Summary
본 명세서에서, 알츠하이머병 모델 마우스의 학습 및 기억 능력을 평가하고 이를 치료하기 위한 수동 침술의 효과를 평가하기 위한 모리스 수질 미로 시험을 수행하는 프로토콜이 기재되어 있다.
Abstract
모리스 물 미로 (MWM) 실험은 실험 동물이 수영하고 물에 숨겨진 플랫폼을 찾는 법을 배워야강제로. 그것은 널리 학습과 동물의 메모리를 평가하기 위해 과학 연구에서 사용된다. MWM 테스트의 광범위한 사용으로 인해, 시각적 실험 프로토콜은 연구자에 필수적이다. 이 원고는 MWM 테스트의 프로토콜을 소개하기 위해 최신 연구를 사용합니다. 알츠하이머 병 (AD)은 기억력과 인지 기능의 점진적 인 손실을 특징으로합니다. AD에 사용되는 대안및 보완 치료는 수동 침술 (MA)입니다. AD 모델 마우스의 학습 및 기억 능력을 평가하기 위해 MWM 테스트를 실시하였다. MWM의 가시적 플랫폼 시험, 숨겨진 플랫폼 시험, 프로브 시험 및 반전 시험을 사용하여 공간 학습 및 메모리 능력을 평가했습니다. 가시적인 플랫폼 시험에서, 다른 그룹에서 마우스의 수영 속도 및 탈출 대기 시간은 크게 다르지 않았다. 숨겨진 플랫폼과 반전 시험에서 AD 그룹은 긴 탈출 대기 시간을 보였습니다. 이스케이프 레이턴시MA 처리 후 현저히 감소하였다. 낮은 플랫폼 크로스오버 수 및 프로브 시험에서 SW 사분면에서의 시간 비율은 MA 처리 후 증가하였다(p&0.05 또는 p< 0.01). MWM 테스트의 결과는 MA가 AD 모델 마우스의 공간 학습 및 기억 능력을 효과적으로 향상시킬 수 있음을 시사합니다. 엄격한 실험 작업을 통해 결과의 신뢰성을 보장했습니다.
Introduction
현재, MWM 실험은 동물의 공간 학습 및 기억을 평가하기 위해 가장 널리 사용되고 표준 행동 실험이되고있다1. 그것은 처음에 영국 심리학자 리처드 G. 모리스에 의해 설계 되었으며 지속적으로 개선 되었습니다. 최소한의 훈련, 종 간 유틸리티, 체중 차이에 대한 무감각, MWM의 반복 테스트 능력과 같은 많은 장점은 인지 기능을 평가하는 가장 좋은 방법입니다2. 알츠하이머 병 (AD)은 주로 메모리 처리 및 인지 기능의 감소를 특징으로하는 주요 의료 문제입니다3. MWM은 AD 모델 동물의 학습 및 기억 능력과 내정간섭 방법의 효과를 평가하는 데 필수적인 실험 수단이다. MWM 실험은 일반적으로 시간이 많이 소요되며(6-11일) 많은 가변 인자를수반합니다 4. 물 미로 실험에 대 한 많은 기사가 있지만, 실제로, 연구원은 일관 된 프로토콜 부족. 따라서 직관적이고 엄격한 프로토콜 프로세스 비디오가 특히 중요합니다. 이전 실험을 예로5로사용하여 MWM의 모든 단계를 설명합니다. MWM을 사용하여, 이전 연구는 침술이 AD 모형 마우스5,6,7의현상을 구호할 수 있었다는 것을 건의했습니다 .
본 명세서에서, 최근 연구에서 사용된 MWM 프로토콜5는 연구자들이 AD 모델 동물의 공간 학습 및 기억을 평가하기 위한 간단하고 가시적인 방법을 제공하기 위해 기술된다.
Protocol
이 프로토콜은 중국 의학 대학의 동물 윤리위원회에 의해 승인되었으며, 중국의 실험실 동물의 관리 및 사용에 대한 모든 지침에 따라. 실험 절차 도중 우발적인 죽음 상황이 없었고, 이 연구에서 안락사될 필요가 없는 동물도 없었습니다.
1. 준비
- 구매 30 남성 SAMP8 마우스와 10 남성 SAMR1 마우스 (나이: 8 개월).
- 24°C의 온도와 12시간 의 어두운/빛 주기에서 개별 환기 케이지에 마우스를 개별적으로 보관하십시오.
- 표준 펠릿 다이어트 사용 가능한 광고 리비툼으로 마우스를 공급하고 멸균 식수를 제공합니다.
- 모든 마우스를 실험 전 5일 동안 환경에 적응시다.
2. 동물의 그룹화
- 무작위로 30 SAMP8 마우스를 세 그룹 (n = 10 / 그룹)으로 나눕니다 : AD 그룹, 수동 침술 (MA) 그룹 및 의학 (M) 그룹.
- 10개의 SAMR1 마우스를 정상 대조군(N) 군6으로사용한다.
3. 도네페질 염산염 정제의 관리
- 도네페질 염산염 정제(5 mg/정제)를 분쇄하고 증류수 50 mL에 녹입니다.
- MA 치료 및 MWM 검사가 수행되는 날을 포함하여 전체 실험 동안 하루에 한 번경구 을 사용하여 마우스에 1 mg / kg의 용량으로 3.1 단계로 준비 된 약을 전달하십시오.
4. 수동 침술의 관리
- 마우스 백에 MA 군의 마우스를 고정시.
- 일회용 멸균 침술 바늘 (0.25 mm x 13mm)을 사용하고 20 분 동안 코쪽으로 바이후이 (GV20)와 인탕 (GV29)5에 MA의 평평한 가시 방법을 적용하십시오.
- MA 치료 및 MWM 검사가 수행되는 날을 포함하여 전체 실험 동안 매번 ~ 15s마다 약 180 r /min의 속도로 90 ° 이내의 조작을 양방향으로 돌이킵니다.
5. MWM 테스트
참고: 15일 연속 치료 후 24시간에서, 4개의 그룹에서 마우스를 MWM 시험으로 대상화하였다. 가시적인 플랫폼 평가판, 숨겨진 플랫폼 평가판, 프로브 재판 및 반전 시험을 순서대로 수행합니다.
- MWM 테스트를 준비합니다.
- MWM 장치와 신호 수집 및 처리 시스템을 방음 유지하도록 설계된 실험실에 배치합니다.
- MWM 장치 중간에 불투명 한 천으로 둘러싸인 원형 흰색 탱크 (직경 = 90cm, 높이 = 50cm)를 넣습니다.
- 비디오 카메라를 MWM 장치의 천장에 고정하고 자동화된 추적 시스템을 사용하여 비디오 레코더에 연결하여 데이터를 수집합니다.
- 물 미로 탱크를 두 개의 상호 수직 선을 사용하여 동일한 4개의 동일한 영역으로 나누어 북쪽(N), 남쪽(S), 동쪽(E) 및 서쪽(W)으로 표시합니다. 풀 영역을 개념적으로 동일한 크기의 네 개의 사분면(NE, NW, SW 및 SE)으로 나눕니다.
- 마우스 의 시야 내에서 각 사분면의 벽에 서로 다른 모양의 시각적 단서를 시각적 참조(예: 사각형, 삼각형 및 원)로 배치합니다.
참고: 말단 신호는 플랫폼을 찾기 위한 동물의 탐색 참조 지점입니다. 따라서 테스트 중에 이동하지 마십시오. 연구원의 위치는 잠재적인 말단 단서이며 MWM에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 연구원은 동물이 시험을 능력을 발휘하기 위하여 기다리는 동안 마우스의 시야에서 머물러야 합니다. - 원형 탱크를 30cm 깊이로 물로 채우고 전기 히터로 22 ± 2 °C에서 유지하십시오.
- 약 150g의 분유로 물을 불투명하게 만듭니다.
- 표시되는 플랫폼 평가판을 수행합니다.
- 플라스틱 원형 플랫폼(직경 = 9.5cm, 높이 = 28cm)을 임의의 사분면에 수면 위에 1cm 위에 놓습니다.
- 플랫폼에 검은 깃발을 놓습니다.
- 탱크 벽을 마주보고있는 네 개의 시작 위치 중 하나에서 수위에서 물에 각 마우스를 부드럽게 해제합니다. 마우스를 물에 떨어뜨리지 마십시오.
- 마우스가 물에 방출되는 즉시 컴퓨터 추적 프로그램을 활성화합니다.
- 플랫폼을 검색하기 위해 각 마우스 60s를 제공합니다. 각 평가판이 끝나면 각 마우스를 플랫폼에 놓고 10-30초에 마우스를 계속 사용할 수 있습니다.
- 컴퓨터에서 마우스의 수영 궤적을 관찰하고 마우스가 플랫폼을 탈출 대기 시간으로 찾는 데 걸린 시간을 기록하고 수영 속도를 분석합니다.
- 수건으로 각 마우스를 건조하고 전기 히터로 따뜻하게. 동물이 과열되지 않도록 적절한 열원을 사용하십시오.
참고: 각 마우스를 4개의 다른 시작 사분면 각각에 풀에 놓고, 이후의 각 시험과 함께 플랫폼을 다른 위치로 이동합니다. 각 마우스를 사용하는 두 시험 사이의 간격은 15-20 분입니다.
- 숨겨진 플랫폼 평가판/장소 탐색 테스트를 수행합니다.
- SE 사분면에 플래그없이 동일한 플랫폼을 배치합니다.
- 네 개의 사분면(NE, NW, SW, N)에서 4개의 시험을 위해 풀 벽을 마주보고 있는 각 사분면에서 마우스를 무작위로 풀에 놓습니다. 두 번의 시험 사이에 15-20분의 시간 간격을 사용하십시오.
- 숨겨진 플랫폼을 검색하기 위해 각 마우스 60s를 제공합니다.
- 후속 분석을 위해 마우스가 플랫폼으로 올라간 후 각 시험의 이스케이프 대기 시간을 기록합니다.
- 수건으로 각 마우스를 건조하고 전기 히터로 따뜻하게.
참고: 2일부터 6일까지 숨겨진 플랫폼 평가판을 실시합니다. 마우스가 60s에서 플랫폼을 찾을 수없는 경우, 플랫폼까지 올라 가서 각 시험의 끝에 10-30s에 머물 수 있도록 마우스를 리드. 플랫폼과 일정한 위치에서 시각적 단서를 통해 5일 동안 각 마우스에 대해 하루에 4회 시험을 수행합니다.
- 프로브 시험을 수행합니다.
참고: 새로운 시작 위치에서 풀에 있는 각 마우스를 찾아 마우스의 공간 탐색 능력을 관찰합니다.- 플랫폼을 제거합니다.
- 60s에 대해 한 번 풀에서 탱크 벽을 향한 각 마우스를 찾습니다.
- 미로에서 수영 거리, 수영 속도 및 플랫폼 크로스 오버 번호를 기록합니다.
- 각 마우스를 수건으로 말리고 시험 후 따뜻함을 제공합니다.
- 반전 시험을 수행합니다.
참고: 8-11일부터 반전 시험을 수행합니다.- SE 사분면 대신 NW 사분면 중간에 플랫폼을 배치합니다.
- 숨겨진 플랫폼 평가판 섹션에 자세히 설명된 대로 5.3.2 -5.3.5 단계를 따르십시오.
6. 통계분석
- 통계 분석을 수행하려면 통계 소프트웨어(예: SPSS 20.0)를 사용합니다.
Representative Results
이 프로토콜의 시간 축 다이어그램은 그림 1에나와 있습니다.
그림 1: 스터디 프로토콜의 시간 축 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
시간 축은 이 실험이 총 21일 동안 지속되었다는 것을 보여줍니다. 치료는 전체 실험 동안 마우스에 적용되었고 MWM 시험은 15일 의 치료 후에 시작되었다. 가시플랫폼, 숨겨진 플랫폼, 프로브, 반전 시험이 순서대로 진행되었습니다.
Ding 등5에서 이전에 게시 된 결과는 MWM 도 2의전형적인 결과로 제시됩니다.
도 2: 모리스 물 미로 시험의 전형적인 결과(n=10). (A)가시 플랫폼 시험에서 다른 그룹 들 사이에서 쥐의 탈출 대기 시간 및 수영 속도의 변화. (B)숨겨진 플랫폼과 반전 시험에서 다른 그룹 중 쥐의 탈출 대기 시간의 변화. p-값은 대조군과 비교하여 *p< 0.05 및 **p< 0.01입니다. 기호 ##는 AD 그룹과 비교하여 p< 0.01을 나타냅니다. (C)플랫폼 크로스오버 수의 변화와 프로브 시험에서 상이한 실험군 들 사이에서 북서부 사분면에서 쥐가 보낸 시간의 백분율이다. 각 그룹에서 가시플랫폼, 숨겨진 플랫폼 및 반전 시험의 결과가 도시된다(n=10, 평균 ±SD). 이 그림은 딩 외5에서수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2A는 가시플랫폼 평가판의 결과를 나타낸다. MWM 의 첫날에 그룹 간의 탈출 대기 시간 또는 수영 속도에서 통계적 차이는 관찰되지 않았다. 도 2B는 2-6 일 및 8-11 일로부터 숨겨진 플랫폼 및 반전 시험의 결과를 나타낸다. AD 그룹의 이스케이프 레이턴시(escape late)는 시험 의 날마다 높은 수준에 머물렀다. 다른 세 그룹의 탈출 대기 시간은 점차 감소하였다. 3일-6일 및 8-11일로부터의 탈출 대기 시간은 대조군(p< 0.01)보다 AD 군에서 더 길어졌다. MA 및 약물 군에서 마우스의 탈출 대기는 각각 2-6일 및 8-11일에 AD 군에서 마우스의 그보다 짧하였다(p< 0.01). 도 2C는 프로브 시험의 결과를 나타낸다. AD 군에서 의 플랫폼 크로스오버 마우스 수는 대조군(p< 0.01)보다 통계적으로 낮았다. MA 그룹의 플랫폼 크로스오버 수는 AD 그룹(p< 0.05)보다 높았다. AD 군에서 마우스에 의한 SW 사분면에서 소요된 시간의 비율은 대조군(p< 0.01)보다 현저히 낮았다. MA 그룹의 SW 사분면에서 소요된 시간의 비율은 AD 그룹(p< 0.01)보다 높았습니다.
Discussion
비엘 워터 미로와 신시내티 물 미로를 포함한 많은 물 미로가 적어도 한 세기 동안 주변에 있었지만 MWM만이 공간 학습 및 기억 능력을 효과적이고 객관적으로 평가하는 데 널리 사용되어 왔습니다. 장점9. MWM을 광범위하게 사용했음에도 불구하고 절차가 항상 최적으로 사용되는 것은 아닙니다. MWM 실험은 일반적으로 시간이 오래 걸리며 많은 변수 요인의 영향을 받습니다. 고려해야 할 공간 학습 및 메모리 능력의 변화를 감지하는 데 도움이 몇 가지 효과적이고 신뢰할 수있는 측면이 있습니다.
4개의 다른 MWM 시험이 수행되었다. 눈에 보이는 플랫폼 시험은 MWM의 첫 날에 사용되었습니다. 동물이 플랫폼에 직접 수영 할 수 있다면, 그것은 동물의 수영 능력과 비전이 정상 이었다는 것을 나타냈다10. Otnass는 가시적 인 플랫폼 시험을 먼저11을 실시해야한다고 제안했습니다. 이 연구에서 가시적인 플랫폼 시험의 결과는 4개의 그룹이 동일한 학습 수준에서 시작되었다는 것을 의미했습니다. 거기에서, 연속적인 실험을 시작할 수 있었습니다. 숨겨진 플랫폼 시험은 학습 및 기억 능력을 획득하는 마우스의 능력을 평가하는 데 사용되었다. 프로브 재판은 숨겨진 플랫폼 재판이 끝난 후 7 일, 24 시간 동안 수행되어 작업 기억을 평가했습니다. 마지막으로, 반전 재판은 작업 메모리를 평가하는 데 사용되었다2. MWM의 4개의 다른 예심에 있는 변경은 AD 모형 마우스가 낮은 학습 및 기억 능력을 가지고 있고 MA가 AD5에긍정적인 효력이 있었다는 것을 표시했습니다.
풀 및 플랫폼1의크기에 대한 특정 표준은 없습니다. 대부분의 MWM 연구에서는 214cm 직경의 수영장이 사용됩니다. Vorhees와 윌리엄스는 동일한 프로토콜을 사용하면 쥐가 210cm 풀보다 122cm 풀에서 더 빨리 배울 수 있음을 보여주었습니다. 학습 곡선의 가파른 경사면은 122cm 직경의 수영장이 쥐가12를탐색하기가 매우 쉽다는 것을 나타냅니다. 현재 프로토콜에서는 AD 마우스의 노년및 약한 키를 고려하여, 직경 90cm 풀 및 9.5cm 직경 플랫폼을 사용하였다. 예비 실험의 결과는 마우스가 더 큰 직경 풀에 있는 플랫폼을 찾는 더 어려움이 있었다는 것을 표시했습니다. 따라서 큰 풀의 테스트는 그룹 간의 실제 차이를 나타내지 않습니다. 실험 동물은 더 작은 플랫폼4와더 큰 수영장에서 플랫폼을 찾는 데 어려움을 겪었습니다. 따라서, 풀과 플랫폼의 크기는 실험 동물의 실험 요건 및 상태에 따라 예비 실험에서 최적화되어야 한다.
MWM 테스트4를수행하기 위해 20-24 °C범위의 온도에서 물을 권장합니다. 노인 실험동물은냉수(13)에서저조한 수행을 보였으며, 이는 체온조절(14)의 명확한 연령 의존적 손실을 나타낸다. 본 연구에서, 온도 조절기는 20-24°C에서 물의 온도를 유지하기 위해 풀의 바닥에 배치되었다. 연구 결과는 4개의 단 중 수영 속도에 있는 유의한 다름을 보여주지않았습니다 5.
MWM은 인지 기능을 평가하는 강력한 기술이며 현재 연구에 널리 사용됩니다. 그러나, 풀 및플랫폼(15,16)의크기를 포함하는 MWM 테스트를 수행하기 위한 정의된, 표준, 일관된 장비는 없다. 실험실마다 MWM에 대한 사양이 다릅니다. 따라서, 연구원은 그들의 개별적인 실험 적인 요구 사항에 따라 적절 한 실험 장치를 선택, 연구자 들 사이 혼란을 일으킬 수 있는. 예비 실험도 필요합니다. MWM 같은 기본 실험에 더 많은 연구를 실시 해야. 현재, 실험 적 도구로서의 MWM의 유연성은 목적된 연구에 따라 기본 프로토콜을 선택하는 능력에있다. 따라서, 이 시험은 더 깊이 있는 인지 기능을 평가하기 위하여 적용될 수 있습니다.
Disclosures
저자는 잠재적 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
후일링 티안과 닝 딩은 공동 첫 번째 저자입니다. 지강 리와 징장은 공동 저자입니다. 이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (그랜트 번호 81804178, 81473774, 및 81503654)에서 보조금에 의해 지원되었다. 본 명세서에 기술된 프로토콜 및 결과는 "수동 침술의 참여는 알츠하이머 병의 SAMP8 마우스 모델에서 행동과 대뇌 혈류를 조절한다"는 기사에서 유래했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acupuncture needles | Beijing Zhongyan Taihe Medical Instrument Limited Company | 511526 | |
| desktop computer | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | Lenovo T4700D | |
| Donepezil Hydrochloride Tablet | Eisai China | H20050978 | Aricept |
| mice | Zhi Shan (Beijing) Academy of Medical Science | SCXK2014-0003 | |
| Mirros water maze device | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | WMT-100S | |
| mouse bags | home-made | ||
| Signal acquisition and processing system | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | BL-420N |
References
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