Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Developmental Biology

تقييم نضج البويضة البشرية وتطبيقها السريري

doi: 10.3791/60058 Published: August 19, 2019

Summary

نحن نقدم الخطوط العريضة للبروتوكول السريري للتقييم غير الغازية لنضج البويضة البشرية باستخدام الفحص المجهري الخفيف المستقطب.

Abstract

التوقيت الأمثل لحقن الحيوانات المنوية intracytoplasmic (ICSI) هو مصدر قلق خطير لبرامج الخصوبة لأن دخول الحيوانات المنوية في الوقت المناسب يقلل من الكفاءة التنموية للبويضة. وجود أول جسم قطبي (PB) جنبا إلى جنب مع المغزل meiotic يشير إلى الانتهاء من نضج البويضة واستعداد البويضة للإخصاب. في الممارسة السريرية، فمن المعتاد أن نفترض أن جميع البويضات التي تعرض PB هي البويضات metaphase ناضجة (MII). ومع ذلك، البثق PB يسبق تشكيل المغزل MII ثنائي القطب. هذا التزامن يجعل مجرد وجود PB علامة غير موثوق بها من نضج البويضة. يسمح التصوير المغزل غير الغازية باستخدام الفحص المجهري الضوئي المستقطب (PLM) بالفحص السريع والسهل لمعرفة ما إذا كانت البويضة التي تعرض PB قد أعادت تجميع المغزل الميوتيك قبل الحقن المجهري. هنا، نقدم بروتوكول قياسي لإجراء تقييم نضج البويضة البشرية في المختبر السريري. كما نعرض كيفية تحسين وقت الحقن المجهري فيما يتعلق بمرحلة نمو البويضة من أجل منع حقن الحيوانات المنوية المبكرة للبويضات المتأخرة النضج. باستخدام هذا النهج، حتى البويضات غير ناضجة البثق PB في المختبر يمكن استخدامها سريريا. تأكيد أن المغزل MII موجود قبل حقن الحيوانات المنوية والتكيف الفردي من وقت الحقن المجهري مهم بشكل خاص في سوء التكهن دورات الإخصاب في المختبر (IVF) مع عدد قليل من البويضات المتاحة للإخصاب.

Introduction

لتصبح بويضة الهابلويد القابلة للإخصاب، يجب على البويضة ثنائية الديلويد أن تضخ نصف معلوماتها الوراثية في خلية مجاورة، تسمى أول جسم قطبي (PB)، ومحاذاة الكروموسومات في خط الاستواء من مغزل المرحلة الفوقية الثانية ثنائي القطب (MII). في حين يمكن ملاحظة PB بوضوح عن طريق الفحص المجهري الخفيف التقليدي، فإن الكشف عن المواد الوراثية والهياكل الهيكلية الخلوية يتطلب عادة إجراءات تحضيرية الغازية التي تتعارض مع استخدام البويضة بشكل أكبر لعلاج الخصوبة. وبالتالي، في الممارسة السريرية، ويعتبر وجود PB كسمة مميزة لنضج البويضة. ومع ذلك، كشف التصوير الحي لديناميات الأنابيب الدقيقة والكروموسوم أثناء نضج البويضات البشرية أن PB يصبح مرئيا بضع ساعات قبل أن يتم تجميع المغزل MII ثنائي القطب ويتم محاذاة الكروموسومات1. ومع ذلك، في الضوء المنقولة، وMII القبض على البيض لا يمكن تمييزها عن البويضات التي دخلت للتو عملية فصل الكروموسوم. وهكذا، قد تحتوي مجموعة من البويضات، المصنفة على أنها بويوسية MII على أساس وجود PB فقط، على البويضات التي لم تستكمل بعد تطورها وبالتالي ليست جاهزة للإخصاب.

تأخير نضج البويضات من المرجح أن يؤثر على السكان من المستجيبين الفقراء مع عدد منخفض من البويضات MII ونسبة عالية من البويضات غير ناضجة التي تم جمعها بشكل غير متوقع في دورات حفز2. في الجسم الحي، واحد فقط، بيضة ذات جودة أفضل يحقق النضج ويصبح مبيض. في دورات الإخصاب في المختبر (IVF)، يتم استخدام فرط تحفيز المبيض الخاضع للرقابة لتجنيد البويضات المتعددة للنضج. الطفرة Gonadotropin يؤدي إلى استئناف برنامج meiotic وذرية البيض من المفترض أن تصل إلى مرحلة الاعتقال MII في غضون 36 ساعة3. ومع ذلك، فإن البويضات التي يتم استردادها من بصيلات ما قبل الأوبلاتورية غالباً ما تشكل مجموعة متنوعة من بويضات MII المعروضة والبويضات غير الناضجة، إما في المرحلة الفوقية الأولى (MI) أو مرحلة الحويصلة الجرثومية (GV) (الشكل 1). تخضع البويضات MII فقط لحقن الحيوانات المنوية intracytoplasmic (ICSI) في حين يتم التخلص من البويضات غير الناضجة عادة. ومع ذلك، عندما تزرع في المختبر، ويلاحظ عادة الكريات البيض MI لقذف PB في المختبر. على الرغم من دونيتها العامة، وقد تم استخدام البويضات في وقت متأخر النضج التي أكملت تلقائيا أول انقسام meiotic خلال ثقافة بين عشية وضحاها بنجاح كالبويضات المورد الأخير، وتم الإبلاغ عن المواليد الأحياء4،5 ،6،7،8. وبالتالي ، فإن الحقن المفاجئ للنطفية قد يكون السبب الرئيسي الكامن وراء النتائج التنموية السيئة للبويضات المتأخرة التي تم الإبلاغ عنها في الدراسات السابقة9،10،11.

يسمح الفحص المجهري الضوئي المستقطب (PLM) مع برنامج معالجة الصور بالتصور غير الغازي للمغزل الميوتيك في البويضة الحية. يتم إنشاء انعكاس مزدوج من خلال التفاعل من شعاع الضوء الاستقطاب مع الجمعية أمر للغاية من microtubules بناء المغزل ثنائي القطب. وبما أن الضوء المستقطب هو من الكثافة العادية، يمكن استخدام هذه التقنية بأمان في البيئات السريرية لعرض ديناميات جهاز التقسيم11،12،13،14. وقد تم تحديد وجود birefringence المغزل MII داخل البويضة كعلامة على الكفاءة التنموية للبيضة9،15،16،17،18، 19،20،21،22،23. وهكذا، فقد اقترح أن التصوير المغزل meiotic غير الغازية يمكن استخدامها لمراقبة جودة البيض في الممارسة السريرية11،14،20.

منذ تمحلالجدول الزمني لديناميات الأنابيب الدقيقة أثناء داء المكورات الأنبوبية 1 ، يمكن أن يكون نمط الحركة الشعبية لتحرير السودان الملاحظ أفضل صلة بمسار الوقت من MI إلى MII الانتقال. بعد وقت قصير من انبعاث PB، يصبح المغزل MII الوليدة غير قابل للكشف من قبل PLM. ومع ذلك، إذا تم الاحتفاظ البويضات في الثقافة، قد تظهر إشارة birefringence في وقت لاحق عندما يعيد المغزل MII ثنائي القطب تجميع9،10،11. وهكذا، في البويضات البثق PB في المختبر، قد يكون غياب المغزل مؤقتة فقط المقابلة للانتقال الفسيولوجي للبويضة في وقت متأخر النضج من MI إلى مرحلة MII. إذا كانت إشارة المغزل MII غير قابلة للكشف، يمكن تأجيل حقن الحيوانات المنوية إلى نقطة زمنية لاحقة توفير وقت إضافي لتشكيل المغزل MII. الاستفادة المثلى بمساعدة PLM من وقت الحقن المجهري يزيد من فرصة استخدام البويضات المتأخرةالنضج سريرياً وإحداث فرق للمرضى الفقراء في التكهن 9.

أدناه، نحن نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لكيفية إجراء التصوير المغزل غير الغازية في البويضات البشرية. كما نبين كيف يمكن استخدام الحركة الشعبية لتحرير السودان لتجنب خطر الإخصاب المبكر للبويضات المتأخرة النضج.

Protocol

يصف هذا البروتوكول الإجراء السريري الذي هو "إضافة إلى" علاج التلقيح الاصطناعي القياسية. وينبغي أن يقوم بها موظفون من ذوي الخبرة وفقا للممارسات المختبرية الجيدة والمبادئ التوجيهية السريرية24،25. ويوصى بالحصول على موافقة خطية مستنيرة من المرضى المؤهلين. وقد وافقت لجنة الأخلاقيات المؤسسية على هذا البروتوكول.

1. استرداد البيض وdenudation

  1. حث تحفيز المبيض باستخدام بروتوكولات التحفيز التقليدية3. ضبط الجرعة إلى استجابة فردية. عندما اثنين أو أكثر من بصيلات, تصور بواسطة التصوير بالموجات فوق الصوتية, تصل إلى قطر 18 ملم, حث نضج البويضة مع تطبيق 250 ميكروغرام من الغدد التناسلية القرنية البشرية (hCG). جدولة التقاط البويضات (OPU) في 35-36 ساعة بعد حقن hCG.
  2. جمع المجمعات الركام والبويضات المستردة (COCs) في CO2-مستقلة التعامل مع المتوسطة (جدولالمواد). بعد فترة حضانة قصيرة (10-15 دقيقة) في حاضنة مستقلةعنثاني أكسيد الكربون، تعرض لفترة وجيزة (حتى 30 ق) COCs التي تم جمعها إلى حل hyaluronidase (جدولالمواد). تحت مجهر مجسم، قم بإزالة خلايا الكسولوكورونا ميكانيكيًا عن طريق أنابيب COCs برفق مع طرف فلتر بمقدار 200 ميكرولتر.
  3. باستخدام micropipettes التدنّم مع قطر تناقص تدريجي (200 ميكرومتر، 180 ميكرومتر و 150 ميكرومتر)، بلطف تجريد البويضات من الخلايا الجريبية المتبقية وغسل البويضات 3X في التعامل مع المتوسطة.
  4. تقييم عدد البويضات العارية وحالتها التنموية وفقاً لوجود أو غياب النواةوPB الأول (الشكل 1).
  5. تحقق من معايير الإدراج لفحص الحركة الشعبية لتحرير السودان. إجراء تقييم نضج البيض إذا كان هناك (1) استجابة سيئة غير متوقعة للتحفيز التقليدي مع أقل من 6 البويضات MII التي تم جمعها في OPU و (2) تاريخ فشل الإخصاب السابق أو عدم نضج البويضة.
  6. ضع أويات GV وMI وMII في آبار منفصلة في طبق أطفال الأنابيب، كلمنها يحتوي على 500 ميكرولتر من CO 2-dependent culture المتوسطة (جدولالمواد)المغطاة بالزيوت المعدنية (جدولالمواد).
  7. حضانة ل3-4 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية في جو رطب من 5% O2 و 6% CO2.

2 - التحضير لفحص الحركة الشعبية لتحرير السودان وما تلاه من امتحان

ملاحظة: يصف البروتوكول الوارد هنا تقييم الحركة الشعبية لتحرير السودانالذي تم إجراؤه باستخدام نظام OCTAX Polar AIDE (جدول المواد). وبدلاً من ذلك، يمكن استخدام أنظمة أخرى متاحة تجارياً لعرض المغزل.

  1. إعداد لوحات لزراعة الأجنة.
    1. اعتمادا على عدد البويضات التي سيتم فحصها (مجموع البويضات MII، وMI البويضات البثق PB خلال فترة ما قبل الحضانة)، وإعداد إما لوحة 4 جيدا أو لوحة 12 جيدا، وملء كل بئر مع 500 درجة مئوية أو 30 ميكرولتر من وسط الثقافة، على التوالي ، وتغطيمع الزيوت المعدنية متساوية سابقا.
    2. تأكد من أن كل من الثقافة المتوسطة والمعدنية النفط قد تم معادلة في حاضنة CO2 بين عشية وضحاها. الحفاظ على الطبق المعدفي CO 2-تعتمد على حاضنة لمدة 2 ساعة على الأقل.
  2. إعداد طبق ICSI.
    1. استخدام طبق من البلاستيك المخصصوجعل 5 ميكرولتر قطرات من وسائل المناولة prewarmed لكل البويضة PB-عرض وقطرة إضافية واحدة لغسل إبرة. جعل قطرة إضافية من البولي فينيل بيروليدون (PVP) الحل (جدولالمواد)لشل الحيوانات المنوية قبل الحقن المجهري (إضافة الحيوانات المنوية قبل الحقن المجهري) وتراكب مع الزيوت المعدنية prewarmed.
    2. الحفاظ على طبق ICSI المعدة في حاضنة CO2مستقلة لمدة 20 دقيقة على الأقل.
  3. إعداد طبق فحص الحركة الشعبية لتحرير السودان.
    1. استخدام طبق أسفل الزجاج المخصصة وجعل 5 قطرات من السائل معالجة prewarmed لكل البويضة PB-عرض. يُتراكب مع الزيت المعدني المُسخّر مسبقاً.
    2. احتفظ بالطبق في الحاضنة المستقلة CO2لمدة 20 دقيقة على الأقل.
  4. تعيين المجهر جاهزة لفحص الحركة الشعبية لتحرير السودان.
    1. تبديل مرحلة ساخنة على المجهر المقلوب في وقت مبكر لتحقيق درجة حرارة الاحترار الصحيح. تأكد من أن الإعدادات يتم تعديلها بدقة للحفاظ على 37 درجة مئوية في قطرات متوسطة التعامل مع طبق PLM/ICSI أثناء إجراءات المعالجة الدقيقة.
    2. تناسب عقد معقمة وإبرة ICSI في أصحاب الحقن المجهري وجعلها في التركيز. بدلا من ذلك، استخدم إبرة الفقس.
    3. حدد الهدف المناسب (20x و 25x هي الأنسب) وضمان أن المكثف هو في موضع حقل مشرق.
    4. إدراج مرشح التداخل الأخضر (الضوء يتحول إلى اللون الأخضر) وتعيين شريط التمرير تحليل الكريستال السائل في موقف العمل.
    5. تعيين مصراع إلى ~ 50٪ وضبط الاستقطاب الدائري لتقليل الضوضاء الخلفية.
  5. تعيين الكمبيوتر جاهزة لفحص PLM.
    1. قم بتشغيل برنامج التصوير.
    2. اختر الفيديو | مصدر الفيديو | polarAIDE في قائمة الفيديو في شريط القوائم العلوي.
    3. التبديل إلى الفيديو الحي عن طريق الذهاب إلى صفحة الفيديو وتفعيل تحليل المغزل وزونا عن طريق ضرب على أيقونة (الشكل التكميلي 1) في شريط أدوات الفيديو.
    4. حدد وضع العرض للتحجيم الديناميكي أثناء التصوير المغزل: (1) طريقة العرض المشتركة باللون الأحمر (birefringence)/الأخضر (الخلفية)، أو (2) عرض أبيض (birefringence)/وأسود (خلفية). يتم استخدام وضع التهديف الديناميكي لتسجيل النقاط التلقائية في المنطقة pellucida.

3. فحص نضج البيض

  1. بعد فترة ما قبل الحضانة (3-4 ساعة)، قم بإجراء فحص للحركة الشعبية لتحرير السودان يكشف عن حالة نضج البويضة في الوقت القياسي لـ ICSI (39-40 ساعة بعد مشغل hCG).
  2. نقل جميع البويضات إلى قطرات فردية على طبق PLM ووضعها تحت المجهر المقلوب المعدة للتصوير المغزل. تذكر إزالة الغطاء البلاستيكي من الطبق السفلي الزجاجي قبل بدء الفحص.
  3. جلب البويضة الأولى في التركيز. إذا كان من الصعب البحث عن الخلية تحت الضوء الأخضر، اسحب المرشح الأخضر مؤقتاً. تأكد من إدراج عامل التصفية الأخضر قبل التحليل.
  4. مراقبة صورة birefringence البويضة المكتشفة (الأحمر / البرتقالي على خلفية خضراء) كما يتم معالجتها عن الكمبيوتر وعرضها في الوقت الحقيقي على شاشة الكمبيوتر. تذكر أن الإشارة غير مرئية في العدسة.
  5. إذا كانت الرسالة التي تعلن عن التعرض للضوء منخفضة جدا / عالية للملوثات العضوية الثابتة، وضبط السطوع إلى كثافة مناسبة باستخدام مقبض شدة الضوء المجهر.
  6. استخدام عقد وإبرة ICSI لتحويل البويضة حتى PB هو في موقف الساعة 12 والتركيز على PB.
  7. إذا كان birefringence المغزل غير مرئية للوهلة الأولى في محيط PB، بدوره بلطف البويضة حول كل محور عن طريق لمس قليلا pellucida المنطقة لضمان محاذاة الضوء المستقطب مع ألياف المغزل صفيف (فيديو تكميلي ). أعلن عن غياب مغزل MII طالما فشلت البويضة في إظهار إشارة المغزل على الرغم من دوران صارم.
  8. استناداً إلى نمط البيرهامشة الملاحظ، قم بتصنيف البويضات إلى الفئات التالية (الشكل2): (A) البويضات ذات الإشارة الساطعة للمغزل ثنائي القطب على شكل برميل MII مع حدود مرسومة بوضوح وحتى توزيع ثنائي ة ; (ب) البويضات ذات المغزل ثنائي الشكل والقطبي ة والشفافة MII ذات الحدود غير النظامية والتوزيع غير المتكافئ للإشارة؛ (C) البويضات مع عدم وجود BII المغزل birefringence في ooplasm؛   (د) الطور الأول/الطور اللايفي الأول، الذي يظهر جسراً ميكرووبلي (حبلاً الضام بين PB الأول والبويضة) بدلاً من مغزل MII.
    ملاحظة: البويضة مع إشارة المغزل MII للكشف (الصف A أو B) هي مناسبة لICSI الفوري.
  9. التقاط لقطة (F9) أو تسجيل الفيديو لتقرير و / أو تحليل الصورة اللاحقة. الاحتفاظ بمستندات نمط الصورة لتقليل الذاتية للمشغل.
  10. انتقل إلى موضع البويضة التالية وكرر الخطوات 3.6−3.9.

4. تحسين توقيت ICSI

  1. نقل جميع البويضات الإيجابية المغزل (الصف A أو B، الخطوة 3.8) في طبق ICSI وإخضاعها لICSI وفقا للبروتوكولات القياسية24،25.
  2. إذا كانت البويضات لا تظهر أي إشارة المغزل MII للكشف، وضع طبق PLM في CO2- حاضنة مستقلة وتحويل الحقن المجهري إلى وقت لاحق.
  3. إجراء إعادة فحص الحركة الشعبية لتحرير السودان حوالي 2-3 ح في وقت لاحق بعد الخطوات 3.3-3.9. إذا كانت بعض البويضات لا تزال تفتقر إلى مغزل MII، مزيد من التأخير ICSI لمدة 1−2 ساعة إضافية.
  4. نقل جميع البويضات في طبق ICSI وحقنها وفقا للبروتوكولات القياسية24. إذا كان طبق PLM متوافق مع زاوية الانحناء من إبرة الحقن المجهري، وأداء الحقن المجهري على الفور في طبق PLM بعد التحول إلى وضع حقل مشرق.
  5. عند الحقن المجهري، نقل البويضات إلى لوحات أعدت لزراعة الأجنة والثقافة حتى مرحلة الكيسة الكيسية.

Representative Results

يجعل الفحص المجهري الضوئي المستقطب من الممكن فحص ما إذا كانت البويضة قد أكملت النضج النووي وتجميع المغزل MII قبل الحقن المجهري. نظرا لطابعها غير الغازية، ويمكن استخدامه لتقييم بأمان استعداد البويضة البشرية للإخصاب في البيئات السريرية11،12،13،14. البويضات المدورة هي أكثر عرضة للظهور في الأجنة قابلة للحياة من البويضات دون المغزل9،15،16،17،18،19، 20 , 21 , 22 , 23.أيضا، البويضات يضم المغزل ثنائي القطب متميزة يبدو أن لديها كفاءة التنميةأعلى من البويضات مع المغزل خلل الشكل 9،21،22. وإذا ما أُخذت معاً، يمكن أن يكون تصوير المغزل بمثابة أداة لتحديد البويضات التي تنطويعلى أكبر قدر من الإمكانات للإخصاب بنجاح، والخضوع لتطوير ما قبل الزرع، ودعم الحمل على المدى الكامل 9،15، 16 سنة , 17 سنة , 18 سنة , 19 سنة , 20 , 21 , 22 , 23.

ويختلف معدل الإصابة المبلغ عنه للمغزل (44-97 في المائة) تعكس تنوع السكان المدروسين9 و15و16و17و18 و19و20و21 22 , 23 , 26 , 27 , 28.في الجسم الحي نضجت البويضات من المستجيبين العاديين تظهر عادة ثنائي القطب MII المغزل في 40 ساعة بعد hCG الزناد9،18،27،29. ومع ذلك ، في المستجيبين بطيئة ، يتأثر تجمع البويضات المستردة من بصيلات preovulatory بتأخير النضج9،27. هنا، ينبغي إجراء التصوير المغزل للتمييز البويضات التي تم القبض عليها في مرحلةMII من تلك التي تمر بمرحلة انتقالية النضج الهامة (الشكل 3). نوصي بإزالة الخلايا الجريبية فور استرجاعها، وحضانة البويضات MI وMII في آبار منفصلة لتكون قادرة على التمييز بين البويضات الناضجة في الجسم الحي والبويضات التي تنضج في وقت متأخر من البثق PB في المختبر، قبل وقت قصير من الحقن المجهري. في حالة تنفيذ التدنّذ قبل الحقن المجهري مباشرة، لا يمكن تمييز هاتين المجموعتين من البويضات على أساس مظهر PB.

وينبغي تفسير التغييرات الخاصة بالمرحلة في نمط الحركة الشعبية لتحرير السودان في سياق معرفة ديناميات المغزل أثناء النضج الميوتيك. خلال interkinesis، جهاز تقسيم يخضع لإعادة تنظيم هيكليةواسعة النطاق وإشارة PLM يختفي عابرة 1،10،11. وهكذا، في البويضات تأخر التنمية البثق PB في المختبر، وعدم وجود إشارة المغزل MII قد لا تعكس بالضرورة اضطراب الخلوية ولكن يمكن أن تشير إلى تطور البويضة من MI إلى MII المرحلة (الشكل3). إذا تم حقن الحيوانات المنوية في نقطة زمنية غير فسيولوجية، فإن القدرة التنموية للبويضة تتعرض للخطر. تأجيل الحقن المجهري يوفر البويضات في وقت متأخر النضج مع مزيد من الوقت لتجميع المغزل MII الذي يرتبط وجوده مع نتائج سريرية أفضل10،11. في الدراسة السريرية التي تنطوي على المستجيبين بطيئة / الفقراء، ما يقرب من 60٪ من البويضات المغزل السلبية في البداية وضعت إشارة المغزل قبل الحركة الشعبية لتحرير السودان إعادة فحص ما يقرب من 2 ح في وقت لاحق9. اعتمادا ً على مرحلة النمو واللياقة البدنية الشاملة للبويضات المتأخرة النضج، فإن ظهور المغزل MII بعد قذف PB يستغرق عادة 2−6 ساعة (ملاحظة غير منشورة). تتطلب البويضات التي تعرض جسر اسطواني ميكروتوبول (الإنزال/الطور التلفي، الصف D) خلال الفحص الأول للحركة الشعبية لتحرير السودان وقتاً أطول لتطوير إشارة المغزل MII من البويضات التي لا يوجد فيها مغزل مرئي (المغزل الناشئ، الصف C). التكيف الفردي لوقت الحقن المجهري إلى مرحلة نمو البويضة يمنع التنشيط المبكر للبويضة ويؤدي إلى تحسين معدل الإخصاب ونجاح نمو الأجنة9.

على الرغم من أن البويضات التي تنضج في وقت متأخر البثق PB في المختبر عموما لديها كفاءة التنمية أقل مما كانت عليه في البويضات في الجسم الحي نضجت، ومعدل تطور الجنين هو مقبول إذا تمكنوا من تجميع المغزل للكشف قبل تأخر الحقن المجهري (التفجير معدل 41.32٪)9. باستخدام هذا النهج، حتى البويضات غير الناضجة، التي يتم رفضها عادة لعلاج الخصوبة، يمكن استخدامها سريريا، وإنتاج الأجنة القابلة للتحويل، ويؤدي إلى الحمل على المدى الكامل. تقييم المرحلة النضجية لكل البويضة الفردية مفيد بشكل خاص في دورات التكهن السيئة مما يؤدي إلى عدد قليل من البويضات MII و / أو بعد إجراء عملية إنقاذ في المختبر النضج من البويضات غير ناضجة9.

وبصرف النظر عن تقييم نضج البيض، ينصح أيضا التصوير المغزل قبل خزعة PB من أجل تجنب تدمير المغزل في الخلايا المدورة الأولى / التيلوفية. في علم الأجنة التجريبية ، يتم استخدام التصور من المغزل meiotic أثناء التوهين البيض و / أو إجراء نقل المغزل13.

Figure 1
الشكل 1: نضج البويضات البشرية. في الجسم الحي نضجت البويضات (MII) تظهر PB في وقت الاسترجاع. يمكن للبويضات غير الناضجة (GV, MI) إكمال النضج تلقائيًا في المختبر. شريط مقياس = 20 درجة.

Figure 2
الشكل 2: تصنيف البويضات على أساس النمط المكتشف من قبل الحركة الشعبية لتحرير السودان. أمثلة تمثيلية لدرجات البويضة (A-D) استناداً إلى ظهور إشارة المغزل. نمط الحركة الشعبيةلتحرير السودان الكشف: (أ) إشارة بارزة من المغزل ثنائي القطب، (B) شفافة القطبية MII المغزل المغزل، (C) لا المغزل للكشف، و (د) جسر ميكروتوبيول. شريط مقياس = 20 درجة.

Figure 3
الشكل 3: مراحل انتقال MI إلى MII في نضج البويضة. يظهر ظهور البويضات في المجال الساطع (الصف العلوي)، جنبا إلى جنب مع إشارة الفلورة من الكروموسومات (سماوي) وmicrotubules (أرجواني) (الصف الأوسط)، وفي ضوء الاستقطاب (الصف السفلي). تم فحص كل البويضات أولاً من قبل الحركة الشعبية لتحرير السودان وتم إصلاحها على الفور. كانت البويضات الثابتة (المناعية) وصفت مع Hoechst (DNA) والأجسام المضادة للتنبيب (microtubules). السهم الأصفر يشير إلى وجود PB والسهم الأبيض يسلط الضوء على موقف microtubules birefringent. شريط مقياس = 20 ميكرومتر. تم تعديل هذا الرقم من Holubcová وآخرون، JARG 20199. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: ارتباط تنظيم الكروموسوم والأنابيب الدقيقة بنمط البيرفرينج الذي تم اكتشافه بواسطة الفحص المجهري الضوئي المستقطب. يظهر ظهور البويضات في المجال الساطع جنبا إلى جنب مع إشارة الفلورسنت للكروموسومات (سماوي) وmicrotubules (أرجواني) (الصف العلوي)، وفي ضوء الاستقطاب (الصف السفلي). تم إصلاح كل البويضات مباشرة بعد فحص PLM. وكان الحمض النووي (Hoechst) وmicrotubule (α-tubulin) ملطخة. (A-C)البويضات مع المغزل القابلة للكشف PLMبعد الكروموسومات غير المنحازة (A، B)أو أعمدة المغزل المركزة بشكل فضفاض (C)؛ (D-F)البويضات غير طبيعية دون PLM-القابلة للكشفMII المغزل تظهر المتخلفة (D)، القطبية (E) أو لا المغزل(F). السهم الأبيض يسلط الضوء على موقف الأنابيب الدقيقة birefringent، والعلامة النجمية (*) يشير إلى موقف الكروماتين decondensed. شريط مقياس = 20 درجة.

Figure 5
الشكل 5: هياكل البيرهامش في البويضات البشرية. أمثلة تمثيلية للهياكل(A-D)التي اكتشفتها الحركة الشعبية لتحرير السودان في البويضات البشرية. ZP = زونا بيلوسيدا; PM = غشاء البلازما (أوليما)؛ RB = الأجسام الحرارية، vacuoles. سهم أبيض، مغزل ميوروتيك في مراحل مختلفة من النضج. (E) MII المغزل عدم المحاذاة مع الجسم القطبي (PB). (F) مفرزة المغزل من غشاء البلازما. شريط مقياس = 20 درجة.

الشكل التكميلي 1: تخطيط سطح المكتب لبرنامج تحليل الصور. الرجاء النقر هنا لتحميل هذا الملف.

فيديو تكميلي: إجراء فحص الحركة الشعبية لتحرير السودان. مطلوب دوران البويضة لاستبعاد وجود المغزل (السهم). شريط مقياس = 20 درجة.

Discussion

المغزل الميوسيتي اللاسنتروسومي في البويضات البشرية ديناميكية للغاية وبنية حساسة1. في ظل الظروف دون المستوى الأمثل، وألياف microtubule depolymerize بسرعة والمغزل meiotic تفكيك30،31،32،33. وبالتالي، من المهم للغاية ضمان أن تكون ثقافة البويضة وظروف المعالجة الدقيقة، وهي درجة الحرارة ودرجة الحموضة في النطاق الأمثل. لتقليل خطر اضطراب المغزل، يجب أن تبقى البويضات في بيئة تسيطر عليها درجة الحرارة تحافظ على 37 ± 0.5 درجة مئوية في وسائل الإعلام البويضة. مطلوب بدقة استخدام المجاهر وإعداد الحقن المجهري مجهزة مرحلة ساخنة. يجب أن يتم كل التلاعب مع البويضات خارج الحاضنة في HEPES / MOPS وسائل الإعلام المخزنة لتجنب التذبذبات الحموضة. لتجنب الآثار السلبية المحتملة لتسليم البويضة المفرطة في حالة المحيطة، يجب ألا يتجاوز الوقت الإجمالي لفحص الحركة الشعبية لتحرير السودان 10 دقائق. يجب تحليل البويضات على الطبق السفلي الزجاجي مع إزالة الغطاء البلاستيكي لأن تحديد مواقع البلاستيك القياسي في مسار الحزمة يضعف تحليل الصورة. لأن الأطباق البلاستيكية والزجاج القاع لها خصائص حرارية مختلفة، وينبغي فحص درجة الحرارة مباشرة في قطرات من التعامل مع المتوسطة في طبق الفحص.

وبالإضافة إلى الظروف المختبرية، يمكن أن يكون للاختلافات الإجرائية ومهارات التلاعب الجزئي لدى المشغل تأثير على دقة فحص الحركة الشعبية لتحرير السودان. فقط المغزل ثنائي القطب تجميعها للغاية يمكن تصورها بشكل غير غازي. الإشارة الملاحظة تتناسب مع درجة التنظيم الهيكلي للمغزل. المغزل الوليدة، القطبية، خففت أو مشوشة لا تظهر سوى عدم وضوح birefringence أو لا شيء على الإطلاق (الشكل3 والشكل 4). إلى جانب ذلك، محاذاة ناقصة من الضوء المستقطب مع صفائف microtubule تنتج فقط birefringence شفافةوغير محددة على الرغم من الوجود الفعلي للمغزل ثنائي القطب متطورة (الشكل 4). ما لم تكن موجهة بشكل صحيح، قد يكون من السهل أن تفوت إشارة المغزل والنضج البويضة تشخيصها بشكل خاطئ (فيديوتكميلي). للتصوير الأمثل المغزل، يجب أن تتحول البويضة بشكل صحيح حول كل محور. وبما أن الـ birefringence غير مرئي في الأعين، فإن المشغل يجب أن يشاهد شاشة الكمبيوتر أثناء إجراء دوران البويضة. الخبرة السابقة مع التلاعب الدقيق وتدريب التصوير المغزل في فائض في المختبر نضجت البويضات هو مرغوب فيه قبل التحول إلى التطبيق السريري.

وإلى جانب المغزل، فإن الخلايا الركام المحيطة بالبويضة، والوليما، والطبقة الداخلية من الزونا بيلوسيدا وبعض الهياكل السيتوبلازمية (على سبيلالمثال، الهيئات الحرارية، الفراغات) تظهر ثنائية الهوامش (الشكل 5A-D). ما لم تتم إزالتها بدقة من البويضة قبل التصوير، تنتج الخلايا الجريبية المرفقة بإحكام ضوضاء في الخلفية وحلول وسطية للكشف عن المغزل المتحيّف. يجب الحرص على عدم خطأ جسم حراري كبير للمغزل. العديد من التضمينات السيتوبلازمية المقيمة في السيتوبلازم عرض سطوع عالية التي تتناقض بشكل حاد مع الخلفية المظلمة. ومن ناحية أخرى، لا يظهر المغزل الميوتيك سوى إشارة معتدلة، وحدود غير واضحة، وعادة ما يعلق على الأوليما تحت أو بجوار أول PB. في بعض الأحيان، يكشف فحص PLM انحراف المغزل الإجمالي عن وضعها القياسي (الشكل5E،F). إذا كان هناك اختلال كبير بين جهاز التقسيم وPB، تساعد PLM على توجيه البويضة لتجنب خطر الإصابة بالمغزل أثناء الحقن المجهري. لا يبدو أن الوضع النسبي للمغزل داخل البويضة يؤثر على الإمكانات التنموية للأجنة الناتجة17،34. ومع ذلك، عندما ينفصل المغزل بشكل تنافسي عن الأوليما، تحدث تشوهات الإخصاب. ومن المثير للاهتمام، بعض البويضات ذات الجودة السيئة تخضع لإزالة التكثيف الكروماتين مباشرة بعد قذف PB بدلا من بدء النوى microtubule (الشكل4F). باستخدام الفحص المجهري الضوئي التقليدي وPB كعلامة فقط على نضج البويضات، تعتبر هذه البويضات الفرعية المختصة قابلة للتخصيب. وهكذا، بالإضافة إلى التقييم المورفولوجي الروتيني، يضيف التصوير المغزل معلومات هامة حول نضج البويضة ويمكن أن يكون بمثابة علامة غير مباشرة لجودتها.

ومن المرجح أن يتأثر حدوث البويضات المدورة من MII بخصائص السكان الذين شملتهم الدراسة (مثل الخلفية الوراثية، والحالة الطبية، وعمر الأم). وبالإضافة إلى ذلك، فإن نسبة البويضات المتأخرة من الناحية الإنمائية داخل المجموعة سوف تؤثر على العدد الفعلي للالبويضات المغزل السلبية المكتشفة9،27. التصور المغزل Meiotic يجعل من الممكن لتحديد واضح البويضات القابلة للإخصاب التي تم القبض عليها في مرحلة MII. وعلاوة على ذلك، فإن الفحص الثاني في وقت لاحق قد يكشف ما إذا كانت البويضة السلبية المغزل غير طبيعية أو أنها لم تتقدم إلا مؤخرا من خلال انتقال MI /MII9و10و11. عندما يسمح لتطوير المغزل قبل الحقن المجهري، حتى البويضات غير الناضجة، والتي يتم تجاهلها بشكل روتيني، يمكن أن تنتج الأجنة قابلة للحياة9. في دورات مع عدد قليل جدا من البويضات المتاحة للإخصاب، يمكن أن يكون الحقن المجهري في الوقت المناسب بدقة من البويضات البثق PB بمثابة استراتيجية الإنقاذ وبديل لإلغاء دورة.

ومع ذلك ، لا ينبغي تعميم تمديد وقت ما قبل الحضانة لجميع البويضات. في الجسم الحي نضجت البويضات من المستجيبين العاديين عادة ما تظهر المغزل MII9،20،21،27. هنا ، تنخفض فرصة التصوير المغزلي الناجح مع مرور الوقت نتيجة لمرحلة ما بعد الإباضة في المختبر الشيخوخة35. إذا كان ذلك ممكنا، يجب أن يتم الحقن المجهري في يوم الاسترجاع ويجب أن لا تتجاوز 9 ساعات (45 ساعة بعد hCG)، وهي الفترة المرتبطة بانخفاض في نوعية الجنين الناتجة36،37. يجب أن تخضع البويضات التي تعرض المغزل ثنائي القطب المتميز ة لـ ICSI دون مزيد من التأخير. وباختصار، فإن التحسين الفردي لتوقيت الحقن المجهري أمر جدير بالاهتمام في المرضى الذين يعانون من سوء التكهن لاستبعاد أي خطر لحقن الحيوانات المنوية قبل الأوان. ومع ذلك، فإنه من غير الضروري، وتستغرق وقتا طويلا جدا وشاقة ليتم تنفيذها في جميع دورات التلقيح الاصطناعي.

يكشف تحليل الحركة الشعبية لتحرير السودان ما إذا كانت البويضة قد وصلت إلى مرحلة MII. ومع ذلك، فإن التصور غير الغازية للمغزل الميوتيك لا يوفر أي معلومات حول تنظيم الكروموسوم. قد يكون هناك خلل شديد في الكروموسومات و/أو تقسيم الكروماتيد المرتبط بالعمرالأمومي في البويضات التي تتميز بمغزل ثنائي القطب (الشكل 5). عوامل أخرى مختلفة لها تأثير كبير على نجاح الإنجاب (على سبيل المثال، عامل الحيوانات المنوية، الميتوكوندريا، تنشيط الجينوم الجنيني، الانقسام غير المنتظم، علم الوراثة، بطانة الرحم، مناعة الأمومة). لذلك، الكشف عن المغزل MII في حد ذاته، لا يضمن نتيجة سريرية إيجابية من إجراء التلقيح الاصطناعي.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

نود أن نشكر مختبر علم الأجنة في إعادة الربح الدولية. كما نعترف بالمرفق الأساسي لـ CELLIM من CEITEC بدعم من MEYS CR (LM2015062 Czech-Bioimaging) لدعمها في الحصول على بيانات التصوير المناعي ة المعروضة هنا.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Continuous Single Culture Complete with Human Serum Albumin Irvine Scientific 90164 bicarbonate based single-step culture medium for embryo culture
Denuding micropipette 150 µm Microtech IVF 005-150C
Denuding micropipette 180 µm Microtech IVF 005-180B suitable for oocyte transfer between dishes
Denuding micropipette 200 µm Microtech IVF 005-250-A suitable for oocyte transfer between dishes
FluoroDish World Precision Instruments FD 5040-100 glass-bottom dish
(alternative: WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells)
Holding micropipette Microtech 001-120-30 sterile glass microneedles
Hyaluronidase solution Irvine Scientific 90101 for oocyte denudation
ICSI micropipette Microtech 002-5-30 sterile glass microneedles
Micro Droplet Culture Dish Vitrolife 16003 12-well plate for embryo culture
Multipurpose Handling Medium (MHM) with Gentamicin Irvine Scientific 90163 handling medium, MOPS/HEPES buffered
Nikon Eclipse TE 2000-U Nikon inverted microscope with heated stage
Nunc IVF Petri Dish, 60 mm Thermo Fisher Scientific 150270 plastic ICSI dish
Nunc non-treated 4-well IVF dish Thermo Fisher Scientific 179830 4-well plate for embryo culture
OCTAX polarAide MTG integrated PLM system
Oil for embryo culture Irvine Scientific 9305 oil for overlay
Polyvinylpyrrolidone Irvine Scientific 90123 for sperm immobilization prior to ICSI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Holubcova, Z., Blayney, M., Elder, K., Schuh, M. Human oocytes. Error-prone chromosome-mediated spindle assembly favors chromosome segregation defects in human oocytes. Science. 348, (6239), 1143-1147 (2015).
  2. Oudendijk, J. F., Yarde, F., Eijkemans, M. J., Broekmans, F. J., Broer, S. L. The poor responder in IVF: is the prognosis always poor?: a systematic review. Human Reproduction Update. 18, (1), 1-11 (2012).
  3. Gautam, N., Allahbadia, Y. M. Ovarian Stimulation Protocols. Springer. India, Mumbai, India. (2016).
  4. Piqueras, P., et al. Live birth after replacement of an embryo obtained from a spontaneously in vitro matured metaphase-I oocyte. Systems Biology in Reproductive Medicine. 63, (3), 209-211 (2017).
  5. Liu, J., Lu, G., Qian, Y., Mao, Y., Ding, W. Pregnancies and births achieved from in vitro matured oocytes retrieved from poor responders undergoing stimulation in in vitro fertilization cycles. Fertility and Sterility. 80, (2), 447-449 (2003).
  6. Shu, Y., et al. Fertilization, embryo development, and clinical outcome of immature oocytes from stimulated intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertility and Sterility. 87, (5), 1022-1027 (2007).
  7. Sachdev, N. M., Grifo, J. A., Licciardi, F. Delayed intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with trophectoderm biopsy and preimplantation genetic screening (PGS) show increased aneuploidy rates but can lead to live births with single thawed euploid embryo transfer (STEET). Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33, (11), 1501-1505 (2016).
  8. De Vos, A., Van de Velde, H., Joris, H., Van Steirteghem, A. In-vitro matured metaphase-I oocytes have a lower fertilization rate but similar embryo quality as mature metaphase-II oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 14, (7), 1859-1863 (1999).
  9. Holubcova, Z., et al. Egg maturity assessment prior to ICSI prevents premature fertilization of late-maturing oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 36, (3), 445-452 (2019).
  10. Montag, M., Schimming, T., van der Ven, H. Spindle imaging in human oocytes: the impact of the meiotic cell cycle. Reproductive BioMedicine Online. 12, (4), 442-446 (2006).
  11. Montag, M., van der Ven, H. Symposium: innovative techniques in human embryo viability assessment. Oocyte assessment and embryo viability prediction: birefringence imaging. Reproductive BioMedicine Online. 17, (4), 454-460 (2008).
  12. Keefe, D., Liu, L., Wang, W., Silva, C. Imaging meiotic spindles by polarization light microscopy: principles and applications to IVF. Reproductive BioMedicine Online. 7, (1), 24-29 (2003).
  13. Caamano, J. N., Munoz, M., Diez, C., Gomez, E. Polarized light microscopy in mammalian oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 45, 49-56 (2010).
  14. Eichenlaub-Ritter, U., Shen, Y., Tinneberg, H. R. Manipulation of the oocyte: possible damage to the spindle apparatus. Reproductive BioMedicine Online. 5, (2), 117-124 (2002).
  15. Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. The spindle observation and its relationship with fertilization after intracytoplasmic sperm injection in living human oocytes. Fertility and Sterility. 75, (2), 348-353 (2001).
  16. Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Keefe, D. L. Developmental ability of human oocytes with or without birefringent spindles imaged by Polscope before insemination. Human Reproduction. 16, (7), 1464-1468 (2001).
  17. Moon, J. H., et al. Visualization of the metaphase II meiotic spindle in living human oocytes using the Polscope enables the prediction of embryonic developmental competence after ICSI. Human Reproduction. 18, (4), 817-820 (2003).
  18. Cohen, Y., et al. Spindle imaging: a new marker for optimal timing of ICSI? Human Reproduction. 19, (3), 649-654 (2004).
  19. Rama Raju, G. A., Prakash, G. J., Krishna, K. M., Madan, K. Meiotic spindle and zona pellucida characteristics as predictors of embryonic development: a preliminary study using PolScope imaging. Reproductive BioMedicine Online. 14, (2), 166-174 (2007).
  20. Heindryckx, B., De Gheselle, S., Lierman, S., Gerris, J., De Sutter, P. Efficiency of polarized microscopy as a predictive tool for human oocyte quality. Human Reproduction. 26, (3), 535-544 (2011).
  21. Kilani, S., Cooke, S., Tilia, L., Chapman, M. Does meiotic spindle normality predict improved blastocyst development, implantation and live birth rates? Fertility and Sterility. 96, (2), 389-393 (2011).
  22. Kilani, S., Chapman, M. G. Meiotic spindle normality predicts live birth in patients with recurrent in vitro fertilization failure. Fertility and Sterility. 101, (2), 403-406 (2014).
  23. Tilia, L., Venetis, C., Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Is oocyte meiotic spindle morphology associated with embryo ploidy? A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 105, (4), 1085-1092 (2016).
  24. ESHRE Guideline Group on Good Practice in IVF Labs, De los Santos, M. J., et al. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). Human Reproduction. 31, (4), 685-686 (2016).
  25. Principles of IVF Laboratory Practice: Optimizing Performance and Outcomes. Montag, M., Morbeck, D. Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2017).
  26. Chamayou, S., et al. Meiotic spindle presence and oocyte morphology do not predict clinical ICSI outcomes: a study of 967 transferred embryos. Reproductive BioMedicine Online. 13, (5), 661-667 (2006).
  27. Rienzi, L., et al. Relationship between meiotic spindle location with regard to the polar body position and oocyte developmental potential after ICSI. Human Reproduction. 18, (6), 1289-1293 (2003).
  28. Woodward, B. J., Montgomery, S. J., Hartshorne, G. M., Campbell, K. H., Kennedy, R. Spindle position assessment prior to ICSI does not benefit fertilization or early embryo quality. Reproductive BioMedicine Online. 16, (2), 232-238 (2008).
  29. Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Time course of meiotic spindle development in MII oocytes. Zygote. 19, (1), 55-62 (2011).
  30. Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. Limited recovery of meiotic spindles in living human oocytes after cooling-rewarming observed using polarized light microscopy. Human Reproduction. 16, (11), 2374-2378 (2001).
  31. Sun, X. F., Wang, W. H., Keefe, D. L. Overheating is detrimental to meiotic spindles within in vitro matured human oocytes. Zygote. 12, (1), 65-70 (2004).
  32. Mullen, S. F., et al. The effect of osmotic stress on the metaphase II spindle of human oocytes, and the relevance to cryopreservation. Human Reproduction. 19, (5), 1148-1154 (2004).
  33. Swearman, H., et al. pH: the silent variable significantly impacting meiotic spindle assembly in mouse oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 37, (3), 279-290 (2018).
  34. Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human Reproduction Update. 17, (1), 34-45 (2011).
  35. Miao, Y. L., Kikuchi, K., Sun, Q. Y., Schatten, H. Oocyte aging: cellular and molecular changes, developmental potential and reversal possibility. Human Reproduction Update. 15, (5), 573-585 (2009).
  36. Pujol, A., Garcia, D., Obradors, A., Rodriguez, A., Vassena, R. Is there a relation between the time to ICSI and the reproductive outcomes? Human Reproduction. 33, (5), 797-806 (2018).
  37. Yanagida, K., et al. Influence of oocyte preincubation time on fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13, (8), 2223-2226 (1998).
تقييم نضج البويضة البشرية وتطبيقها السريري
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Holubcová, Z., Kyjovská, D., Martonová, M., Páralová, D., Klenková, T., Kloudová, S. Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application. J. Vis. Exp. (150), e60058, doi:10.3791/60058 (2019).More

Holubcová, Z., Kyjovská, D., Martonová, M., Páralová, D., Klenková, T., Kloudová, S. Human Egg Maturity Assessment and Its Clinical Application. J. Vis. Exp. (150), e60058, doi:10.3791/60058 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter