Summary
Ici, un protocole pour mener les essais de labyrinthe d'eau de Morris pour évaluer la capacité d'apprendre et la mémoire des souris modèles de la maladie d'Alzheimer et pour évaluer l'effet de l'acupuncture manuelle pour les traiter est décrit.
Abstract
Une expérience du labyrinthe d'eau Morris (MWM) force les animaux expérimentaux à nager et à apprendre à trouver une plate-forme cachée dans l'eau. Il est largement utilisé dans la recherche scientifique pour évaluer l'apprentissage et la mémoire des animaux. En raison de l'utilisation intensive du test MWM, les protocoles expérimentaux visuels sont essentiels pour les chercheurs. Ce manuscrit utilise les dernières études pour introduire le protocole du test MWM. La maladie d'Alzheimer (MA) est caractérisée par une perte progressive de la mémoire et de la fonction cognitive. Un traitement alternatif et complémentaire utilisé pour la MA est l'acupuncture manuelle (MA). Pour évaluer la capacité d'apprentissage et de mémoire des souris modèles AD, le test MWM a été effectué. L'essai de plate-forme visible, l'essai de plate-forme cachée, l'essai de sonde, et l'essai d'inversion de MWM ont été employés pour évaluer l'apprentissage spatial et la capacité de mémoire. Dans l'essai de plate-forme visible, la vitesse de natation et la latence d'évasion des souris dans différents groupes n'était pas significativement différente. Dans la plate-forme cachée et les essais d'inversion, le groupe AD a montré une longue latence d'évasion. La latence d'évasion a diminué de manière significative après le traitement de MA. Le faible nombre de croisements de plate-forme et la proportion de temps dans le quadrant SW dans l'essai de la sonde ont augmenté après le traitement MA (p 'lt; 0.05 ou p 'lt; 0.01). Les résultats des tests MWM suggèrent que MA peut améliorer efficacement l'apprentissage spatial et les capacités de mémoire des souris modèle AD. Des opérations expérimentales rigoureuses ont assuré la fiabilité des résultats.
Introduction
Actuellement, l'expérience MWM est devenue l'expérience comportementale la plus largement utilisée et la norme pour évaluer l'apprentissage spatial et la mémoire des animaux1. Il a été initialement conçu par le psychologue britannique Richard G. Morris et a été constamment amélioré. De nombreux avantages tels que la formation minimale, l'utilité inter-espèces, l'insensibilité aux différences de poids corporel, et la capacité d'essai répétée de MWM en font la meilleure méthode pour évaluer la fonction cognitive2. La maladie d'Alzheimer (MA) est un problème médical majeur, principalement caractérisé par un déclin dans le traitement de la mémoire et la fonction cognitive3. MWM est un moyen expérimental indispensable pour évaluer la capacité d'apprentissage et de mémoire des animaux modèles AD et l'efficacité des méthodes d'intervention. Les expériences MWM prennent généralement du temps (6 à 11 jours) et impliquent de nombreux facteurs variables4. Bien qu'il existe de nombreux articles sur les expériences de labyrinthe d'eau, dans la pratique, les chercheurs n'ont pas un protocole cohérent. Par conséquent, une vidéo de processus de protocole intuitive et rigoureuse est particulièrement importante. En utilisant une expérience précédente comme exemple5, toutes les étapes du MWM sont décrites. En utilisant MWM, des études antérieures ont suggéré que l'acupuncture pourrait soulager les symptômes des souris modèle AD5,6,7.
Ici, le protocole MWM utilisé dans une étude récente5 est décrit pour fournir une méthode simple et visible pour les chercheurs d'évaluer l'apprentissage spatial et la mémoire des animaux modèle AD.
Protocol
Ce protocole a été approuvé par le Comité d'éthique animale de l'Université de médecine chinoise de Beijing, et il était conforme à toutes les lignes directrices pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire de la Chine. Il n'y avait aucune situation de mort accidentelle pendant la procédure expérimentale, et aucun animal n'a dû être euthanasié dans cette étude.
1. Préparation
- Achetez 30 souris Mâles SAMP8 et 10 souris Mâles SAMR1 (âge : 8 mois).
- Loger les souris individuellement dans des cages de ventilation individuelles à une température de 24 oC et un cycle sombre/léger de 12 h.
- Nourrir les souris avec un régime standard de granulés disponibles ad libitum et fournir de l'eau potable stérile.
- Acclimater toutes les souris à l'environnement pendant 5 jours avant l'expérimentation.
2. Regroupement d'animaux
- Diviser au hasard 30 souris SAMP8 en trois groupes (n - 10/groupe) : le groupe AD, le groupe d'acupuncture manuelle (MA) et le groupe de médecine (M).
- Utilisez 10 souris SAMR1 comme groupe de contrôle normal (N)6.
3. Administration des comprimés d'hydrochlorure de donepezil
- Écraser un comprimé d'hydrochlorure de donepezil (5 mg/comprimé) et le dissoudre dans 50 ml d'eau distillée.
- Fournir le médicament préparé à l'étape 3.1 à des doses de 1 mg/kg aux souris en utilisant un gavage oral une fois par jour8 pendant toute l'expérience, y compris les jours où le traitement MA et les tests MWM sont effectués.
4. Administration de l'acupuncture manuelle
- Immobiliser les souris du groupe MA dans des sacs de souris.
- Utilisez des aiguilles d'acupuncture stériles jetables (0,25 mm x 13 mm) et appliquez la méthode de l'épine plate de MA sur Baihui (GV20) et Yintang (GV29)5 vers le nez pendant 20 min. Assurez-vous que la profondeur de l'aiguille est de 0,2 à 0,3 cm.
- Bidirectionnellement tournoyer la manipulation dans un rayon de 90 degrés à une vitesse d'environ 180 r/min toutes les 5 minutes pour 15 s à chaque fois pendant toute l'expérience, y compris les jours où le traitement MA et les tests MWM sont effectués.
5. Test MWM
REMARQUE : À 24 h après les 15 jours consécutifs de traitement, soumettez les souris dans les quatre groupes au test de MWM. Effectuer l'essai de plate-forme visible, l'essai de plate-forme cachée, l'essai de sonde, et l'essai d'inversion dans l'ordre.
- Préparez-vous pour le test MWM.
- Positionner le dispositif MWM et le système d'acquisition et de traitement du signal dans une salle d'expérimentation conçue pour maintenir l'isolation sonore.
- Placez un réservoir blanc circulaire (diamètre de 90 cm, hauteur de 50 cm) entouré d'un chiffon opaque au milieu du dispositif MWM.
- Fixez une caméra vidéo au plafond de l'appareil MWM et connectez-la à un enregistreur vidéo avec un système de suivi automatisé pour recueillir les données.
- Divisez le réservoir du labyrinthe d'eau également en quatre régions égales en utilisant deux lignes perpendiculaires mutuelles, étiquetées nord (N), sud (S), est (E) et ouest (W). Divisez conceptuellement la zone de la piscine en quatre quadrants de la même taille (NE, NW, SW et SE).
- À la vue de la souris, placez des repères visuels de différentes formes sur le mur de chaque quadrant comme références visuelles (p. ex. carrés, triangles et cercles).
REMARQUE : Les repères distal sont les points de référence de navigation de l'animal pour localiser la plate-forme. Par conséquent, ne les déplacez pas pendant le test. La position du chercheur est un indice distal potentiel et peut influencer le MWM. Par conséquent, le chercheur doit rester hors de la vue des souris en attendant que l'animal effectue le test. - Remplissez le réservoir circulaire d'eau à une profondeur de 30 cm et maintenez-le à 22 o2 oC avec un chauffe-eau électrique.
- Rendre l'eau opaque avec environ 150 g de lait en poudre.
- Effectuer l'essai de plate-forme visible.
- Placer une plate-forme circulaire en plastique (diamètre de 9,5 cm; hauteur de 28 cm) à 1 cm au-dessus de la surface de l'eau dans n'importe quel quadrant au hasard.
- Mettez un drapeau noir sur la plate-forme.
- Relâchez doucement chaque souris dans l'eau au niveau de l'eau à partir de l'un des quatre emplacements de départ faisant face au mur du réservoir. Ne laissez pas tomber la souris dans l'eau.
- Activez le programme de suivi informatique dès que la souris est libérée dans l'eau.
- Donnez à chaque souris 60 s pour rechercher la plate-forme. À la fin de chaque essai, placez chaque souris sur la plate-forme et laissez-la rester dessus pendant 10 à 30 s.
- Observez les trajectoires de nage des souris sur l'ordinateur, enregistrez le temps que la souris a pris pour trouver la plate-forme comme latence d'évasion, et analysez la vitesse de nage.
- Séchez chaque souris avec des serviettes et réchauffez-la avec un chauffe-eau électrique. Assurez-vous d'utiliser une source de chaleur appropriée pour empêcher l'animal de surchauffer.
REMARQUE : Placez chaque souris dans la piscine à chacun des quatre quadrants de départ différents pour quatre essais, déplaçant la plate-forme à un endroit différent à chaque essai ultérieur. L'intervalle entre deux essais à l'aide de chaque souris est de 15 à 20 min.
- Effectuer le test de navigation de la plate-forme cachée d'essai/lieu.
- Placez la même plate-forme sans drapeau dans le quadrant SE.
- Placez la souris au hasard dans la piscine de chacun des quatre quadrants (NE, NW, SW, N) face au mur de la piscine pendant quatre essais. Utilisez un intervalle de temps de 15 à 20 min entre deux essais.
- Donnez à chaque souris 60 s pour rechercher la plate-forme cachée.
- Enregistrez la latence d'évasion de chaque essai après que la souris remonte à la plate-forme pour une analyse ultérieure.
- Séchez chaque souris avec des serviettes et réchauffez-la avec un chauffe-eau électrique.
REMARQUE : Effectuez l'essai de la plate-forme cachée à partir des jours 2 à 6. Si la souris ne peut pas trouver la plate-forme en 60 s, conduisez la souris à monter jusqu'à la plate-forme et lui permettre de rester là pendant 10 à 30 s à la fin de chaque essai. Effectuez quatre essais/jour pour chaque souris pendant 5 jours consécutifs, avec la plate-forme et les repères visuels à des positions constantes.
- Effectuez l'essai de sonde.
REMARQUE : Localisez chaque souris dans la piscine à une nouvelle position de départ pour observer la capacité d'exploration spatiale de la souris.- Retirez la plate-forme.
- Localiser chaque souris face au mur du réservoir dans la piscine une fois pour 60 s. Assurez-vous que l'emplacement de départ est le quadrant nord-ouest, qui est le quadrant le plus éloigné du quadrant SE.
- Enregistrez la distance de nage, la vitesse de nage et le numéro de croisement de la plate-forme dans le labyrinthe.
- Séchez chaque souris avec des serviettes et apportez de la chaleur après l'essai.
- Effectuez l'essai d'inversion.
REMARQUE : Effectuez l'essai d'inversion des jours 8-11.- Placez la plate-forme au milieu du quadrant NORD-ouest (au lieu du quadrant SE).
- Suivez les étapes 5.3.2 5.3.5 comme détaillé dans la section d'essai de plate-forme cachée.
6. Analyse statistique
- Utilisez un logiciel de statistiques (p. ex., SPSS 20.0) pour effectuer l'analyse statistique.
Representative Results
Le diagramme de l'axe temporel de ce protocole est indiqué à la figure 1.
Figure 1 : Diagramme de l'axe temporel du protocole d'étude. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
L'axe temporel montre que cette expérience a duré au total 21 jours. Le traitement a été appliqué à la souris pendant toute l'expérience et les tests MWM ont commencé après 15 jours de traitement. La plate-forme visible, la plate-forme cachée, la sonde et les essais d'inversion ont été menés dans l'ordre.
Les résultats publiés antérieurement de Ding et coll.5 sont présentés comme des résultats typiques de la figure 2de MWM .
Figure 2 : Résultats typiques de l'essai de labyrinthe d'eau de Morris (n ' 10). (A) Changements dans la latence d'évasion et la vitesse de nage des rats parmi les différents groupes dans l'essai de plate-forme visible. (B) Changements dans la latence d'évasion des rats parmi les différents groupes dans la plate-forme cachée et les essais d'inversion. Les valeurs p sont de 0,05 et 0,01 par rapport au groupe témoin. Le symbole indique p 'lt; 0.01 par rapport au groupe AD. (C) Changements dans le nombre de croisements de plate-forme et le pourcentage du temps passé par les rats dans le quadrant nord-ouest parmi les différents groupes expérimentaux dans l'essai de sonde. Les résultats de la plate-forme visible, de la plate-forme cachée et de l'essai d'inversion dans chaque groupe sont affichés (n ' 10, moyenne et SD). Ce chiffre a été modifié à partir de Ding et al5. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
La figure 2A montre les résultats de l'essai de plate-forme visible. Aucune différence statistique n'a été observée dans la latence d'évacuation ou la vitesse de nage parmi les groupes le premier jour de MWM. La figure 2B montre les résultats de la plate-forme cachée et de l'essai d'inversion des jours 2-6 et des jours 8-11. La latence d'évasion du groupe AD est restée à un niveau élevé chaque jour de l'essai. La latence d'évasion des trois autres groupes a diminué graduellement. La latence d'évasion des jours 3 à 6 et jours 8-11 était plus longue dans le groupe AD que dans le groupe témoin (p 'lt; 0.01). Les latences d'évasion des souris dans les groupes de MA et de drogue étaient plus courtes que celle des souris dans le groupe d'AD les jours 2-6 et les jours 8-11, respectivement (p lt ; 0.01). La figure 2C montre les résultats de l'essai de la sonde. Le nombre de souris de croisement de plate-forme dans le groupe d'AD était statistiquement inférieur à celui dans le groupe témoin (p lt ; 0.01). Le nombre de multi-bandes de la plate-forme dans le groupe MA était plus élevé que celui du groupe AD (p 'lt; 0.05). La proportion de temps passé dans le quadrant DeW par des souris dans le groupe d'AD était sensiblement inférieure à celle dans le groupe témoin (p lt ; 0.01). La proportion de temps passé dans le quadrant SW dans le groupe MA était plus élevée que dans le groupe AD (p 'lt; 0.01).
Discussion
Bien que de nombreux labyrinthes d'eau, y compris le labyrinthe d'eau de Bienne et le labyrinthe d'eau de Cincinnati, ont été autour depuis au moins un siècle, seulement le MWM a été largement utilisé pour évaluer efficacement et objectivement l'apprentissage spatial et la capacité de mémoire parce qu'il a de nombreux avantages9. Malgré l'utilisation intensive du MWM, la procédure n'a pas toujours été utilisée de manière optimale. Les expériences MWM prennent généralement beaucoup de temps et sont influencées par de nombreux facteurs variables. Il existe des aspects efficaces et fiables qui aident à détecter les changements dans l'apprentissage spatial et la capacité de mémoire qui devraient être pris en considération.
Quatre essais différents de MWM ont été exécutés. L'essai de plate-forme visible a été utilisé le jour 1 de MWM. Si les animaux pouvaient nager directement à la plate-forme, il a indiqué que la capacité de natation et la vision des animaux étaient normales10. Otnass a suggéré que l'essai de plate-forme visible devrait être effectué d'abord11. Les résultats de l'essai de plate-forme visible dans cette étude ont signifié que les quatre groupes ont commencé au même niveau d'apprentissage. À partir de là, les expériences successives pourraient être lancées. L'essai de plate-forme cachée a été utilisé pour évaluer la capacité des souris à acquérir la capacité d'apprentissage et de mémoire. L'essai de sonde a été mené le jour 7, 24 h après la fin de l'essai de plate-forme cachée, pour évaluer la mémoire de travail. Enfin, l'essai d'inversion a été utilisé pour évaluer la mémoire de travail2. Les changements dans les quatre essais différents de MWM ensemble ont indiqué que les souris de modèle d'AD ont eu la capacité d'apprentissage et de mémoire basse et que MA a eu un effet positif sur AD5.
Il n'y a pas de normes spécifiques pour les dimensions de la piscine et de la plate-forme1. Une piscine de 214 cm de diamètre est utilisée dans la plupart des études DE MWM. Vorhees et Williams ont démontré qu'avec des protocoles identiques, les rats apprennent plus vite dans une piscine de 122 cm que dans une piscine de 210 cm; la pente raide de la courbe d'apprentissage indique que la piscine de 122 cm de diamètre est extrêmement facile pour les rats de naviguer12. Dans le protocole actuel, compte tenu de la vieillesse et de la faible stature des souris AD, une piscine de 90 cm de diamètre et une plate-forme de 9,5 cm de diamètre ont été utilisées. Les résultats des expériences préliminaires ont indiqué que les souris avaient plus de difficulté à trouver la plate-forme dans une piscine de plus grand diamètre. Par conséquent, les tests dans les grands pools ne représentent pas la vraie différence entre les groupes. Les animaux expérimentaux ont eu plus de mal à trouver la plate-forme dans une plus grande piscine avec une plus petite plate-forme4. Par conséquent, la taille de la piscine et de la plate-forme doit être optimisée dans les expériences préliminaires en fonction des exigences expérimentales et de l'état des animaux expérimentaux.
L'eau à une température allant de 20 à 24 oC est recommandée pour effectuer le test MWM4. Animaux expérimentaux âgés ont obtenu de mauvais résultats dans l'eau froide13, ce qui indique une perte claire de thermorégulation dépendante de l'âge14. Dans cette étude, un thermostat a été placé au fond de la piscine pour maintenir la température de l'eau à 20 à 24 oC. Les résultats de l'étude n'ont montré aucune différence significative dans les vitesses de nage parmi les quatre groupes5.
MWM est une technique puissante pour évaluer la fonction cognitive et est largement utilisé dans les études actuellement. Cependant, il n'y a pas d'équipement défini, standard et cohérent pour effectuer le test MWM, y compris les tailles de la piscine et de la plate-forme15,16. Différents laboratoires ont des spécifications différentes pour MWM. Par conséquent, les chercheurs choisissent le dispositif expérimental approprié en fonction de leurs besoins expérimentaux individuels, ce qui peut causer de la confusion parmi les chercheurs. Des expériences préliminaires sont également nécessaires. D'autres études doivent être menées sur des expériences de base comme MWM. À l'heure actuelle, la flexibilité du MWM en tant qu'outil expérimental réside uniquement dans la capacité de choisir les protocoles de base selon l'étude ciblée. Par conséquent, ce test peut être appliqué pour évaluer la fonction cognitive plus en profondeur.
Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d'intérêts potentiel.
Acknowledgments
Huiling Tian et Ning Ding sont les co-premiers auteurs. Zhigang Li et Jing Jiang sont co-auteurs correspondants. Cette recherche a été soutenue par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 81804178, 81473774, et 81503654). Le protocole et les résultats décrits ci-contre proviennent de l'article « Involvement of Manual Acupuncture Regulates Behavior and Cerebral Blood Flow in the SAMP8 Mouse Model of Alzheimer's Disease » par le Dr Ning Ding et coll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acupuncture needles | Beijing Zhongyan Taihe Medical Instrument Limited Company | 511526 | |
| desktop computer | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | Lenovo T4700D | |
| Donepezil Hydrochloride Tablet | Eisai China | H20050978 | Aricept |
| mice | Zhi Shan (Beijing) Academy of Medical Science | SCXK2014-0003 | |
| Mirros water maze device | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | WMT-100S | |
| mouse bags | home-made | ||
| Signal acquisition and processing system | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | BL-420N |
References
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Value of water mazes for assessing spatial and egocentric learning and memory in rodent basic research and regulatory studies. Neurotoxicology Teratology. 45, 75-90 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocol. 1 (2), 848-858 (2006).
- The state of the art of dementia research: New frontiers; World Alzheimer Report 2018. Alzheimer's Disease International. 9, 1-46 (2018).
- Vorhees, C. V., et al. Effects of neonatal (+)-methamphetamine on path integration and spatial learning in rats: effects of dose and rearing conditions. International Journal of Developmental Neuroscience. 26 (6), 599-610 (2008).
- Ding, N., Jiang, J., Xu, A., Tang, Y., Li, Z. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 13, 37 (2019).
- Ding, N., et al. Manual acupuncture suppresses the expression of proinflammatory proteins associated with the NLRP3 inflammasome in the hippocampus of SAMP8 mice. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2017, 1-8 (2017).
- Cao, J., et al. Behavioral changes and hippocampus glucose metabolism in APP/PS1 transgenic mice via electro-acupuncture at governor vessel acupoints. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 5 (2017).
- Amy, E., et al. Effects of sub-chronic donepezil on brain Abeta and cognition in a mouse model of Alzheimer's disease. Psychopharmacology. 230, 279-289 (2013).
- Garthe, A., Kempermann, G. An old test for new neurons: refining the Morris water maze to study the functional relevance of adult hippocampal neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 7, 63 (2013).
- Schoenfeld, R., Schiffelholz, T., Beyer, C., Leplow, B., Foreman, N. Variants of the Morris water maze task to comparatively assess human and rodent place navigation. Neurobiology of Learning and Memory. 139, 117-127 (2017).
- Otnass, M. K., Brun, V. H., Moser, M., Moser, E. I. Pretraining prevents spatial learning impairment after saturation of hippocampal long-term potentiation. Journal of Neuroscience. 19 (24), 49 (1999).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. Ilar Journal. 55 (2), 310-332 (2014).
- Vorhees, C. V., Skelton, M. R., Williams, M. T. Age-dependent effects of neonatal methamphetamine exposure on spatial learning. Behavioural Pharmacology. 18 (5-6), 549-562 (2007).
- Iivonen, H., Nurminen, L., Harri, M., Tanila, H., Puoliväli, J. Hypothermia in mice tested in Morris water maze. Behaviour Brain Research. 141 (2), 207-213 (2003).
- Lin, S. Y., et al. Ozone inhibits APP/Aβ production and improves cognition in an APP/PS1 transgenic mouse model. Neuroscience. , (2019).
- Zuo, Y., et al. Preoperative vitamin-rich carbohydrate loading alleviates postoperative cognitive dysfunction in aged rats. Behavioural Brain Research. 373, 112107 (2019).
