Summary
Bu protokol, öncelikle hücre göçü çalışmaları için fare modellerinden kranial nöral krest hücrelerinin diseksiyon ve kültürünü açıklar. Kullanılan canlı görüntüleme tekniklerini ve hız ve hücre şekli değişikliklerinin analizini anlatıyoruz.
Abstract
Son birkaç on yıl içinde insan patolojileri taklit etmek için kullanılan genetiği değiştirilmiş fare modellerinin artan bir kullanılabilirlik olmuştur. Ancak, hücre hareketleri ve in vivo farklılaşma çalışma yeteneği hala çok zordur. Nörocristopatiler, ya da nöral krest soyundan bozukluklar, özellikle önemli embriyonik aşamaları erişilebilirlik eksikliği ve bitişik mezodermal mezenkim den nöral krest mezenkim ayıran zorluklar nedeniyle çalışmak zordur. Burada, primer kranial nöral krest hücrelerinin kültürü için iyi tanımlanmış, rutin bir protokol oluşturmak için yola çıktık. Yaklaşımımızda ilk nöral abik indüksiyon aşamasında fare sinir plakası sınırını inceleriz. Nöral plaka sınır bölgesi ekselmiş ve kültürlüdür. Nöral krest hücreleri nöral plaka sınırını çevreleyen bir epitel levha içinde form, ve tarafından 24 saat ekstrandan sonra, delaminat başlar, bir epitel-mezenkimal geçiş geçiren (EMT) tam hareketli nöral krest hücreleri olmak. İki boyutlu kültürlenme yaklaşımımız sayesinde, farklı doku popülasyonları (nöral plaka premigratory ve migratory nöral ibik karşı) kolayca ayırt edilebilir. Canlı görüntüleme yaklaşımlarını kullanarak, nöral abi indüksiyonu, EMT ve göçmen davranışlarındaki değişiklikleri belirleyebiliriz. Genetik mutantlar ile bu tekniğin kombinasyonu normal ve patolojik nöral krest hücre biyolojisi anlamak için çok güçlü bir yaklaşım olacaktır.
Introduction
Nöral ibik (NC) soyu, erken embriyonik gelişim sırasında sadece omurgalılarda görünen geçici, çok güçlü ve göçmen bir hücre popülasyonudur1,2. Nöral krest türevleri son derece çeşitlidir, ve glia dahil, düz kas, melanositler, nöronlar ve kraniyofasiyal kemik ve kıkırdak3,4. Nöral tepe birçok organ sisteminin işlevine katkıda olduğu için, bu soy insan embriyogeneziçin gereklidir. Anormal NC gelişimi en yaygın insan doğum kusurları geniş bir yelpazede karıştığı (yani, yarık dudak ve damak)5, ve hirschsprung hastalığı gibi bozukluklar (HSCR), Wardensburg sendromu (WS), CHARGE sendromu ve Williams Sendromu6 ,7,8,9.
NC gelişimi Xenopus,civciv ve zebra balığı modelleri de dahil olmak üzere olmayan memeli model sistemleri bir dizi araştırılmıştır. Memelilerde, fare modellerinde yapılan çalışmalar, nöral krest gelişiminin altında yatan bazı önemli genetik olayları belirlemiştir; ancak, fare embriyosu erişilemezliği nedeniyle nöral krest göç hücre biyolojisi takip etmek daha zor olmuştur (başka bir yerde gözden10,11). Ayrıca, civciv, Xenopus ve zebra balıkları çalışmaları NC için bir gen düzenleyici ağ kurmuş olsa da, bu hayvan modellerinde fonksiyon çalışmaları kaybı bazen fare karşılaştırılabilir bir fenotip sergilemez. Örneğin, Xenopus, zebra balığı ve civciv, non-kanonik Wnt sinyalnc göç kapasitesi12,13,14,15 elde etmek için izin veren hücresel mekanizmalardan biridir . Ancak, fare, non-canonical Wnt sinyal kaybı geçiş16etkilemez. In vivo NC göç fare uzun süre izlemek zor olduğu gibi, bu tür farklılıkları göç farklı modları, ya da moleküler düzenleme farklılıkları yansıtacak olup olmadığı belirsizdir.
Belirtildiği gibi, embriyoların eski rahim kültürü zahmetli olduğu için fare NC çalışmaları çok zor olmuştur. Ayrıca, NC mezoderm ve nötrektoderm gibi komşu dokular ile samimi temas halinde sürekli. Nöral krest spesifik Cre sürücülerin veya eksojen boyaların son kullanımı bize floresan göçmen NC etiket izin verdi; ancak, bu yaklaşımlar hala sınırlıdır. NC göç 17 ,18görselleştirmek için farklı teknikler açıklayan birden fazla rapor rağmen, basit ve rutin bir prosedür haline bu teknikleri çözmek için zor olmuştur.
Memeli NC'nin işlenmesine ve karakterizasyonuna olanak sağlayan teknikler için bir ihtiyaç olduğu açıktır. Biz insan kraniyofasiyal gelişim ve nörokoniopatiler çalışma için birincil model olarak fare kranial NC üzerinde çabalarımızı odaklanmıştır. Biz NC hücrelerinin birincil kültürünü açıklayan birkaç ilginç raporlara dayalı yaklaşımımızı rafine19,20,21. Burada, birincil NC hücrelerini ekstreleme için en uygun kültür tekniklerini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Biz canlı hücre görüntüleme yöntemi ve kültür plakaları kaplamak için farklı matrislerin optimal kullanımı göstermek. Protokolümüz, diğer mikroskoplarla kullanım kılavuzu olarak tasarlanan ters bir mikroskop kullanarak canlı NC hücrelerinin göçünün nasıl yakalandığını ve hücresel analizlerimizin ayrıntılı bir özetini açıklar.
Ekstrandan beklenen sonuç, mikroskop altında açıkça ayırt edilen hücrelerin güzel bir şekilde ortaya konması gerekir, burada (i) nöral plakayı, (ii) premigratory'yi temsil eden üç farklı hücre popülasyonu görülebilir ve (iii) göçmen nöral krest hücreleri. Epitel-mezenkimal geçiş sırasında hücre öncesi popülasyonunun sınırındaki hücre davranışlarının nasıl analiz edilebildiğini gösteriyoruz. Ayrıca hücre hızı, mesafe ve hücre morfolojisi için tam göçmen hücreleri üzerinde çalışma odaklı.
Protocol
Tüm hayvan çalışmaları King's College London Etik İnceleme Süreci tarafından etik onay almıştır ve İngiltere Home Office Proje Lisansı P8D5E2773 (KJL) uyarınca gerçekleştirilmiştir.
1. Reaktiflerin hazırlanması
- Steril fosfat tampon salini (PBS), %70 etanol, diseksiyon aletleri (forseps ve diseksiyon bıçakları veya steril iğneler), plastik plakalar veya ticari olarak kullanılabilen hücre dışı matriks ile kaplanmış cam kaydıraklar dahil olmak üzere genel çözümler ve araçlar hazırlayın ( ECM) bazlı hidrojel veya fibronektin (Malzemeler Tablosu'nabakınız), ve nöral krest media (aşağıya bakınız).
- Dulbecco'nun modifiye Eagle'ın modifiye Eagle ortamını (DMEM, 4500 mg/L glukoz), %15 fetal sığır serumu (FBS), 0,1 mM minimum esansiyel orta esansiyel olmayan amino asitleri (MEM NEAA 100X), 1 mM sodyum pirüuvat, 55 μM β-mercaptoetanol, 100 kullanarak nöral armonik bazal ortamı hazırlayın üniteler/mL penisilin, 100 adet/mL streptomisin ve 2 mM L-glutamin.
- Büyüme inhibe STO besleyici hücreleri kullanarak bir gecede medya durumu21.
- %10 FBS ve 100 U/mL penisilin, 100 U/mL streptomisin ile desteklenen DMEM içeren STO hücrelerini (Malzeme Tablosunabakın) ortamhazırlayın. % 0.1 jelatin ile kaplanmış2 şişe2 şişeler içinde biraraya Gelmek ve STO hücreleri genişletmek. 5000 rad gama ışınlaması uygulayın.
- Tohum yaklaşık 3 x 106 büyüme inhibe hücreleri üzerine 10 cm2 çanak veya 25 cm2 şişe (adım 1.2.1.1). Nöral krest bazal orta yaklaşık 10-12 mL ekleyin ve gece kuluçka.
NOT: Tohumlu hücreler 10 güne kadar koşullu ortam üretmek için kullanılabilir. Hücrelerin görünümünü düzenli olarak kontrol edin
- Orta (0,22 μm gözenek boyutu) filtreleyin ve 25 ng/mL temel fibroblast büyüme faktörü (bFGF) ve 1000 U lösemi inhibitörü faktörü (LIF) ile tamam.
NOT: 4 °C'de saklayın ve bir ay içinde kullanın veya -20 °C'de saklayın ve 3 ay içinde kullanın.
- Büyüme inhibe STO besleyici hücreleri kullanarak bir gecede medya durumu21.
- Hücre dışı matris ile doku kültürü yüzeylerini katla.
NOT: Sorulan biyolojik soruya bağlı olarak, matris cam dipli kültür yemekleri, plastik doku kültür yemekleri veya cam kapak fişleri üzerine kaplanabilir. Matris substratına bağlı farklı ECM bazlı hidrojel seyreltmeleri için aşağıya bakın. Fibronektin cam dipli yemeklerde ve kapak fişlerinde sadece aşağıda belirtilen konsantrasyonlarda test edilmiştir. Burada, substrat kaplı yüzeylere "kaplamalı plakalar" olarak atıfta bulunacağız.- ECM tabanlı hidrojel ile doku kültürü yüzeylerini katla.
NOT: Substratı kaplamaya kadar soğuk tutun, ya ortamı soğutarak ya da buzda tutarak.- Hidrojeli bir gecede 4 °C'de eritin. 10 mL'lik son hacim için DMEM'de %10 FBS ile 5 mL hidrojel ekleyin (Malzeme Tablosunabakın).
- 0,5-1 mL aliquots uygun olarak olun ve -20 °C'de saklayın.
- Buz üzerinde hidrojel aliquots eritin.
- Plastik kaplamak için hidrojel stokunun 1:20 seyreltilmesini kullanın.
- Cam slaytları ve cam dipli doku kültür plakalarını kaplamak için hidrojel stokunun 1:5 seyreltilmesini kullanın.
NOT: Hidrojeli soğuk DMEM'de seyreltin. - Plakalar / slaytlar ve 37 °C'de 30-45 dakika kuluçka üzerine istenilen alanı kapsayacak kadar seyreltilmiş hidrojel uygulayın.
- Hemen kaplanmış plakaları/slaytları kullanın veya kaplanmış slaytları gece boyunca 4 °C'de saklayın.
- Kullanmadan önce aşırılıkları çıkarın ve slaytları yüksek glikozLu DMEM (isteğe bağlı) ile durula.
- Fibronektin ile doku kültürü yüzeylerini kat.
- 1 mg/mL fibronectin stok çözeltisi aliquots olun ve -80 °C'de saklayın. 1 μg/mL son konsantrasyona Dulbecco PBS (dPBS) ile seyreltin fibronektin.
- İstenilen alanı kapsayacak kadar fibronektin uygulayın ve 15 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
- Artık fibronektin çıkarın ve cam 30-45 dakika kurumasını bekleyin.
- Kullanmadan önce kuyuları durulayın veya yüksek glikozlu DMEM (isteğe bağlı) ile kapak fişleri.
- ECM tabanlı hidrojel ile doku kültürü yüzeylerini katla.
2. Gün 1: Erken somit evre embriyolarının diseksiyonu
NOT: Steril aletler ve steril çözümler kullanın. Genotipleme gerekiyorsa, DNA çıkarma için embriyo nun gövdesini toplayın.
- Kranial nöral plaka diseksiyon embriyolar ile sınırlıdır 8.5 gün sonrası coitum (dpc). 5-8 somite aşamasında embriyoseçin. PBS içine rahim diseksiyon ve her embriyo ayırmak için mesometrium kesti(Şekil 1A). Uterusun kas duvarı kas ve desidual doku görünür hale gelecektir (Şekil 1B).
NOT: Diseksiyonlar her seferinde bir embriyo yapılırken, embriyoları rahimde buz gibi PBS'de muhafaza edin. Görünürlüğü artırmak ve kontaminasyonu azaltmak için embriyoları cam pasteur pipetli olarak taze steril PBS'ye taşıyın. - Kas tabakası ve desidual doku arasında kaydırma ve forceps ikinci bir çift ile kas tabakası kaldırmak(Şekil 1C).
- Forceps kullanarak, mesometrial kutup kenarlarında yaprak delmek ve perçeler ikinci bir çift ile kutup dik açmak için gözyaşı.
- Reichert zarını görselleştirmek için desidual dokuyu çalgılarla soyun.
- Reichert'in zarını dikkatlice çıkarın. Visseral sarısı kese görünür hale gelir ve embriyo içinde görülebilir (Şekil 1D).
- Visseral sarısı kesesini ve amnionu(Şekil 1E)çıkarın ve embriyoyu baş kıvrımını görselleştirmek için konumlandırın (Şekil 1F).
- Temiz bir nöral plaka (NP) elde etmek için forceps ve/veya kirpik araçlarını kullanarak kalbin üzerindeki baş kıvrımını kesin ve altta yatan mezodermi kazıyın(Şekil 1H).
NOT: NP, anteroposterior ekseninin tamamının veya bölünerek her iki tarafın ayrı ayrı kaplanabilir. Nöral plaka sınırı eksplantlara nöronal katkıları en aza indirmek için nöral plaka dan daha fazla kesilmiş olabilir. - İncelenmiş nöral plakayı şartlı nöral krest media ile dolu hidrojel kaplı bir tabağa aktarmak için cam pasteur pipetkullanın.
- Yavaşça kuyunun ortasında NP konumlandırmak için çanak girdap. Bu, canlı hücre görüntülemesi için faz kalitesinin maksimize edilmesi için önemlidir (2. günde).
- 37 °C'de geceleme (veya istenilen zaman noktasına) %5 CO2. Nöral krest hücreleri nöral plaka nın dışına gözle görülür bir şekilde göç etmelidir.
NOT: Hücreler genellikle 6-8 saat içinde bağlanır. Ekstrektifi bağlandıktan sonra, geçiş hücrelerini görselleştirmek için daha fazla zaman bekleyin. Genellikle 24 saat sonrası ekstreğe göre, üç ayırt edilebilir hücre popülasyonu bulabiliriz. Ekstryenin merkezindeki ilk popülasyon nöral plakadır (NP). İkinci popülasyon, premigratory NC (pNC), hücrelerin bir epitel levha NP çevreleyen. Üçüncü popülasyon, dış halkada, büyük boyutlu olan göçmen NC 'den (mNC) oluşur ve tam mezenkimal görünür(Şekil 2).
3. Gün 2: Murinrin kranial nöral krest hücrelerinin canlı hücre görüntülemesi
NOT: Görüntüleme 24 saat sonrası en iyi görüntü ve nöral krest hücre göç ölçmek için ekstrplanting yapılmalıdır. NC indüksiyon ortamıcanlı hücre görüntüleme önce yenilenmesi gerekmez. Motorlu bir sahne ve dahil bir çevre odası ile ters bir mikroskopa erişim gereklidir. Görüntülemeye uygun çok kuyulu doku kültürü yemeklerini kullanın(Malzeme Tablosu).
-
Mikroskop kurulumu
- Çevre odasını 37 °C ve %5 CO2olarak ayarlayın.
- Co 2nemlendirme odasına bağlı CO2 iğnesinin plaka nın içinde oturabilmesi için doku kültürü plakakapağının kapağına bir delik açın.
- Çok iyi edinimi sırasında titremeönlemek için örnek tutucu içine doku kültürü çanak yerleştirin ve plaka kapağı ve CO2 iğne aşağı bant.
- Mikroskop denetleyicisini, sahne denetleyicisini ve görüntüleme yazılımını açın.
- 10x büyütmede kranial NC hücrelerine odaklanın (seçilen kondansatörde eşleşen faz halkası ile).
- Mikroskop kurulum kılavuzunda belirtildiği gibi iris diyafram, diyafram diyaframı ve merkezleme teleskopunu ayarlayarak mikroskop üzerinde yüksek kaliteli faz kontrastı ayarlayın.
-
Faz kontrastlı canlı hücre görüntüleme
- Zaman atlamalı dosyaların kaydedileceği dizin veya dosya konumunu ayarlayın.
- Pozlama süresini, binning'i ve kamera alanını ayarlayın.
- Zaman noktalarının sayısını, görüntüleme süresini ve çerçeveler arasındaki zaman aralığını ayarlayın.
- NC hücre göç kapasitesini ölçmek için, mikroskobu her 5 dakikada 1 kare (18 saat üzerinden 217 zaman puanı) alarak 10x büyütmeye ayarlayın. Hücre morfolojisini ölçmek için büyütmeyi 40x olarak ayarlayın, 1 kare/dk (1 saat üzerinden 61 zaman puanı) alın. Lamellipodial dinamikleri ölçmek için, büyütmeyi 40x veya 60x büyütmeye ayarlayın, her 10 s (10 dk'dan fazla) 1 kare alın.
- Çok iyi görüntüleme için, mekanik sahneyi seçilen XY konumlar arasında hareket ettirecek şekilde ayarlayın. Kranial NC hücrelerinin odakta olduğunu ve sahne konumlarının doğru olduğunu doğrulayın.
- Hızlandırılmış görüntülemeyi başlatmak için Edinme komutunu kullanın.
- Hızlandırılmış görüntüleme tamamlandıktan sonra, çok boyutlu verileri gözden geçirin ve analiz için .stk dosyalarını dışa aktarın.
NOT: .stk bir TIFF yığın dosyasıdır. - Yazılımdan çıkın, bilgisayarı kapatın ve sahneyi, kamerayı ve mikroskop denetleyicilerini kapatın.
4. Görüntüleme analizi: nöral krest hücre göçünün nicelleştirilmesi
NOT: Murine kranial nöral krest hücrelerinin göç ederek sergilediği hücresel davranışları daha iyi tanımlamak için, özellikle göç kapasitesi ve hücre şekli dinamiği üzerinde odaklanarak bir dizi ölçülebilir göç parametrelerini analiz ettik. (1) Geçiş (birikmiş mesafe) hücre (μm) tarafından alınan toplam yol uzunluğudur; (2) Göç (Öklid mesafesi) hücrenin başlangıç ve son konumu arasındaki düz çizgi uzaklığıdır (μm); (3) Geçiş (hücre hızı) hücre tarafından zaman birimi başına katedilen mesafedir (μm/dk); (4) Hücre Şekli (hücre alanı) hücre ile kaplanmış toplam yüzeydir. Pikseli görüntüleme mikroskobuna göre mikron ölçeğine ayarlayın. (A = Apx x Npx, burada Apx = piksel alanı ve Npx = piksel sayısı. Birimler: μm2; (5) Hücre şekli (hücre daireselliği), A = alanı ve P = çevrenin bulunduğu 1.0 (4π (A/P2)) dairesellik değeriile gösterilen mükemmel bir daireden hücre şeklinin sapmasıdır.
-
Tek hücreizleme
NOT: NC hücre geçişini ölçmek için, tüm zaman atlamalı çerçeveler boyunca tek tek hücrelerin XY koordinatları oluşturulur. Bu, hücre geçişinin uzaklık, hız ve kalıcılık ölçülerinin sonraki analizini sağlar.- ImageJ'i açın ve VERILERI TIFF yığın dosyaları olarak aktarın.
- Analiz Et ' i tıklatın | .stk dosyalarını piksel/μm'de çalışan mikroskop ayarlarına göre kalibre etmek için Ölçek'i ayarlayın.
- Eklentiler | İzleme | Resim J manuel hücre izleme eklentisini açmak için Manuel İzleme. Hücre izlemeyi başlatmak için parça ekle'yiseçin.
- Çekirdeği referans noktası olarak kullanarak hücreleri tüm hızlandırılmış filmlerin karelerinde izleyin.
NOT: Ekstryen başına 10-20 hücre izlenmeli ve toplam 60 hücre izlenmelidir (n = 3). Zaman atlamalı süre boyunca hücre bölünmesi geçiren hücreler analiz dışı edilmelidir. - Sonuçları .csv dosyası olarak kaydedin ve dışa aktarın. Sonuçlar, tüm kareler üzerinde tek tek hücre izleme numarasını, dilim numarasını ve XY koordinatlarını temsil eder.
-
Nöral krest hücre göç kapasitesinin sayısallaştırılması
- Tek hücre izleme verilerini açın (yukarıya bakın). .csv dosyalarını .txt dosya biçimine dönüştürün.
- Geçiş yazılımını (Malzeme Tablosu)açın. Hücre izleme verilerini .txt dosyası olarak almak için Verileri İçe Aktar sekmesini tıklatın.
- Veri Setleri Altında | Başlatma,çözümlenecek dilim veya çerçeve sayısını seçin ve XY kalibrasyonunu ve çerçeveler arasındaki zaman aralığını ayarlayın. Ayarları kaydetmek için Uygula ayarlarını seçin.
- Yörünge çizimlerini oluşturmak için Çizim Verileri simgesini seçin. Mesafe ve hız ölçülerini ölçmek için İstatistikler simgesini seçin.
- Yörünge çizimlerini bitmap (.bmp) dosyaları olarak, mesafe ve hız ölçülerini ise .txt dosyaları olarak kaydedin. Verileri Kaldır simgesini seçin. Diğer hızlandırılmış dosyalar için yineleyin.
NOT: Yörünge çizimleri, belirli bir hücre durumu veya zaman atlamalı filmler(Şekil 4A)boyunca durum için tek tek hücre yollarının doğrudanlığını görselleştirmek için kullanılabilir. Daha sonra .txt dosyalarında depolanan mesafe ve hız verileri daha fazla analiz için kullanılabilir.
-
Nöral krest hücre alanının ve daireselliğinin nicelleştirilmesi
- ImageJ'deki hızlandırılmış .stk dosyalarını açın ve piksel/μm'de çalışarak mikroskop ayarlarına göre kalibre edin.
- Analiz Altında | Ölçümleri Ayarla,hücre şekli parametrelerini seçmek için tıklatın: hücre alanı, çevre ve şekil tanımlayıcısı.
- Kılavuz olarak hücre zarı sınırlarını kullanarak her hücrenin etrafında el ile çizmek için Freehand Seçimi aracını kullanın.
- Görüntüdeki hücre anahatlarını korumak için klavyedeki Ctrl + B tuşlarına basın. Her hızlandırılmış çerçeve üzerinde hücreler için tekrarlayın.
- Resmi Kullanma | Bindirme | Değerleri depolamak için YG Yöneticisi'ne.
- Kare başına ilgi çeken tüm hücreler ana hatlarıyla belirlendikten sonra Ölçü'yetıklayın. Sonuçları .csv dosyası olarak kaydedin.
NOT: Film başına 10-20 hücre ana hatlarıyla belirtilmeli ve her koşulda toplam 30-60 hücre analiz edilmelidir (n = 3). Hücre şekli verileri (.csv dosyaları) hücre şekli dinamiğinin zaman içinde nasıl değiştiğini(Şekil 4C)veya morfolojinin farklı hücre tedavileri altında nasıl değiştirilebileceğini ölçmek için kullanılabilir.
Representative Results
Burada gösterilen prosedür kullanılarak, fare embriyoları rahimden çıkarıldı ve ekstraembriyonik dokular çıkarıldı(Şekil 1A-D). Embriyolar somit aşamalı (5-8 somites (ss), Şekil 1E,Fsadece embriyolar kullanılarak) idi. Kranial nöral plaka daha sonra kesildi ve nöroepitel izole edildi. Gevşek, dairesel, mezenkimal hücreler olarak tanımlanan mezodermal hücreler hafifçe fırçalandı(Şekil 1G-L). Anterior nöral plaka bütün ekilebilir, bu durumda nöral krest dokusu yanal ortaya çıkacak ve explant etrafında radyal genişletmek, ya da her sinir plakası sınır (sağ ve sol) ayrı ayrı eklenebilir. Bu özellikle genetik mutantlardan ekstren yaparken yararlıdır.
24 saat içinde, premigratory (epitel) kranial nöral ibik bir bölge açıkça nöral plaka ekstrüzyonu çevreleyen görülebilir (Şekil 2B). Ayrıca, nöral krest hücrelerinin bir alt popülasyonu mezenkimal geçiş ekilyal geçirmiş ve tam mezenkimal görünür (Şekil 2). Böylece, merkezde nöral plaka (NP), orta dairede premigratory nöral tepe (pNC) ve dış halkada göçmen nöral tepecik (mNC) popülasyonu ile farklı hücrelerin birkaç eşmerkezli halkası vardır(Şekil 2B). NC hücrelerinin izini sürmek için Şekil 2C'degösterdiğimiz gibi genetiği değiştirilmiş fare modellerini kullanmak mümkündür. Bu durumda, nöral ibik spesifik Wnt1 kullandık::Cre; RosamTmG nc hücreleri yeşil etiketli neden olur. Bu farelerde hücreler, Cre rekombinaz ifade etmedikçe membran domatesi (mT, kırmızı) ifade ederler. Rekombinasyon membran yeşil floresan protein (GFP, yeşil) ifade hücreleri yol açar. Eksplantın merkezinde gösterilen kırmızı hücreler nöral plaka hücreleridir. Bazı dorsal nöral plaka hücreleri de GFP ifade; uzun vadeli kültür için, biz merkezinde tüm hücreleri çıkarmak istiyorsunuz. Bizim amaçlarımız için, eksplantsaflığı farklı nöral krest hücre popülasyonlarını izlemek için yeterlidir. Nöral armasının daha yüksek saflıkta olması gerektiğinde, bu genetik etiketleme stratejisi, popülasyonun saflığını sağlamak için floresan aktif hücre sıralama (FACS) ile kombine edilebilir. Alternatif olarak, ekstesikleri onarmak ve antikor etiketleme ile NC popülasyonu belirlemek mümkündür.
Ayrıca 24 saat ile ekstrektif kültürlerin premigratory ve tam göçmen NC hücrelerinin karakteristik konsantrik halkaları bağımlı olmadığı ve matris seçimi ile yönetilmediğini açıkça ortaya koymaktadır(Şekil 3). Hem ECM tabanlı hidrojel hem de fibronektin üzerine biçilmiş eksplant kültürleri, üç hücre popülasyonu, NP, pNC ve mNC'den oluşan karşılaştırılabilir eksplant yapıları oluşturmuştur(Şekil 3A,C). Nöral krest hücre morfolojisi de ECM tabanlı hidrojel ve fibronektin kaplamaları arasında karşılaştırılabilir(Şekil 3B,D). Ancak, fibronektin üzerinde kaplanmış eksektifler hücre nin önde gelen kenarında daha belirgin lamellipodia olan hücreler ürettiler, göç yönünde daha kutuplaşmış gibi görünmektedirler(Şekil 3B,D).
Göçmen nöral krest hücrelerinin popülasyonu belirgin hale geldiklerinde canlı hücre görüntülemesi tamamlanabilir. Zaman atlamalı mikroskopi NC hücre geçişinin sonraki analizi için 10x büyütme (18 saat, 1 kare/5 dk) olarak ayarlanır (Şekil 4A). ImageJ Manuel İzleme eklentisi, hızlandırılmış filmlerin tüm karelerinde tek tek hücrelerin XY koordinatlarını oluşturur(Şekil 4B). Bu koordinatlar geçiş yazılımı kullanılarak işlenebilir. Bu yazılım zaman içinde tek tek hücre parçalarının görselleştirilmesini sağlar(Şekil 4B)ve birikmiş ve Öklid uzaklığı yanı sıra hücre hızını ölçmek için kullanılabilir.
Hızlandırılmış görüntüleme verileri ayrıca kranial nöral krest hücrelerinin göçü sırasında hücre morfolojisi hakkında bilgi zenginliği sağlar(Şekil 4C). Tek tek hücre zarlarını ana hatlarıyla, hücre alanı ve çevre ölçümleri filmlerin tüm karelerinden hesaplanabilir(Şekil 4C). Bu ölçümler hücre alanı nın ve daireselliğin sonraki nicelemesine olanak sağlar (Şekil 4D). Şekil 4C hücre şekli değişikliklerinin analizini gösterir 18 h. Hücre eksplanttan uzaklaştıkça hücre alanının önemli ölçüde arttığına dikkat edin hücre daireselliği nispeten sabit kalırken (tek yönlü ANOVA, Tukey'in çoklu karşılaştırma testi) ( Şekil 4E,F). Bu, hücrelerin epitel kenarından ayrılıp hücre hücre bağlantılarını kaybettikleri için hücre yayılma alanının arttığını gösterdiğini göstermektedir. Hücre dairesellik önlemleri zaman içinde önemli ölçüde değişmedi; ancak, zaman puanlarının artması nın ölçülmesi durumunda dairesellikte kısa vadeli değişiklikler görülebilir. Hücre dairesellik önlemleri de bir kemotaktik işaret varlığında veya sınırlı koşullar altında hücre şekli dinamikleri hakkında ilginç veriler sağlayabilir.
Şekil 1: Kranial nöral abi eksültörübir e8.5 embriyodan izolasyon.
Görüntüler, mikro diseksiyon tekniğini belgeleyen bir videodan elde edilen fotoğraflar. (A–C) Embriyonun rahimden diseksiyonu. (B–C) İki keskin forceps kullanarak, yavaşça kas tabakası nı ayırın. Panel (D) visseral sarısı kese (sarı çizgi) içinde embriyo gösterir. Visseral sarısı kesesinden embriyo ayıklayın. (E) Evre 8.5 lateral embriyolateral görünümleri. (F) Evre 8.5'te embriyonun dorsal görünümü. Embriyoların yaşını belirlemek için somitler (ss) saymak; genellikle 5-8 ss (F sarı daireler). (G) Embriyonun kranial bölgesine yakından bakın. Kranial bölgeden ekstraembriyonik membranları çıkarın; somites sarı bir çizgi ile işaretlenir. (H) Anterior nöral plakanın diseksiyonları ilk dalsal kemer (sarı çizgi) altında yapılır. (I) Anterior nöral plaka diseksiyonun lateral görünümü. Nöral krest hücreleri ortaya çıkan nöral kıvrımlar, sarı bir çizgi ile işaretlenir. (J-L) Mezodermal doku kaldırın (kabarık mezenkimal hücreler) hazırlanan kültür yemekleri üzerine NP kaplama önce mümkün olduğunca ön nöral kıvrımlar altında yatan. Film 3.0X zoom geniş alan apochromatic lens ile bir stereo-mikroskop kullanılarak alınmıştır (Malzemeler Tablosubakınız). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Murine kranial nöral abi ekstrekti.
(A) Bir e8.5 fare embriyosundaki sırt görünümünün şematik gösterimi. Embriyonun kafatası bölgesi kesik çizgide kesilir. Nöral plaka sınırı (kırmızı ile vurgulanır) çevreleyen mezoderm dokusundan izole edilir ve kranial nöral tepenin göç etmesine izin vermek için 24 saat kültürlüdür. Şematik22,23uyarlanmıştır. (B) Sol: Kaplamadan 24 saat sonra kranial nöral bir iktisadinin temsili parlak alan görüntüsü. Üç hücre popülasyonu gözlenir, bunlar da sağda şematize edilir. NP = nöral plaka, pNC = göçmen öncesi nöral tepeve mNC = göçmen nöral tepecik. Ölçek çubuğu = 250 μm. (C) Genetik olarak etiketlenmiş fareden bir ekstrkülün daha yüksek büyütme görüntüleri (Wnt1::cre; RosamTmG). Cre sürücüsü olmayan hücreler membran domatesi (mT) kırmızı ile ifade eder. Bir nöral krest spesifik Wnt1 organizatörü kontrolü altında Cre ifadesi mT kaset ve membran GFP ekspresyonu eksizyon yol açar (mG) yeşil. Çekirdekleri Hoescht (mavi) ile boyanmış. Ölçek çubuğu = 200 μm. (D–D'') Membran GFP (D) ifade eden göçmen hücrelerin yüksek büyütme görüntüleri. (D') DNA Hoescht (mavi) ile etiketlenmiştir. (D'') D ve D'nin birleşmesi. Ölçek çubuğu = 20 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Ekstreler farklı yüzeylerde kültürlenmiş.
(A–B) Ticari ECM-hidrojel üzerinde kültüre eksplants Faz kontrast görüntüleri. (C–D) Eksektifler 1 μg/mL fibronektin üzerine kültürlenmişlerdir. Nöral plaka (NP), premigratory (pNC) ve göçmen (mNC) nöral krest hücreleri farklı hücre morfolojileri ile ayırt edilebilir. Ölçek çubuğu = 100 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Kranial nöral krest hücre göçü ve hücre şekil dinamiğinin nicelleştirilmesi.
(A) ImageJ/Fiji Manuel Hücre İzleme eklentisi kullanılarak, tek nöral krest hücre parçalarıyla kaplanmış ekstrüzyon kültürlerinin hızlandırılmış görüntülemesinden faz-kontrast çerçeveleri. On temsili mNC hücresi 18 saat (217 kare) ve XY üzerinden manuel olarak izlendi koordinatları ihraç edildi. Veriler, bir yer kaplama nokta ve satır çizimleri olarak temsil edilir. Hücreler 1 μg/mL fibronektin üzerine kaplandı. Ölçek çubuğu = 200 μm. (B) Geçiş yazılımı kullanılarak oluşturulan 10 mNC hücrenin temsili yörünge çizimi. (C) Ekstrkül kültürlerinin hızlandırılmış analizinden alınan faz-kontrast çerçeveleri. Kesik çizgiler, 1 μg/mL fibronektin üzerine kaplandığında hücre şekli dinamiği için analiz edilen 8 temsili göçmen nöral krest hücresinin ana hatlarını oluşturur. Ölçek çubuğu = 200 μm. (D) Hücre alanını ve daireselliği ölçmek için kullanılan hesaplamaların şematik gösterimi. Şema hücre morfolojisi mavi (C)ile vurgulanan hücrenin dir. Birpx = piksel alanı, Npx = piksel sayısı, A = alan, P = çevre (1 piksel = 1.60772 μm2). (E-F) Hücre alanının ve hücre daireselliğinin zaman içinde ölçülmesi. Veriler ortalama ± SEM'i temsil eder. Her nokta, 3 bağımsız deneyden alınan ve 0 saat, 6 saat, 12 saat ve 18 h (ns önemsiz olmayan, * p<0.05, **** p < 0.0001 tek yönlü ANOVA, Tukey'in çoklu karşılaştırma testi) olarak analiz edilen bir hücreyi (n = 60) temsil eder. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Discussion
Memeli nöral krest hücrelerinin incelenmesi, memeli gelişiminin rahim yapısı nedeniyle bilim adamları için bir meydan okuma olmuştur. In vivo çalışmalar kurmak zordur, embriyo rahim yaşam taklit koşullar altında manipüle edilmelidir gibi. Pratikte, bu (E8+) embriyoların 24 saatten daha uzun süre tekrarlanması neredeyse imkansızdır, özellikle canlı görüntüleme için. Ayrıca, nöral ibik indüksiyon ve göç fare nöral tüp kapanması ve embriyonik tornalama ile eş zamanlı olarak meydana; Bu çok önemli ve stresli morfogenetik bir olaydır, embriyolar kültürlü eski rahimolduğunda sık sık başarısız olur. Bu nedenle, ex utero yaklaşımlarının başarı oranı genellikle düşüktür. Ölümsüzleştirilmiş NC hücrelerinin kullanımı21 hayvan kullanımını azaltmak için yararlı bir araçtır ve uzun vadeli analiz, transfeksiyon ve zenginleştirme çalışmaları için nöral krest hücrelerinin daha iyi bir kaynak sağlayabilir. Ancak, açıkça güvenilir kültür birincil nöral krest hücreleri için bir ihtiyaç vardır. Yöntemimiz fare nakavt veya koşullu genetik modeller için geçerlidir. Bizimkiyle karşılaştırılabilir bir yöntem diğer nöral krest popülasyonları için tanımlanmıştır20; ancak, yöntemimiz iyice murine kranial NC hücrelerinin adım adım izolasyon açıklar. Ayrıca farklı matrislerin yanı sıra göç analizi prosedürünü de ayrıntılı olarak tanımlıyoruz.
Tutarlı sonuçlar elde etmek için, embriyo seçimi sırasında evreleme doğru özel dikkat bulundu. Beklendiği gibi, somitlerin sayısı kranial NC gelişiminde farklı aşamaları ile ilişkilidir. Bu nedenle, herhangi bir deneysel veri elde etmeden önce embriyo anatomisi bilgisi çok önemlidir. Bu yaklaşım daha sonra biyolojik soru ve hedef hücrelere bağlı olarak, nöral krest hücrelerinin ayrık popülasyonları izole doğru adapte edilebilir.
Embriyolar seçilip parçalandıktan sonra mezodermal hücreler kolayca ayırt edilebilir ve daha iyi görselleştirme ve kontaminasyonu azaltmak için çıkarılmalıdır. Uzun süreli kültürler için, nöral plaka dokusu nöral dokular tarafından kontaminasyonu önlemek için kaplama 24 saat kaldırılabilir. Bir başka arıtma floresan soy etiketleme kullanımı olabilir (örneğin, bir Wnt1 kullanarak::cre veya Sox10::creERT sürücüleri floresan muhabirleri ile birlikte24,25) nöral krest hücreleri ayırt etmek için şekil 2C'degösterildiği gibi diğer dokular .
Önceki raporlar, en sık ticari ECM hidrojelleri, fibronektin ve kollajen I, farklı matrisler üzerinde kaplama fare NC explant kültürlerin potansiyelini vurgulamıştır20,21,26. Elimizde, fare kranial NC eksplant kültürleri başarıyla orijinal raporlarda belirtilen konsantrasyonlarda, her üç matris üzerinde yetiştirilen (veriler gösterilmez). NC ekstrandal kültürlerimiz için uyarladığımız ilk rafine yaklaşım, öncelikle laminin ve kollajenlerden oluşan tercih matrisi olarak ticari bir hidrojel kullandı.21(Şekil 3A–B). Ancak, bu hidrojel bileşimi açıkça tanımlanmış değildir, bilinmeyen büyüme faktörü ve protein içeriği ile. Bu nedenle, o zamandan beri fibronectin üzerinde fare NC explant kültürleri kaplama yaklaşımımızı değiştirdik (Şekil 3C–D). Fibronektin iyi tanımlanmış ve yüksek NC hücreleri göç boyunca ECM ve bazal membranlarda ifadein vivo28,29,30. Hidrojel kullanılarak görüldüğü gibi nöral krest hücre göçünü ve morfolojisini en iyi şekilde kopyalayan bir fibronektin matrisini optimize etmek için hidrojelüzerinde sergilenen NC hücre davranışlarını 0,25-30 μg/mL fibronektin titrasyonuile karşılaştırdık ve 1 μg/mL fibronektin olarak tanımladık. ideal özellikler (veri gösterilmez) sağlama. Bu ön çalışmanın, daha önce tanımlanan lar, yani kollajen ve lamininler ile fibronektin gibi matrislerin sistematik olarak karşılaştırılması için bir çerçeve oluşturulmasına yardımcı olabileceğine inanıyoruz.32,33,34. Kollajen-IA1'in fare, kuş ve insan NC hücreleri tarafından endojen olarak salgılandığı göz önüne alındığında, fibronektin ile kollajen I'deki fare NC hücre göç kapasitesini karşılaştırmak özellikle ilginç olacaktır.28,30,31,32. Kollajen I bu nedenle matris seçimi dikkate fibronektin olarak ilgilidir. Ayrıca, medyadaki büyüme faktörlerinin biyoyararlanımının, özellikle medyamızın yüksek serum içeriği göz önüne alındığında, farklı matris bileşenleri tarafından değiştirilebileceği de kabul etmek gerekir. Bunun üstesinden gelmek için, şu anda serumiçermeyen tanımlanmış kültür koşulları üretmek için çalışıyoruz. Bu tanımlanmış ortamlar pluripotent kök hücre alanında nöral alelade indüksiyon protokollerinde başarıyla kullanılır, ancak NC ekstre kültür sistemimiz için daha fazla optimizasyon gerektirir33,34. Çalışmalarımız aynı zamanda kardiyak ve gövde NC gibi NC hücrelerinin diğer türleri için rafine koşulları için bir başlangıç noktası olarak hizmet verebilir, ve NC farklılaşma sonraki çalışmalar için. En önemlisi, bu protokol çeşitli uygulamalar için kranial NC hücrelerinin izolasyon sağlar. Yönlendirilmiş göç, 3 boyutlu göç ve istila üzerine çalışmalar öngörüyoruz. Bu şekilde izole edilen hücreler tedavi edilebilirin vitrobir dizi analiz için. Örneğin, hücreler belirli proteinleri hedeflemek için farklı küçük moleküller kullanılarak kolayca tedavi edilebilir, bunlar tanımlanmış zaman noktalarında tedavi edilebilir ve yıkama deneyleri hücre davranışlarının iyileşmesini belirlemek için tasarlanabilir (Şekil 4). Transfeksiyon ve farklılaşma tahlilleri için uzun vadeli kültür, hem de hücrelerin geçişi (veri gösterilmez) mümkündür. Ancak, canlılık, hücre yenilenmesi ve multipotency kapasitesi passaging sonra doğrulanmalıdır. Cam kapaklara kaplanmış hücreler, canlı görüntülemesonrasında immünoresan boyama protokollerinde de kullanılabilir. Son olarak, bu yaklaşım genetik fare modellerinden NC göç üincelemek için son derece güçlü bir sistemi temsil eder22,23,24,25.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması yok.
Acknowledgments
Biz King's College Londra Biyolojik Hizmetler Birimi, özellikle Tiffany Jarvis ve Lynsey Cashnella onların sürekli destek için müteşekkiriz. Derek Stemple, Mamoru Ishii ve Robert Maxson'a bu protokolün ilk kuruluşunda reaktiflere yardımcı olan tavsiyeleri ve yardımları için teşekkür ederiz. Dheraj Taheem'e STO hücrelerinin gama ışınlaması konusunda yardım ettiği için teşekkür ederiz. Biz Liu ve Krause laboratuvarları, özellikle Tommy Pallett, büyük destek için teşekkür ederiz. Bu çalışma BBSRC (BB/R015953/1' den KJL/MK), MRC Doktora Eğitim Programı (LD), Newland Pedley Fonu (ALM) ve KRIPIS II, Araştırma ve Teknoloji Genel Sekreterliği (GSRT), Eğitim ve Din Bakanlığı'na verilen hibelerle finanse edilmiştir. İşleri, Yunanistan ve Fondation Santé (SGGM için).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| bFGF | R&D systems | 233-FB | |
| b-mercaptoethanol | Gibco | 31350-010 | |
| Tissue culture flasks | Corning | 430639 | 25cm2 culture flasks |
| DMEM (4500 mg/L glucose) | Sigma | D5671 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (dPBS) | Sigma | D8537 | |
| Ethanol | Fisher Chemicals | E/0650DF/C17 | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | TFS AA 10-155 | |
| Fetal Bovine Serum (ES Cell FBS) | Gibco | 26140079/16141-079 | |
| Fibronectin bovine plasma | Sigma | F1141 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9382 | |
| L-glutamine | Sigma | G7513 | |
| Glass-bottomed, multi-well 24-well tissue culture plate | Ibidi | 82406 | Glass-bottomed, No 1.5, 24-well tissue culture dish with black sides |
| Cell migration analysis tool | Ibidi | v2.0 | Manuals for this software can be found at: https://ibidi.com/manual-image-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html. |
| Circularity Plug-in | ImageJ | v1.29 or later | The circularity plug-in is an extended version of ImageJ/Fiji’s Measure command, designed by Rasband, W., (2000) (wsr@nih.gov). |
| LIF | ESGRO by Millipore | ESG1106 | |
| Manual Cell Tracking Plug-in | ImageJ | v1.34k or later | ref Cordelieres F. Institut Curie, Orsay (France) 2005 |
| Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
| MEM non-essential aminoacids 100X | Gibco | 11140-050 | |
| Matrigel (ECM-based Hydrogel) | Corning | 356234 | |
| Microscope | Olympus | 1X81 | Olympus 1X81 inverted microscope |
| Microscope camera | Photometrics | 512B | Photometrics Cascadell 512B camera (4x UPlanFL N, 10x UPlanFL N, 20x UPlanFL N, 40x UPlanFL N objectives) |
| Microscope controller | Olympus | 1X2-UCB | Olympus 1X2-UCB microscope controller |
| Microscope temperature controller | Solent Scientific | RS232 | Maintained at 37°C |
| Penicillin/streptomycin | Sigma | A5955 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | S8636 | |
| Statistics software | Graphpad Prism | v7.0 | |
| STO feeder cells | ATCC | CRL-1503 | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ | |
| XY microscope stage controller | Applied Scientific Instrumentation (ASI) | MS-4400 |
References
- Duband, J. L. Diversity in the molecular and cellular strategies of epithelium-to-mesenchyme transitions: Insights from the neural crest. Cell Adhesion & Migration. 4, 458-482 (2010).
- Mayor, R., Carmona-Fontaine, C. Keeping in touch with contact inhibition of locomotion. Trends in Cell Biology. 20, 319-328 (2010).
- Le Douarin, N., Kalcheim, C. The neural crest. 2nd edn. , Cambridge University Press. (1999).
- Trainor, P. A. Neural Crest Cells : Evolution, Development, and Disease. , Academic Press. (2014).
- Jiang, R., Bush, J. O., Lidral, A. C. Development of the upper lip: morphogenetic and molecular mechanisms. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 235, 1152-1166 (2006).
- Ahola, J. A., et al. Increased incidence of Hirschsprung's disease in patients with hypoplastic left heart syndrome--a common neural crest-derived etiology? Journal of Pediatric Surgery. 44, 1396-1400 (2009).
- Bajpai, R., et al. CHD7 cooperates with PBAF to control multipotent neural crest formation. Nature. 463, 958-962 (2010).
- Inoue, K., et al. Congenital hypomyelinating neuropathy, central dysmyelination, and Waardenburg-Hirschsprung disease: phenotypes linked by SOX10 mutation. Annals of Neurology. 52, 836-842 (2002).
- Kim, H., Kang, K., Ekram, M. B., Roh, T. Y., Kim, J. Aebp2 as an epigenetic regulator for neural crest cells. PloS one. 6, e25174 (2011).
- Barriga, E. H., Trainor, P. A., Bronner, M., Mayor, R. Animal models for studying neural crest development: is the mouse different? Development. 142, 1555-1560 (2015).
- Bronner, M. E., LeDouarin, N. M. Development and evolution of the neural crest: an overview. Developmental Biology. 366, 2-9 (2012).
- De Calisto, J., Araya, C., Marchant, L., Riaz, C. F., Mayor, R. Essential role of non-canonical Wnt signalling in neural crest migration. Development. 132, 2587-2597 (2005).
- Carmona-Fontaine, C., et al. Contact inhibition of locomotion in vivo controls neural crest directional migration. Nature. 456, 957-961 (2008).
- Matthews, H. K., et al. Directional migration of neural crest cells in vivo is regulated by Syndecan-4/Rac1 and non-canonical Wnt signaling/RhoA. Development. 135, 1771-1780 (2008).
- Banerjee, S., et al. A novel role for MuSK and non-canonical Wnt signaling during segmental neural crest cell migration. Development. 138, 3287-3296 (2011).
- Pryor, S. E., et al. Vangl-dependent planar cell polarity signalling is not required for neural crest migration in mammals. Development. 141, 3153-3158 (2014).
- Serbedzija, G. N., Bronner-Fraser, M., Fraser, S. E. Vital dye analysis of cranial neural crest cell migration in the mouse embryo. Development. 116, 297-307 (1992).
- Kawakami, M., Umeda, M., Nakagata, N., Takeo, T., Yamamura, K. Novel migrating mouse neural crest cell assay system utilizing P0-Cre/EGFP fluorescent time-lapse imaging. BMC Developmental Biology. 11, 68 (2011).
- Stemple, D. L., Anderson, D. J. Isolation of a stem cell for neurons and glia from the mammalian neural crest. Cell. 71, 973-985 (1992).
- Etchevers, H. Primary culture of chick, mouse or human neural crest cells. Nature protocols. 6, 1568-1577 (2011).
- Ishii, M., et al. A stable cranial neural crest cell line from mouse. Stem Cells and Development. 21, 3069-3080 (2012).
- Gonzalez Malagon, S. G., Liu, K. J. ALK and GSK3: Shared Features of Neuroblastoma and Neural Crest Cells. Journal of Experimental Neuroscience. 12, 1179069518792499 (2018).
- Gonzalez Malagon, S. G., et al. Glycogen synthase kinase 3 controls migration of the neural crest lineage in mouse and Xenopus. Nature Communications. 9, 1126 (2018).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology : CB. 8, 1323-1326 (1998).
- Laranjeira, C., et al. Glial cells in the mouse enteric nervous system can undergo neurogenesis in response to injury. Journal of Clinical Investigation. 121, 3412-3424 (2011).
- Pfaltzgraff, E. R., Mundell, N. A., Labosky, P. A. Isolation and culture of neural crest cells from embryonic murine neural tube. Journal Of Visualized Experiments : JoVE. , e4134 (2012).
- Sternberg, J., Kimber, S. J. The relationship between emerging neural crest cells and basement membranes in the trunk of the mouse embryo: a TEM and immunocytochemical study. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 98, 251-268 (1986).
- Sternberg, J., Kimber, S. J. Distribution of fibronectin, laminin and entactin in the environment of migrating neural crest cells in early mouse embryos. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 91, 267-282 (1986).
- George, E. L., Georges-Labouesse, E. N., Patel-King, R. S., Rayburn, H., Hynes, R. O. Defects in mesoderm, neural tube and vascular development in mouse embryos lacking fibronectin. Development. 119, 1079-1091 (1993).
- Henderson, D. J., Copp, A. J. Role of the extracellular matrix in neural crest cell migration. Journal of Anatomy. 191 (Pt 4), 507-515 (1997).
- Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Human Molecular Genetics. 17 (21), 3411-3425 (2008).
- Greenberg, J. H., Seppa, S., Seppa, H., Hewitt, T. Role of collagen and fibronectin in neural crest cell adhesion and migration. Developmental Biology. 87 (2), 259-266 (1981).
- Leung, A. W., et al. WNT/β-catenin signaling mediates human neural crest induction via a pre-neural border intermediate. Development. 143 (3), 398-410 (2016).
- Zhu, Q., Lu, Q., Gao, R., Cao, T. Prospect of Human Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Crest Stem Cells in Clinical Application. Stem Cells International. 2016, 7695836 (2016).
