Summary
We bieden een overzicht van het klinische protocol voor niet-invasieve beoordeling van menselijke Eier volwassenheid met behulp van gepolariseerd Lichtmicroscopie.
Abstract
De optimale timing van intracytoplasmorische sperma injectie (ICSI) is een ernstige zorg voor vruchtbaarheids Programma's omdat vroegtijdige sperma invoer de ontwikkelings competentie van het ei vermindert. De aanwezigheid van het eerste polaire lichaam (PB) samen met de Meiotische spil geeft aan dat de eicel rijping is voltooid en de gereedheid van het ei voor bevruchting. In de klinische praktijk is het gebruikelijk om aan te nemen dat alle eicellen die een PB weergeven volwassen metafase (MII) eicellen zijn. De extrusie van PB gaat echter vooraf aan de vorming van de bipolaire MII-spindel. Deze asynfonie maakt de loutere aanwezigheid van PB een onbetrouwbare marker van oöcyt volwassenheid. Niet-invasieve spil beeldvorming met behulp van gepolariseerde Lichtmicroscopie (PLM) maakt een snelle en eenvoudige inspectie mogelijk van de vraag of de PB-weergave van de eicel daadwerkelijk een Meiotische spil voor ICSI opnieuw geassembleerd. Hier presenteren we een standaardprotocol om de menselijke eicel maturiteits beoordeling in het klinisch laboratorium uit te voeren. We laten ook zien hoe de tijd van ICSI met betrekking tot de ontwikkelingsfase van de eicel te optimaliseren om te voorkomen dat vroegtijdige sperma injectie van laat vervallende eicellen. Met deze benadering kunnen zelfs onrijpe eicellen die PB in vitro extruderen, klinisch worden gebruikt. Bevestiging dat MII-spindel aanwezig is voorafgaand aan sperma injectie en individuele aanpassing van de tijd van ICSI is vooral belangrijk bij slechte prognose in-vitro fertilisatie (IVF)-cycli met een laag aantal beschikbare eicellen voor bevruchting.
Introduction
Om een vruchtbaar haploïde ei te worden, moet de diploïde eicel de helft van zijn genetische informatie in een aangrenzende cel extruseren, het eerste polaire lichaam (PB) genoemd, en chromosomen uitlijnen in de evenaar van de bipolaire metafase II (MII) spil. Hoewel PB duidelijk kan worden waargenomen door conventionele Lichtmicroscopie, vereist detectie van genetisch materiaal en cytoskelet structuren doorgaans invasieve voorbereidende procedures die onverenigbaar zijn met het verdere gebruik van de eicel voor vruchtbaarheidsbehandeling. Vandaar, in de klinische praktijk, de aanwezigheid van de PB wordt beschouwd als een kenmerk van oöcyt volwassenheid. Echter, Live beeldvorming van microtubulus en chromosoom dynamiek tijdens humane eicel rijping onthulde dat PB een paar uur zichtbaar wordt voordat bipolaire MII-spindel wordt geassembleerd en chromosomen worden uitgelijnd1. Niettemin, in het uitgezonden licht, de MII gearresteerd eieren zijn niet te onderscheiden van de eicellen die net het proces van chromosoomsegregatie ingevoerd. Zo, een cohort van eicellen, geclassificeerd als MII eicellen alleen op basis van de PB aanwezigheid, kan latematuring eicellen die nog niet voltooid hun ontwikkeling en dus zijn niet klaar voor bevruchting bevatten.
De vertraging van de rijping van de eicel is waarschijnlijk van invloed op de populatie van arme responders met een laag aantal MII-eicellen en een hoog percentage onrijpe eicellen die onverwacht worden verzameld in gestimuleerde cycli2. In vivo bereikt slechts één enkel, beste kwaliteit ei rijpheid en wordt ovulated. In in-vitro fertilisatie (IVF) cycli wordt gecontroleerde ovariële hyperstimulatie gebruikt om meerdere eicellen te rekruteren voor rijping. Gonadotropine Surge activeert een hervatting van de Meiotische programma en ei voor ouders worden verondersteld om de MII arrestatie stadium te bereiken binnen 36 uur3. Echter, eicellen uit de preovulatoire follikels vormen vaak een assortiment van pbmii-eicellen en onrijpe eicellen, hetzij bij metafase I (MI) of Germinal blaasje stage (gv) (Figuur 1). Alleen MII-eicellen worden onderworpen aan intracytoplasmorische sperma injectie (ICSI) terwijl onrijpe eicellen meestal worden weggegooid. Maar, wanneer gekweekt in vitro, MI eicellen worden vaak waargenomen om te extruderen PB in vitro. Ondanks hun algemene inferioriteit, late rijping eicellen die spontaan voltooide de eerste Meiotische divisie tijdens de nachtelijke cultuur zijn met succes gebruikt als laatste resource eicellen, en levende geboorten zijn gemeld4,5 ,6,7,8. Vandaar dat de vroegtijdige injectie van het sperma een primaire oorzaak kan zijn van slechte ontwikkelingsresultaten van late rijping van de eicellen in eerdere onderzoeken9,10,11.
Gepolariseerde Lichtmicroscopie (PLM) in combinatie met een beeldverwerkingssoftware maakt een niet-invasieve visualisatie van de Meiotische spil in de levende eicel mogelijk. De dubbele reflectie wordt gegenereerd door de interactie van gepolariseerde lichtstraal met de zeer geordende assemblage van microtubuli die de bipolaire spil bouwen. Omdat het gepolariseerde licht van normale intensiteit is, kan de techniek veilig worden gebruikt in klinische instellingen om de dynamiek van het divisie apparaat te bekijken11,12,13,14. De aanwezigheid van de Mii-spindel dubbele breking binnen de eicel is geïdentificeerd als een marker van de ontwikkelings competentie van een ei9,15,16,17,18, 19,20,21,22,23. Er is dus gesuggereerd dat niet-invasieve Meiotische spil beeldvorming kan worden gebruikt voor de kwaliteitscontrole van eieren in de klinische praktijk11,14,20.
Aangezien de tijdlijn voor de microtubulaire dynamiek tijdens oöcyt meiose is opgelost1, kan het waargenomen PLM-patroon beter gerelateerd zijn aan de tijdsduur van Mi naar Mii-overgang. Kort na de emissie van PB wordt de ontluikende MII-spil door de PLM ondetecteerbaar. Echter, als de eicellen in de cultuur worden gehouden, het dubbele breking signaal kan later ontstaan wanneer de bipolaire Mii spindel herassembleert9,10,11. Dus, in eicellen die een PB in vitro extruderen, kan de afwezigheid van de spil slechts tijdelijk zijn overeenkomend met de fysiologische overgang van de laat-rijpende eicel van MI naar MII. Als het MII-spindel signaal niet detecteerbaar is, kan sperma injectie worden uitgesteld tot een later tijdstip dat extra tijd biedt voor de vorming van de MII-spindel. PLM-aided Optimization van ICSI-tijd maximaliseert de kans op late rijping van eicellen om klinisch te worden gebruikt en maakt het verschil voor arme prognose patiënten9.
Hieronder bieden we een stap-voor-stap protocol voor het uitvoeren van niet-invasieve spil beeldvorming in menselijke eicellen. We laten ook zien hoe PLM kan worden gebruikt om het risico op vroegtijdige bevruchting van late rijping van eicellen te voorkomen.
Protocol
Dit protocol beschrijft de klinische procedure die een ' add-on ' is voor de standaard IVF-behandeling. Het moet worden uitgevoerd door ervaren personeel in overeenstemming met goede laboratoriumpraktijken en klinische richtlijnen24,25. Het verdient aanbeveling om schriftelijke geïnformeerde toestemming van de in aanmerking komende patiënten te verkrijgen. Dit protocol is goedgekeurd door het institutioneel Comité voor ethische zaken.
1. eiophaling en denudatie
- Induceren van ovariële stimulatie met conventionele stimulatie protocollen3. Pas de dosis aan op individuele respons. Wanneer twee of meer follikels, gevisualiseerd door ultrasone scan, een diameter van 18 mm bereiken, induceren van eicel rijping met toepassing van 250 μg humaan choriongonadotrofine (hCG). Plan oöcyt pick-up (OPU) bij 35 − 36 h post hCG injectie.
- Verzamel opgehaalde Cumulus-eicel complexen (Coc's) in CO2-onafhankelijk handling medium (tabel met materialen). Na een korte incubatieperiode (10 − 15 min) in een CO2-onafhankelijke incubator, worden in het kort (tot 30 s) verzamelde coc's blootgesteld aan hyaluronidase oplossing (tabel met materialen). Verwijder onder een stereomicroscoop de Cumulus-Corona cellen mechanisch door het zachtjes pipetteren van de COCs met een 200 μL filtertip.
- Gebruik denudation micropipetten met een geleidelijk afnemende diameter (200 μm, 180 μm en 150 μm), verwijder de eicellen voorzichtig van de overgebleven folliculaire cellen en was de eicellen 3x in het behandelingsmedium.
- Evalueer het aantal en de ontwikkelings status van de gedenudeerde eicellen volgens de aanwezigheid of afwezigheid van de Nucleus en de eerste PB (Figuur 1).
- Controleer de Inclusiecriteria voor het PLM-onderzoek. Voer een eimaturiteits beoordeling uit als er (1) een onverwachte slechte respons is op conventionele stimulatie met minder dan 6 MII-eicellen die bij OPU zijn verzameld en (2) een voorgeschiedenis van eerdere bemesting falen of onvolwassenheid van de eicel.
- Plaats GV, MI en MII eicellen in afzonderlijke putjes in een IVF-schotel, elk met 500 μL preequilibrated CO2-afhankelijke kweekmedium (inhoudstafel) bedekt met minerale olie (tabel met materialen).
- Inincuberen voor een extra 3 − 4 h bij 37 °C in een bevoficeerde atmosfeer van 5% O2 en 6% co2.
2. VOORbereiding voor PLM-onderzoek en daaropvolgende ICSI
Opmerking: het protocol dat hier wordt beschreven, beschrijft de PLM-beoordeling die wordt uitgevoerd met het OCTAX Polar AIDE-systeem (tabel met materialen). Ook kunnen andere in de handel verkrijgbare spil weergavesystemen worden gebruikt.
- Bereid de platen voor de embryo teelt.
- Afhankelijk van het aantal te onderzoeken eicellen (totaal van MII-eicellen en MI-eicellen die een PB extruderen tijdens de preincubatie periode), een 4-put plaat of een 12-well plaat bereiden, elk goed vullen met respectievelijk 500 μL of 30 μL kweekmedium en bedekken met eerder geëscaleerde minerale olie.
- Zorg dat zowel kweekmedium als minerale olie 's nachts in de CO2 -incubator zijn geëscaleerd. Bewaar de bereide schaal in de CO2-afhankelijke incubator gedurende ten minste 2 uur. de putten indien nodig om het ontwikkelings lot van individuele eicellen bij te houden.
- Bereid het ICSI-gerecht voor.
- Gebruik toegewezen plastic schaaltje en maak 5 μL druppeltjes van voorverwarmde behandelingsmedium voor elke PB-weergave van de eicel en een extra druppel voor het wassen van de naald. Maak een extra druppel Polyvinylpyrrolidon (PvP)-oplossing (tabel met materialen) voor sperma immobilisatie voorafgaand aan ICSI (Voeg sperma net voor ICSI toe) en overlay met voorverwarmde minerale olie.
- Houd het bereide ICSI-gerecht in de CO2-onafhankelijke incubator gedurende ten minste 20 min. nummer de putten indien nodig om de eicellen na ICSI te volgen.
- Bereid de PLM-examen schotel voor.
- Gebruik toegewezen glazen bodem schotel en maak 5 μL druppeltjes van voorverwarmde behandelingsmedium voor elke PB-weergave van de eicel. Overlay met voorverwarmde minerale olie.
- Bewaar het gerecht in de CO2-onafhankelijke incubator gedurende ten minste 20 min. de druppeltjes indien nodig om de eicellen na het PLM-onderzoek te volgen.
- Stel de Microscoop klaar voor PLM-onderzoek.
- Zet het verwarmde podium op de omgekeerde Microscoop goed op voorhand om de juiste temperatuur te bereiken. Zorg ervoor dat de instellingen nauwkeurig zijn afgesteld om 37 °C te behouden bij het hanteren van medium druppeltjes in de PLM/ICSI-schaal tijdens Micro manipulatie procedures.
- Plaats het steriele bedrijf en de ICSI-naald in de microinjectiehouders en breng ze scherp. U ook een broed naald gebruiken.
- Selecteer de juiste doelstelling (20x en 25x zijn het meest geschikt) en zorg ervoor dat de condensor in heldere veld positie staat.
- Voeg een groen storings filter in (het lampje wordt groen) en stel de schuifregelaar Liquid Crystal Analysis in op de werkpositie.
- Stel de sluiter in op ~ 50% en pas de circulaire polarisator aan om achtergrondruis te verkleinen.
- Stel de computer klaar voor PLM-onderzoek.
- Start de imaging software.
- Selecteer video | Video bron | polarAIDE in het video menu in de bovenste menubalk.
- Schakel over naar LiveVideo door naar de video pagina te gaan en spindel en Zona Analysis te activeren door op het pictogram (aanvullende figuur 1) in de video werkbalk te klikken.
- Selecteer weergavemodus voor dynamisch schalen tijdens spil Imaging: (1) rood (Birefringence)/groen (achtergrond) gecombineerde weergave, of (2) wit (Birefringence)/en zwart (achtergrond) weergave. De dynamische Score modus wordt gebruikt voor het automatisch scoren van zona pellucida.
3. onderzoek van de Eier volwassenheid
- Voer na de preincubatie periode (3 − 4 h) een PLM-onderzoek uit met de status van eicel volwassenheid op de standaardtijd van ICSI (39 − 40 uur na hCG-trigger).
- Breng alle eicellen over in afzonderlijke druppels op de PLM-schaal en plaats deze onder de omgekeerde Microscoop, voorbereid voor spil beeldvorming. Vergeet niet om het plastic deksel uit de glazen bodem schotel te verwijderen voordat u met het onderzoek begint.
- Breng de eerste oöcyt in scherp. Als het moeilijk is om naar de cel onder groen licht te zoeken, trekt u het groene filter tijdelijk uit. Zorg ervoor dat het groene filter vóór de analyse wordt ingevoegd.
- Let op de gedetecteerde oöcyt dubbele breking afbeelding (rood/oranje op groene achtergrond) omdat het computer-verwerkte en weergegeven in real time op het computerscherm. Onthoud dat het signaal niet zichtbaar is in het oculair.
- Als het bericht waarin de belichting wordt aangekondigd te laag/hoog is, stelt u de helderheid in op de juiste intensiteit met behulp van de lichtintensiteit knop van de Microscoop.
- Gebruik een bedrijf en een ICSI-naald om de eicel te draaien, zodat de PB zich op de 12-uurs positie bevindt en zich op de PB bevindt.
- Als de spindel dubbele breking niet zichtbaar is op het eerste gezicht in de nabijheid van PB, draai de eicel rond elke as zachtjes door de zona pellucida lichtjes aan te raken om de uitlijning van het gepolariseerde licht te verzekeren met de array spindel vezels (aanvullende video ). Declareer de afwezigheid van de MII-spil zolang de eicel niet het spil signaal laat zien ondanks strenge rotatie.
- Op basis van het waargenomen birefringentie patroon, classificeer de eicellen in de volgende categorieën (Figuur 2): (A) eicellen met helder signaal van bipolaire TONVORMIGE Mii spil met duidelijk afgebakende grenzen en gelijkmatige verdeling van birefringentie ; B) eicellen met dysmorfe, apolaire en doorschijnende MII-spindel met onregelmatige grenzen en ongelijke verdeling van het signaal; C) eicellen zonder detecteerbare MII-spindel-birefringentie in ooplasma; D) anafase i/telophase i oöcyten, met een microtubulaire brug (een verbindende streng tussen eerste PB en de eicel) in plaats van mii-spindel.
Opmerking: oöcyt met detecteerbaar MII spindel signaal (klasse A of B) zijn geschikt voor directe ICSI. - Maak een momentopname (F9) of neem een video op voor een rapport en/of een latere analyse van de afbeelding. Houd documentatie van het afbeeldings patroon om subjectiviteit van de operator te verminderen.
- Ga naar de positie van een volgende eicel en herhaal stap 3.6 − 3.9.
4. het optimaliseren van ICSI timing
- Breng alle spil-positieve eicellen (klasse A of B, stap 3,8) over in het ICSI-gerecht en onderwerleer ze aan ICSI volgens de standaardprotocollen24,25.
- Als de eicellen geen detecteerbaar MII-spindel signaal vertonen, plaatst u de PLM-schaal in de CO2-onafhankelijke incubator en verschuift u de ICSI naar een later tijdstip.
- Voer PLM-heronderzoek uit ~ 2 − 3 uur later volgende stappen 3.3 − 3.9. Als sommige eicel (s) nog steeds een MII-spindel missen, verdere vertraging ICSI voor extra 1 − 2 h.
- Breng alle eicellen over in het ICSI-gerecht en Injecteer ze volgens de standaardprotocollen24. Als de PLM-schotel compatibel is met de buighoek van de microinjectienaald, voert u ICSI onmiddellijk uit in de PLM-schaal na het overschakelen naar een heldere veld modus.
- Op ICSI, overdracht van eicellen naar bereide platen voor embryo teelt en cultuur tot de blastocyst stadium.
Representative Results
Gepolariseerde Lichtmicroscopie maakt het mogelijk om direct te inspecteren of de eicel is voltooid nucleaire rijping en geassembleerde MII spindel voorafgaand aan ICSI. Door zijn niet-invasieve karakter kan het worden gebruikt om de gereedheid van het menselijk ei voor bevruchting in klinische instellingen11,12,13,14veilig te beoordelen. Spindled-eicellen geven eerder aanleiding tot levensvatbare embryo's dan oöcyten zonder spindel9,15,16,17,18,19, 20 , 21 , 22 , 23. ook lijken eicellen met een afzonderlijke bipolaire spil een hogere ontwikkelings competentie te hebben dan eicellen met dysmorfe spindels9,21,22. Samen genomen, kan spindel Imaging dienen als een hulpmiddel om de eicellen te identificeren met het grootste potentieel om succesvol te worden bevruchte, de ontwikkeling van preimplantatie te ondergaan en de zwangerschap op de volledige termijn te ondersteunen9,15, 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23.
De gerapporteerde incidentie van de spil varieert (44 − 97%) een afspiegeling van de diversiteit van de bestudeerde populatie9,15,16,17,18,19,20,21, 22 , 23 , 26 , 27 , 28. in vivo gerijpte eicellen van normale responders vertonen meestal bipolaire Mii spindel op 40 h na HCGtrigger 9,18,27,29. Echter, in trage responders, de pool van eicellen opgehaald uit de preovulatory follikels wordt beïnvloed door maturatie vertraging9,27. Hier moet spil beeldvorming worden uitgevoerd om de in het MII-stadium aangehouden eicellen te discrimineren van degenen die een belangrijke looptijden overgang ondergaan (Figuur 3). We raden het verwijderen van folliculaire cellen onmiddellijk na het ophalen, en de incubatie van MI en MII eicellen in afzonderlijke putjes te kunnen onderscheiden van de in vivo gerijpte eicellen en laat vervallende oöcyten extruderen PB in vitro, kort voor ICSI. In het geval dat de denudatie net voor ICSI wordt uitgevoerd, zijn deze twee populaties van eicellen niet te onderscheiden op basis van het uiterlijk van het PB.
De fase-specifieke veranderingen van het PLM-patroon moeten worden geïnterpreteerd in de context van de kennis van de spil dynamiek tijdens de Meiotische rijping. Tijdens de interkinesis, divisie apparatuur ondergaat uitgebreide structurele reorganisatie en PLM signaal tijdelijk verdwijnt1,9,10,11. Dus, in ontwikkelmentaal vertraagde eicellen die PB in vitro extruderen, kan de afwezigheid van het MII-spil signaal niet noodzakelijkerwijs cellulaire verstoring weergeven, maar het kan de progressie van de eicel van MI naar MII-stadium aangeven (Figuur 3). Als het sperma wordt geïnjecteerd op een onfysiologische tijdpunt, het ontwikkelingspotentieel van de Egg is aangetast. Uitstellen van ICSI biedt laat vervallende eicellen met meer tijd om een Mii-spil te monteren waarvan de aanwezigheid geassocieerd is met betere klinische resultaten9,10,11. In de klinische studie waarbij trage/slechte responders betrokken waren, ontwikkelde bijna 60% van de aanvankelijk spindel-negatieve eicellen het spindel signaal vóór de PLM-heronderzoek ongeveer 2 uur later9. Afhankelijk van de ontwikkelingsfase en de algehele geschiktheid van laat-vervallende oöcyten, neemt de MII-spil verschijning na PB-extrusie meestal 2 − 6 h (ongepubliceerde observatie). De eicellen die een microtubulusbrug vertonen (anafhase/telophase, graad D) tijdens het eerste PLM-onderzoek vereisen een langere tijd om het MII-spindel signaal te ontwikkelen dan oöcyten zonder zichtbare spil (opkomende spindels, Grade C). Individuele aanpassing van de tijd van ICSI aan de ontwikkelingsfase van de Egg voorkomt vroegtijdige activering van de eicel en resulteert in een verbeterde bevruchting en een succesvolle embryo ontwikkeling9.
Hoewel laat-vervallende oöcyten die PB in vitro extruderen over het algemeen een lagere ontwikkelings competentie hebben dan in vivo gerijpte eicellen, is de embryonale ontwikkeling aanvaardbaar als ze erin slagen een detecteerbare spil te monteren voorafgaand aan vertraagde ICSI (blastulatie percentage van 41,32%)9. Met deze benadering kunnen zelfs onrijpe eicellen, die normaliter worden afgekeurd voor vruchtbaarheidsbehandeling, klinisch worden gebruikt, overdraagbare embryo's produceren en aanleiding geven tot zwangerschappen op de volledige termijn. Evaluatie van de maturatie fase van elke individuele eicel is vooral gunstig bij slechte prognose cycli die een klein aantal MII-eicellen opleveren en/of na het uitvoeren van een redding in vitro rijping van onrijpe eicellen9.
Naast de beoordeling van de eimaturiteit, wordt spindel beeldvorming ook aanbevolen vóór PB biopsie om spindel vernietiging in anafase I/telophase eicellen te voorkomen. In experimentele embryologie wordt visualisatie van de Meiotische spil gebruikt tijdens de Eier-enucleatie en/of spindel overdracht procedure13.
Figuur 1: humane eicel rijping. In vivo de gerijpte eicellen (MII) vertonen PB op het moment van opvraging. Onrijpe eicellen (GV, MI) kunnen de rijping in vitro spontaan voltooien. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: oöcyten classificatie op basis van door de PLM gedetecteerd patroon. Representatieve voorbeelden van oöcyten soorten (A-D) op basis van het uiterlijk van het spil signaal. PLM-gedetecteerd patroon: (a) prominent signaal van bipolaire spindel, (B) DOORSCHIJNEND apolaire Mii spindel spindel, (C) geen detecteerbare spil, en (D) microtubulus brug. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: stadia van Mi naar MII overgang in eicel rijping. Het verschijnen van eicellen in helderveld (bovenste rij), gecombineerd met een fluorescentie signaal van chromosomen (cyaan) en microtubuli (magenta) (middelste rij), en in gepolariseerd licht (onderste rij) wordt getoond. Elke eicel werd eerst met PLM onderzocht en onmiddellijk gerepareerd. Vaste eicellen waren (immuno) gelabeld met Hoechst (DNA) en anti-α-tubulin antilichamen (microtubuli). De gele pijl geeft de aanwezigheid van PB aan en de witte pijl markeert de positie van birefringent microtubuli. Schaalbalk = 20 μm. Dit cijfer is gewijzigd van Holubcová et al., JARG 20199. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: correlatie van de organisatie van chromosoom-microtubulus met dubbele breking patroon gedetecteerd door gepolariseerd Lichtmicroscopie. De verschijning van eicellen in het heldere veld gecombineerd met een fluorescerende signaal voor chromosomen (cyaan) en microtubuli (magenta) (bovenste rij), en in gepolariseerd licht (onderste rij) wordt getoond. Elke eicel werd onmiddellijk na het PLM-onderzoek vastgesteld. DNA (Hoechst) en microtubulus (α-tubulin) werden bevlekt. (A-C) eicellen met PLM-detecteerbare spindel en toch verkeerd uitgelijnde chromosomen (a, B) of losjes gerichte spil palen (C); (D-F) abnormale eicellen zonder PLM-detecteerbare Mii-spindel met onderontwikkeld (D), apolaire (E) of geen spil (F). De witte pijl markeert de positie van birefringent microtubuli en een sterretje (*) geeft de positie van het gedegecondenseerde Chromatin aan. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 5: Birefringentie structuren in menselijke eicellen. Representatieve voorbeelden van (a-D) birefringent structuren gedetecteerd door PLM in menselijke eicellen. ZP = zona pellucida; PM = plasma membraan (oolema); RB = refractiel lichamen, vacuolen. Witte pijl, Meiotische spil in verschillende stadia van rijping. (E) Mii spindel afwijking met Polar Body (PB). F) loslating van de spil van het plasma membraan. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Aanvullend figuur 1: bureaubladindeling van de beeldanalyse software. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende video: PLM-examenprocedure. Rotatie van de eicel is vereist om de aanwezigheid van de spil (pijl) uit te sluiten. Schaalbalk = 20 μm. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
De acentrosomale Meiotische spil in menselijke eicellen is zeer dynamisch en een delicate structuur1. Onder suboptimale omstandigheden, de microtubulus vezels snel cellulose en Meiotische spil disassembleert30,31,32,33. Daarom is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de oöcyt cultuur en Micro manipulatie condities, namelijk temperatuur en pH, in het optimale bereik liggen. Om het risico van verstoring van de spil te minimaliseren, moeten de eicellen in een temperatuurgecontroleerde omgeving worden gehouden met behoud van 37 ± 0,5 °C in de eicel media. Gebruik van microscopen en Microinjection Setup uitgerust met een verwarmde podium is strikt noodzakelijk. Alle manipulatie met eicellen buiten de incubator moet worden uitgevoerd in HEPES/MOPS gebufferde media om pH-fluctulaties te voorkomen. Om mogelijke nadelige effecten van overmatige eicel overdracht in de omgevings toestand te voorkomen, mag de totale tijd van het PLM-onderzoek niet meer dan 10 minuten bedragen. De eicellen moeten worden geanalyseerd op de glazen bodem schotel met het plastic deksel verwijderd omdat positionering van een standaard plastic in het Beam Path de beeldanalyse schaadt. Omdat plastic en glasbodem gerechten verschillende thermische kenmerken hebben, moet de temperatuur direct in de druppeltjes van het behandelingsmedium in het examen gerecht worden gecontroleerd.
Naast laboratoriumomstandigheden kunnen procedurele verschillen en de Micro manipulatie vaardigheden van de operator een impact hebben op de nauwkeurigheid van het PLM-onderzoek. Alleen hooggemonteerde bipolaire spindels kunnen niet invasief worden gevisualiseerd. Waargenomen signaal is evenredig met de mate van structurele organisatie van de spil. Ontluikende, apolar, losgemaakt of onscherpe spindels tonen alleen wazig dubbele breking of helemaal geen (Figuur 3 en Figuur 4). Bovendien produceert onvolmaakte uitlijning van gepolariseerd licht met microtubulus arrays slechts een doorschijnende en slecht gedefinieerde birefringentie, ondanks de werkelijke aanwezigheid van een wellontwikkelde bipolaire spil (Figuur 4). Tenzij goed georiënteerd, het spindel signaal kan gemakkelijk worden gemist en oocyt volwassenheid verkeerd gediagnosticeerd (aanvullende video). Voor optimale spil beeldvorming moet de eicel op de juiste manier rond elke as worden gedraaid. Aangezien dubbele breking niet zichtbaar is in oculair, moet de bediener het computerscherm bekijken tijdens het uitvoeren van de rotatie van de eicel. Eerdere ervaring met Micro manipulatie en training van spil beeldvorming in overtollige in vitro gerijpte eicellen is wenselijk alvorens over te schakelen naar klinische toepassing.
Naast de spil, de Cumulus cellen rond de eicel, oolema, de binnenste laag van de zona pellucida en sommige cytoplasmische structuren (bijv. refractiellichamen, vacuolen) vertonen dubbele breking (figuur 5a-D). Tenzij grondig verwijderd uit de eicel vóór Imaging, strak bevestigde folliculaire cellen produceren achtergrondlawaai en compromitteren Meiotische spil detectie. Wees voorzichtig niet te verwarren een grote refractile lichaam voor de spil. Veel cytoplasmische insluitsels woonachtig in het cytoplasma display hoge helderheid die scherp contrasteert met de donkere achtergrond. Meiotische spil, aan de andere kant, vertonen alleen gematigd signaal, vage grenzen en meestal hecht aan de oolema onder of grenzend aan de eerste PB. Soms onthult het PLM-onderzoek een bruto spil afwijking van de standaardpositie (figuur 5e, F). Als er een grote afwijking is tussen de delings apparatuur en de PB, helpt PLM de eicel te oriënteren om het risico op spindel letsel tijdens de micro injectie te vermijden. De relatieve positie van de spil binnen de eicel lijkt niet van invloed te zijn op het ontwikkelingspotentieel van de resulterende embryo's17,34. Echter, wanneer de spindel pakken loskomt van de oolema, komen bevruchting afwijkingen voor. Interessant, sommige slechte kwaliteit eicellen ondergaan chromatine decondensatie onmiddellijk na PB extrusie in plaats van het starten van microtubulus nucleatie (figuur 4F). Met behulp van conventionele Lichtmicroscopie en de PB als enige marker van oöcyt volwassenheid, zouden dergelijke subcompetente eicellen als bemeseerbaar worden beschouwd. Dus bovenop de routine morfologische beoordeling voegt spindle Imaging belangrijke informatie toe over de volwassenheid van de Egg en kan het dienen als een indirecte marker van zijn kwaliteit.
De incidentie van de MII-eicellen met spindled zal waarschijnlijk worden beïnvloed door de kenmerken van de Studiepopulatie (bijv. genetische achtergrond, medische aandoening, leeftijd van de moeder). Bovendien zal het aandeel van ontwikkelmentaal vertraagde eicellen binnen de cohort het werkelijke aantal waargenomen spil-negatieve oöcyten9,27beïnvloeden. Meiotische spil visualisatie maakt het mogelijk om bemeseerbare eicellen duidelijk te identificeren die in het MII-stadium zijn gearresteerd. Bovendien kan de tweede inspectie op een later tijdstip onthullen of de spil-negatieve eicel abnormaal is of pas recentelijk is gevorderd via mi/Mii-overgang9,10,11. Wanneer toegestaan om een spindel voorafgaand aan ICSI ontwikkelen, zelfs onrijpe eicellen, die routinematig worden weggegooid, kunnen produceren levensvatbare embryo's9. In cycli met zeer weinig eicellen beschikbaar voor bevruchting, fijngetimede ICSI van eicellen extruderen PB kan dienen als een redding strategie en alternatief voor cyclus annulering.
Niettemin mag de verlenging van de preincubatie tijd niet worden veralgemeend tot alle eicellen. In vivo gerijpte eicellen van normale responders vertonen meestal een Mii-spindel9,20,21,27. Hier, de kans op succesvolle spil Imaging afneemt met de tijd als gevolg van post-ovulatory in vitro veroudering35. Indien mogelijk, ICSI moet worden uitgevoerd op de dag van de opvraging en mag niet meer dan 9 uur (45 uur na HCG), de periode geassocieerd met een afname van de resulterende embryo kwaliteit36,37. Oöcyten die afzonderlijke bipolaire spindels vertonen, moeten zonder verdere vertraging aan ICSI worden onderworpen. Samengevat, geïndividualiseerde optimalisatie van ICSI timing is de moeite waard bij patiënten met een slechte prognose om elk risico van vroegtijdige sperma injectie uit te sluiten. Het is echter onnodig, te tijdrovend en omslachtige om in alle IVF-cycli te worden uitgevoerd.
PLM-analyse onthult of de eicel het MII-stadium bereikte. Echter, niet-invasieve visualisatie van de Meiotische spil biedt geen informatie over chromosoom organisatie. Er kan ernstige chromosoomafwijking en/of leeftijdsgebonden chromatide splitsing in eicellen met een bipolaire spindel (Figuur 5) zijn. Verschillende andere factoren hebben een significant effect op het reproductie succes (bijv. sperma factor, mitochondriën, embryonale genoom activatie, onregelmatige decolleté, epigenetica, endometrium, maternale immuniteit). De detectie van de MII-spil per se garandeert daarom geen positief klinisch resultaat van de IVF-procedure.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen graag het embryo laboratorium van Reprofit International bedanken. We erkennen ook de kern faciliteit CELLIM van CEITEC, ondersteund door MEYS CR (LM2015062 Czech-Bioimaging), voor hun ondersteuning bij het verkrijgen van immunofluorescentie beeldvormings gegevens die hier worden gepresenteerd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Continuous Single Culture Complete with Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 90164 | bicarbonate based single-step culture medium for embryo culture |
| Denuding micropipette 150 µm | Microtech IVF | 005-150C | |
| Denuding micropipette 180 µm | Microtech IVF | 005-180B | suitable for oocyte transfer between dishes |
| Denuding micropipette 200 µm | Microtech IVF | 005-250-A | suitable for oocyte transfer between dishes |
| FluoroDish | World Precision Instruments | FD 5040-100 | glass-bottom dish |
| (alternative: WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells) | |||
| Holding micropipette | Microtech | 001-120-30 | sterile glass microneedles |
| Hyaluronidase solution | Irvine Scientific | 90101 | for oocyte denudation |
| ICSI micropipette | Microtech | 002-5-30 | sterile glass microneedles |
| Micro Droplet Culture Dish | Vitrolife | 16003 | 12-well plate for embryo culture |
| Multipurpose Handling Medium (MHM) with Gentamicin | Irvine Scientific | 90163 | handling medium, MOPS/HEPES buffered |
| Nikon Eclipse TE 2000-U | Nikon | inverted microscope with heated stage | |
| Nunc IVF Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 150270 | plastic ICSI dish |
| Nunc non-treated 4-well IVF dish | Thermo Fisher Scientific | 179830 | 4-well plate for embryo culture |
| OCTAX polarAide | MTG | integrated PLM system | |
| Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | oil for overlay |
| Polyvinylpyrrolidone | Irvine Scientific | 90123 | for sperm immobilization prior to ICSI |
References
- Holubcova, Z., Blayney, M., Elder, K., Schuh, M. Human oocytes. Error-prone chromosome-mediated spindle assembly favors chromosome segregation defects in human oocytes. Science. 348 (6239), 1143-1147 (2015).
- Oudendijk, J. F., Yarde, F., Eijkemans, M. J., Broekmans, F. J., Broer, S. L. The poor responder in IVF: is the prognosis always poor?: a systematic review. Human Reproduction Update. 18 (1), 1-11 (2012).
- Gautam, N., Allahbadia, Y. M. Ovarian Stimulation Protocols. , Springer. India, Mumbai, India. (2016).
- Piqueras, P., et al. Live birth after replacement of an embryo obtained from a spontaneously in vitro matured metaphase-I oocyte. Systems Biology in Reproductive Medicine. 63 (3), 209-211 (2017).
- Liu, J., Lu, G., Qian, Y., Mao, Y., Ding, W. Pregnancies and births achieved from in vitro matured oocytes retrieved from poor responders undergoing stimulation in in vitro fertilization cycles. Fertility and Sterility. 80 (2), 447-449 (2003).
- Shu, Y., et al. Fertilization, embryo development, and clinical outcome of immature oocytes from stimulated intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertility and Sterility. 87 (5), 1022-1027 (2007).
- Sachdev, N. M., Grifo, J. A., Licciardi, F. Delayed intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with trophectoderm biopsy and preimplantation genetic screening (PGS) show increased aneuploidy rates but can lead to live births with single thawed euploid embryo transfer (STEET). Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (11), 1501-1505 (2016).
- De Vos, A., Van de Velde, H., Joris, H., Van Steirteghem, A. In-vitro matured metaphase-I oocytes have a lower fertilization rate but similar embryo quality as mature metaphase-II oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 14 (7), 1859-1863 (1999).
- Holubcova, Z., et al. Egg maturity assessment prior to ICSI prevents premature fertilization of late-maturing oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 36 (3), 445-452 (2019).
- Montag, M., Schimming, T., van der Ven, H. Spindle imaging in human oocytes: the impact of the meiotic cell cycle. Reproductive BioMedicine Online. 12 (4), 442-446 (2006).
- Montag, M., van der Ven, H. Symposium: innovative techniques in human embryo viability assessment. Oocyte assessment and embryo viability prediction: birefringence imaging. Reproductive BioMedicine Online. 17 (4), 454-460 (2008).
- Keefe, D., Liu, L., Wang, W., Silva, C. Imaging meiotic spindles by polarization light microscopy: principles and applications to IVF. Reproductive BioMedicine Online. 7 (1), 24-29 (2003).
- Caamano, J. N., Munoz, M., Diez, C., Gomez, E. Polarized light microscopy in mammalian oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 45, 49-56 (2010).
- Eichenlaub-Ritter, U., Shen, Y., Tinneberg, H. R. Manipulation of the oocyte: possible damage to the spindle apparatus. Reproductive BioMedicine Online. 5 (2), 117-124 (2002).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. The spindle observation and its relationship with fertilization after intracytoplasmic sperm injection in living human oocytes. Fertility and Sterility. 75 (2), 348-353 (2001).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Keefe, D. L. Developmental ability of human oocytes with or without birefringent spindles imaged by Polscope before insemination. Human Reproduction. 16 (7), 1464-1468 (2001).
- Moon, J. H., et al. Visualization of the metaphase II meiotic spindle in living human oocytes using the Polscope enables the prediction of embryonic developmental competence after ICSI. Human Reproduction. 18 (4), 817-820 (2003).
- Cohen, Y., et al. Spindle imaging: a new marker for optimal timing of ICSI? Human Reproduction. 19 (3), 649-654 (2004).
- Rama Raju, G. A., Prakash, G. J., Krishna, K. M., Madan, K. Meiotic spindle and zona pellucida characteristics as predictors of embryonic development: a preliminary study using PolScope imaging. Reproductive BioMedicine Online. 14 (2), 166-174 (2007).
- Heindryckx, B., De Gheselle, S., Lierman, S., Gerris, J., De Sutter, P. Efficiency of polarized microscopy as a predictive tool for human oocyte quality. Human Reproduction. 26 (3), 535-544 (2011).
- Kilani, S., Cooke, S., Tilia, L., Chapman, M. Does meiotic spindle normality predict improved blastocyst development, implantation and live birth rates? Fertility and Sterility. 96 (2), 389-393 (2011).
- Kilani, S., Chapman, M. G. Meiotic spindle normality predicts live birth in patients with recurrent in vitro fertilization failure. Fertility and Sterility. 101 (2), 403-406 (2014).
- Tilia, L., Venetis, C., Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Is oocyte meiotic spindle morphology associated with embryo ploidy? A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 105 (4), 1085-1092 (2016).
- ESHRE Guideline Group on Good Practice in IVF Labs, De los Santos, M. J., et al. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). Human Reproduction. 31 (4), 685-686 (2016).
- Principles of IVF Laboratory Practice: Optimizing Performance and Outcomes. Montag, M., Morbeck, D. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2017).
- Chamayou, S., et al. Meiotic spindle presence and oocyte morphology do not predict clinical ICSI outcomes: a study of 967 transferred embryos. Reproductive BioMedicine Online. 13 (5), 661-667 (2006).
- Rienzi, L., et al. Relationship between meiotic spindle location with regard to the polar body position and oocyte developmental potential after ICSI. Human Reproduction. 18 (6), 1289-1293 (2003).
- Woodward, B. J., Montgomery, S. J., Hartshorne, G. M., Campbell, K. H., Kennedy, R. Spindle position assessment prior to ICSI does not benefit fertilization or early embryo quality. Reproductive BioMedicine Online. 16 (2), 232-238 (2008).
- Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Time course of meiotic spindle development in MII oocytes. Zygote. 19 (1), 55-62 (2011).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. Limited recovery of meiotic spindles in living human oocytes after cooling-rewarming observed using polarized light microscopy. Human Reproduction. 16 (11), 2374-2378 (2001).
- Sun, X. F., Wang, W. H., Keefe, D. L. Overheating is detrimental to meiotic spindles within in vitro matured human oocytes. Zygote. 12 (1), 65-70 (2004).
- Mullen, S. F., et al. The effect of osmotic stress on the metaphase II spindle of human oocytes, and the relevance to cryopreservation. Human Reproduction. 19 (5), 1148-1154 (2004).
- Swearman, H., et al. pH: the silent variable significantly impacting meiotic spindle assembly in mouse oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 37 (3), 279-290 (2018).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human Reproduction Update. 17 (1), 34-45 (2011).
- Miao, Y. L., Kikuchi, K., Sun, Q. Y., Schatten, H. Oocyte aging: cellular and molecular changes, developmental potential and reversal possibility. Human Reproduction Update. 15 (5), 573-585 (2009).
- Pujol, A., Garcia, D., Obradors, A., Rodriguez, A., Vassena, R. Is there a relation between the time to ICSI and the reproductive outcomes? Human Reproduction. 33 (5), 797-806 (2018).
- Yanagida, K., et al. Influence of oocyte preincubation time on fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (8), 2223-2226 (1998).
