Udvikling af en dual-funktionelle konjugat af antigene peptid og FC-III MIME (DCAF) er en roman til eliminering af skadelige antistoffer. Her beskriver vi en detaljeret protokol for syntesen af DCAF1 molekyle, som selektivt kan blokere 4G2 antistof for at eliminere antistof afhængige ekstraudstyr effekt under dengue virus infektion.
Eliminering af skadelige antistoffer fra organismer er en værdifuld tilgang til intervention af antistof-associerede sygdomme, såsom Dengue hæmoragisk feber og autoimmune sygdomme. Da tusinder af antistoffer med forskellige epitoper cirkulerer i blodet, blev ingen universel metode, bortset fra Dual-funktionelle konjugat af antigene peptid og FC-III MIME (DCAF), rapporteret til at målrette specifikke skadelige antistoffer. Udviklingen af DCAF-molekyler bidrager betydeligt til udviklingen af målrettet terapi, som blev påvist at eliminere antistof afhængige ekstraudstyr (ADE) effekt i en dengue virus (DENV) infektion model og at øge acetylcholin receptor aktivitet i en myasthenia gravis-model. Her beskriver vi en protokol for syntesen af et DCAF-molekyle (DCAF1), som selektivt kan blokere 4G2-antistof for at dæmpe ADE-effekten under Denguevirus infektion og illustrere bindingen af DCAF1 til 4G2-antistof ved en ELISA-analyse. I vores metode, DCAF1 er syntetiseret ved konjugering af en hydrazin derivat af en FC-III peptid og en rekombinant udtrykt lang α-Helix med antigen sekvens gennem Native kemisk ligering (NCL). Denne protokol er blevet anvendt med succes på DCAF1 samt andre DCAF-molekyler til målretning af deres cognate-antistoffer.
Antistoffer spiller vigtige roller i humorale immunrespons for neutralisering af patogene bakterier og vira1. Men, nogle antistoffer udviser skadelige virkninger for organismer, såsom cross-reaktive antistoffer i ade effekt under DENV infektion og over-reaktive antistoffer i myasthenia gravis, som er en autoimmune sygdomme2,3. ADE effekt er medieret af de Cross-reaktive antistoffer, der gør broen til at forbinde DENV og FC receptor præsenterer celler4,5, mensmyasthenia gravis er forårsaget af de overdrevneantistoffer, derangriber acetylcholin receptorer mellem celle-celle vejkryds i muskelvæv6,7. Selv om delvis effektive tilgange er blevet udviklet til behandling af disse sygdomme8,9, vil uden tvivl direkte eliminering af disse skadelige antistoffer gøre fremskridt for interventionerne.
For nylig er DCAF-molekyler, som har dual-funktionelle grupper, blevet udviklet til målrettet antistof blokering10. DCAF er et langt peptid, der består af 3 dele: 1) en antigen del, der specifikt kan genkende det cognate antistof, 2) en FC-III eller FC-III-4C-tag for stærkt binding til FC-området af antistoffet for at hæmme enten FC-receptoren eller komplement komponent proteiner , 3) en lang α-spiralformet linker, der konjugater disse to funktionelle grupper10. Linker-delen, der er designet fra Moesin FERM Domain, blev optimeret af Rosseta-software for at sikre, at antigen delen og FC-III-delen i et DCAF-molekyle kan binde sig til de fabelagtige og FC-regioner i IgG samtidigt. Fire DCAF molekyler er blevet syntetiseret til at målrette 4 forskellige antistoffer, blandt dem DCAF1 blev brugt til at fjerne 4G2 antistof, som er et kryds reaktivt antistof under DENV infektion at bidrage til ADE effekt; og DACF4 blev designet til redning af acetylcholin receptorer ved at blokere mab35 antistof i myasthenia gravis10.
I denne undersøgelse, der blev taget DCAF1 som eksemplet, viste vi protokollerne for syntesen af DCAF-molekyle og påvisning af samspillet mellem en DCAF og det deraf følgende cognate-antistof. DCAF1 er semi-syntetiseret af NCL approach11,12,13,14, som konjugater hydrazin derivatet af et FC-III peptid og de udtrykte linker-antigen dele sammen. NCL tilgang har betydelige fordele i forhold til fuldt kemisk syntese og fuldt rekombinant udtryk for DCAF1 syntese, fordi begge disse metoder fører til lav udbytte og høje omkostninger. Den nuværende tilgang er ikke kun den mest omkostningseffektive måde at få fuld længde DCAF, men også kan opretholde konstellationen af linker del lignende som sin oprindelige form. Da forskellige DCAF-molekyler har lignende sekvenser bortset fra antigen delene, kan vores metoder til DCAF1 syntese og interaktions analysen mellem DCAF1 og 4G2 antistof anvendes på andre DCAF-molekyler til målrettet blokering af deres cognate-antistoffer.
Protokollen her beskriver semi-syntese og påvisning af DCAF1 ved hjælp af NCL tilgang, som er vist i figur 1. Kort, de to fragmenter af DCAF1 er kemiske syntetiseret og rekombinant udtrykt, henholdsvis; derefter, den fulde længde DCAF1 molekyle er samlet, modificeret og renset. For den hydrazin afledte FC-III fragment syntese, ved hjælp af lav kapacitet 2-CL harpiks er ganske vigtigt, fordi høj kapacitet har en negativ effekt for hydrazin generation og fører til lav udbytte af produkte…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev delvist støttet af Tsinghua University-Gates Foundation (nr. OPP1021992), den nationale naturvidenskabelige fond i Kina (nr. 21502103, 21877068 og 041301475), og det nationale centrale forsknings-og udviklings program i Kina (no. 2017YFA0505103).
2-Chlorotrityl resin | Tianjin Nankai HECHENG S&T | ||
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide | GL Biochem | 00703 | |
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate | GL Biochem | 00706 | |
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride | J&K Scientific | 503236 | |
4G2 antibody | Thermo | MA5-24387 | |
4-mercaptophenylacetic acid | Alfa Aesar | H27658 | |
96-well microtiter plates | NEST | 701001 | |
Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
AgOAc | Sinopharm Chemical Reagent | 30164324 | |
anti-GST antibody | Abclonal | AE001 | |
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
CD spectrometer | Applied Photophysics Ltd | ||
dialysis bag | Sbjbio | SBJ132636 | |
Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent | 80047360 | |
diethyl ether | Sinopharm Chemical Reagent | 10009318 | |
DNA Gel Extraction Kit | Beyotime | D0056 | |
Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
Guanidine hydrochloride | Sinopharm Chemical Reagent | 30095516 | |
Hydrazine hydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 80070418 | |
Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10011018 | |
imidazole | SIGMA | 12399-100G | |
Isopropyl β-D-Thiogalactoside | SIGMA | 5502-5G | |
kanamycin | Beyotime | ST101 | |
Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
N, N-Diisopropylethylamine | GL Biochem | 90600 | |
N, N-Dimethylformamide | Sinopharm Chemical Reagent | 8100771933 | |
NcoI | Thermo | ER0571 | |
PBS buffer | Solarbio | P1022 | |
Peptide BEH C18 Column | Waters | 186003625 | |
piperidine | Sinopharm Chemical Reagent | 80104216 | |
Plasmid Extraction Kit | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
Rapid DNA Ligation Kit | Beyotime | D7002 | |
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | |
Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent | 10019762 | |
Sodium nitrite | Sinopharm Chemical Reagent | 10020018 | |
sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | |
Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem | ||
sterilizing pot | Tomy | SX-700 | |
SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
stop solution | Biolegend | 423001 | |
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen | Taihe Biotechnology Compay | ||
TMB reagent | Biolegend | 421101 | |
Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6508 | |
Triisopropylsilane | GL Biochem | 91100 | |
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Aladdin | T107252-5g | |
tryptone | OXOID | LP0042 | |
Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
Ultimate 3000 HPLC | Thermo | ||
vacuum pump | YUHUA | SHZ-95B | |
XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
yeast extract | OXOID | LP0021 |