease: phenotypes linked by SOX10 mutation. Annals of Neurology. 52, 836-842 (2002).
  9. Kim, H., Kang, K., Ekram, M. B., Roh, T. Y., Kim, J. Aebp2 as an epigenetic regulator for neural crest cells. PloS one. 6, e25174 (2011).
  10. Barriga, E. H., Trainor, P. A., Bronner, M., Mayor, R. Animal models for studying neural crest development: is the mouse different? Development. 142, 1555-1560 (2015).
  11. Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: an overview. Developmental Biology. 366, 2-9 (2012).
  12. De Calisto, J., Araya, C., Marchant, L., Riaz, C. F., Mayor, R. Essential role of non-canonical Wnt signalling in neural crest migration. Development. 132, 2587-2597 (2005).
  13. Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456, 957-961 (2008).
  14. Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135, 1771-1780 (2008).
  15. Banerjee, S., et al. A novel role for MuSK and non-canonical Wnt signaling during segmental neural crest cell migration. Development. 138, 3287-3296 (2011).
  16. Pryor, S. E., et al. Vangl-dependent planar cell polarity signalling is not required for neural crest migration in mammals. Development. 141, 3153-3158 (2014).
  17. Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Vital dye analysis of cranial neural crest cell migration in the mouse embryo. Development. 116, 297-307 (1992).
  18. Kawakami, M., Umeda, M., Nakagata, N., Takeo, T., Yamamura, K. Novel migrating mouse neural crest cell assay system utilizing P0-Cre/EGFP fluorescent time-lapse imaging. BMC Developmental Biology. 11, 68 (2011).
  19. Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
  20. Etchevers, H. Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells. Nature protocols. 6, 1568-1577 (2011).
  21. Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21, 3069-3080 (2012).
  22. Gonzalez Malagon, S. G., Liu, K. J. ALK and GSK3: Shared Features of Neuroblastoma and Neural Crest Cells. Journal of Experimental Neuroscience. 12, 1179069518792499 (2018).
  23. Gonzalez Malagon, S. G., et al. Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus. Nature Communications. 9, 1126 (2018).
  24. Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology : CB. 8, 1323-1326 (1998).
  25. Laranjeira, C., et al. Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury. Journal of Clinical Investigation. 121, 3412-3424 (2011).
  26. Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and culture of neural crest cells from embryonic murine neural tube. Journal Of Visualized Experiments : JoVE. , e4134 (2012).
  27. Sternberg, J., Kimber, S. J. The relationship between emerging neural crest cells and basement membranes in the trunk of the mouse embryo: a TEM and immunocytochemical study. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 98, 251-268 (1986).
  28. Sternberg, J., Kimber, S. J. Distribution of fibronectin, laminin and entactin in the environment of migrating neural crest cells in early mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 91, 267-282 (1986).
  29. George, E. L., Georges-Labouesse, E. N., Patel-King, R. S., Rayburn, H., Hynes, R. O. Defects in mesoderm, neural tube and vascular development in mouse embryos lacking fibronectin. Development. 119, 1079-1091 (1993).
  30. Henderson, D. J., Copp, A. J. Role of the extracellular matrix in neural crest cell migration. Journal of Anatomy. 191 (Pt 4), 507-515 (1997).
  31. Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Human Molecular Genetics. 17 (21), 3411-3425 (2008).
  32. Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Hewitt, T. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Developmental Biology. 87 (2), 259-266 (1981).
  33. Leung, A. W., et al. WNT/β-catenin signaling mediates human neural crest induction via a pre-neural border intermediate. Development. 143 (3), 398-410 (2016).
  34. Zhu, Q., Lu, Q., Gao, R., Cao, T. Prospect of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Crest Stem Cells in Clinical Application. Stem Cells International. 2016, 7695836 (2016).

Tags

Utvecklingsbiologi cellkultur Live Imaging mus kranial neurala Crest cell migration epitelial-mesenkymala övergång cell motilitet
Dissektion, kultur och analys av primära kraniella neurala krön celler från musen för studiet av neurala Crest cell delaminering och migration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Gonzalez Malagon, S. G., Dobson, L., … More

Gonzalez Malagon, S. G., Dobson, L., Muñoz, A. M. L., Dawson, M., Barrell, W., Marangos, P., Krause, M., Liu, K. J. Dissection, Culture and Analysis of Primary Cranial Neural Crest Cells from Mouse for the Study of Neural Crest Cell Delamination and Migration. J. Vis. Exp. (152), e60051, doi:10.3791/60051 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter