Summary
Forniamo un profilo del protocollo clinico per la valutazione non invasiva della maturità dell'uovo umano utilizzando la microscopia a luce polarizzata.
Abstract
La tempistica ottimale dell'iniezione di spermatozoi intracitolati (ICSI) è di una seria preoccupazione per i programmi di fertilità perché l'ingresso intempestivo dello sperma diminuisce la competenza di sviluppo dell'uovo. La presenza del primo corpo polare (PB) insieme al mandrino meiotico indica il completamento della maturazione degli ovociti e la prontezza dell'uovo per la fecondazione. Nella pratica clinica, è consuetudine presumere che tutti gli ovociti che visualizzano un PB siano metafase matura (MII) ovociti. Tuttavia, l'estrusione PB precede la formazione del mandrino MII bipolare. Questa asincronia rende la semplice presenza di PB un marcatore inaffidabile di maturità degli ovociti. L'imaging non invasivo del mandrino mediante microscopia a luce polarizzata (PLM) consente di verificare in modo rapido e semplice se l'ovocita con visualizzazione PB ha effettivamente riassemblato un mandrino meiotico prima dell'ICSI. Qui, presentiamo un protocollo standard per eseguire la valutazione della maturità dell'uovo umano nel laboratorio clinico. Mostriamo anche come ottimizzare il tempo di ICSI rispetto allo stadio di sviluppo degli ovociti al fine di prevenire l'iniezione prematura di spermatozoi di ovociti a maturazione tardiva. Utilizzando questo approccio, anche gli ovociti immaturi che estrudano PB in vitro possono essere utilizzati clinicamente. L'affermazione che il mandrino MII è presente prima dell'iniezione di spermatozoi e la regolazione individuale del tempo dell'ICSI è particolarmente importante nei cicli di fecondazione in vitro (IVF) di prognosi in vitro con un basso numero di ovociti disponibili per la fecondazione.
Introduction
Per diventare un uovo aploide fecondabile, l'ovocita diploide deve estrusione della metà delle sue informazioni genetiche in una cellula adiacente, chiamata primo corpo polare (PB), e allineare i cromosomi nell'equatore del mandrino della metafase bipolare II (MII). Mentre il PB può essere chiaramente osservato dalla microscopia leggera convenzionale, il rilevamento di materiale genetico e strutture citoscheletriche richiede in genere procedure preparatorie invasive incompatibili con l'ulteriore uso dell'ovocita per il trattamento della fertilità. Quindi, nella pratica clinica, la presenza del PB è considerata un segno distintivo della maturità degli ovociti. Tuttavia, l'imaging live delle dinamiche dei microtubuli e dei cromosomi durante la maturazione degli ovociti umani ha rivelato che il PB diventa visibile un paio d'ore prima che il mandrino MII bipolare venga assemblato e che i cromosomi siano allineati1. Tuttavia, nella luce trasmessa, le uova arrestate del MII sono indistinguibili dagli ovociti che sono appena entrati nel processo di segregazione cromosomica. Pertanto, una coorte di ovociti, classificati come ovociti MII basati solo sulla presenza PB, potrebbe contenere ovociti a maturazione tardiva che non hanno ancora completato il loro sviluppo e quindi non sono pronti per la fecondazione.
Il ritardo della maturazione degli ovociti probabilmente colpirà la popolazione di poveri soccorritori con un basso numero di ovociti MII e un'alta percentuale di ovociti immaturi raccolti inaspettatamente nei cicli stimolati2. In vivo, solo un singolo uovo di migliore qualità raggiunge la maturità e diventa ovulato. Nei cicli di fecondazione in vitro (IVF), l'iperstimolazione ovarica controllata viene utilizzata per reclutare più ovociti per la maturazione. L'onda del Gonadotropin innesca una ripresa del programma meiotico e i progenitori delle uova dovrebbero raggiungere la fase di arresto del MII entro 36 ore3. Tuttavia, gli ovociti recuperati dai follicoli preovulatori spesso costituiscono un assortimento di PBdisplaying MII e ovociti immaturi, sia a metafase I (MI) che in fase di vescicolo germinale (GV) (Figura 1). Solo gli ovociti MII sono sottoposti a iniezione intracitoplasmatica (ICSI) mentre gli ovociti immaturi vengono in genere scartati. Eppure, quando coltivati in vitro, gli ovociti MI sono comunemente osservati per estrudere PB in vitro. Nonostante la loro inferiorità generale, gli ovociti a maturazione tardiva che hanno completato spontaneamente la prima divisione meiotica durante la cultura durante la notte sono stati utilizzati con successo come ultimi ovociti delle risorse, e le nascite vive sono state segnalate4,5 ,6,7,8. Quindi, l'iniezione prematura dello sperma potrebbe essere una ragione primaria alla base di scarsi esiti di sviluppo di ovociti a maturazione tardiva riportati in studi precedenti9,10,11.
La microscopia a luce polarizzata (PLM) combinata con un software di elaborazione delle immagini consente una visualizzazione non invasiva del mandrino meiotico nell'ovocita dal vivo. Il doppio riflesso è generato dall'interazione del fascio di luce polarizzato con l'assemblaggio altamente ordinato di microtubuli che costruiscono il mandrino bipolare. Poiché la luce polarizzata è di intensità normale, la tecnica potrebbe essere utilizzata in modo sicuro in ambienti clinici per visualizzare la dinamica dell'apparato di divisione11,12,13,14. La presenza della bireviera del mandrino MII all'interno dell'ovocita è stata identificata come un indicatore della competenza di sviluppo di un uovo9,15,16,17,18, 19,20,21,22,23. Pertanto, è stato suggerito che l'imaging non invasivo del mandrino meiotico potrebbe essere utilizzato per il controllo della qualità delle uova nella pratica clinica11,14,20.
Poiché la linea temporale per la dinamica microtubare durante la meiosi oocite è stata risolta1, il modello PLM osservato può essere meglio correlato al corso temporale della transizione da MI a MII. Poco dopo l'emissione di PB, il nascente mandrino MII diventa inosservabile dal PLM. Tuttavia, se gli ovociti sono mantenuti nella coltura, il segnale di birefranazione può emergere in seguito quando il mandrino MII bipolare si rimonta9,10,11. Così, negli ovociti che estrudano un PB in vitro, l'assenza del mandrino potrebbe essere solo temporanea corrispondente alla transizione fisiologica dell'ovocita a maturazione tardiva dallo stadio MI allo stadio MII. Se il segnale del mandrino MII non è rilevabile, l'iniezione di sperma può essere rinviata a un momento successivo fornendo più tempo per la formazione del mandrino MII. L'ottimizzazione PLM-aided del tempo ICSI massimizza la possibilità che gli ovociti a maturazione tardiva vengano utilizzati clinicamente e facciano la differenza per i pazienti con prognosi infausta9.
Di seguito, forniamo un protocollo passo-passo di come eseguire l'imaging del mandrino non invasivo negli ovociti umani. Dimostriamo anche come il PLM può essere impiegato per evitare il rischio di fecondazione prematura di ovociti a maturazione tardiva.
Protocol
Questo protocollo descrive la procedura clinica che è un "add-on" al trattamento di fecondazione in vitro standard. Deve essere eseguita da personale esperto nel rispetto di buone pratiche di laboratorio e linee guida cliniche24,25. Si raccomanda di ottenere il consenso informato scritto dei pazienti idonei. Questo protocollo è stato approvato dal Comitato Etico istituzionale.
1. Recupero e denudazione degli ovuli
- Indurre la stimolazione ovarica utilizzando protocolli di stimolazione convenzionali3. Regolare la dose in base alla risposta individuale. Quando due o più follicoli, visualizzati mediante ecografia, raggiungono un diametro di 18 mm, inducono la maturazione degli ovociti con l'applicazione di 250 g di gonadotropina colionica umana (hCG). Programmare il pick-up di ovociti (OPU) a 35-36 h post h h iniezione hCG.
- Raccogliere i complessi cumulo-ovociti (COC)recuperati in un mezzo di movimentazione indipendente da CO2 (Tabella dei materiali). Dopo un breve periodo di incubazione (10-15 min) in un'incubatrice indipendente da CO 2, espongono brevemente i COC raccolti alla soluzione di ialuronidasi (Tabella dei materiali). Sotto uno stereoscopio, rimuovere meccanicamente le cellule cumulo-corona pipetting delicatamente COC con una punta di filtro 200 .L.
- Utilizzando micropipette di denudazione con un diametro gradualmente decrescente (200 m, 180 m e 150 m), togliere delicatamente gli ovociti dalle cellule follicolari rimanenti e lavare gli ovociti 3x nel mezzo di manipolazione.
- Valutare il numero e lo stato di sviluppo degli ovociti denudati in base alla presenza o all'assenza del nucleo e del primo PB (Figura 1).
- Controllare i criteri di inclusione per l'esame PLM. Effettuare una valutazione della maturità degli ovuli se c'è (1) una risposta inesa inaspettata alla stimolazione convenzionale con meno di 6 ovociti MII raccolti all'OPU e (2) una storia di precedente insufficienza di fecondazione o immaturità degli ovociti.
- Collocare gli ovociti GV, MI e MII in pozze separate in un piatto di fecondazione in vitro, ciascuno contenente 500 -L di co2 -centro di coltura dipendente da CO2(Tabella dei materiali) coperto di olio minerale ( Tabella deimateriali).
- Incubare per un ulteriore 3-4 h a 37 gradi centigradi in un'atmosfera umidificata del 5% O2 e 6% DI CO2.
2. Preparazione per l'esame PLM e successivo ICSI
NOTA: il protocollo fornito qui descrive la valutazione PLM eseguita utilizzando il sistema OCTAX Polar AIDE (Tabella dei materiali). In alternativa, è possibile utilizzare altri sistemi di visualizzazione del mandrino disponibili in commercio.
- Preparare le piastre per la coltivazione dell'embrione.
- A seconda del numero di ovociti da esaminare (totale di ovociti MII e mi ovociti che estrusioni un PB durante il periodo di preincubazione), preparare una piastra a 4 pozzetti o una piastra di 12 pozzetti, riempire ciascuno con 500 e coprire con olio minerale precedentemente equilibrato.
- Assicurarsi che sia il mezzo di coltura che l'olio minerale siano stati equilibrati nell'incubatore di CO2 durante la notte. Tenere il piatto preparato nell'incubatrice dipendente da CO2per almeno 2 h. Numerare i pozze se necessario per monitorare il destino dello sviluppo dei singoli ovociti.
- Preparare il piatto ICSI.
- Utilizzare piatto di plastica assegnato e fare 5 gocciolina di supporto preriscaldato di movimentazione per ogni ovocita PB-displaying e una goccia in più per il lavaggio dell'ago. Fare una goccia aggiuntiva di polivinylpyrrolidone (PVP) soluzione (Tabella dei materiali) per l'immobilizzazione dello sperma prima di ICSI (aggiungere sperma poco prima di ICSI) e sovrapporli con olio minerale preriscaldato.
- Tenere il piatto ICSI preparato nell'incubatrice indipendente da CO2per almeno 20 min.
- Preparare la tesi dell'esame PLM.
- Utilizzare la parabola del fondo di vetro assegnata e fare 5 goccioline di mezzo di movimentazione preriscaldato per ogni ovocita PB- displaying. Sovrapporre con olio minerale preriscaldato.
- Tenere il piatto nell'incubatrice indipendente da CO2per almeno 20 min.
- Preparare il microscopio per l'esame PLM.
- Accendere lo stadio riscaldato sul microscopio invertito con largo anticipo per raggiungere la temperatura di riscaldamento corretta. Assicurarsi che le impostazioni siano regolate con precisione per mantenere 37 gradi centigradi nelle goccioline medie di movimentazione nella parabola PLM/ICSI durante le procedure di micromanipolazione.
- Montare l'aneed sterile e l'ago ICSI in supporti per microiniezione e metterli a fuoco. In alternativa, utilizzare un ago di tratteggio.
- Selezionare l'obiettivo appropriato (20x e 25x sono i più adatti) e assicurarsi che il condensatore sia in posizione luminosa.
- Inserire il filtro di interferenza verde (la luce diventa verde) e impostare il dispositivo di scorrimento dell'analisi del cristallo liquido nella posizione di lavoro.
- Impostare l'otturatore al 50% e regolare il polarizzatore circolare per ridurre il rumore di fondo.
- Preparare il computer per l'esame PLM.
- Avviare il software di imaging.
- Selezionare Il video Sorgente Video polarAIDE nel menu video nella barra dei menu in alto.
- Passare al video in diretta accedendo alla pagina Video e attivare l'analisi del mandrino e della zona premendo l'icona ( Figura supplementare1) nella barra degli strumenti video.
- Selezionare la modalità di visualizzazione per il ridimensionamento dinamico durante l'imaging del mandrino: (1) visualizzazione combinata rossa (birimediazione)/verde (sfondo) o (2) bianca (birefringence)/e visualizzazione nera (sfondo). La modalità di punteggio dinamico viene utilizzata per il punteggio automatico di zona pellucida.
3. Esame della maturità dell'uovo
- Dopo il periodo di preincubazione (3-4 h), eseguire un esame PLM rivelando lo stato di maturità degli ovociti all'ora solare dell'ICSI (39-40 h dopo il trigger hCG).
- Trasferire tutti gli ovociti in singole goccioline sul piatto PLM e posizionarlo al microscopio invertito preparato per la stampa del mandrino. Ricordarsi di rimuovere il coperchio di plastica dal piatto di fondo di vetro prima di iniziare l'esame.
- Mettere a fuoco il primo ovocita. Se è difficile cercare la cella sotto la luce verde, estrarre temporaneamente il filtro verde. Assicurarsi che il filtro verde sia inserito prima dell'analisi.
- Osservare l'immagine rilevata oocyte birefringence (rosso/arancione su sfondo verde) come è elaborato al computer e visualizzato in tempo reale sullo schermo del computer. Ricordate che il segnale non è visibile nell'oculare.
- Se il messaggio che annuncia l'esposizione alla luce è troppo basso/alto si apre, regolare la luminosità all'intensità appropriata utilizzando la manopola dell'intensità della luce del microscopio.
- Utilizzare un ago di tenuta e ICSI per girare l'ovocita in modo che il PB sia nella posizione delle ore 12 e concentrare il sistema sul PB.
- Se la birefringenza del mandrino non è visibile a prima vista nelle vicinanze di PB, ruotare delicatamente l'ovocita intorno ad ogni asse toccando leggermente la zona pellucida per garantire l'allineamento della luce polarizzata con le fibre del mandrino dell'array (Video supplementare ). Dichiarare l'assenza del mandrino MII fino a quando l'ovocita non riesce a mostrare il segnale del mandrino nonostante la rotazione rigorosa.
- Sulla base del modello di birefazione osservato, classificare gli ovociti nelle seguenti categorie (Figura 2): (A) ovociti con segnale luminoso del mandrino MII a forma di barile bipolare con confini chiaramente delineati e anche la distribuzione della birefringence ; (B) ovociti con mandrino MII dismorfico, apolare e traslucido con confini irregolari e distribuzione irregolare del segnale; (C) ovociti senza birefringenza del mandrino MII non rilevabile nell'ooplasma; (D) ovociti anafase I/telofase I, che mostra un ponte microtubare (un filo connettivo tra il primo PB e l'ovocita) al posto del mandrino MII.
NOTA: l'ovocita con segnale mandrino MII rilevabile (grado A o B) è adatto per immediati ICSI. - Creare uno snapshot (F9) o registrare video per un report e/o una successiva analisi delle immagini. Mantenere la documentazione del modello di immagine per ridurre la soggettività dell'operatore.
- Spostarsi nella posizione di un oocito successivo e ripetere i passaggi 3.6.3.9.
4. Ottimizzazione dei tempi ICSI
- Trasferire tutti gli ovociti positivi al mandrino (grado A o B, passaggio 3.8) nel piatto ICSI e sottoporli a ICSI secondo i protocolli standard24,25.
- Se gli ovociti non mostrano alcun segnale del mandrino MII rilevabile, posizionare il piatto PLM nell'incubatrice indipendente CO2e spostare l'ICSI in un secondo momento.
- Eseguire il riesame DEL PLM n. 2/3 h più avanti dopo i passaggi 3.3 e 3.9. Se alcuni ovociti mancano ancora di un mandrino MII, ritardare ulteriormente iCSI per ulteriori 1/2 h.
- Trasferire tutti gli ovociti nel piatto ICSI e iniettarli secondo i protocolli standard24. Se la parabola PLM è compatibile con l'angolo di piegatura dell'ago di microiniezione, eseguire immediatamente ICSI nella parabola PLM dopo il passaggio a una modalità campo luminoso.
- Dopo l'ICSI, trasferire gli ovociti in piastre preparate per la coltivazione e la coltura dell'embrione fino allo stadio di blastocisti.
Representative Results
La microscopia a luce polarizzata consente di verificare istantaneamente se l'ovocita ha completato la maturazione nucleare e il mandrino MII assemblato prima dell'ICSI. A causa del suo carattere non invasivo, può essere utilizzato per valutare in modo sicuro la disponibilità dell'uovo umano per la fecondazione in ambienti clinici11,12,13,14. Gli ovociti spindled sono più propensi a dare origine a embrioni vitali degli ovociti senza mandrino9,15,16,17,18,19, 20 anni , 21 Mieto , 22 Milia , 23.Inoltre, gli ovociti caratterizzati da un caratteristico mandrino bipolare sembrano avere una maggiore competenza di sviluppo rispetto agli ovociti con assi dismorfici9,21,22. Nel loro insieme, l'imaging del mandrino può servire come strumento per identificare gli ovociti con il maggior potenziale per essere fecondati con successo, subire lo sviluppo preimpianto e sostenere la gravidanza a tempo pieno9,15, 16 , 17 mi lato , 18 mi lato , 19 del 12 , 20 anni , 21 Mieto , 22 Milia , 23.
L'incidenza riportata del mandrino varia (44-97%) che riflette la diversità della popolazione studiata9,15,16,17,18,19,20,21, 22 Milia , 23 del 23 o , 26 del sistema di , 27 mi lapiùdel , 28. Gli ovociti maturati in vivo dei normali soccorritori mostrano in genere il mandrino MII bipolare a 40 h dopo il grilletto hCG9,18,27,29. Tuttavia, nei soccorritori lenti, la riserva di ovociti recuperati dai follicoli preovulatori è influenzata dal ritardo di maturazione9,27. In questo caso, la imaging del mandrino dovrebbe essere effettuata per discriminare gli ovociti arrestati nella fase MII da quelli sottoposti a un'importante transizione maturazionale (Figura 3). Si consiglia la rimozione delle cellule follicolari immediatamente al momento del recupero, e l'incubazione di MI e MII ovociti in pozzi separati per essere in grado di distinguere gli ovociti maturati in vivo e gli ovociti a maturazione tardiva estrusivo PB in vitro, poco prima dell'ICSI. Nel caso in cui la denudazione venga eseguita poco prima dell'ICSI, queste due popolazioni di ovociti sono indistinguibili in base all'aspetto PB.
I cambiamenti specifici della fase del modello PLM devono essere interpretati nel contesto della conoscenza delle dinamiche del mandrino durante la maturazione meiotica. Durante l'intercinesi, l'apparato di divisione subisce un'ampia riorganizzazione strutturale e il segnale PLM scompare transitoriamente1,9,10,11. Pertanto, negli ovociti ritardati nello sviluppo che estrugono PB in vitro, l'assenza del segnale del mandrino MII potrebbe non riflettere necessariamente il disturbo cellulare, ma potrebbe indicare la progressione dell'ovocita dalla fase MI a MII (Figura 3). Se lo sperma viene iniettato in un punto di tempo non fisiologico, il potenziale di sviluppo dell'uovo è compromesso. Il rinvio di ICSI fornisce agli ovociti a maturazione tardiva più tempo per assemblare un mandrino MII la cui presenza è associata a migliori risultati clinici9,10,11. Nello studio clinico che coinvolge soccorritori lenti/poveri, quasi il 60% degli ovociti inizialmente colonnati-negativi ha sviluppato il segnale del mandrino prima del riesame del PLM circa 2 h dopo9. A seconda dello stadio di sviluppo e dell'idoneità complessiva degli ovociti a maturazione tardiva, l'aspetto del mandrino MII dopo l'estrusione PB richiede in genere 2-6 h (osservazione inedita). Gli ovociti che espongono un ponte a microtubuli (anafase/telofase, grado D) durante il primo esame PLM richiedono un tempo più lungo per sviluppare il segnale del mandrino MII rispetto agli ovociti senza mandrino visibile (assi emergenti, grado C). La regolazione individuale del tempo dell'ICSI allo stadio di sviluppo dell'uovo previene l'attivazione prematura dell'ovocita e si traduce in un miglioramento del tasso di fecondazione e di successo dello sviluppo embrionale9.
Sebbene gli ovociti a lenta maturazione estrudano PB in vitro abbiano generalmente una competenza di sviluppo inferiore rispetto agli ovociti maturati in vivo, il tasso di sviluppo dell'embrione è accettabile se riescono ad assemblare un mandrino rilevabile prima di iCSI ritardato (blastulation 41,32%)9. Utilizzando questo approccio, anche gli ovociti immaturi, che normalmente vengono rifiutati per il trattamento della fertilità, possono essere utilizzati clinicamente, producono embrioni trasferibili e danno origine a gravidanze a pieno termine. La valutazione dello stadio maturazionale di ogni singolo ovocita è particolarmente utile nei cicli di prognosi poveri che producono un piccolo numero di ovociti MII e/o dopo aver eseguito un salvataggio in vitro maturazione di ovociti immaturi9.
Oltre alla valutazione della maturità delle uova, l'imaging del mandrino è raccomandato anche prima della biopsia PB per evitare la distruzione del mandrino negli ovociti I/telofase anaphase. Nell'embriologia sperimentale, la visualizzazione del mandrino meiotico viene utilizzata durante l'elusione degli ovuli e/o la procedura di trasferimento del mandrino13.
Figura 1: Maturazione degli ovociti umani. Gli ovociti maturati in vivo (MII) presentano PB al momento del recupero. Gli ovociti immaturi (GV, MI) possono completare spontaneamente la maturazione in vitro. Barra di scala 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Classificazione degli ovociti basata sul modello rilevato dal PLM. Esempi rappresentativi di gradi di ovociti (A-D) in base alla comparsa del segnale del mandrino. Modello rilevato dal PLM: (A) segnale prominente del mandrino bipolare, (B) il mandrino miMiI traslucido, (C) nessun mandrino rilevabile e ponte a microtubulo (D). Barra di scala 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Fasi della transizione da MI a MII nella maturazione degli ovociti. Viene mostrata la comparsa di ovociti in campo luminoso (riga in alto), combinata con un segnale di fluorescenza di cromosomi (cianomi) e microtubuli (magenta) (riga centrale) e in luce polarizzata (riga inferiore). Ogni ovocita è stato esaminato per la prima volta sul PLM e subito fissato. Gli ovociti fissi erano (immuno)etichettati con Hoechst (DNA) e anticorpi anti-tubulina (microtubuli). La freccia gialla indica la presenza di PB e la freccia bianca evidenzia la posizione dei microtubuli biorefringenti. Barra della scala: 20 m. Questa cifra è stata modificata da Holubcov à et al., JARG 20199. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Correlazione dell'organizzazione cromosomico-microtubulo con il modello di bireporta rilevata dalla microscopia a luce polarizzata. Viene mostrata la comparsa di ovociti nel campo luminoso combinati con un segnale fluorescente per cromosomi (ciano) e microtubuli (magenta) (riga superiore) e in luce polarizzata (riga inferiore). Ogni ovocita è stato fissato immediatamente dopo l'esame PLM. DNA (Hoechst) e microtubulo (z-tubulina) sono stati macchiati. (A-C) ovociti con mandrino rilevabile dal PLM ma cromosomi non allineati (A, B) o poli mandrino a fuoco libero (C); (D-F) ovociti anomali senza mandrino MII rilevabile dal PLM che mostrano sottosviluppato (D), apolar (E) o nessun mandrino (F). La freccia bianca evidenzia la posizione dei microtubuli biorefringenti, e l'asterisco (-) indica la posizione della cromatina decondensata. Barra di scala 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: Strutture di birefazione negli ovociti umani. Esempi rappresentativi di strutture birecanti (A-D) rilevate dal PLM negli ovociti umani. P - zona pellucida; PM - membrana plasmatica (oolema); RB - corpi refractile, vacuoli. Freccia bianca, mandrino meiotico in diverse fasi della maturazione. (E) Disallineamento del mandrino MII con il corpo polare (PB). (F) Distacco del mandrino dalla membrana plasmatica. Barra di scala 20 m. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura supplementare 1: layout del desktop del software di analisi delle immagini. Fare clic qui per scaricare questo file.
Video supplementare: Procedura di esame PLM. La rotazione dell'ovocita è necessaria per escludere la presenza del mandrino (freccia). Barra di scala 20 m. Fare clic qui per scaricare questo file.
Discussion
Il mandrino meiotico acentrosomico negli ovociti umani è altamente dinamico e una struttura delicata1. In condizioni non ottimali, le fibre di microtubuli depolimerizzano rapidamente e meiotico il mandrino smonta30,31,32,33. Pertanto, è di fondamentale importanza garantire che la coltura degli ovociti e le condizioni di micromanipolazione, vale a dire la temperatura e il pH siano nell'intervallo ottimale. Per ridurre al minimo il rischio di perturbazione del mandrino, gli ovociti devono essere mantenuti in un ambiente a temperatura controllata mantenendo 37 x 0,5 gradi centigradi nel supporto ovocita. L'uso di microscopi e la configurazione della microiniezione dotati di uno stadio riscaldato sono rigorosamente necessari. Tutte le manipolazioni con ovociti al di fuori dell'incubatrice devono essere effettuate su supporti tamponati HEPES/MOPS per evitare fluttuazioni di pH. Per evitare potenziali effetti negativi di un'eccessiva consegna di ovociti in condizioni ambientali, il tempo totale dell'esame PLM non deve superare i 10 minuti. Gli ovociti devono essere analizzati sul piatto inferiore di vetro con il coperchio di plastica rimosso perché il posizionamento di una plastica standard nel percorso del fascio compromette l'analisi dell'immagine. Poiché i piatti in plastica e vetro fondo hanno caratteristiche termiche diverse, la temperatura deve essere controllata direttamente nelle goccioline di mezzo di movimentazione nel piatto di esame.
Oltre alle condizioni di laboratorio, le differenze procedurali e le capacità di micromanipolazione dell'operatore potrebbero avere un impatto sull'accuratezza dell'esame PLM. Solo i mandrini bipolari altamente assemblati possono essere visualizzati in modo non invasivo. Il segnale osservato è proporzionale al grado di organizzazione strutturale del mandrino. I mandrini nascenti, apolari, allentati o disarrayed mostrano solo bitraffazione sfocata o nessuna (Figura 3 e Figura 4). Inoltre, l'allineamento imperfetto della luce polarizzata con gli array di microtubuli produce solo una birenza traslucida e mal definita, nonostante l'effettiva presenza di mandrino bipolare ben sviluppato (Figura 4). A meno che non sia orientato correttamente, il segnale del mandrino potrebbe essere facilmente perso e la maturità degli ovociti non diagnosticata correttamente (Supplemental Video). Per un'imaging ottimale del mandrino, l'ovocita deve essere ruotato correttamente intorno a ogni asse. Poiché la biordigia non è visibile negli oculari, l'operatore deve guardare lo schermo del computer durante la rotazione dell'ovocita. Prima di passare all'applicazione clinica, è auspicabile una precedente esperienza con la micromanipolazione e la formazione dell'imaging del mandrino in ovociti in vitro in eccesso in vitro.
Oltre al mandrino, le cellule cumuli che circondano gli ovociti, gli oolema, lo strato interno della zona pellucida e alcune strutture citoplasmiche (ad esempio, corpi refractile, vacuole) presentano biordine (Figura 5A-D). A meno che non vengano accuratamente rimosse dall'ovocita prima dell'imaging, le cellule follicolari strettamente attaccate producono rumore di fondo e compromettono il rilevamento del mandrino meiotico. Fare attenzione a non confondere un grande corpo refractile per il mandrino. Molte inclusioni citoplasmiche che risiedano nel citoplasma mostrano un'elevata luminosità che contrasta nettamente con lo sfondo scuro. Il mandrino meiotico, d'altra parte, mostra solo segnali moderati, contorni sfocati e tipicamente si attacca all'oolema sottostante o adiacente al primo PB. Occasionalmente, l'esame PLM rivela una deviazione lorda del mandrino dalla sua posizione standard (Figura 5E, F). Se c'è un grave disallineamento tra l'apparato di divisione e il PB, il PLM aiuta a orientare l'ovocita per evitare il rischio di lesioni al mandrino durante la microiniezione. La posizione relativa del mandrino all'interno dell'ovocita non sembra influenzare il potenziale di sviluppo degli embrioni risultanti17,34. Tuttavia, quando il mandrino si stacca in modo competitivo dall'oolema, si verificano anomalie di fecondazione. È interessante notare che alcuni ovociti di scarsa qualità vengono sottoposti a decondensazione della cromatina immediatamente dopo l'estrusione PB invece di avviare la nucleazione di microtubuli (Figura 4F). Utilizzando la microscopia leggera convenzionale e il PB come unico indicatore della maturità degli ovociti, tali ovociti sub-competenti sarebbero considerati fecondati. Così, oltre alla valutazione morfologica di routine, l'imaging del mandrino aggiunge importanti informazioni sulla maturità dell'uovo e può servire come marcatore indiretto della sua qualità.
L'incidenza degli ovociti MII spinsi è probabilmente influenzata dalle caratteristiche della popolazione dello studio (ad esempio, background genetico, condizione medica, età materna). Inoltre, la proporzione di ovociti ritardati dallo sviluppo all'interno della coorte influenzerà il numero effettivo di ovociti rilevati mandrino-negativi9,27. La visualizzazione meotica del mandrino consente di identificare chiaramente gli ovociti fecondati arrestati nella fase MII. Inoltre, la seconda ispezione in un secondo momento può rivelare se l'ovocita del mandrino-negativo è anormale o è progredito solo di recente attraverso la transizione MI/MII9,10,11. Quando sono ammessi a sviluppare un mandrino prima dell'ICSI, anche gli ovociti immaturi, che vengono regolarmente scartati, possono produrre embrioni vitali9. Nei cicli con pochissimi ovociti disponibili per la fecondazione, iCSI a tempo fine di ovociti estrusivo PB possono servire come strategia di salvataggio e alternativa alla cancellazione del ciclo.
Tuttavia, l'estensione del tempo di preincubazione non dovrebbe essere generalizzata a tutti gli ovociti. Gli ovociti maturati in vivo dai normali soccorritori presentano in genere un mandrino MII9,20,21,27. Qui, la possibilità di un successo nell'imaging del mandrino diminuisce con il tempo come conseguenza dell'invecchiamento post-ovulatorio in vitro35. Se possibile, l'ICSI deve essere eseguita il giorno del recupero e non deve superare le 9 ore (45 ore dopo l'hCG), il periodo associato a un calo della qualità dell'embrione risultante36,37. Gli ovociti che mostrano distinti mandrini bipolari dovrebbero essere sottoposti a ICSI senza ulteriori ritardi. In sintesi, l'ottimizzazione individualizzata dei tempi ICSI vale la pena nei pazienti con prognosi a precaria per escludere qualsiasi rischio di iniezione prematura di spermatozoi. Tuttavia, non è necessario, troppo tempo e laborioso per essere eseguita in tutti i cicli di fecondazione in vitro.
L'analisi PLM rivela se l'ovocita ha raggiunto la fase MII. Tuttavia, la visualizzazione non invasiva del mandrino meiotico non fornisce alcuna informazione sull'organizzazione dei cromosomi. Potrebbe esserci un grave disallineamento cromosomico e/o la divisione cromatide legata all'età materna in ovociti con un mandrino bipolare (Figura 5). Vari altri fattori hanno un impatto significativo sul successo della riproduzione (ad esempio, fattore spermatono, mitocondri, attivazione del genoma embrionale, scissione irregolare, epigenetica, endometrio, immunità materna). Pertanto, il rilevamento del mandrino MII di per sé, non garantisce un esito clinico positivo della procedura di fecondazione in vitro.
Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo il laboratorio di embriologia di Reprofit International. Riconosciamo anche lo stabilimento principale CELLIM del CEITEC supportato da MEYS CR (LM2015062 Czech-Bioimaging) per il loro supporto con l'ottenimento dei dati di imaging immunofluorescenza qui presentati.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Continuous Single Culture Complete with Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 90164 | bicarbonate based single-step culture medium for embryo culture |
| Denuding micropipette 150 µm | Microtech IVF | 005-150C | |
| Denuding micropipette 180 µm | Microtech IVF | 005-180B | suitable for oocyte transfer between dishes |
| Denuding micropipette 200 µm | Microtech IVF | 005-250-A | suitable for oocyte transfer between dishes |
| FluoroDish | World Precision Instruments | FD 5040-100 | glass-bottom dish |
| (alternative: WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells) | |||
| Holding micropipette | Microtech | 001-120-30 | sterile glass microneedles |
| Hyaluronidase solution | Irvine Scientific | 90101 | for oocyte denudation |
| ICSI micropipette | Microtech | 002-5-30 | sterile glass microneedles |
| Micro Droplet Culture Dish | Vitrolife | 16003 | 12-well plate for embryo culture |
| Multipurpose Handling Medium (MHM) with Gentamicin | Irvine Scientific | 90163 | handling medium, MOPS/HEPES buffered |
| Nikon Eclipse TE 2000-U | Nikon | inverted microscope with heated stage | |
| Nunc IVF Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 150270 | plastic ICSI dish |
| Nunc non-treated 4-well IVF dish | Thermo Fisher Scientific | 179830 | 4-well plate for embryo culture |
| OCTAX polarAide | MTG | integrated PLM system | |
| Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | oil for overlay |
| Polyvinylpyrrolidone | Irvine Scientific | 90123 | for sperm immobilization prior to ICSI |
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