Summary
Burada, Alzheimer hastalığı model farelerin öğrenme ve hafıza yeteneğini değerlendirmek ve bunları tedavi etmek için manuel akupunktur etkisini değerlendirmek için Morris su labirent testleri yapmak için bir protokol açıklanmıştır.
Abstract
Morris su labirenti (MWM) deneyi deneysel hayvanları yüzmeye ve suda gizlenmiş bir platform bulmayı öğrenmeye zorlar. Hayvanların öğrenme ve hafızasını değerlendirmek için bilimsel araştırmalarda yaygın olarak kullanılmaktadır. MWM testinin yaygın kullanımı nedeniyle, görsel deneysel protokoller araştırmacılar için gereklidir. Bu el yazması MWM testinin protokolünü tanıtmak için en son çalışmaları kullanır. Alzheimer Hastalığı (AD) bellek ve bilişsel fonksiyon ilerleyici bir kaybı ile karakterizedir. AD için kullanılan alternatif ve tamamlayıcı bir tedavi Manuel Akupunktur (MA) olduğunu. AD model farelerin öğrenme ve hafıza yeteneğini değerlendirmek için MWM testi yapılmıştır. Görünür platform denemesi, gizli platform denemesi, sonda denemesi ve MWM'nin ters deneme si mekansal öğrenme ve hafıza yeteneğini değerlendirmek için kullanıldı. Görünür platform denemesinde, farklı gruplardaki farelerin yüzme hızı ve kaçış gecikmesi önemli ölçüde farklı değildi. Gizli platform ve ters denemelerde, AD grubu uzun bir kaçış gecikmesi gösterdi. Ma tedavisinden sonra kaçış gecikmesi önemli ölçüde azalmıştır. Düşük platform crossover sayısı ve sonda denemesinde SW çeyreğinde zaman oranı MA tedavisinden sonra artmıştır (p < 0.05 veya p < 0.01). MWM testlerinin sonuçları, MA'nın AD modeli farelerin mekansal öğrenme ve hafıza yeteneklerini etkili bir şekilde geliştirebileceğini göstermektedir. Titiz deneysel operasyonlar, sonuçların güvenilirliğinin güvencesini sağladı.
Introduction
Şu anda, MWM deneyen en yaygın olarak kullanılan vestandartdavranışsal deney hayvanların mekansal öğrenme ve bellek değerlendirmek için 1 haline gelmiştir. Başlangıçta İngiliz psikolog Richard G. Morris tarafından tasarlanmış ve sürekli geliştirilmiştir. Minimal eğitim gibi birçok avantajı, türler arası yarar, vücut ağırlığı farklılıklarına duyarsızlık, ve MWM tekrarlanan test yeteneği bilişsel fonksiyon değerlendirmek için en iyi yöntem yapmak2. Alzheimer hastalığı (AD) önemli bir tıbbi sorundur, öncelikle bellek işleme ve bilişsel fonksiyon bir düşüş ile karakterize3. MWM, AD modeli hayvanların öğrenme ve hafıza yeteneğini ve müdahale yöntemlerinin etkinliğini değerlendirmek için vazgeçilmez bir deneysel araçtır. MWM deneyleri genellikle zaman alıcıdır (6-11 gün) ve birçok değişken faktör içerir4. Su labirenti deneyleri hakkında birçok makale olmasına rağmen, pratikte, araştırmacılar tutarlı bir protokol eksikliği. Bu nedenle, sezgisel ve titiz bir protokol süreci video özellikle önemlidir. Bir öncekidenemeörnekolarak 5 kullanılarak, MWM'nin tüm adımları açıklanmıştır. MWM kullanarak, önceki çalışmalarda akupunktur AD modelifarelerinbelirtileri rahatlatmak olabileceğini ileri sürdü5 ,6,7.
Burada, yeni bir çalışmada kullanılan MWM protokolü5 araştırmacılar için mekansal öğrenme ve AD modeli hayvanların bellek değerlendirmek için basit ve görünür bir yöntem sağlamak için açıklanmıştır.
Protocol
Bu protokol Pekin Çin Tıbbı Üniversitesi Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylandı ve Çin Laboratuvar Hayvanları bakımı ve kullanımı için tüm kurallara uygun oldu. Deneysel işlem sırasında kazara ölüm durumu yoktu ve bu çalışmada ötenaziye gerek yoktu.
1. Hazırlık
- 30 erkek SAMP8 fare ve 10 erkek SAMR1 faresatın alın (yaş: 8 ay).
- Fareleri 24 ±2 °C sıcaklıkta ve 12 saat karanlık/ışık döngüsünde ayrı ayrı havalandırma kafeslerinde barındırın.
- Fareleri standart pelet diyeti ile besleyin ve mevcut reklam libitum ve steril içme suyu sağlayın.
- Tüm fareleri denemeden önce 5 gün boyunca çevreye alıştırın.
2. Hayvanların gruplanması
- 30 SAMP8 fareyi rastgele üç gruba (n = 10/grup): AD grubu, manuel akupunktur (MA) grubu ve tıp (M) grubu olarak bölün.
- Normal kontrol (N) grubu6olarak 10 SAMR1 fare kullanın.
3. Donepezil hidroklorür tabletlerinin yönetimi
- Donepezil hidroklorür tableti (5 mg/tablet) ezin ve 50 mL distile suda çözün.
- Adım 3.1'de hazırlanan ilacı, MA tedavisi ve MWM testlerinin yapıldığı günler de dahil olmak üzere, tüm deneyboyunca 8 yaşında oral gavaj kullanarak farelere 1 mg/kg dozlarda teslim edin.
4. Manuel akupunkturun uygulanması
- Fare torbaları içinde MA grubunun fareler immobilize.
- Tek kullanımlık steril akupunktur iğneleri (0,25 mm x 13 mm) kullanın ve Baihui (GV20) ve Yintang (GV29)5'te 20 dakika boyunca buruna doğru MA'nın düz diken yöntemini uygulayın.
- Ma tedavisi ve MWM testlerinin yapıldığı günler de dahil olmak üzere, tüm deney boyunca ~15 s için her 5 dakikada bir yaklaşık 180 r/dk hızda manipülasyonu 90° içinde çift yönlü olarak döndürün.
5. MWM testi
NOT: 15 günlük tedaviden sonra saat 24'te dört gruptaki farelerM Testine tabi tutulur. Görünür platform denemesini, gizli platform denemesini, sonda denemesini ve ters denemeyi sırayla gerçekleştirin.
- MWM testine hazırlanın.
- MWM cihazını ve sinyal alım ve işleme sistemini ses yalıtımını korumak için tasarlanmış bir deney odasına yerleştirin.
- MWM cihazının ortasına opak bir bezle çevrili dairesel beyaz bir tank (çap = 90 cm, yükseklik = 50 cm) koyun.
- MWM aygıtının tavanına bir video kamera sabitve verileri toplamak için otomatik izleme sistemi ile bir video kaydedici bağlayın.
- Su labirent tankını, kuzey (N), güney (S), doğu (E) ve batı (W) olarak etiketlenmiş iki karşılıklı dik çizgi kullanarak eşit olarak dört eşit bölgeye bölün. Havuz alanını kavramsal olarak aynı boyuttadört çeyreğe (NE, NW, SW ve SE) bölün.
- Farenin görüş alanı içinde, her çeyreğin duvarına farklı şekillerin görsel ipuçlarını görsel referanslar (örn. kareler, üçgenler ve daireler) yerleştirin.
NOT: Distal ipuçları, hayvanın platformu bulmak için seyir referans noktalarıdır. Bu nedenle, test sırasında bunları hareket ettirin. Araştırmacının konumu potansiyel bir distal ipucudur ve MWM'yi etkileyebilir. Bu nedenle, araştırmacı hayvan testi gerçekleştirmek için beklerken farelerin görüş dışında durmalıdır. - Dairesel tankı 30 cm derinliğe kadar suyla doldurun ve 22 ± 2 °C'de elektrikli ısıtıcı ile koruyun.
- Süt tozu yaklaşık 150 g ile su opak hale getirin.
- Görünür platform denemesini gerçekleştirin.
- Plastik dairesel bir platform (çap = 9,5 cm; yükseklik = 28 cm) su yüzeyinin 1 cm yukarısını herhangi bir kadranda rastgele yerleştirin.
- Platforma siyah bir bayrak as.
- Her fareyi tank duvarına bakan dört başlangıç noktasından birinden su seviyesinde yavaşça suya bırakın. Fareyi suya düşürmeyin.
- Fare suya salınır bırakılmaz bilgisayar izleme programını etkinleştirin.
- Platform aramak için her fare 60 s verin. Her denemenin sonunda, her fareyi platforma yerleştirin ve 10-30 s boyunca üzerinde kalmasına izin verin.
- Bilgisayardaki farelerin yüzme yörüngelerini gözlemleyin, farenin platformu kaçış gecikmesi olarak bulmak için aldığı zamanı kaydedin ve yüzme hızını analiz edin.
- Havlu ile kuru her fare ve elektrikli ısıtıcı ile ısıtın. Aşırı ısınmasını önlemek için uygun bir ısı kaynağı kullandığınızdan emin olun.
NOT: Her fareyi dört deneme için dört farklı başlangıç çeyreğindehavuza yerleştirin ve platformu sonraki denemelerde farklı bir konuma taşıyın. Her fareyi kullanarak iki deneme arasındaki aralık 15-20 dk'dır.
- Gizli platform deneme/yer gezinti testini gerçekleştirin.
- SE çeyreğine bayrak sız aynı platformu yerleştirin.
- Fareyi dört bölümden (NE, NW, SW, N) dört deneme için havuz duvarına bakan dört çeyreğin her birinden havuza rastgele yerleştirin. İki deneme arasında 15-20 dk arasında bir zaman aralığı kullanın.
- Gizli platformu aramak için her fare 60 s verin.
- Fare sonraki analiziçin platforma tırmandıktan sonra her denemenin kaçış gecikmesini kaydedin.
- Havlu ile kuru her fare ve elektrikli ısıtıcı ile ısıtın.
NOT: Gizli platform denemesini 2−6. Fare platformu 60'lı yıllarda bulamazsa, farenin platforma tırmanmasına yol verin ve her denemenin sonunda 10-30 s'de orada kalmasına izin verin. Platform ve görsel ipuçları sabit konumlarda 5 gün boyunca her fare için dört deneme/gün gerçekleştirin.
- Sonda denemesini gerçekleştirin.
NOT: Farenin mekansal keşif yeteneğini gözlemlemek için havuzdaki her fareyi yeni bir başlangıç pozisyonunda bulun.- Platformu kaldırın.
- 60 s. Başlangıç yerinin SE çeyreğine en uzak olan NW çeyreği olduğundan emin olun.
- Labirentte yüzme mesafesi, yüzme hızı ve platform geçit numarasını kaydedin.
- Her fareyi havluyla kurulayın ve denemeden sonra sıcaklık sağlayın.
- Ters denemeyi gerçekleştirin.
NOT: Ters denemeyi 8−11 günlerinden itibaren gerçekleştirin.- Platformu NW çeyreğinin ortasına yerleştirin (SE çeyreği yerine).
- Gizli platform deneme bölümünde ayrıntılı olarak 5.3.2 −5.3.5 adımlarını izleyin.
6. İstatistiksel Analiz
- İstatistiksel analizyapmak için istatistik yazılımını (örn. SPSS 20.0) kullanın.
Representative Results
Bu protokolün zaman ekseni diyagramı Şekil 1'degösterilmiştir.
Şekil 1: Çalışma protokolünün zaman ekseni diyagramı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Zaman ekseni, bu denemenin toplam 21 gün sürdüğünü gösterir. Tedavi tüm deney boyunca fareye uygulandı ve MWM testleri 15 günlük tedaviden sonra başladı. Görünür platform, gizli platform, sonda ve ters denemeler sırayla yapılmıştır.
Ding ve ark.5'ten daha önce yayınlanmış sonuçlar MWM Şekil 2'nintipik sonuçları olarak sunulmuştur.
Şekil 2: Morris su labirent testinin tipik sonuçları (n = 10). (A) Görünür platform denemesinde farklı gruplar arasında farelerin kaçış gecikmesi ve yüzme hızında ki değişiklikler. (B) Gizli platformda farklı gruplar arasında farelerin kaçış gecikmesi ve ters denemelerdeğişiklikler. P-değerleri kontrol grubuna göre *p < 0.05 ve **p < 0.01'dir. ## sembolü, AD grubuyla karşılaştırıldığında p < 0.01'i gösterir. (C) Platform geçit numarasındaki değişiklikler ve kuzeybatı çeyreğinde farelertarafından harcanan zaman yüzdesi, sonda denemesindeki farklı deneysel gruplar arasında dır. Her grupta görünür platformun, gizli platformun ve ters denemenin sonuçları gösterilir (n = 10, ortalama ± SD). Bu rakam Ding ve ark5'tendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2A, görünür platform denemesinin sonuçlarını gösterir. MWM'nin ilk gününde gruplar arasında kaçış gecikmesi veya yüzme hızında istatistiksel fark gözlenmedi. Şekil 2B, gizli platformun sonuçlarını ve 2−6 ve gün 8−11 günlerinden geri alma deneme sonuçlarını gösterir. AD grubunun kaçış gecikmesi testin her gününde yüksek bir seviyede kaldı. Diğer üç grubun kaçış gecikmesi giderek azaldı. 3−6 ve 8−11 günlerinden kaçış gecikmesi AD grubunda kontrol grubuna göre daha uzundu (p < 0.01). MA ve ilaç gruplarındaki farelerin kaçış süreleri sırasıyla 2−6 ve 8−11 günlerinde AD grubundaki farelerden daha kısaydı (p < 0.01). Şekil 2C sonda denemesinin sonuçlarını gösterir. AD grubundaki farelerin platform geçit sayısı kontrol grubundakinden istatistiksel olarak daha düşüktü (p < 0.01). MA grubundaki platform geçit sayısı AD grubundakinden (p < 0.05) daha yüksekti. AD grubundaki fareler tarafından SW çeyreğinde harcanan sürenin oranı kontrol grubundakinden anlamlı olarak daha düşüktü (p < 0.01). MA grubunda SW çeyreğinde harcanan zaman oranı AD grubundakinden daha yüksekti (p < 0.01).
Discussion
Biel su labirenti ve Cincinnati su labirenti de dahil olmak üzere birçok su labirenti, en az bir yüzyıl boyunca var olmasına rağmen, sadece MWM yaygın olarak etkili ve objektif olarak mekansal öğrenme ve bellek yeteneğini değerlendirmek için kullanılmıştır çünkü birçok vardır avantajları9. MWM'nin yaygın kullanımına rağmen, prosedür her zaman en iyi şekilde kullanılmamıştır. MWM deneyleri genellikle uzun zaman alır ve birçok değişken faktörden etkilenir. Uzamsal öğrenme ve hafıza yeteneğindeki değişikliklerin saptanmasında dikkate alınması gereken bazı etkili ve güvenilir yönler vardır.
Dört farklı MWM denemesi yapıldı. Görünür platform denemesi MWM'nin 1. Eğer hayvanlar doğrudan platforma yüzebilselerdi, bu hayvanların yüzme yeteneği ve görme normal olduğunu gösterdi10. Otnass, görünür platform denemesinin ilk11'deyapılması gerektiğini ileri sürdü. Bu çalışmada görünür platform deneme sonuçları dört grubun aynı öğrenme düzeyinde başladığı anlamına geliyordu. Oradan, ardışık deneyler başlatılabilir. Gizli platform deneme öğrenme ve hafıza yeteneği elde farelerin yeteneğini değerlendirmek için kullanılmıştır. Soruşturma duruşması, gizli platform denemesinin bitiminden sonra, çalışma belleği değerlendirmek için 7. Son olarak, ters deneme çalışma belleği2değerlendirmek için kullanılmıştır. Birlikte MWM dört farklı çalışmalarda değişiklikler AD modeli fareler düşük öğrenme ve hafıza yeteneği olduğunu ve MA AD5üzerinde olumlu bir etkiye sahip olduğunu belirtti .
Havuz ve platform1boyutları için özel bir standart yoktur. MWM çalışmalarının çoğunda 214 cm çapında bir havuz kullanılmaktadır. Vorhees ve Williams, aynı protokollerle farelerin 122 cm'lik bir havuzda 210 cm'lik havuzdan daha hızlı öğrendiklerini; öğrenme eğrisidik eğim 122 cm çapında havuz fareler için son derece kolay olduğunu gösterir12. Mevcut protokolde, AD farelerinin yaşlılık ve zayıf boyları göz önünde bulundurularak 90 cm çapında havuz ve 9.5 cm çapında platform kullanılmıştır. İlk deneylerin sonuçları, farelerin platformu daha büyük çaplı bir havuzda bulmakta daha fazla zorluk çektiğini göstermiştir. Bu nedenle, daha büyük havuzlarda testler gruplar arasında gerçek farkı temsil etmez. Deneysel hayvanlar daha küçük bir platform4ile daha büyük bir havuzda platform bulmak zor bir zaman vardı. Bu nedenle, havuzun ve platformun büyüklüğü deneysel gereksinimleri ve deneysel hayvanların durumuna göre ön deneylerde optimize edilmelidir.
MWM testi4'üngerçekleştirilmesi için 20-24 °C arasında değişen sıcaklıktaki su önerilir. Yaşlı deneysel hayvanlar soğuk suda kötü bir şekilde icra edilmiştir13, termoregülasyon net bir yaşa bağlı kaybı gösteren14. Bu çalışmada, suyun sıcaklığını 20-24 °C'de tutmak için havuzun dibine bir termostat yerleştirildi. Çalışma sonuçları dört grup5arasında yüzme hızlarında önemli bir fark olmadığını gösterdi.
MWM bilişsel fonksiyonu değerlendirmek için güçlü bir tekniktir ve yaygın çalışmalarda şu anda kullanılır. Ancak, havuz ve platform15,16boyutları da dahil olmak üzere MWM testi gerçekleştirmek için tanımlanmış, standart, tutarlı ekipman yoktur. Farklı laboratuvarlar MWM için farklı özelliklere sahiptir. Bu nedenle, araştırmacılar kendi bireysel deneysel gereksinimlerine göre uygun deneysel cihaz seçin, hangi araştırmacılar arasında karışıklığa neden olabilir. Ön deneyler de gereklidir. MWM gibi temel deneyler üzerinde daha fazla çalışma yapılması gerekmektedir. Günümüzde, MWM'nin deneysel bir araç olarak esnekliği sadece temel protokolleri amaçlı çalışmaya göre seçebilme yeteneğinde yatsın. Bu nedenle, bu test daha derinlemesine bilişsel fonksiyonu değerlendirmek için uygulanabilir.
Disclosures
Yazarlar olası bir çıkar çatışması olmadığını beyan ediyor.
Acknowledgments
Huiling Tian ve Ning Ding ortak yazar. Zhigang Li ve Jing Jiang birlikte yazar. Bu araştırma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı hibe (Hibe No. 81804178, 81473774 ve 81503654) tarafından desteklenmiştir. Burada açıklanan protokol ve sonuçlar, Dr. Ning Ding ve ark.'nın "Alzheimer Hastalığının SAMP8 Fare Modelinde Manuel Akupunkturun Davranışı ve Serebral Kan Akışını Düzenleyen" makalesinden kaynaklanmaktadır.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| acupuncture needles | Beijing Zhongyan Taihe Medical Instrument Limited Company | 511526 | |
| desktop computer | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | Lenovo T4700D | |
| Donepezil Hydrochloride Tablet | Eisai China | H20050978 | Aricept |
| mice | Zhi Shan (Beijing) Academy of Medical Science | SCXK2014-0003 | |
| Mirros water maze device | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | WMT-100S | |
| mouse bags | home-made | ||
| Signal acquisition and processing system | Chengdu Techman Software Limited Liability Company | BL-420N |
References
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Value of water mazes for assessing spatial and egocentric learning and memory in rodent basic research and regulatory studies. Neurotoxicology Teratology. 45, 75-90 (2014).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Morris water maze: procedures for assessing spatial and related forms of learning and memory. Nature Protocol. 1 (2), 848-858 (2006).
- The state of the art of dementia research: New frontiers; World Alzheimer Report 2018. Alzheimer's Disease International. 9, 1-46 (2018).
- Vorhees, C. V., et al. Effects of neonatal (+)-methamphetamine on path integration and spatial learning in rats: effects of dose and rearing conditions. International Journal of Developmental Neuroscience. 26 (6), 599-610 (2008).
- Ding, N., Jiang, J., Xu, A., Tang, Y., Li, Z. Manual acupuncture regulates behavior and cerebral blood flow in the SAMP8 mouse model of Alzheimer's disease. Frontiers in Neuroscience. 13, 37 (2019).
- Ding, N., et al. Manual acupuncture suppresses the expression of proinflammatory proteins associated with the NLRP3 inflammasome in the hippocampus of SAMP8 mice. Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine. 2017, 1-8 (2017).
- Cao, J., et al. Behavioral changes and hippocampus glucose metabolism in APP/PS1 transgenic mice via electro-acupuncture at governor vessel acupoints. Frontiers in Aging Neuroscience. 9, 5 (2017).
- Amy, E., et al. Effects of sub-chronic donepezil on brain Abeta and cognition in a mouse model of Alzheimer's disease. Psychopharmacology. 230, 279-289 (2013).
- Garthe, A., Kempermann, G. An old test for new neurons: refining the Morris water maze to study the functional relevance of adult hippocampal neurogenesis. Frontiers in Neuroscience. 7, 63 (2013).
- Schoenfeld, R., Schiffelholz, T., Beyer, C., Leplow, B., Foreman, N. Variants of the Morris water maze task to comparatively assess human and rodent place navigation. Neurobiology of Learning and Memory. 139, 117-127 (2017).
- Otnass, M. K., Brun, V. H., Moser, M., Moser, E. I. Pretraining prevents spatial learning impairment after saturation of hippocampal long-term potentiation. Journal of Neuroscience. 19 (24), 49 (1999).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T. Assessing spatial learning and memory in rodents. Ilar Journal. 55 (2), 310-332 (2014).
- Vorhees, C. V., Skelton, M. R., Williams, M. T. Age-dependent effects of neonatal methamphetamine exposure on spatial learning. Behavioural Pharmacology. 18 (5-6), 549-562 (2007).
- Iivonen, H., Nurminen, L., Harri, M., Tanila, H., Puoliväli, J. Hypothermia in mice tested in Morris water maze. Behaviour Brain Research. 141 (2), 207-213 (2003).
- Lin, S. Y., et al. Ozone inhibits APP/Aβ production and improves cognition in an APP/PS1 transgenic mouse model. Neuroscience. , (2019).
- Zuo, Y., et al. Preoperative vitamin-rich carbohydrate loading alleviates postoperative cognitive dysfunction in aged rats. Behavioural Brain Research. 373, 112107 (2019).
