Summary
Hierin, een protocol om de Morris water doolhof tests uit te voeren om het vermogen van het leren en het geheugen van de ziekte van Alzheimer model muizen te evalueren en om het effect van handmatige acupunctuur voor de behandeling van hen te beoordelen wordt beschreven.
Abstract
Een Morris water Maze (MWM) experiment dwingt experimentele dieren om te zwemmen en te leren een platform te vinden dat verborgen is in het water. Het wordt veel gebruikt in wetenschappelijk onderzoek om het leren en geheugen van dieren te beoordelen. Door het uitgebreide gebruik van de MWM test zijn visuele experimentele protocollen essentieel voor onderzoekers. Dit manuscript maakt gebruik van de nieuwste studies om het Protocol van de MWM test te introduceren. De ziekte van Alzheimer (AD) wordt gekenmerkt door een progressief verlies van geheugen en cognitieve functie. Een alternatieve en complementaire behandeling die wordt gebruikt voor AD is manuele acupunctuur (MA). Om de leer-en geheugencapaciteit van advertentie model muizen te beoordelen, werd de MWM-test uitgevoerd. De proefversie van het zichtbare platform, de proefversie van Hidden platform, de test proef en de omkering van de proefversie van MWM werden gebruikt om ruimtelijk leren en geheugencapaciteit te evalueren. In de proefversie van het zichtbare platform was de zwem snelheid en de ontsnappings latentie van muizen in verschillende groepen niet significant verschillend. In het verborgen platform en omkering proeven, de advertentiegroep toonde een lange Escape latentie. De ontsnappings latentie daalde aanzienlijk na de behandeling met MA. Laag platform crossover-nummer en de verhouding van de tijd in het SW-Kwadrant in het testproces verhoogd na de behandeling met MA (p < 0,05 of p < 0,01). De resultaten van de MWM-tests suggereren dat MA effectief de ruimtelijke leer-en geheugencapaciteiten van advertentie model muizen kan verbeteren. Rigoureuze experimentele operaties waarborgen de betrouwbaarheid van de resultaten.
Introduction
Momenteel is de MWM experiment uitgegroeid tot de meest gebruikte en de standaard gedrags experiment om de ruimtelijke leren en het geheugen van de dieren te evalueren1. Het werd oorspronkelijk ontworpen door de Britse psycholoog Richard G. Morris en is voortdurend verbeterd. Vele voordelen zoals minimale training, cross-species nut, ongevoeligheid voor verschillen in lichaamsgewicht, en herhaalde testen vermogen van MWM maken het de beste methode voor het beoordelen van de cognitieve functie2. De ziekte van Alzheimer (AD) is een groot medisch probleem, voornamelijk gekenmerkt door een afname van de geheugen verwerking en cognitieve functie3. MWM is een onmisbaar experimenteel middel om de leer-en geheugencapaciteit van de dieren van het advertentie model en de effectiviteit van de interventiemethoden te evalueren. MWM experimenten zijn over het algemeen tijdrovend (6 – 11 dagen) en omvatten veel variabele factoren4. Hoewel er veel artikelen over water doolhof experimenten, in de praktijk, onderzoekers missen een samenhangend protocol. Daarom is een intuïtieve en rigoureuze protocol proces video bijzonder belangrijk. Als u een vorig experiment als voorbeeld5gebruikt, worden alle stappen van de mwm beschreven. Met behulp van mwm suggereerden eerdere studies dat acupunctuur de symptomen van advertentie model muizen5,6,7kon verlichten.
Hierin wordt het MWM-protocol dat wordt gebruikt in een recente studie5 beschreven om een eenvoudige en zichtbare methode te bieden voor onderzoekers om het ruimtelijke leren en geheugen van advertentie model dieren te beoordelen.
Protocol
Dit protocol is goedgekeurd door de ethische commissie dieren van Beijing University of Chinese Medicine, en het was in overeenstemming met alle richtlijnen voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren van China. Tijdens de experimentele procedure was er geen sprake van een accidentele sterfte en in dit onderzoek moesten geen dieren worden geëuriseerd.
1. voorbereiding
- Aankoop 30 mannelijke SAMP8 muizen en 10 mannelijke SAMR1 muizen (leeftijd: 8 maanden).
- Huis de muizen individueel in individuele ventilatie kooien bij een temperatuur van 24 ± 2 °C en een donker/licht cyclus van 12 uur.
- Voer de muizen met een standaard pellet dieet beschikbaar ad libitum en leveren steriel drinkwater.
- Acclimate alle muizen in de omgeving voor 5 dagen voor experimenten.
2. groepering van dieren
- Verdeel 30 SAMP8 muizen willekeurig in drie groepen (n = 10/groep): de AD groep, handmatige acupunctuur (MA) groep, en geneeskunde (M) groep.
- Gebruik 10 SAMR1 muizen als de normale besturing (N) groep6.
3. toediening van donepezil hydrochloride tabletten
- Plet een donepezil hydrochloride Tablet (5 mg/tablet) en los het op in 50 mL gedistilleerd water.
- Lever het geneesmiddel dat in stap 3,1 is bereid bij doses van 1 mg/kg aan de muizen met behulp van een orale maagsonde eenmaal daags8 gedurende het hele experiment, inclusief de dagen waarop de ma-behandeling en mwm-tests worden uitgevoerd.
4. toediening van manuele acupunctuur
- Immobiliseer de muizen van de MA-groep in muis zakken.
- Gebruik wegwerp steriele acupunctuur naalden (0,25 mm x 13 mm) en breng de platte Doorn methode van MA aan op Baihui (GV20) en Yintang (GV29)5 in de richting van de neus gedurende 20 minuten. Zorg ervoor dat de naald diepte 0,2 – 0,3 cm is.
- Verdraai bidirectioneel de manipulatie binnen 90 ° met een snelheid van ongeveer 180 r/min elke 5 min gedurende ~ 15 s elke keer tijdens het hele experiment, inclusief dagen waarop MA-behandeling en MWM-tests worden uitgevoerd.
5. MWM test
NB: bij 24 uur na de 15 opeenvolgende dagen van de behandeling, onderwerpen de muizen in de vier groepen aan de MWM test. Voer de proefversie van het zichtbare platform, de proefversie van Hidden platform, de test proef en de omkering in volgorde uit.
- Bereid je voor op de MWM test.
- Positioneer MWM-apparaat en het signaal acquisitie-en verwerkingssysteem in een experiment ruimte die is ontworpen om geluidsisolatie te behouden.
- Plaats een ronde witte tank (diameter = 90 cm, hoogte = 50 cm) omgeven door een ondoorzichtige doek in het midden van het MWM-apparaat.
- Bevestig een videocamera aan het plafond van het MWM-apparaat en verbind het met een video recorder met een geautomatiseerd tracking systeem om de gegevens te verzamelen.
- Verdeel de water doolhof tank gelijkmatig in vier gelijke gebieden met twee onderling loodrechte lijnen, met het label Noord (N), Zuid (S), Oost (E) en West (W). Verdeel het zwembad gebied conceptueel in vier kwadranten van dezelfde grootte (NE, NW, SW en SE).
- Plaats in de ogen van de muis visuele aanwijzingen van verschillende vormen op de wand van elk kwadrant als visuele verwijzingen (bijvoorbeeld vierkantjes, driehoeken en cirkels).
Opmerking: distale cues zijn de navigatie referentiepunten van het dier voor het lokaliseren van het platform. Verplaats ze daarom niet tijdens de test. De positie van de onderzoeker is een potentiële distale Cue en kan invloed hebben op de MWM. Daarom moet de onderzoeker buiten de ogen van de muizen blijven tijdens het wachten op het dier om de test uit te voeren. - Vul de ronde tank met water tot een diepte van 30 cm en onderhoud bij 22 ± 2 °C met een elektrische kachel.
- Het water ondoorzichtig maken met ongeveer 150 g melkpoeder.
- Voer de zichtbare platform proef uit.
- Plaats een kunststof circulair platform (diameter = 9,5 cm; hoogte = 28 cm) 1 cm boven het wateroppervlak in elk kwadrant willekeurig.
- Zet een zwarte vlag op het platform.
- Laat elke muis zachtjes in het water op waterniveau los van een van de vier start locaties tegenover de tankwand. Laat de muis niet in het watervallen.
- Activeer het computer Volgprogramma zodra de muis in het water wordt losgelaten.
- Geef elke muis 60 s om naar het platform te zoeken. Aan het einde van elke proef, plaats elke muis op het platform en laat het om te blijven op het voor 10 – 30 s.
- Observeer de zwem trajecten van de muizen op de computer, noteer de tijd die de muis nam om het platform als escape latency te vinden en analyseer de zwem snelheid.
- Droog elke muis met handdoeken en verwarm hem met een elektrische kachel. Zorg ervoor dat u een geschikte warmtebron gebruikt om te voorkomen dat het dier oververhit raakt.
Opmerking: plaats elke muis in het zwembad van elk van de vier verschillende start kwadranten voor vier proeven, waarbij het platform wordt verplaatst naar een andere locatie bij elke volgende proef. Het interval tussen twee proeven met elke muis is 15 – 20 min.
- Voer de proef-/plaatnavigatietest van Hidden platform uit.
- Plaats hetzelfde platform zonder vlag in het SE-Kwadrant.
- Plaats de muis willekeurig in het zwembad van elk van de vier kwadranten (NE, NW, SW, N) tegenover de pool muur voor vier proeven. Gebruik een tijdsinterval van 15 – 20 minuten tussen twee proeven.
- Geef elke muis 60 s om te zoeken naar het verborgen platform.
- Noteer de Escape latency van elke proefperiode nadat de muis naar het platform klimt voor verdere analyse.
- Droog elke muis met handdoeken en verwarm hem met een elektrische kachel.
Opmerking: Voer de proefversie van Hidden platform uit vanaf dagen 2 − 6. Als de muis het platform niet kan vinden in 60 s, leid je de muis om naar het platform te klimmen en laat het daar gedurende 10 – 30 s aan het einde van elke proef. Voer gedurende 5 opeenvolgende dagen vier proeven per dag uit voor elke muis, met het platform en de visuele aanwijzingen op constante posities.
- Voer de test proef uit.
Opmerking: Lokaliseer elke muis in de pool bij een nieuwe startpositie om de ruimtelijke exploratie mogelijkheid van de muis te observeren.- Verwijder het platform.
- Zoek elke muis naar de tankwand in het zwembad eenmaal voor 60 s. Zorg ervoor dat de startlocatie het NW-kwadrant is, het Kwadrant dat het verst verwijderd is van het SE-Kwadrant.
- Noteer de zwemafstand, de zwem snelheid en het platform crossover-nummer in het doolhof.
- Droog elke muis met handdoeken en geef warmte na de proef.
- De omkering van de proef uit te voeren.
Opmerking: Voer de omkering van de proef uit vanaf dagen 8 − 11.- Plaats het platform in het midden van het NW-Kwadrant (in plaats van het SE-Kwadrant).
- Volg stappen 5.3.2 − 5.3.5 zoals beschreven in de sectie proefversie van Hidden platform.
6. statistische analyse
- Gebruik statistiek software (bijv. SPSS 20,0) om de statistische analyse uit te voeren.
Representative Results
Het tijdas diagram van dit protocol wordt weergegeven in Figuur 1.
Figuur 1: tijdas diagram van het onderzoeksprotocol. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
De tijd-as laat zien dat dit experiment duurde voor een totaal van 21 dagen. De behandeling werd toegepast op de muis tijdens het hele experiment en de MWM tests begon na 15 dagen van de behandeling. Het zichtbare platform, verborgen platform, sonde en omkering proeven werden uitgevoerd in volgorde.
Eerder gepubliceerde resultaten van ding et al.5 worden gepresenteerd als typische resultaten van mwm Figuur 2.
Figuur 2: typische resultaten van de Morris water Maze test (n = 10). A) veranderingen in de vlucht latentie en de zwem snelheid van ratten tussen de verschillende groepen in de zichtbare platform proef. (B) veranderingen in de ontsnappings latentie van ratten tussen de verschillende groepen in het verborgen platform en omkerings proeven. De p-waarden zijn * p < 0,05 en * * p < 0,01 in vergelijking met de controlegroep. Het symbool # # geeft p < 0,01 aan in vergelijking met de advertentiegroep. (C) veranderingen in het platform crossover-nummer en het percentage van de tijd doorgebracht door de ratten in de Northwest Quadrant tussen de verschillende experimentele groepen in de sonde trial. De resultaten van het zichtbare platform, het verborgen platform en de omkering van de proef in elke groep worden weergegeven (n = 10, gemiddelde ± SD). Dit cijfer is gewijzigd van ding et al5. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Fig. 2a toont de resultaten van de zichtbare platform proef. Er werden geen statistische verschillen waargenomen in de Escape latency of zwem snelheid tussen de groepen op de eerste dag van MWM. Figuur 2b toont de resultaten van het verborgen platform en de omkering van de proef van dagen 2 − 6 en dagen 8 − 11. De Escape latentie van de advertentiegroep bleef op een hoog niveau op elke dag van de test. De Escape latency van de andere drie groepen daalde geleidelijk. De Escape latentie van dagen 3 − 6 en dagen 8 − 11 was langer in de advertentiegroep dan in de controlegroep (p < 0,01). De ontsnappings latenties van muizen in de MA-en geneesmiddelen groepen waren korter dan die van muizen in de advertentiegroep op dag 2 − 6 en dag 8 − 11, respectievelijk (p < 0,01). Afbeelding 2c toont de resultaten van de test proef. Het platform crossover-aantal muizen in de advertentiegroep was statistisch lager dan in de controlegroep (p < 0,01). Het crossover-nummer van het platform in de MA-groep was hoger dan in de advertentiegroep (p < 0,05). De hoeveelheid tijd die door muizen in de advertentiegroep in het SW-kwadrant is doorgebracht, was significant lager dan die in de controlegroep (p < 0,01). De hoeveelheid tijd die in het SW-Kwadrant in de MA-groep is doorgebracht, was hoger dan in de advertentiegroep (p < 0,01).
Discussion
Hoewel veel water doolhoven, waaronder het water doolhof van Biel en het Cincinnati water Maze, al minstens een eeuw zijn geweest, is alleen de MWM op grote schaal gebruikt om het ruimtelijk leren en het geheugen vermogen effectief en objectief te evalueren, omdat het veel voordelen9. Ondanks het uitgebreide gebruik van de MWM is de procedure niet altijd optimaal benut. MWM experimenten duren meestal lang en worden beïnvloed door vele variabele factoren. Er zijn enkele effectieve en betrouwbare aspecten die helpen bij het detecteren van veranderingen in ruimtelijke leren en geheugen vermogen waarmee rekening moet worden gehouden.
Er werden vier verschillende MWM-proeven uitgevoerd. De zichtbare platform proef werd gebruikt op dag 1 van MWM. Als de dieren direct naar het platform konden zwemmen, gaf het aan dat het zwem vermogen en de visie van de dieren normaal waren10. Otnass suggereerde dat het zichtbare platform eerst11moest worden uitgevoerd. De resultaten van de zichtbare platform trial in deze studie betekende dat de vier groepen begonnen op hetzelfde leer niveau. Vanaf daar kunnen de opeenvolgende experimenten worden gestart. Het proces van Hidden platform werd gebruikt om het vermogen van de muizen om leer-en geheugencapaciteit te verwerven te beoordelen. De test proef werd uitgevoerd op dag 7, 24 h na het einde van de proef van het verborgen platform, om het werkgeheugen te beoordelen. Ten slotte werd de omkering van het proces gebruikt om het werkgeheugen2te beoordelen. De veranderingen in de vier verschillende onderzoeken van MWM gaven aan dat de advertentie model muizen weinig leer-en geheugencapaciteit hadden en dat MA een positief effect had op AD5.
Er zijn geen specifieke normen voor de afmetingen van de pool en platform1. Een 214-cm diameter zwembad wordt gebruikt in de meeste MWM studies. Vorhees en Williams toonden aan dat ratten met identieke protocollen sneller leren in een zwembad van 122 cm dan in een zwembad van 210 cm; de steile helling van de leercurve geeft aan dat de 122-cm diameter zwembad zeer gemakkelijk is voor ratten om12te navigeren. In het huidige protocol werden, gezien de ouderdom en de zwakke statuur van de advertentie muizen, een 90-cm diameter zwembad en een platform van 9,5 cm diameter gebruikt. De resultaten van voorbereidende experimenten gaven aan dat muizen meer moeite hadden om het platform te vinden in een groter diameter zwembad. Daarom vertegenwoordigen tests in grotere Pools niet het werkelijke verschil tussen de groepen. De experimentele dieren hadden een moeilijker tijd om het platform te vinden in een groter zwembad met een kleiner platform4. Daarom moeten de grootte van het zwembad en het platform worden geoptimaliseerd in voorbereidende experimenten volgens de experimentele vereisten en de conditie van de proefdieren.
Water bij een temperatuur variërend van 20 – 24 °C wordt aanbevolen voor het uitvoeren van de MWM test4. Verouderde proefdieren slecht uitgevoerd in koud water13, wat duidt op een duidelijk leeftijd afhankelijk verlies van thermoregulatie14. In deze studie werd een thermostaat op de bodem van het zwembad geplaatst om de temperatuur van het water te behouden bij 20 – 24 °C. De studieresultaten toonden geen significant verschil in de zwem snelheden tussen de vier groepen5.
MWM is een krachtige techniek om cognitieve functie te beoordelen en wordt veel gebruikt in studies op dit moment. Er is echter geen gedefinieerde, standaard, consistente apparatuur om de mwm-test uit te voeren, inclusief de afmetingen van het zwembad en platform15,16. Verschillende laboratoria hebben verschillende specificaties voor MWM. Daarom, onderzoekers kiezen voor de juiste experimentele apparaat volgens hun individuele experimentele eisen, die verwarring onder onderzoekers kunnen veroorzaken. Voorbereidende experimenten zijn ook noodzakelijk. Meer studies moeten worden uitgevoerd op basis experimenten zoals MWM. Momenteel ligt de flexibiliteit van MWM als een experimenteel instrument alleen in de mogelijkheid om de basis protocollen te kiezen volgens de studie die is bedoeld. Daarom kan deze test worden toegepast om de cognitieve functie in grotere diepte te beoordelen.
Disclosures
De auteurs verklaren geen potentieel belangenconflict.
Acknowledgments
Huiling Tian en Ning ding zijn co-eerste auteurs. Zhigang Li en Jing Jiang zijn co-corresponderend auteurs. Dit onderzoek werd gesteund door subsidies van de National Natural Science Foundation van China (Grant NOS. 81804178, 81473774 en 81503654). Het protocol en de hierin beschreven resultaten zijn afkomstig van het artikel, "betrokkenheid van handmatige acupunctuur regelt gedrag en cerebrale doorbloeding in de SAMP8 Mouse model van de ziekte van Alzheimer" door Dr. ning ding et al.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acupuncture needles | Beijing Zhongyan Taihe Medical Instrument Limited Company | 511526 | |
| desktop computer | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | Lenovo T4700D | |
| Donepezil Hydrochloride Tablet | Eisai China | H20050978 | Aricept |
| mice | Zhi Shan (Beijing) Academy of Medical Science | SCXK2014-0003 | |
| Mirros water maze device | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | WMT-100S | |
| mouse bags | home-made | ||
| Signal acquisition and processing system | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | BL-420N |
References
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Value of water mazes for assessing spatial and egocentric learning and memory in rodent basic research and regulatory studies. Neurotoxicology Teratology. 45, 75-90 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocol. 1 (2), 848-858 (2006).
- The state of the art of dementia research: New frontiers; World Alzheimer Report 2018. Alzheimer's Disease International. 9, 1-46 (2018).
- Vorhees, C. V., et al. Effects of neonatal (+)-methamphetamine on path integration and spatial learning in rats: effects of dose and rearing conditions. International Journal of Developmental Neuroscience. 26 (6), 599-610 (2008).
- Ding, N., Jiang, J., Xu, A., Tang, Y., Li, Z. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 13, 37 (2019).
- Ding, N., et al. Manual acupuncture suppresses the expression of proinflammatory proteins associated with the NLRP3 inflammasome in the hippocampus of SAMP8 mice. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2017, 1-8 (2017).
- Cao, J., et al. Behavioral changes and hippocampus glucose metabolism in APP/PS1 transgenic mice via electro-acupuncture at governor vessel acupoints. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 5 (2017).
- Amy, E., et al. Effects of sub-chronic donepezil on brain Abeta and cognition in a mouse model of Alzheimer's disease. Psychopharmacology. 230, 279-289 (2013).
- Garthe, A., Kempermann, G. An old test for new neurons: refining the Morris water maze to study the functional relevance of adult hippocampal neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 7, 63 (2013).
- Schoenfeld, R., Schiffelholz, T., Beyer, C., Leplow, B., Foreman, N. Variants of the Morris water maze task to comparatively assess human and rodent place navigation. Neurobiology of Learning and Memory. 139, 117-127 (2017).
- Otnass, M. K., Brun, V. H., Moser, M., Moser, E. I. Pretraining prevents spatial learning impairment after saturation of hippocampal long-term potentiation. Journal of Neuroscience. 19 (24), 49 (1999).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. Ilar Journal. 55 (2), 310-332 (2014).
- Vorhees, C. V., Skelton, M. R., Williams, M. T. Age-dependent effects of neonatal methamphetamine exposure on spatial learning. Behavioural Pharmacology. 18 (5-6), 549-562 (2007).
- Iivonen, H., Nurminen, L., Harri, M., Tanila, H., Puoliväli, J. Hypothermia in mice tested in Morris water maze. Behaviour Brain Research. 141 (2), 207-213 (2003).
- Lin, S. Y., et al. Ozone inhibits APP/Aβ production and improves cognition in an APP/PS1 transgenic mouse model. Neuroscience. , (2019).
- Zuo, Y., et al. Preoperative vitamin-rich carbohydrate loading alleviates postoperative cognitive dysfunction in aged rats. Behavioural Brain Research. 373, 112107 (2019).
