Summary
Nós fornecemos um esboço do protocolo clínico para a avaliação não invasora da maturidade humana do ovo usando a microscopia de luz polarizada.
Abstract
O momento ideal da injeção intracytoplasmic do esperma (ICSI) é de uma preocupação séria para programas da fertilidade porque a entrada de esperma prematura diminui a competência desenvolvente do ovo. A presença do primeiro corpo polar (PB) juntamente com o fuso meiótico indica a conclusão da maturação dos oócitos e a prontidão do ovo para a fertilização. Na prática clínica, é habitual supor que todos os oócitos exibindo um PB são os oócitos maduros da metafase (MII). Entretanto, a extrusão do PB precede a formação do eixo bipolar de MII. Esta assinando faz a mera presença de PB um marcador incerto da maturidade do oócito. A imagem latente não invasora do eixo usando a microscopia de luz polarizada (PLM) permite a inspeção rápida e fácil de se o oócito PB-indicando remontou realmente um eixo meiótico antes do ICSI. Aqui, nós apresentamos um protocolo padrão para executar a avaliação humana da maturidade do ovo no laboratório clínico. Também mostramos como otimizar o tempo de ICSI em relação ao estágio de desenvolvimento do oócito, a fim de prevenir a injeção prematura de espermatozóides de ovócitos de amadurecimento tardio. Usando esta aproximação, mesmo os oócitos imaturos que expulsando o PB in vitro podem ser utilizados clìnica. A afirmação de que o eixo MII está presente antes da injeção de espermatozóides e o ajuste individual do tempo de ICSI é particularmente importante em ciclos de fertilização in vitro (FIV) de mau prognóstico com um baixo número de oócitos disponíveis para fertilização.
Introduction
Para se tornar um ovo haploide fertilizável, o oócito diploide tem que expulsar metade de sua informação genética em uma célula adjacente, chamada de primeiro corpo polar (PB), e alinhar os cromossomas no Equador do eixo bipolar da metafase II (MII). Enquanto o PB pode ser claramente observado pela microscopia de luz convencional, a detecção de material genético e estruturas citoesqueléticas tipicamente requer procedimentos preparatórios invasivos que são incompatíveis com o uso adicional do oócito para o tratamento de fertilidade. Assim, na prática clínica, a presença do PB é considerada como uma marca registrada da maturidade do oócito. Entretanto, a imagem latente viva da dinâmica do microtubule e do cromossoma durante a maturação humana do oócito revelou que o PB se torna visível um par horas antes que o eixo bipolar de miI esteja montado e os cromossomas estejam alinhados1. No entanto, na luz transmitida, os ovos presos MII são indistinguíveis dos oócitos que apenas entraram no processo de segregação cromossômica. Assim, uma coorte de oócitos, classificada como oócitos MII com base apenas na presença de PB, pode conter oócitos latematurantes que ainda não concluíram seu desenvolvimento e, portanto, não estão prontos para a fertilização.
O atraso da maturação dos oócitos é susceptível de afetar a população de pobres respondedores com um baixo número de oócitos MII e uma alta proporção de oócitos imaturos coletados inesperadamente em ciclos estimulados2. In vivo, apenas um único ovo de melhor qualidade atinge a maturidade e se torna ovulado. Em ciclos in vitro de fertilização (FIV), a hiperestimulação ovariana controlada é usada para recrutar oócitos múltiplos para maturação. O surto de gonadotropina desencadeia uma retomada do programa meiótico e os progenitores de ovos devem chegar ao estágio de detenção MII dentro de 36 horas3. No entanto, os oócitos recuperados de folículos pré-ovulatórios geralmente constituem uma variedade de pbexibindo oócitos miI e oócitos imaturos, seja na metafase I (MI) ou no estágio germinais da vesícula (GV) (Figura 1). Apenas os oócitos MII são submetidos à injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI), enquanto os oócitos imaturos são tipicamente descartados. No entanto, quando cultivadas in vitro, os oócitos do MI são comumente observados para expulsar o PB in vitro. Apesar de sua inferioridade geral, oócitos de amadurecimento tardio que completaram espontaneamente a primeira divisão meiótica durante a cultura durante a noite foram usados com sucesso como último recurso oócitos, e nascidos vivos foram relatados4,5 ,6,7,8. Daqui, a injeção prematura do esperma pôde ser uma razão preliminar que subjacente resultados desenvolventes pobres de oócitos devencimento relatados em estudos precedentes9,10,11.
A microscopia de luz polarizada (PLM) combinada com um software de processamento de imagem permite a visualização não invasiva do fuso meiótico no oócito vivo. A reflexão dobro é gerada pela interação do feixe luminoso polarizado com o conjunto altamente requisitado dos microtúbulos que constroem o eixo bipolar. Uma vez que a luz polarizada é de intensidade normal, a técnica pode ser usada com segurança em configurações clínicas para visualizar a dinâmica do aparelho de divisão11,12,13,14. A presença da birefringência do eixo miI dentro do oócito foi identificada como um marcador da competência de desenvolvimento de um ovo9,15,16,17,18, 19,20,21,22,23. Assim, tem sido sugerido que a imagem de eixo meiótico não invasivo poderia ser utilizada para o controle da qualidade do ovo na prática clínica11,14,20.
Desde que a linha do tempo para a dinâmica microtubular durante o meiose do oócito foi resolvida1, o teste padrão observado de PLM pode ser melhor relacionado ao curso do tempo de mi à transição de miI. Logo após a emissão de PB, o eixo MII nascente torna-se indetectável pelo PLM. No entanto, se os oócitos forem mantidos na cultura, o sinal de birefringência poderá surgir mais tarde quando o eixo bipolar miI remonta9,10,11. Assim, nos oócitos que expulam um PB in vitro, a ausência do fuso pode ser apenas temporária correspondente à transição fisiológica do oócito de amadurecimento tardio do MI para o estágio MII. Se o sinal do eixo MII for indetectável, a injeção de espermatozóides pode ser adiada para um ponto de tempo posterior, proporcionando tempo extra para a formação do eixo MII. A otimização auxiliada pelo PLM do tempo do ICSI maximiza a chance de os oócitos de amadurecimento tardio serem utilizados clinicamente e fazer a diferença para pacientes com mau prognóstico9.
Abaixo, nós fornecemos um protocolo passo a passo de como executar a imagem latente não invasora do eixo em oocytes humanos. Também demonstramos como o PLM pode ser empregado para evitar o risco de fertilização prematura de ovócitos de maturação tardia.
Protocol
Este protocolo descreve o procedimento clínico que é um "Add-on" ao tratamento padrão de IVF. Deve ser realizado por pessoal experiente em conformidade com boas práticas laboratoriais e diretrizes clínicas24,25. Recomenda-se a obtenção do consentimento informado por escrito dos pacientes elegíveis. Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de ética institucional.
recuperação 1. Egg e desnudamento
- Induzir estimulação ovariana utilizando protocolos convencionais de estimulação3. Ajuste a dose para a resposta individual. Quando dois ou mais folículos, visualizados por ultrassonografia, atingem um diâmetro de 18 mm, induzem a maturação de oócitos com aplicação de 250 μg de gonadotropina coriónica humana (hCG). Programe o pick-up do oócito (opu) em 35 − 36 h após a injeção do HCG.
- Coletar complexos Cumulus-oócitos recuperados (COCs) em meio de manuseio independente de CO2(tabela de materiais). Após um curto período de incubação (10 − 15 min) em uma incubadora independente de CO2, brevemente (até 30 s) expõem COCs coletados à solução de hialuronidase (tabela de materiais). um estereomicroscópio, remova mecanicamente as células Cumulus-Corona gentilmente pipetando COCs com uma ponta de filtro de 200 μL.
- Usando Micropipetas de denudação com um diâmetro gradualmente decrescente (200 μm, 180 μm e 150 μm), retire suavemente os oócitos das células foliculares remanescentes e lave os oócitos 3x em meio de manuseio.
- Avaliar o número e o estado de desenvolvimento dos oócitos desuded de acordo com a presença ou ausência do núcleo e do primeiro PB (Figura 1).
- Verifique os critérios de inclusão para o exame de PLM. Realizar uma avaliação da maturidade do ovo se houver (1) uma resposta inesperada ruim à estimulação convencional com menos de 6 oócitos MII coletados em OPU e (2) história de falência prévia de fertilização ou imaturidade de oócitos.
- Coloque os oócitos GV, MI e MII em poços separados em um prato de fertilização in vitro, cada um contendo 500 μL de meio de cultura dependente de CO2pré-equilibrados (tabela de materiais) coberto com óleo mineral (tabela de materiais).
- Incubar por um adicional de 3 − 4 h a 37 ° c em uma atmosfera umidificada de 5% O2 e 6% co2.
2. preparação para a examinação de PLM e o ICSI subseqüente
Observação: o protocolo fornecido aqui descreve a avaliação do PLM realizada usando o sistema OCTAX polar AIDE (tabela de materiais). Alternativamente, outros sistemas disponíveis comercialmente da vista do eixo podem ser usados.
- Prepare placas para cultivo embrionário.
- Dependendo do número de oócitos a serem examinados (total de oócitos MII, e oócitos MI expulsando um PB durante o período de pré-incubação), prepare uma placa de 4 poços ou uma placa de 12 poços, encha cada poço com 500 μL ou 30 μL de meio de cultura, respectivamente e cubra com óleo mineral previamente equilibrado.
- Assegure-se de que o meio de cultura e o óleo mineral estejam equilibrados na incubadora do CO2 durante a noite. Mantenha o prato preparado na incubadora dependente de CO2por pelo menos 2 h. número de poços, se necessário, para rastrear o destino de desenvolvimento de oócitos individuais.
- Prepare o prato ICSI.
- Use o prato plástico atribuído e faça a gota de 5 μl do meio de manipulação pré-aquecido para cada pb-indicando o oócito e uma gota extra para a lavagem da agulha. Faça uma gota adicional de solução de polivinilpirrolidona (PVP) (tabela de materiais) para imobilização de espermatozóides antes do ICSI (adicione espermatozóides pouco antes do ICSI) e sobreponha com óleo mineral pré-aquecido.
- Mantenha o prato ICSI preparado na incubadora CO2independente por pelo menos 20 min. número de poços, se necessário, para rastrear os oócitos após ICSI.
- Prepare o prato de exame PLM.
- Use o prato inferior de vidro atribuído e faça 5 μL de gotas de meio de manuseio pré-aquecido para cada oócito exibindo PB. Sobreposição com óleo mineral pré-aquecido.
- Mantenha o prato na incubadora CO2independente por pelo menos 20 min. número de gotas, se necessário, para rastrear os oócitos após o exame de PLM.
- Ajuste o microscópio pronto para o exame de PLM.
- Mude o estágio aquecido no microscópio invertido sobre bem adiantado para conseguir a temperatura de aquecimento correta. Assegure-se de que as configurações sejam ajustadas com precisão para manter 37 ° c nas gotas médias de manuseio no prato PLM/ICSI durante os procedimentos de micromanipulação.
- Encaixe a fixação estéril e a agulha ICSI em suportes de microinjecção e coloque-as em foco. Alternativamente, use uma agulha de incubação.
- Selecione o objetivo apropriado (20x e 25x são os mais apropriados) e assegure-se de que o condensador esteja na posição brilhante do campo.
- Insira o filtro de interferência verde (a luz fica verde) e defina o controle deslizante de análise de cristal líquido na posição de trabalho.
- Ajuste o obturador a ~ 50% e ajuste o polarizador circular para diminuir o ruído de fundo.
- Defina o computador pronto para o exame de PLM.
- Inicie o software de imagem.
- Selecione vídeo | Fonte de vídeo | polarAIDE no menu de vídeo na barra de menu superior.
- Mude para vídeo ao vivo, indo para a página de vídeo e ativar a análise de fuso e zona, batendo no ícone (suplementar Figura 1) na barra de ferramentas de vídeo.
- Selecione o modo de exibição para dimensionamento dinâmico durante a imagem do eixo: (1) vermelho (birefringence)/verde (fundo) vista combinada, ou (2) branco (birefringence)/e preto (fundo) vista. O modo de Pontuação dinâmica é usado para autoscoring da zona pellucida.
3. examinação da maturidade do ovo
- Após o período de pré-incubação (3 − 4 h), realize uma examinação de PLM que revela o status da maturidade do oócito no tempo padrão de ICSI (39 − 40 h após o disparador do HCG).
- Transfira todos os oócitos em gotas individuais no prato do PLM e coloque-o o microscópio invertido preparado para a imagem do eixo. Recorde remover a tampa plástica do prato inferior de vidro antes de começar a examinação.
- Traga o primeiro oócito em foco. Se for difícil procurar a célula luz verde, retire o filtro verde temporariamente. Certifique-se de que o filtro verde esteja inserido antes da análise.
- Observe a imagem de birefringência de oócitos detectada (vermelho/laranja no fundo verde), pois é processada por computador e exibida em tempo real na tela do computador. Lembre-se que o sinal não é visível na ocular.
- Se a mensagem anunciando exposição à luz é muito baixa/alta aparece, ajustar o brilho para a intensidade adequada usando o botão de intensidade de luz do microscópio.
- Use uma terra arrendada e uma agulha de ICSI para girar o oócito assim que o PB está na posição das 12 horas e no foco ao PB.
- Se o birrefringência do eixo não é visível na primeira vista nas proximidades do PB, gire delicadamente o oócito em torno de cada linha central tocando levemente o pelúcida da zona para assegurar o alinhamento da luz polarizada com as fibras do eixo da disposição (vídeo suplementar ). Declare a ausência do eixo miI contanto que o oócito não mostre o sinal do eixo apesar da rotação rigorosa.
- Com base no padrão de birefringência observada, classificar os oócitos nas seguintes categorias (Figura 2): (a) oócitos com sinal luminoso de eixo miI em forma de barril bipolar com limites claramente delineados e até mesmo distribuição de birefringência ; (B) oócitos com eixo MII dismórfico, apolar e translúcido com limites irregulares e distribuição desigual do sinal; (C) oócitos sem birefringência de eixo MII detectável em ooplasm; (D) anaphase I/telophase I oócitos, mostrando uma ponte microtubular (uma vertente Conectiva entre o primeiro PB e o oócito) em vez do eixo MII.
Nota: oócito com sinal de eixo MII detectável (grau A ou B) são adequados para ICSI imediato. - Faça um snapshot (F9) ou grave um vídeo para um relatório e/ou análise de imagem subsequente. Mantenha a documentação do padrão de imagem para reduzir a subjetividade do operador.
- Mova-se para a posição de um oócito seguinte e repita os passos 3.6 − 3.9.
4. otimizando o sincronismo de ICSI
- Transfira todos os oócitos do eixo positivo (grau a ou B, passo 3,8) para o prato ICSI e sujei-os ao ICSI de acordo com os protocolos padrão24,25.
- Se os oócitos não mostrarem sinal de eixo MII detectável, coloque o prato de PLM na incubadora independente de CO2e mude o ICSI para um tempo posterior.
- Execute o re-exame de PLM ~ 2 − 3 h mais tarde seguintes etapas 3.3 − 3.9. Se algum oócito (s) ainda faltar um eixo MII, mais um atraso ICSI para adicional 1 − 2 h.
- Transfira todos os oócitos para o prato ICSI e injete-os de acordo com os protocolos padrão24. Se o prato de PLM for compatível com o ângulo de dobra da agulha de microinjeção, execute ICSI imediatamente no prato do PLM depois de mudar para um modo de campo brilhante.
- Após ICSI, transfira oócitos para placas preparadas para cultivo de embriões e cultura até o estágio de blastocist.
Representative Results
A microscopia de luz polarizada torna possível inspecionar instantaneamente se o oócito concluiu a maturação nuclear e montou o eixo MII antes do ICSI. Devido ao seu caráter não invasivo, pode ser utilizado para avaliar com segurança a prontidão do ovo humano para fertilização em configurações clínicas11,12,13,14. Os oócitos alongados são mais propensos a dar origem a embriões viáveis do que os oócitos sem um eixo9,15,16,17,18,19, 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , 23. Além disso, oócitos com um eixo bipolar distinto parecem ter uma maior competência de desenvolvimento do que oócitos com fusos dismórficos9,21,22. Tomados junto, a imagem latente do eixo pode serir como uma ferramenta para identificar os oócitos com o maior potencial a ser fertilizado com sucesso, submeter-se ao desenvolvimento do pré-implante e apoiar a gravidez a termo9,15, 16 anos de , 17 anos de , 18 anos de , 19 anos de , 20 anos de , 21 anos de , 22 anos de , a 23.
A incidência relatada do eixo varia (44 − 97%) refletindo a diversidade da população estudada9,15,16,17,18,19,20,21, 22 anos de , 23 anos de , 26 anos de , 27 anos de , 28. Os oócitos maturadas in vivo de Respondedores normais tipicamente mostram o eixo miI bipolar em 40 h após o gatilho de HCG9,18,27,29. No entanto, em respondedores lentos, o pool de oócitos recuperados dos folículos pré-ovulatórios é afetado pelo atraso de maturação9,10. Aqui, a imagem do eixo deve ser realizada para discriminar os oócitos presos no estágio MII daqueles submetidos à importante transição maturacional (Figura 3). Nós recomendamos a remoção de pilhas foliculares imediatamente em cima da recuperação, e a incubação dos oócitos do mi e do miI em poços separados para poder distinguir os oócitos in vivo amadurecidos e os oócitos de vencimento tardio que expulsando o PB in vitro, imediatamente antes de ICSI. Caso a denudação seja realizada pouco antes do ICSI, essas duas populações de oócitos são indistinguíveis com base na aparência do PB.
As mudanças específicas da fase do padrão de PLM devem ser interpretadas no contexto do conhecimento da dinâmica do fuso durante a maturação meiótica. Durante a intercinese, o aparato de divisão sofre extensa reorganização estrutural e o sinal de PLM desaparece transientemente de1,9,10,11. Assim, em oócitos com retardo desenvolvimental que expulsou PB in vitro, a ausência do sinal do eixo MII pode não refletir necessariamente distúrbios celulares, mas pode indicar a progressão do oócito do estádio MI para MII (Figura 3). Se o esperma é injetado em um ponto de tempo fisiológicos, o potencial desenvolvente do ovo é comprometido. Adiar ICSI fornece oócitos de amadurecimento tardio com mais tempo para montar um eixo miI cuja presença está associada a melhores resultados clínicos9,10,11. No estudo clínico que envolve respondedores lentos/pobres, quase 60% dos oócitos inicialmente Spindle-negativos desenvolveram o sinal do eixo antes do reexame de PLM aproximadamente 2 h mais tarde9. Dependendo do estágio de desenvolvimento e da aptidão geral dos oócitos de amadurecimento tardio, a aparência do eixo MII após a extrusão de PB normalmente leva 2 − 6 h (observação inédita). Os oócitos que exibem uma ponte microtubular (anaphase/telophase, grau D) durante o primeiro exame de PLM exigem um tempo mais longo para desenvolver o sinal do eixo MII do que os oócitos sem eixo visível (fusos emergentes, grau C). O ajuste individual do tempo de ICSI ao estágio desenvolvente do ovo impede a ativação prematura do oócito e resulta em uma taxa melhorada da fecundação e em um desenvolvimento bem sucedido do embrião9.
Embora os oócitos de amadurecimento tardio que expulsando PB in vitro geralmente tenham uma menor competência de desenvolvimento do que os oócitos maturados in vivo, a taxa de evolução do embrião é aceitável se conseguirem montar um fuso detectável antes do ICSI tardio (blastulação taxa de 41,32%)9. Usando esta aproximação, mesmo os oocytes imaturos, que são rejeitados normalmente para o tratamento de fertilidade, podem ser utilizados clìnica, produzem embriões transferíveis, e dão o aumento gravidezes a termo. A avaliação do estágio maturacional de cada oócito individual é especialmente benéfica em ciclos de mau prognóstico produzindo um pequeno número de oócitos MII e/ou após a realização de um resgate in vitro de maturação de oócitos imaturos9.
Aparte da avaliação da maturidade do ovo, a imagem latente do eixo é recomendada igualmente antes da biópsia do PB a fim evitar a destruição do eixo em anaphase I/telophase oocytes. Na embriologia experimental, a visualização do fuso meiótico é utilizada durante a Enucleação do ovo e/ou o procedimento de transferência do eixo13.
Figura 1: maturação dos oócitos humanos. Os oócitos maturando in vivo (MII) exibem PB no momento da recuperação. Os oócitos imaturos (GV, MI) podem espontaneamente concluir a maturação in vitro. Barra de escala = 20 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: classificação de oócitos com base no padrão detectado pelo PLM. Exemplos representativos de graus de oócitos (A-D) com base na aparência do sinal do eixo. Padrão de PLM detectado: (A) sinal proeminente do eixo bipolar, (B) eixo de eixo APOLAR translúcido do miI, (C) nenhum eixo detectável, e (D) ponte do microtubule. Barra de escala = 20 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: estágios da transição mi para miI na maturação de oócitos. A aparência de oócitos em campo brilhante (linha superior), combinada com um sinal de fluorescência de cromossomas (ciano) e microtúbulos (magenta) (linha do meio), e em luz polarizada (linha de fundo) é mostrada. Cada oócito foi examinado pelo primeiro PLM e imediatamente corrigido. Oócitos fixos foram (immuno) rotulados com Hoechst (DNA) e anticorpo anti-α-tubulina (microtúbulos). A seta amarela indica a presença de PB e a seta branca destaca a posição dos microtúbulos birefringentes. Barra de escala = 20 μm. Este número foi modificado de Holubcová et al., JARG 20199. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: correlação da organização cromossomo-microtúse com padrão de birefringência detectada por microscopia óptica polarizada. O aparecimento de oócitos no campo luminoso combinado com um sinal fluorescente para cromossomas (ciano) e microtúbulos (magenta) (linha superior), e em luz polarizada (linha de fundo) é mostrado. Cada oócito foi fixado imediatamente após o exame de PLM. O DNA (Hoechst) e o microtubule (α-tubulin) foram manchados. (A-C) oócitos com eixo detectáveis por PLM ainda desalinhados cromossomas (a, B) ou pólos de eixo vagamente focados (C); (D-F) oócitos anormais sem eixo miI detectáveis por PLM mostrando subdesenvolvidos (d), apolar (E) ou sem fuso (F). A seta branca destaca a posição dos microtúbulos birefringentes, e o asterisco (*) indica a posição da cromatina desdensed. Barra de escala = 20 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: estruturas de Birefringência em oócitos humanos. Exemplos representativos de (A-D) estruturas birefringentes detectadas pelo PLM em oócitos humanos. ZP = zona pellucida; PM = membrana plasmática (oolema); RB = corpos de corpos, vacúolos. Seta branca, eixo meiótico em estágios diferentes da maturação. (E) desalinhamento do eixo miI com corpo polar (PB). (F) descolamento do eixo da membrana plasmática. Barra de escala = 20 μm. por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Complementar Figura 1: layout do desktop do software de análise de imagem. Por favor, clique aqui para baixar este arquivo.
Vídeo suplementar: procedimento de exame de PLM. A rotação do oócito é necessária para excluir a presença do eixo (seta). Barra de escala = 20 μm. por favor clique aqui para baixar este arquivo.
Discussion
O eixo meiótico acentrosomal em oócitos humanos é altamente dinâmico e uma estrutura delicada1. condições suboptimal, as fibras do microtubule despolimerizam rapidamente e o eixo meiótico desmonta30,31,32,33. Portanto, é extremamente importante garantir que as condições de cultura e micromanipulação de oócitos, a saber, temperatura e pH estão na faixa ideal. Para minimizar o risco de ruptura do fuso, os oócitos devem ser mantidos em um ambiente controlado por temperatura mantendo 37 ± 0,5 ° c nos meios de oócitos. O uso dos microscópios e da instalação do microinjection equipados com um estágio heated é exigido estritamente. Toda a manipulação com oócitos fora da incubadora deve ser realizada em meios tamponado HEPES/MOPS para evitar fluctulations pH. Para evitar potenciais efeitos adversos da entrega excessiva de oócitos na condição ambiente, o tempo total de exame de PLM não deve exceder 10 minutos. Os oócitos têm de ser analisados no prato de fundo de vidro com a tampa plástica removida porque o posicionamento de um plástico padrão no trajeto do feixe prejudica a análise da imagem. Como os pratos de plástico e de fundo de vidro têm características térmicas diferentes, a temperatura deve ser verificada diretamente nas gotas do meio de manuseio no prato de exame.
Além das condições laboratoriais, as diferenças processuais e as habilidades de micromanipulação do operador podem ter impacto na precisão do exame de PLM. Somente os fusos bipolares altamente montados podem ser visualizados não invasivamente. O sinal observado é proporcional ao grau de organização estrutural do eixo. Os fusos de nascente, apolar, afrouxados ou desarralhados exibem apenas a birefringência turva ou nenhuma (Figura 3 e Figura 4). Além disso, o alinhamento imperfeito da luz polarizada com matrizes microtubulas produz apenas uma birefringência translúcida e mal definida, apesar da presença real do eixo bipolar de poço desenvolvido (Figura 4). A menos que orientado corretamente, o sinal do eixo pôde facilmente ser faltado e a maturidade do oócito diagnosticada mal (vídeo suplementar). Para a imagem latente óptima do eixo, o oócito tem que ser girado corretamente em torno de cada linha central. Desde que o birrefringência não é visível nas oculares, o operador tem que prestar atenção à tela de computador ao executar a rotação do oocyte. A experiência prévia com micromanipulação e treinamento da imagem latente do eixo em oócitos vencidas excedentes in vitro é desejável antes de comutar à aplicação clínica.
Além do eixo, as células Cumulus em torno do oócito, oolema, a camada interna da zona pelúcida e algumas estruturas citoplasmáticas (por exemplo, corpos corpos, vacúolos) exibem birefringência (Figura 5a-D). A menos que removido completamente do oócito antes da imagem latente, as pilhas foliculares firmemente Unidas produzem o ruído de fundo e comprometem a deteção meiótico do eixo. Tenha cuidado para não confundir um grande corpo de corpos para o eixo. Muitas inclusões cytoplasmic que residem no brilho elevado da exposição do citoplasma que contrasta agudamente com o fundo escuro. O eixo meiotic, de um lado, mostra somente o sinal moderado, os limites borrados e atribui tipicamente ao oolema abaixo ou adjacente ao primeiro PB. Ocasionalmente, a examinação de PLM revela um desvio de eixo bruto de sua posição padrão (Figura 5E, F). Se houver um grande desalinhamento entre o aparelho de divisão e o PB, o PLM ajudará a orientar o oócito para evitar o risco de lesão do fuso durante a microinjeção. A posição relativa do fuso dentro do oócito não parece influenciar o potencial de desenvolvimento dos embriões resultantes17,34. Entretanto, quando o eixo se destaca competely do oolema, as anomalias da fertilização ocorrem. Curiosamente, alguns oócitos de baixa qualidade passam por uma desdenação da cromatina imediatamente após a extrusão do PB em vez de se iniciar o nucleamento de microtúcitos (Figura 4F). Usando a microscopia de luz convencional e o PB como o único marcador da maturidade do oócito, tais oócitos subcompetentes seriam considerados como fertilizable. Assim, além da avaliação morfológica rotineira, a imagem do eixo acrescenta informações importantes sobre a maturidade do ovo e pode servir como um marcador indireto de sua qualidade.
A incidência de oócitos MII alongados é susceptível de ser afetada pelas características da população estudada (por exemplo, antecedentes genéticos, condição médica, idade materna). Além disso, a proporção de oócitos com retardo desenvolvimental dentro da coorte influenciará o número real de oócitos detectados do eixo-negativo9,27. A visualização do fuso meiótico possibilita identificar claramente os oócitos fertilizáveis presos no estágio MII. Além disso, a segunda inspeção em um momento posterior pode revelar se o oócito eixo-negativo é anormal ou só recentemente progrediu através da transição mi/miI9,10,11. Quando autorizados a desenvolver um eixo antes do ICSI, mesmo os oócitos imaturos, que são rotineiramente descartados, podem produzir embriões viáveis9. Em ciclos com muito poucos oócitos disponíveis para fertilização, ICSI finamente cronometrado de oócitos expulsando PB pode servir como uma estratégia de resgate e alternativa ao cancelamento do ciclo.
No entanto, estender o tempo de pré-incubação não deve ser generalizado para todos os oócitos. Oócitos vencidas in vivo de Respondedores normais tipicamente exibem um eixo miI9,20,21,27. Aqui, a possibilidade de imagem latente bem sucedida do eixo diminui com o tempo em conseqüência do envelhecimento in vitro borne-ovulatory35. Se possível, o ICSI deve ser realizado no dia da recuperação e não deve exceder 9 horas (45 horas após o HCG), o período associado a um declínio na qualidade resultante do embrião36,37. Os oócitos que exibem fusos bipolares distintos devem ser submetidos ao ICSI sem demora. Em resumo, a otimização individualizada do sincronismo ICSI vale a pena em pacientes de mau prognóstico para excluir qualquer risco de injeção prematura de espermatozóides. No entanto, é desnecessário, muito demorado e trabalhoso para ser realizado em todos os ciclos de fertilização in vitro.
A análise de PLM revela se o oócito atingiu o estágio MII. Entretanto, a visualização não invasora do eixo meiótico não fornece nenhuma informação sobre a organização do cromossoma. Pode haver desalinhamento cromossômico grave e/ou cromatid relacionada à idade materna em oócitos com eixo bipolar (Figura 5). Vários outros fatores têm impacto significativo no sucesso da reprodução (por exemplo, fator espermática, mitocôndria, ativação do genoma embrionário, clivagem irregular, epigenetismo, endométrio, imunidade materna). Portanto, a detecção do eixo MII per se, não garante um desfecho clínico positivo do procedimento de FIV.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Gostaríamos de agradecer ao laboratório de embriologia da Reprofit International. Também reconhecemos a facilidade central CELLIM do CEITEC apoiada pela MEYS CR (LM2015062 Czech-BioImaging) por seu apoio com a obtenção de dados de imagem de imunofluorescência apresentados aqui.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Continuous Single Culture Complete with Human Serum Albumin | Irvine Scientific | 90164 | bicarbonate based single-step culture medium for embryo culture |
| Denuding micropipette 150 µm | Microtech IVF | 005-150C | |
| Denuding micropipette 180 µm | Microtech IVF | 005-180B | suitable for oocyte transfer between dishes |
| Denuding micropipette 200 µm | Microtech IVF | 005-250-A | suitable for oocyte transfer between dishes |
| FluoroDish | World Precision Instruments | FD 5040-100 | glass-bottom dish |
| (alternative: WillCo-dish GWST-5040 WillCo Wells) | |||
| Holding micropipette | Microtech | 001-120-30 | sterile glass microneedles |
| Hyaluronidase solution | Irvine Scientific | 90101 | for oocyte denudation |
| ICSI micropipette | Microtech | 002-5-30 | sterile glass microneedles |
| Micro Droplet Culture Dish | Vitrolife | 16003 | 12-well plate for embryo culture |
| Multipurpose Handling Medium (MHM) with Gentamicin | Irvine Scientific | 90163 | handling medium, MOPS/HEPES buffered |
| Nikon Eclipse TE 2000-U | Nikon | inverted microscope with heated stage | |
| Nunc IVF Petri Dish, 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 150270 | plastic ICSI dish |
| Nunc non-treated 4-well IVF dish | Thermo Fisher Scientific | 179830 | 4-well plate for embryo culture |
| OCTAX polarAide | MTG | integrated PLM system | |
| Oil for embryo culture | Irvine Scientific | 9305 | oil for overlay |
| Polyvinylpyrrolidone | Irvine Scientific | 90123 | for sperm immobilization prior to ICSI |
References
- Holubcova, Z., Blayney, M., Elder, K., Schuh, M. Human oocytes. Error-prone chromosome-mediated spindle assembly favors chromosome segregation defects in human oocytes. Science. 348 (6239), 1143-1147 (2015).
- Oudendijk, J. F., Yarde, F., Eijkemans, M. J., Broekmans, F. J., Broer, S. L. The poor responder in IVF: is the prognosis always poor?: a systematic review. Human Reproduction Update. 18 (1), 1-11 (2012).
- Gautam, N., Allahbadia, Y. M. Ovarian Stimulation Protocols. , Springer. India, Mumbai, India. (2016).
- Piqueras, P., et al. Live birth after replacement of an embryo obtained from a spontaneously in vitro matured metaphase-I oocyte. Systems Biology in Reproductive Medicine. 63 (3), 209-211 (2017).
- Liu, J., Lu, G., Qian, Y., Mao, Y., Ding, W. Pregnancies and births achieved from in vitro matured oocytes retrieved from poor responders undergoing stimulation in in vitro fertilization cycles. Fertility and Sterility. 80 (2), 447-449 (2003).
- Shu, Y., et al. Fertilization, embryo development, and clinical outcome of immature oocytes from stimulated intracytoplasmic sperm injection cycles. Fertility and Sterility. 87 (5), 1022-1027 (2007).
- Sachdev, N. M., Grifo, J. A., Licciardi, F. Delayed intracytoplasmic sperm injection (ICSI) with trophectoderm biopsy and preimplantation genetic screening (PGS) show increased aneuploidy rates but can lead to live births with single thawed euploid embryo transfer (STEET). Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (11), 1501-1505 (2016).
- De Vos, A., Van de Velde, H., Joris, H., Van Steirteghem, A. In-vitro matured metaphase-I oocytes have a lower fertilization rate but similar embryo quality as mature metaphase-II oocytes after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 14 (7), 1859-1863 (1999).
- Holubcova, Z., et al. Egg maturity assessment prior to ICSI prevents premature fertilization of late-maturing oocytes. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 36 (3), 445-452 (2019).
- Montag, M., Schimming, T., van der Ven, H. Spindle imaging in human oocytes: the impact of the meiotic cell cycle. Reproductive BioMedicine Online. 12 (4), 442-446 (2006).
- Montag, M., van der Ven, H. Symposium: innovative techniques in human embryo viability assessment. Oocyte assessment and embryo viability prediction: birefringence imaging. Reproductive BioMedicine Online. 17 (4), 454-460 (2008).
- Keefe, D., Liu, L., Wang, W., Silva, C. Imaging meiotic spindles by polarization light microscopy: principles and applications to IVF. Reproductive BioMedicine Online. 7 (1), 24-29 (2003).
- Caamano, J. N., Munoz, M., Diez, C., Gomez, E. Polarized light microscopy in mammalian oocytes. Reproduction in Domestic Animals. 45, 49-56 (2010).
- Eichenlaub-Ritter, U., Shen, Y., Tinneberg, H. R. Manipulation of the oocyte: possible damage to the spindle apparatus. Reproductive BioMedicine Online. 5 (2), 117-124 (2002).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. The spindle observation and its relationship with fertilization after intracytoplasmic sperm injection in living human oocytes. Fertility and Sterility. 75 (2), 348-353 (2001).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Keefe, D. L. Developmental ability of human oocytes with or without birefringent spindles imaged by Polscope before insemination. Human Reproduction. 16 (7), 1464-1468 (2001).
- Moon, J. H., et al. Visualization of the metaphase II meiotic spindle in living human oocytes using the Polscope enables the prediction of embryonic developmental competence after ICSI. Human Reproduction. 18 (4), 817-820 (2003).
- Cohen, Y., et al. Spindle imaging: a new marker for optimal timing of ICSI? Human Reproduction. 19 (3), 649-654 (2004).
- Rama Raju, G. A., Prakash, G. J., Krishna, K. M., Madan, K. Meiotic spindle and zona pellucida characteristics as predictors of embryonic development: a preliminary study using PolScope imaging. Reproductive BioMedicine Online. 14 (2), 166-174 (2007).
- Heindryckx, B., De Gheselle, S., Lierman, S., Gerris, J., De Sutter, P. Efficiency of polarized microscopy as a predictive tool for human oocyte quality. Human Reproduction. 26 (3), 535-544 (2011).
- Kilani, S., Cooke, S., Tilia, L., Chapman, M. Does meiotic spindle normality predict improved blastocyst development, implantation and live birth rates? Fertility and Sterility. 96 (2), 389-393 (2011).
- Kilani, S., Chapman, M. G. Meiotic spindle normality predicts live birth in patients with recurrent in vitro fertilization failure. Fertility and Sterility. 101 (2), 403-406 (2014).
- Tilia, L., Venetis, C., Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Is oocyte meiotic spindle morphology associated with embryo ploidy? A prospective cohort study. Fertility and Sterility. 105 (4), 1085-1092 (2016).
- ESHRE Guideline Group on Good Practice in IVF Labs, De los Santos, M. J., et al. Revised guidelines for good practice in IVF laboratories (2015). Human Reproduction. 31 (4), 685-686 (2016).
- Principles of IVF Laboratory Practice: Optimizing Performance and Outcomes. Montag, M., Morbeck, D. , Cambridge University Press. Cambridge, UK. (2017).
- Chamayou, S., et al. Meiotic spindle presence and oocyte morphology do not predict clinical ICSI outcomes: a study of 967 transferred embryos. Reproductive BioMedicine Online. 13 (5), 661-667 (2006).
- Rienzi, L., et al. Relationship between meiotic spindle location with regard to the polar body position and oocyte developmental potential after ICSI. Human Reproduction. 18 (6), 1289-1293 (2003).
- Woodward, B. J., Montgomery, S. J., Hartshorne, G. M., Campbell, K. H., Kennedy, R. Spindle position assessment prior to ICSI does not benefit fertilization or early embryo quality. Reproductive BioMedicine Online. 16 (2), 232-238 (2008).
- Kilani, S., Cooke, S., Chapman, M. Time course of meiotic spindle development in MII oocytes. Zygote. 19 (1), 55-62 (2011).
- Wang, W. H., Meng, L., Hackett, R. J., Odenbourg, R., Keefe, D. L. Limited recovery of meiotic spindles in living human oocytes after cooling-rewarming observed using polarized light microscopy. Human Reproduction. 16 (11), 2374-2378 (2001).
- Sun, X. F., Wang, W. H., Keefe, D. L. Overheating is detrimental to meiotic spindles within in vitro matured human oocytes. Zygote. 12 (1), 65-70 (2004).
- Mullen, S. F., et al. The effect of osmotic stress on the metaphase II spindle of human oocytes, and the relevance to cryopreservation. Human Reproduction. 19 (5), 1148-1154 (2004).
- Swearman, H., et al. pH: the silent variable significantly impacting meiotic spindle assembly in mouse oocytes. Reproductive BioMedicine Online. 37 (3), 279-290 (2018).
- Rienzi, L., Vajta, G., Ubaldi, F. Predictive value of oocyte morphology in human IVF: a systematic review of the literature. Human Reproduction Update. 17 (1), 34-45 (2011).
- Miao, Y. L., Kikuchi, K., Sun, Q. Y., Schatten, H. Oocyte aging: cellular and molecular changes, developmental potential and reversal possibility. Human Reproduction Update. 15 (5), 573-585 (2009).
- Pujol, A., Garcia, D., Obradors, A., Rodriguez, A., Vassena, R. Is there a relation between the time to ICSI and the reproductive outcomes? Human Reproduction. 33 (5), 797-806 (2018).
- Yanagida, K., et al. Influence of oocyte preincubation time on fertilization after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (8), 2223-2226 (1998).
