נוגדנים ממוקד חסימה על ידי המשלים כפול תפקודית של פפטיד Antigenic ו-השלישי מימטיקה (בית קפה)
Summary
פיתוח של המשלים כפול תפקודית של פפטיד אנטיגניים ו-Fc-III mimetics (DCAF) הוא הרומן לחיסול של נוגדנים מזיקים. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לסינתזה של מולקולה DCAF1, אשר יכול באופן סלקטיבי לחסום נוגדן 4G2 כדי לחסל את ההשפעה התלויה נוגדן שיפור במהלך זיהום וירוס דנגה.
Abstract
חיסול של נוגדנים מזיקים מאורגניזמים הוא גישה רבת ערך להתערבות של מחלות הקשורות נוגדן, כגון קדחת דנגה מדמם ומחלות אוטואימוניות. מאחר שאלפי נוגדנים בעלי אפיסקופים שונים מסתובבים בדם, אין שיטה אוניברסלית, למעט המשלים הדו-תפקודי של הפפטיד האנטי-גניים ו-Fc-III (DCAF), דווחה כדי למקד את הנוגדנים המזיקים הספציפיים. הפיתוח של מולקולות DCAF הופכת תרומה משמעותית להתקדמות של טיפול ממוקד, אשר הוכחו לחסל את ההשפעה שיפור הנוגדן (ADE) אפקט של נגיף דנגה (DENV) זיהום המודל כדי להגביר את אצטילכולין הקולטן פעילות במודל מיאסטניה גרביס. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לסינתזה של מולקולה DCAF (DCAF1), אשר ניתן באופן סלקטיבי לחסום נוגדן 4G2 כדי להחליש את אפקט ADE במהלך זיהום וירוס דנגה, ולהמחיש את הכריכה של DCAF1 כדי 4G2 נוגדן על ידי שיטת אליסה. בשיטה שלנו, DCAF1 הוא מסונתז על ידי הקוניוגציה של נגזרת של הידראזין של פפטיד Fc-III ו רקומביננטי הביע לאורך α-סליל עם רצף אנטיגניים באמצעות הקשר הכימי המקורי (NCL). פרוטוקול זה הוחל בהצלחה על DCAF1, כמו גם מולקולות אחרות של dcaf לצורך התמקדות נוגדנים קנצוני שלהם.
Introduction
נוגדנים לשחק תפקידים חשובים בתגובה החיסונית ומוראלית עבור נטרול של חיידקים פתוגניים ווירוסים1. עם זאת, נוגדנים מסוימים מפגין השפעות מזיקות לאורגניזמים, כגון נוגדנים מתגובתית באפקט ADE במהלך זיהום denv ונוגדנים מגיבים יותר במיאסטניה גראביס, שהיא מחלות אוטואימוניות2,3. האפקט ADE מתווכת על ידי הנוגדנים החוצה תגובתי שעושים את הגשר להתחבר denv ו הקולטן Fc הצגת תאים4,5, בעוד מיאסטניה גרביס נגרמת על ידי נוגדנים מוגזמת התוקפים קולטני אצטילכולין בין הצמתים של תאי התא. ברקמת שריר6,7 למרות שגישות אפקטיביות חלקית פותחו כדי לטפל במחלות אלה8,9, ללא ספק חיסול ישיר של נוגדנים מזיקים אלה יהיה להתקדם התערבויות.
לאחרונה, מולקולות DCAF אשר בעלי פונקציונליות כפולה, פותחו עבור נוגדנים ממוקד חסימת10. Dcaf הוא פפטיד ארוך המורכב מ 3 חלקים: 1) חלק אנטיגן שיכול ספציפי לזהות את הנוגדן קנצוני, 2) fc-iii או השלישי-4c תג עבור מחייב מאוד את האזור fc של נוגדן לעכב או קולטן fc או המשלים חלבונים רכיב , 3) מקשר ארוך α-helical המעלה את שתי הקבוצות האלה פונקציונלי10. החלק המקשר, שתוכנן מתחום מוסין FERM, היה ממוטב על ידי תוכנת Rosseta כדי להבטיח את החלק אנטיגן ו-Fc-III חלק במולקולה DCAF יכול לאגד את האזורים Fab ו Fc של IgG בו. ארבעה מולקולות DCAF יש כבר מסונתז ליעד 4 נוגדנים שונים, ביניהם DCAF1 השתמשו כדי לחסל את הנוגדן 4G2, אשר הוא נוגדן חוצה תגובתי במהלך זיהום DENV לתרום לאפקט ADE; ו DACF4 נועד להצלת קולטני אצטילכולין ידי חסימת mab35 נוגדן במיאסטניה גרביס10.
במחקר הנוכחי, נלקח DCAF1 כדוגמה, הצגנו את הפרוטוקולים לסינתזה של מולקולה dcaf ואת הזיהוי של האינטראקציה בין dcaf ו נוגדן קנצוני שלה. הDCAF1 הוא מסונתז למחצה על ידי הגישה משנת11,12,13,14, אשר מעלה באוב את נגזרות הידראזין של פפטיד Fc-III ואת החלקים מתבטא-אנטיגן ביחד. הגישה NCL יש יתרונות משמעותיים על גבי סינתזה כימית מלאה ביטוי מלא רקומביננטי עבור סינתזה DCAF1, כי שתי שיטות אלה להוביל תשואה נמוכה ועלות גבוהה. הגישה הנוכחית היא לא רק הדרך החסכונית ביותר כדי לקבל את DCAF באורך מלא, אבל גם יכול לשמור על היווצרות של חלק המקשר דומה לצורתו הטבעית. מאז שונים מולקולות dcaf יש רצפים דומים למעט החלקים אנטיגן, השיטות שלנו לסינתזה DCAF1 ואת הקושי האינטראקציה בין DCAF1 ו 4g2 נוגדן ניתן להחיל מולקולות אחרות dcaf כדי ממוקדות לחסום נוגדנים קנצוני שלהם גם.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול מתאר להלן את הסינתזה והזיהוי של DCAF1 באמצעות גישת NCL, המוצגת באיור 1. בקצרה, שני שברי DCAF1 הם מסונתז כימי recombinantly ביטא, בהתאמה; לאחר מכן, אורך מלא DCAF1 מולקולה מורכב, שונה ומטוהר. לצורך הידראזין הנגזר הסינתזה של החלקיק השלישי, שימוש ב-2-Cl בעל קיבולת נמוכה, הוא די חשוב, מכיוו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת בחלקו על ידי קרן שערי אוניברסיטת Tsinghua (לא. OPP1021992), הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (no. 21502103, 21877068 ו 041301475), ואת תוכנית המחקר ופיתוח המפתח הלאומי של סין (no 2017YFA0505103).
Materials
| 2-Chlorotrityl resin | Tianjin Nankai HECHENG S&T | ||
| 1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide | GL Biochem | 00703 | |
| 2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate | GL Biochem | 00706 | |
| 2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride | J&K Scientific | 503236 | |
| 4G2 antibody | Thermo | MA5-24387 | |
| 4-mercaptophenylacetic acid | Alfa Aesar | H27658 | |
| 96-well microtiter plates | NEST | 701001 | |
| Acetonitrile | Thermo-Fisher | A955 | MS Grade |
| AgOAc | Sinopharm Chemical Reagent | 30164324 | |
| anti-GST antibody | Abclonal | AE001 | |
| Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling Technology | 7076P2 | |
| BSA | Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL | ||
| CD spectrometer | Applied Photophysics Ltd | ||
| dialysis bag | Sbjbio | SBJ132636 | |
| Dichloromethane | Sinopharm Chemical Reagent | 80047360 | |
| diethyl ether | Sinopharm Chemical Reagent | 10009318 | |
| DNA Gel Extraction Kit | Beyotime | D0056 | |
| Fusion Lumos mass spectrometer | Thermo | ||
| GSH Sepharose | GE Lifesciences | ||
| Guanidine hydrochloride | Sinopharm Chemical Reagent | 30095516 | |
| Hydrazine hydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 80070418 | |
| Hydrochloric acid | Sinopharm Chemical Reagent | 10011018 | |
| imidazole | SIGMA | 12399-100G | |
| Isopropyl β-D-Thiogalactoside | SIGMA | 5502-5G | |
| kanamycin | Beyotime | ST101 | |
| Methanol | Thermo-Fisher | A456 | MS Grade |
| N, N-Diisopropylethylamine | GL Biochem | 90600 | |
| N, N-Dimethylformamide | Sinopharm Chemical Reagent | 8100771933 | |
| NcoI | Thermo | ER0571 | |
| PBS buffer | Solarbio | P1022 | |
| Peptide BEH C18 Column | Waters | 186003625 | |
| piperidine | Sinopharm Chemical Reagent | 80104216 | |
| Plasmid Extraction Kit | Sangon Biotech | B611253-0002 | |
| QIAexpress Kit | QIAGEN | 32149 | |
| Rapid DNA Ligation Kit | Beyotime | D7002 | |
| Sodium dihydrogen phosphate dihydrate | Sinopharm Chemical Reagent | 20040718 | |
| Sodium hydroxide | Sinopharm Chemical Reagent | 10019762 | |
| Sodium nitrite | Sinopharm Chemical Reagent | 10020018 | |
| sodium chloride | Sinopharm Chemical Reagent | 10019318 | |
| Standard Fmoc-protected amino acids | GL Biochem | ||
| sterilizing pot | Tomy | SX-700 | |
| SUMO Protease | Thermo Fisher | 12588018 | |
| stop solution | Biolegend | 423001 | |
| the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen | Taihe Biotechnology Compay | ||
| TMB reagent | Biolegend | 421101 | |
| Trifluoroacetic acid | SIGMA | T6508 | |
| Triisopropylsilane | GL Biochem | 91100 | |
| Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Aladdin | T107252-5g | |
| tryptone | OXOID | LP0042 | |
| Tween 20 | Solarbio | T8220 | |
| Ultimate 3000 HPLC | Thermo | ||
| vacuum pump | YUHUA | SHZ-95B | |
| XhoI | Thermo | IVGN0086 | |
| yeast extract | OXOID | LP0021 |
References
- Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. . Human Physiology (4th ed.). , (2003).
- Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
- Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
- Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
- Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
- Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis – autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
- Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
- Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
- Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
- Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
- Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
- Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
- Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
- Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).
