Summary
Aqui, um protocolo para realizar os testes de labirinto de água Morris para avaliar a capacidade de aprendizagem e memória de ratos modelo da doença de Alzheimer e para avaliar o efeito da acupuntura manual para tratá-los é descrito.
Abstract
Um experimento de labirinto de água morris (MWM) força animais experimentais a nadar e aprender a encontrar uma plataforma escondida na água. É amplamente utilizado na investigação científica para avaliar a aprendizagem e memória dos animais. Devido ao uso extensivo do teste MWM, os protocolos experimentais visuais são essenciais para os pesquisadores. Este manuscrito usa os estudos mais recentes para introduzir o protocolo do teste MWM. A doença de Alzheimer (DA) é caracterizada por uma perda progressiva de memória e função cognitiva. Um tratamento alternativo e complementar usado para AD é a cupuntura manual (MA). Para avaliar a capacidade de aprendizagem e memória dos camundongos modelo da DA, o teste MWM foi realizado. O ensaio de plataforma visível, o ensaio de plataforma oculta, o ensaio de sonda e o ensaio de reversão do MWM foram utilizados para avaliar a capacidade de aprendizagem espacial e memória. No ensaio de plataforma visível, a velocidade de natação e a latência de fuga de camundongos em diferentes grupos não foram significativamente diferentes. Na plataforma oculta e testes de reversão, o grupo AD mostrou uma longa latência de fuga. A latência de fuga diminuiu significativamente após o tratamento do MA. O baixo número de crossover da plataforma e a proporção de tempo no quadrante SW no ensaio de sonda aumentaram após o tratamento de MA (p < 0,05 ou p < 0,01). Os resultados dos testes mwm sugerem que ma pode efetivamente melhorar a aprendizagem espacial e habilidades de memória de ratos modelo de dad. Operações experimentais rigorosas forneceram garantia da confiabilidade dos resultados.
Introduction
Atualmente, o experimento MWM tornou-se o mais utilizado e o experimento comportamental padrão para avaliar a aprendizagem espacial e a memória dos animais1. Foi inicialmente projetado pelo psicólogo britânico Richard G. Morris e tem sido constantemente melhorado. Muitas vantagens, como treinamento mínimo, utilidade entre espécies, insensibilidade às diferenças no peso corporal e capacidade de teste repetido de MWM tornam o melhor método para avaliar a função cognitiva2. A doença de Alzheimer (DA) é um grande problema médico, caracterizado principalmente por um declínio no processamento da memória e função cognitiva3. O MWM é um meio experimental indispensável para avaliar a capacidade de aprendizagem e memória dos animais modelo da DA e a eficácia dos métodos de intervenção. Os experimentos de MWM são geralmente demorados (6-11 dias) e envolvem muitos fatores variáveis4. Embora existam muitos artigos sobre experimentos de labirinto de água, na prática, os pesquisadores não têm um protocolo coerente. Portanto, um vídeo de processo de protocolo intuitivo e rigoroso é particularmente importante. Usando um experimento anterior como exemplo5,todas as etapas do MWM são descritas. Usando MWM, estudos anteriores sugeriram que a acupuntura poderia aliviar os sintomas de camundongos modelo AD5,6,7.
Aqui, o protocolo MWM usado em um estudo recente5 é descrito para fornecer um método simples e visível para os pesquisadores avaliarem a aprendizagem espacial e a memória dos animais modelo sa.
Protocol
Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética Animal da Universidade de Medicina Chinesa de Pequim, e estava de acordo com todas as diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório da China. Não houve situação acidental de morte durante o procedimento experimental, e nenhum animal precisou ser sacrificado neste estudo.
1. Preparação
- Compre 30 camundongos Machos SAMP8 e 10 camundongos Machos SAMR1 (idade: 8 meses).
- Adoer os ratos individualmente em gaiolas individuais da ventilação em uma temperatura de 24 ±2 °C e de um ciclo escuro/claro de 12 h.
- Alimente os ratos com uma dieta padrão da pelota disponível o libitum do anúncio e forneça a água bebendo estéril.
- Aclimate todos os ratos ao ambiente por 5 dias antes da experimentação.
2. Agrupamento de animais
- Divida aleatoriamente 30 camundongos SAMP8 em três grupos (n = 10/group): o grupo ad, grupo manual de acupuntura (MA) e grupo de medicina (M).
- Use 10 camundongos SAMR1 como o controle normal (N) grupo6.
3. Administração de comprimidos de cloridrato donepezil
- Esmagar um comprimido de cloridrato donepezil (5 mg / tablet) e dissolvê-lo em 50 mL de água destilada.
- Entregue o medicamento preparado na etapa 3.1 em doses de 1 mg/kg para os camundongos usando um gavage oral uma vez por dia8 durante todo o experimento, incluindo os dias em que o tratamento de MA e os testes de MWM são realizados.
4. Administração de acupuntura manual
- Imobilize os ratos do grupo ma em sacos de rato.
- Use agulhas de acupuntura estéril descartáveis (0,25 mm x 13 mm) e aplique o método de espinho plano de MA em Baihui (GV20) e Yintang (GV29)5 em direção ao nariz por 20 min. Certifique-se de que a profundidade da agulha é de 0,2-0,3 cm.
- Bidirecionalmente girar a manipulação dentro de 90 ° a uma velocidade de cerca de 180 r / min cada 5 min para ~ 15 s cada vez durante todo o experimento, incluindo dias em que o tratamento ma e testes MWM são realizados.
5. Teste MWM
NOTA: Às 24 h após os 15 dias consecutivos de tratamento, submeter os ratos nos quatro grupos para o teste MWM. Conduza o teste visível da plataforma, a experimentação escondida da plataforma, a experimentação da ponta de prova, e a experimentação da reversão em ordem.
- Prepare-se para o teste MWM.
- Posicione o dispositivo MWM e o sistema de aquisição e processamento de sinal em uma sala de experimentos projetada para manter o isolamento de som.
- Coloque um tanque branco circular (diâmetro = 90 cm, altura = 50 cm) cercado por um pano opaco no meio do dispositivo MWM.
- Corrija uma câmera de vídeo no teto do dispositivo MWM e conecte-a a um gravador de vídeo com um sistema de rastreamento automatizado para coletar os dados.
- Divida o tanque do labirinto da água ingualmente em quatro regiões iguais usando duas linhas mutuamente perpendiculares, etiquetadas norte (N), sul (S), leste (E), e oeste (W). Divida a área da piscina conceitualmente em quatro quadrantes do mesmo tamanho (NE, NW, SW e SE).
- Dentro da visão do mouse, coloque pistas visuais de diferentes formas na parede de cada quadrante como referências visuais (por exemplo, quadrados, triângulos e círculos).
NOTA: Pistas distais são os pontos de referência de navegação do animal para localizar a plataforma. Portanto, não movê-los durante o teste. A posição do pesquisador é uma sugestão distal potencial e pode influenciar o MWM. Portanto, o pesquisador deve ficar fora da visão dos ratos enquanto espera o animal para realizar o teste. - Encha o tanque circular com água a uma profundidade de 30 cm e mantenha a 22 ± 2 °C com um aquecedor elétrico.
- Torne a água opaca com cerca de 150 g de leite em pó.
- Realize o teste de plataforma visível.
- Coloque uma plataforma circular de plástico (diâmetro = 9,5 cm; altura = 28 cm) 1 cm acima da superfície da água em qualquer quadrante ao acaso.
- Coloque uma bandeira preta na plataforma.
- Libere cada rato delicadamente na água no nível da água de uma das quatro posições do começo que enfrentam a parede do tanque. Não deixe cair o rato na água.
- Ative o programa de rastreamento de computador assim que o mouse for liberado na água.
- Dê a cada mouse 60 s para procurar a plataforma. No final de cada ensaio, coloque cada mouse na plataforma e permita que ele permaneça nele por 10-30 s.
- Observe as trajetórias de natação dos camundongos no computador, registre o tempo que o mouse levou para encontrar a plataforma como latência de fuga e analise a velocidade de natação.
- Seque cada rato com toalhas e aqueça-o com um aquecedor elétrico. Certifique-se de usar uma fonte de calor adequada para evitar que o animal superaqueça.
NOTA: Coloque cada mouse na piscina em cada um dos quatro quadrantes diferentes de partida para quatro ensaios, movendo a plataforma para um local diferente com cada ensaio subseqüente. O intervalo entre dois ensaios usando cada mouse é de 15 a 20 minutos.
- Realize o teste de navegação de plataforma oculta.
- Coloque a mesma plataforma sem uma bandeira no quadrante SE.
- Coloque aleatoriamente o mouse na piscina de cada um dos quatro quadrantes (NE, NW, SW, N) de frente para a parede da piscina para quatro ensaios. Use um intervalo de tempo de 15-20 min entre dois ensaios.
- Dê a cada mouse 60 s para procurar a plataforma escondida.
- Registre a latência de fuga de cada julgamento depois que o mouse sobe até a plataforma para análise subseqüente.
- Seque cada rato com toalhas e aqueça-o com um aquecedor elétrico.
NOTA: Conduza o teste de plataforma oculta dos dias 2 a 6. Se o mouse não consegue encontrar a plataforma em 60 s, levar o mouse a subir até a plataforma e permitir que ele fique lá por 10-30 s no final de cada julgamento. Realize quatro ensaios/dia para cada mouse por 5 dias consecutivos, com a plataforma e as pistas visuais em posições constantes.
- Realize o teste da sonda.
NOTA: Localizar cada mouse na piscina em uma nova posição de início para observar a capacidade de exploração espacial do mouse.- Retire a plataforma.
- Localizar cada mouse de frente para a parede do tanque na piscina uma vez por 60 s. Certifique-se de que o local de partida é o quadrante NW, que é o quadrante mais distante do quadrante SE.
- Registre a distância de natação, a velocidade de natação e o número de crossover da plataforma no labirinto.
- Seque cada rato com toalhas e forneça o calor após a experimentação.
- Realize o julgamento de reversão.
NOTA: Realize o teste de reversão dos dias 8 a 11.- Posicione a plataforma no meio do quadrante NW (em vez do quadrante SE).
- Siga os passos 5.3.2 −5.3.5 conforme detalhado na seção de avaliação de plataforma oculta.
6. Análise Estatística
- Use o software de estatística (por exemplo, SPSS 20.0) para realizar a análise estatística.
Representative Results
O diagrama do eixo temporal deste protocolo é mostrado na Figura 1.
Figura 1: Diagrama do eixo temporal do protocolo do estudo. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
O eixo do tempo mostra que este experimento durou um total de 21 dias. O tratamento foi aplicado ao camundongo durante todo o experimento e os testes de MWM começaram após 15 dias de tratamento. A plataforma visível, plataforma oculta, sonda e testes de reversão foram realizados em ordem.
Os resultados publicados anteriormente de Ding et al.5 são apresentados como resultados típicos da Mwm Figura 2.
Figura 2: Resultados típicos do teste do labirinto de água de Morris (n = 10). (A)Mudanças na latência de fuga e velocidade de natação de ratos entre os diferentes grupos no ensaio plataforma visível. (B) Mudanças na latência de fuga de ratos entre os diferentes grupos na plataforma oculta e ensaios de reversão. Os p-valores são *p < 0,05 e **p < 0,01 em comparação com o grupo controle. O símbolo ## indica p < 0,01 em comparação com o grupo ad. (C) Mudanças no número de cruzamento da plataforma e a porcentagem do tempo gasto pelos ratos no quadrante noroeste entre os diferentes grupos experimentais no ensaio de sonda. Os resultados da plataforma visível, plataforma oculta e ensaio de reversão em cada grupo são mostrados (n = 10, média ± SD). Este número foi modificado a partir de Ding et al5. Clique aqui para ver uma versão maior deste número.
A Figura 2A mostra os resultados do teste de plataforma visível. Não foram observadas diferenças estatísticas na latência de fuga ou na velocidade de natação entre os grupos no primeiro dia de MWM. A Figura 2B mostra os resultados da plataforma oculta e o teste de reversão dos dias 2-6 e dos dias 8 a 11. A latência de fuga do grupo da DA permaneceu em um nível elevado em cada dia do teste. A latência de fuga dos outros três grupos diminuiu gradualmente. A latência de fuga dos dias 3-6 e dos dias 8 a 11 foi maior no grupo de AD do que no grupo controle (p < 0,01). As latentes de fuga de camundongos no MA e grupos de drogas foram menores do que as de camundongos do grupo de DA nos dias 2-6 e dias 8-11, respectivamente (p < 0,01). A figura 2C mostra os resultados do teste da sonda. O número de crossover de plataforma de camundongos no grupo AD foi estatisticamente menor do que no grupo controle (p < 0,01). O número de crossover da plataforma no grupo MA foi maior do que no grupo AD (p < 0,05). A proporção de tempo gasto no quadrante SW por camundongos do grupo ad foi significativamente menor do que a do grupo controle (p < 0,01). A proporção de tempo gasto no quadrante SW no grupo MA foi maior do que na do grupo ad (p < 0,01).
Discussion
Embora muitos labirintos de água, incluindo o labirinto de água biel e o labirinto de água de Cincinnati, existam há pelo menos um século, apenas o MWM tem sido amplamente utilizado para avaliar de forma eficaz e objetiva a capacidade de aprendizagem espacial e memória porque tem muitos vantagens9. Apesar do uso extensivo do MWM, o procedimento nem sempre foi usado de forma otimizada. Os experimentos de MWM geralmente levam muito tempo e são influenciados por muitos fatores variáveis. Existem alguns aspectos eficazes e confiáveis que ajudam a detectar mudanças na capacidade de aprendizagem espacial e memória que devem ser levadas em consideração.
Foram realizados quatro ensaios diferentes de MWM. O ensaio de plataforma visível foi utilizado no dia 1 do MWM. Se os animais pudessem nadar diretamente até a plataforma, indicava que a capacidade de natação e a visão dos animais eram normais10. Otnass sugeriu que o teste de plataforma visível deve ser realizado primeiro11. Os resultados do ensaio de plataforma visível neste estudo significaram que os quatro grupos começaram no mesmo nível de aprendizagem. A partir daí, as sucessivas experiências poderiam ser iniciadas. O ensaio de plataforma oculta foi usado para avaliar a capacidade dos ratos para adquirir capacidade de aprendizagem e memória. O ensaio da sonda foi realizado no dia 7, 24 h após o fim do ensaio de plataforma oculta, para avaliar a memória de trabalho. Finalmente, o ensaio de reversão foi usado para avaliar a memória de trabalho2. As mudanças nos quatro ensaios diferentes de MWM juntos indicaram que os camundongos modelo AD tinha baixa capacidade de aprendizagem e memória e que MA teve um efeito positivo emAD 5.
Não existem normas específicas para as dimensões do pool e da plataforma1. Uma associação de 214 cm de diâmetro é usada na maioria dos estudos de MWM. Vorhees e Williams demonstraram que, com protocolos idênticos, os ratos aprendem mais rápido em um pool de 122 cm do que em um pool de 210 cm; a encosta íngreme da curva de aprendizado indica que a piscina de 122 cm de diâmetro é extremamente fácil para os ratos navegarem12. No protocolo atual, considerando a velhice e a baixa estatura dos camundongos da DA, uma piscina de 90 cm de diâmetro e uma plataforma de 9,5 cm de diâmetro foram utilizadas. Os resultados de experiências preliminares indicaram que os ratos tiveram mais dificuldade encontrar a plataforma em uma associação mais grande do diâmetro. Portanto, os testes em piscinas maiores não representam a diferença real entre os grupos. Os animais experimentais tiveram mais dificuldade em encontrar a plataforma em uma piscina maior com uma plataforma menor4. Portanto, o tamanho da piscina e da plataforma devem ser otimizados em experimentos preliminares de acordo com os requisitos experimentais e a condição dos animais experimentais.
A água à temperatura que varia de 20 a 24 °C é recomendada para a realização do testeMWM 4. Animais experimentais envelhecidos tiveram um desempenho ruim em água fria13,indicando uma clara perda de termoregulação14por idade dependente. Neste estudo, um termostato foi colocado na parte inferior da piscina para manter a temperatura da água em 20-24 °C. Os resultados do estudo não mostraram diferença significativa nas velocidades de natação entre os quatro grupos5.
Mwm é uma técnica poderosa para avaliar a função cognitiva e é amplamente utilizado em estudos atualmente. No entanto, não há equipamentos definidos, padrão e consistentes para realizar o teste MWM, incluindo os tamanhos da piscina e da plataforma15,16. Diferentes laboratórios têm especificações diferentes para MWM. Portanto, os pesquisadores escolhem o dispositivo experimental apropriado de acordo com seus requisitos experimentais individuais, o que pode causar confusão entre os pesquisadores. Experimentos preliminares também são necessários. Mais estudos precisam ser realizados em experimentos básicos como o MWM. Atualmente, a flexibilidade do MWM como ferramenta experimental reside apenas na capacidade de escolher os protocolos básicos de acordo com o estudo proposital. Portanto, este teste pode ser aplicado para avaliar a função cognitiva em maior profundidade.
Disclosures
Os autores declaram nenhum potencial conflito de interesses.
Acknowledgments
Huiling Tian e Ning Ding são co-primeiros autores. Zhigang Li e Jing Jiang são autores co-correspondentes. Esta pesquisa foi apoiada por doações da National Natural Science Foundation of China (Grant Nos. 81804178, 81473774 e 81503654). O protocolo e os resultados descritos aqui se origina do artigo, "Envolvimento da Acupuntura Manual regula o comportamento e o fluxo sanguíneo cerebral no modelo de camundongo samp8 da doença de Alzheimer", pelo Dr. Ning Ding et al.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acupuncture needles | Beijing Zhongyan Taihe Medical Instrument Limited Company | 511526 | |
| desktop computer | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | Lenovo T4700D | |
| Donepezil Hydrochloride Tablet | Eisai China | H20050978 | Aricept |
| mice | Zhi Shan (Beijing) Academy of Medical Science | SCXK2014-0003 | |
| Mirros water maze device | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | WMT-100S | |
| mouse bags | home-made | ||
| Signal acquisition and processing system | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | BL-420N |
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