Summary

Målrettet antistof blokering ved et dobbelt funktionelt konjugat af antigene peptid og FC-III-Mimetika (DCAF)

Published: September 17, 2019
doi:

Summary

Udvikling af en dual-funktionelle konjugat af antigene peptid og FC-III MIME (DCAF) er en roman til eliminering af skadelige antistoffer. Her beskriver vi en detaljeret protokol for syntesen af DCAF1 molekyle, som selektivt kan blokere 4G2 antistof for at eliminere antistof afhængige ekstraudstyr effekt under dengue virus infektion.

Abstract

Eliminering af skadelige antistoffer fra organismer er en værdifuld tilgang til intervention af antistof-associerede sygdomme, såsom Dengue hæmoragisk feber og autoimmune sygdomme. Da tusinder af antistoffer med forskellige epitoper cirkulerer i blodet, blev ingen universel metode, bortset fra Dual-funktionelle konjugat af antigene peptid og FC-III MIME (DCAF), rapporteret til at målrette specifikke skadelige antistoffer. Udviklingen af DCAF-molekyler bidrager betydeligt til udviklingen af målrettet terapi, som blev påvist at eliminere antistof afhængige ekstraudstyr (ADE) effekt i en dengue virus (DENV) infektion model og at øge acetylcholin receptor aktivitet i en myasthenia gravis-model. Her beskriver vi en protokol for syntesen af et DCAF-molekyle (DCAF1), som selektivt kan blokere 4G2-antistof for at dæmpe ADE-effekten under Denguevirus infektion og illustrere bindingen af DCAF1 til 4G2-antistof ved en ELISA-analyse. I vores metode, DCAF1 er syntetiseret ved konjugering af en hydrazin derivat af en FC-III peptid og en rekombinant udtrykt lang α-Helix med antigen sekvens gennem Native kemisk ligering (NCL). Denne protokol er blevet anvendt med succes på DCAF1 samt andre DCAF-molekyler til målretning af deres cognate-antistoffer.

Introduction

Antistoffer spiller vigtige roller i humorale immunrespons for neutralisering af patogene bakterier og vira1. Men, nogle antistoffer udviser skadelige virkninger for organismer, såsom cross-reaktive antistoffer i ade effekt under DENV infektion og over-reaktive antistoffer i myasthenia gravis, som er en autoimmune sygdomme2,3. ADE effekt er medieret af de Cross-reaktive antistoffer, der gør broen til at forbinde DENV og FC receptor præsenterer celler4,5, mensmyasthenia gravis er forårsaget af de overdrevneantistoffer, derangriber acetylcholin receptorer mellem celle-celle vejkryds i muskelvæv6,7. Selv om delvis effektive tilgange er blevet udviklet til behandling af disse sygdomme8,9, vil uden tvivl direkte eliminering af disse skadelige antistoffer gøre fremskridt for interventionerne.

For nylig er DCAF-molekyler, som har dual-funktionelle grupper, blevet udviklet til målrettet antistof blokering10. DCAF er et langt peptid, der består af 3 dele: 1) en antigen del, der specifikt kan genkende det cognate antistof, 2) en FC-III eller FC-III-4C-tag for stærkt binding til FC-området af antistoffet for at hæmme enten FC-receptoren eller komplement komponent proteiner , 3) en lang α-spiralformet linker, der konjugater disse to funktionelle grupper10. Linker-delen, der er designet fra Moesin FERM Domain, blev optimeret af Rosseta-software for at sikre, at antigen delen og FC-III-delen i et DCAF-molekyle kan binde sig til de fabelagtige og FC-regioner i IgG samtidigt. Fire DCAF molekyler er blevet syntetiseret til at målrette 4 forskellige antistoffer, blandt dem DCAF1 blev brugt til at fjerne 4G2 antistof, som er et kryds reaktivt antistof under DENV infektion at bidrage til ADE effekt; og DACF4 blev designet til redning af acetylcholin receptorer ved at blokere mab35 antistof i myasthenia gravis10.

I denne undersøgelse, der blev taget DCAF1 som eksemplet, viste vi protokollerne for syntesen af DCAF-molekyle og påvisning af samspillet mellem en DCAF og det deraf følgende cognate-antistof. DCAF1 er semi-syntetiseret af NCL approach11,12,13,14, som konjugater hydrazin derivatet af et FC-III peptid og de udtrykte linker-antigen dele sammen. NCL tilgang har betydelige fordele i forhold til fuldt kemisk syntese og fuldt rekombinant udtryk for DCAF1 syntese, fordi begge disse metoder fører til lav udbytte og høje omkostninger. Den nuværende tilgang er ikke kun den mest omkostningseffektive måde at få fuld længde DCAF, men også kan opretholde konstellationen af linker del lignende som sin oprindelige form. Da forskellige DCAF-molekyler har lignende sekvenser bortset fra antigen delene, kan vores metoder til DCAF1 syntese og interaktions analysen mellem DCAF1 og 4G2 antistof anvendes på andre DCAF-molekyler til målrettet blokering af deres cognate-antistoffer.

Protocol

1. kemisk syntese af hydrazinderivatet af et FC-III peptid Konvertering af 2-CL-(TRT)-CL harpiks til 2-CL-(TRT)-NHNH2 harpiks Vejer 625 mg 2-CL-(TRT)-CL harpiks (0,25 mmol) i et 25 mL peptidsyntese fartøj. Der tilsættes 5 mL N, N-dimethylformamid (DMF) til harpiksen fra toppen af beholderen, sættes hætten tilbage, rystes forsigtigt beholderen i 15 s og derefter dræne den. Gentag DMF-vask i to gange. Tilsæt 5 mL dichlormethan (DCM) til beholderen,…

Representative Results

Rutediagrammet for syntese ruten efter Native Chemical ligering i denne artikel er vist i figur 1. Figur 2-6 viser kromatogrammer (A) og massespektre (B) af kemisk syntetiseret HYDRAZIN derivat af et FC-III peptid, rekombinant udtrykt linker og antigen del, det rensede produkt fra NCL-reaktion, den rensede produkt fra desulfurisering-reaktionen og det rensede endelige produkt DCAF1. Kromatogrammerne viser, at rensningen af alle produkterne e…

Discussion

Protokollen her beskriver semi-syntese og påvisning af DCAF1 ved hjælp af NCL tilgang, som er vist i figur 1. Kort, de to fragmenter af DCAF1 er kemiske syntetiseret og rekombinant udtrykt, henholdsvis; derefter, den fulde længde DCAF1 molekyle er samlet, modificeret og renset. For den hydrazin afledte FC-III fragment syntese, ved hjælp af lav kapacitet 2-CL harpiks er ganske vigtigt, fordi høj kapacitet har en negativ effekt for hydrazin generation og fører til lav udbytte af produkte…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev delvist støttet af Tsinghua University-Gates Foundation (nr. OPP1021992), den nationale naturvidenskabelige fond i Kina (nr. 21502103, 21877068 og 041301475), og det nationale centrale forsknings-og udviklings program i Kina (no. 2017YFA0505103).

Materials

2-Chlorotrityl resin Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide GL Biochem 00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate GL Biochem 00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride J&K Scientific 503236
4G2 antibody Thermo MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid Alfa Aesar H27658
96-well microtiter plates NEST 701001
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
AgOAc Sinopharm Chemical Reagent 30164324
anti-GST antibody Abclonal AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076P2
BSA Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer Applied Photophysics Ltd
dialysis bag Sbjbio SBJ132636
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent 80047360
diethyl ether Sinopharm Chemical Reagent 10009318
DNA Gel Extraction Kit Beyotime D0056
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
GSH Sepharose GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride Sinopharm Chemical Reagent 30095516
Hydrazine hydrate Sinopharm Chemical Reagent 80070418
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent 10011018
imidazole SIGMA 12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside SIGMA 5502-5G
kanamycin Beyotime ST101
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine GL Biochem 90600
N, N-Dimethylformamide Sinopharm Chemical Reagent 8100771933
NcoI Thermo ER0571
PBS buffer Solarbio P1022
Peptide BEH C18 Column Waters 186003625
piperidine Sinopharm Chemical Reagent 80104216
Plasmid Extraction Kit Sangon Biotech B611253-0002
QIAexpress Kit QIAGEN 32149
Rapid DNA Ligation Kit Beyotime D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent 20040718
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent 10019762
Sodium nitrite Sinopharm Chemical Reagent 10020018
sodium chloride Sinopharm Chemical Reagent 10019318
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem
sterilizing pot Tomy SX-700
SUMO Protease Thermo Fisher 12588018
stop solution Biolegend 423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent Biolegend 421101
Trifluoroacetic acid SIGMA T6508
Triisopropylsilane GL Biochem 91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Aladdin T107252-5g
tryptone OXOID LP0042
Tween 20 Solarbio T8220
Ultimate 3000 HPLC Thermo
vacuum pump YUHUA SHZ-95B
XhoI Thermo IVGN0086
yeast extract OXOID LP0021

References

  1. Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. . Human Physiology (4th ed.). , (2003).
  2. Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
  3. Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
  4. Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
  5. Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
  6. Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis – autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
  7. Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
  8. Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
  9. Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
  10. Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
  11. Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
  12. Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
  13. Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
  14. Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).

Play Video

Cite This Article
Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao, X., Pan, J., Deng, H., Feng, S. Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF). J. Vis. Exp. (151), e60063, doi:10.3791/60063 (2019).

View Video