Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Målrettet antistof blokering ved et dobbelt funktionelt konjugat af antigene peptid og FC-III-Mimetika (DCAF)

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60063
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 2, 2, 3, 1,2
1Key Laboratory of Structural Biology of Zhejiang Province, School of Life Sciences, Westlake University, 2Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, 3MOE Key Laboratory of Bioinformatics, Center for Synthetic and Systems Biology, School of Life Sciences, Tsinghua University
* These authors contributed equally

Summary

Udvikling af en dual-funktionelle konjugat af antigene peptid og FC-III MIME (DCAF) er en roman til eliminering af skadelige antistoffer. Her beskriver vi en detaljeret protokol for syntesen af DCAF1 molekyle, som selektivt kan blokere 4G2 antistof for at eliminere antistof afhængige ekstraudstyr effekt under dengue virus infektion.

Abstract

Eliminering af skadelige antistoffer fra organismer er en værdifuld tilgang til intervention af antistof-associerede sygdomme, såsom Dengue hæmoragisk feber og autoimmune sygdomme. Da tusinder af antistoffer med forskellige epitoper cirkulerer i blodet, blev ingen universel metode, bortset fra Dual-funktionelle konjugat af antigene peptid og FC-III MIME (DCAF), rapporteret til at målrette specifikke skadelige antistoffer. Udviklingen af DCAF-molekyler bidrager betydeligt til udviklingen af målrettet terapi, som blev påvist at eliminere antistof afhængige ekstraudstyr (ADE) effekt i en dengue virus (DENV) infektion model og at øge acetylcholin receptor aktivitet i en myasthenia gravis-model. Her beskriver vi en protokol for syntesen af et DCAF-molekyle (DCAF1), som selektivt kan blokere 4G2-antistof for at dæmpe ADE-effekten under Denguevirus infektion og illustrere bindingen af DCAF1 til 4G2-antistof ved en ELISA-analyse. I vores metode, DCAF1 er syntetiseret ved konjugering af en hydrazin derivat af en FC-III peptid og en rekombinant udtrykt lang α-Helix med antigen sekvens gennem Native kemisk ligering (NCL). Denne protokol er blevet anvendt med succes på DCAF1 samt andre DCAF-molekyler til målretning af deres cognate-antistoffer.

Introduction

Antistoffer spiller vigtige roller i humorale immunrespons for neutralisering af patogene bakterier og vira1. Men, nogle antistoffer udviser skadelige virkninger for organismer, såsom cross-reaktive antistoffer i ade effekt under DENV infektion og over-reaktive antistoffer i myasthenia gravis, som er en autoimmune sygdomme2,3. ADE effekt er medieret af de Cross-reaktive antistoffer, der gør broen til at forbinde DENV og FC receptor præsenterer celler4,5, mensmyasthenia gravis er forårsaget af de overdrevneantistoffer, derangriber acetylcholin receptorer mellem celle-celle vejkryds i muskelvæv6,7. Selv om delvis effektive tilgange er blevet udviklet til behandling af disse sygdomme8,9, vil uden tvivl direkte eliminering af disse skadelige antistoffer gøre fremskridt for interventionerne.

For nylig er DCAF-molekyler, som har dual-funktionelle grupper, blevet udviklet til målrettet antistof blokering10. DCAF er et langt peptid, der består af 3 dele: 1) en antigen del, der specifikt kan genkende det cognate antistof, 2) en FC-III eller FC-III-4C-tag for stærkt binding til FC-området af antistoffet for at hæmme enten FC-receptoren eller komplement komponent proteiner , 3) en lang α-spiralformet linker, der konjugater disse to funktionelle grupper10. Linker-delen, der er designet fra Moesin FERM Domain, blev optimeret af Rosseta-software for at sikre, at antigen delen og FC-III-delen i et DCAF-molekyle kan binde sig til de fabelagtige og FC-regioner i IgG samtidigt. Fire DCAF molekyler er blevet syntetiseret til at målrette 4 forskellige antistoffer, blandt dem DCAF1 blev brugt til at fjerne 4G2 antistof, som er et kryds reaktivt antistof under DENV infektion at bidrage til ADE effekt; og DACF4 blev designet til redning af acetylcholin receptorer ved at blokere mab35 antistof i myasthenia gravis10.

I denne undersøgelse, der blev taget DCAF1 som eksemplet, viste vi protokollerne for syntesen af DCAF-molekyle og påvisning af samspillet mellem en DCAF og det deraf følgende cognate-antistof. DCAF1 er semi-syntetiseret af NCL approach11,12,13,14, som konjugater hydrazin derivatet af et FC-III peptid og de udtrykte linker-antigen dele sammen. NCL tilgang har betydelige fordele i forhold til fuldt kemisk syntese og fuldt rekombinant udtryk for DCAF1 syntese, fordi begge disse metoder fører til lav udbytte og høje omkostninger. Den nuværende tilgang er ikke kun den mest omkostningseffektive måde at få fuld længde DCAF, men også kan opretholde konstellationen af linker del lignende som sin oprindelige form. Da forskellige DCAF-molekyler har lignende sekvenser bortset fra antigen delene, kan vores metoder til DCAF1 syntese og interaktions analysen mellem DCAF1 og 4G2 antistof anvendes på andre DCAF-molekyler til målrettet blokering af deres cognate-antistoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. kemisk syntese af hydrazinderivatet af et FC-III peptid

  1. Konvertering af 2-CL-(TRT)-CL harpiks til 2-CL-(TRT)-NHNH2 harpiks
    1. Vejer 625 mg 2-CL-(TRT)-CL harpiks (0,25 mmol) i et 25 mL peptidsyntese fartøj.
    2. Der tilsættes 5 mL N, N-dimethylformamid (DMF) til harpiksen fra toppen af beholderen, sættes hætten tilbage, rystes forsigtigt beholderen i 15 s og derefter dræne den. Gentag DMF-vask i to gange.
    3. Tilsæt 5 mL dichlormethan (DCM) til beholderen, Sæt hætten tilbage, Ryst forsigtigt beholderen i 15 s og dræne den. Gentag DCM vask for to gange mere.
    4. Gentag trin 1.1.2 tre gange.
    5. Brug 6 mL 50% (Vol/Vol) DMF/DCM til at svulme harpiks i 30 min, og dræne det.
    6. Overfør 6 mL 5% (Vol/Vol) NH2NH2 i DMF til reaktionsbeholderen, ryst blandingen ved 120 rpm, 30 °c i 30 minutter, og Tøm derefter opløsningen med vakuumpumpe.
      Bemærk: tilsæt 0,3 mL hydrazin hydrat til 5,7 mL DMF for at få 5% (Vol/Vol) NH2NH2. Frisk Forbered NH2NH2 før brug.
      Forsigtig: hydrazin hydrat er et farligt stof og kan forårsage kræft. Bær en laboratorie frakke, handsker og en maske. Udfør forsøgene i en stinkhætte.
    7. Tilsæt 5 mL DMF til beholderen, ryst den forsigtigt i 15 s, og dræne den.
    8. Gentag trin 1.1.6 og vask derefter harpiksen ved at gentage trin 1.1.2-1.1.4 for to gange.
    9. Tilsæt 6 mL 5% (Vol/Vol) MeOH/DMF til beholderen, ryst den forsigtigt i 10 minutter, og dræne den.
      Bemærk: dette trin er meget vigtigt at sikre, at ureagerede sites på harpiks er begrænset.
    10. Harpiksen vaskes grundigt ved at gentage trin 1.1.2-1.1.4.
    11. Tilsæt 5 mL DCM til harpiksen, ryst den forsigtigt i 15 s og dræne den for at få 2-CL-(TRT)-NHNH2 -harpiks.
      Bemærk: harpiksen bliver gul eller lysegrøn, når udskiftningen er vellykket.
  2. Peptid forlængelse
    1. Tilsæt 1 mmol af Fmoc-ALA-OH (934 mg) og 0,95 mmol af 1-[bis (dimethylamino) methylen]-1H-1, 2,3-triazolo-[4,5-b] pyridiniumchlorchromat hexafluorophosphat 3-oxid (HATU) (360 mg) til et 5 mL rør indeholdende 3 mL DMF.
      Forsigtig: udsættelse for HATU kan forårsage en allergisk reaktion. Bær en laboratorie frakke, handsker og en maske.
    2. Tilsæt 2 mmol N, N-diisopropylethylamin (DIEA) (0,36 mL) til den opløste opløsning og vortex til 0,5 – 1 min.
      Bemærk: kritisk trin: aktiveringen bør ikke tage mere end 5 min, som de aktiverede aminosyrer isomerize fra de mere aktive O-former til de mindre aktive N-former over tid.
    3. Tilsæt den aktiverede Fmoc-ALA-OH til reaktionsbeholderen indeholdende 2-CL-(TRT)-NHNH2 harpiks, fremstillet af trin 1,1. Ryst forsigtigt ved 120 rpm, 30 °C i 20 min i en konstant-temperatur Shaker, og dræne derefter opløsningen ved vakuumpumpe.
    4. Tilsæt 5 mL DMF for at vaske harpiksen, ryst den forsigtigt i 15 s og dræne den.
    5. Tilsæt 1 mmol af Fmoc-ALA-OH (934 mg) og 0,95 mmol af 2-(6-chloro-1H-benzotriazol-1-yl)-1, 1, 3, 3-tetramethylaminium hexafluorophosphat (HCTU) (390 mg) til et 5 mL rør indeholdende 3 mL DMF.
      Forsigtig: udsættelse for HCTU kan forårsage en allergisk reaktion. Bær en laboratorie frakke, handsker og en maske.
    6. Tilsæt 2 mmol DIEA (0,36 mL) til røret og vortex i 0,5 – 1 min for at opløse det.
    7. Tilsæt den aktiverede Fmoc-ALA-OH til reaktionsbeholderen. Ryst forsigtigt ved 120 rpm, 30 °C for 40-60 min i en konstant-temperatur Shaker, og derefter dræne opløsningen ved vakuumpumpe.
    8. Harpiksen vaskes ved at gentage trinene 1.1.2-1.1.4.
    9. Der tilsættes 4 mL 20% (Vol/Vol) Piperidin i DMF til harpiks, rystes forsigtigt i 5 minutter ved stuetemperatur og derefter dræne opløsningen.
      Forsigtig: pyridin er meget brandfarlig og giftig. Udfør forsøgene i en stinkhætte.
    10. Tilsæt yderligere 4 mL 20% (Vol/Vol) Piperidin i DMF til harpiks, ryst den forsigtigt i 15 minutter ved stuetemperatur og dræne derefter opløsningen.
    11. Følg trinene 1.2.1-1.2.10 til par og debeskyt Fmoc-ALA-OH, Fmoc-thr-OH, Fmoc-cys-OH, Fmoc-His-OH og Fmoc-ALA-OH. Gentag trin 1.2.5-1.2.10 til par og debeskyt Fmoc-TRP-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-leu-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gly-OH og Fmoc-ASP-OH.
    12. Gentag trin 1.1.2-1.1.4 for at vaske harpiksen grundigt.
    13. Gentag trin 1.1.3 for at vaske harpiksen og derefter vakuum tørre harpiksen i 5 min.
  3. Spaltning af det hydrazin afledte FC-III rå peptid
    1. Tilsæt 12 mL cocktails trifluoroeddikesyre (TFA)/2, 2 ′-(ethylenedioxy) diethanethiol (DODT)/triisopropylsilane (SPIDSER)/H2O (92.5/2.5/2.5/2.5) til harpiksen, og brug derefter en konstant-temperatur shaker til at kløve peptiden fra harpiksen ved 200 rpm, 37 °C ca. 2 h. Filtrer blandingen til et 50 mL centrifugeglas.
    2. Der tilsættes 1 mL cocktails i harpiks til vask og opsamling af filtratet i 50 mL centrifugeglasset. Gentag to gange.
    3. Blandingen koncentreres til 2 mL med en vaper ens rotor i en stinkhætte, hvorefter der tilsættes 20 mL forkølet diethylether i røret for at udløse rå peptider.
      Bemærk: den vandfri ether skal være forkølet til 0 °C for at undgå voldelig varme frigivelse, hvilket kan forårsage bivirkninger af det rå peptid.
    4. Inkuber peptidudfældningen ved-20 °C i 1-2 h.
    5. Centrifugeres ved 5.000 x g, 4 °c i 10 minutter, og opløsningsmidlet fjernes forsigtigt fra centrifugeglasset.
    6. Tilsæt 20 mL forkølet diethylether i røret to gange i henhold til trinene 1.3.3-1.3.5 for at vaske udfældningen. Luft-tør peptidproduktet i et urglas i ca. 15 min. Opbevar de tørrede rå peptider ved 4 °C for yderligere analyse.
  4. Rensning af hydrazinderivatet af et FC-III peptid
    1. Brug højtydende væskekromatografi (HPLC) system til at rense peptid med en 30 min gradient eluering (0-1 min, 5% B; 1-20 min, 50% B; 20-25 min, 85% B; 25-30 min, 85% B) med en strømningshastighed på 1 mL/min.
      Bemærk: kolonnen er i 4,6 mm ID, 250 mm længde, pakket med C-18 harpiks. Mobile fase A bestod af 0,1% TFA i vand, og mobile fase B bestod af 100% acetonitril og 0,1% TFA.

2. protein ekspression og rensning af linker og antigen dele

  1. Plasmid konstruktion
    1. Syntetisere hele genet sekvens, der kan udtrykke SUMO-linker-antigen (Se tabel over materialer).
    2. Skær 10 ng af PET-28a Tom vektor og 50 ng af det syntetiserede SUMO-linker-antigen DNA fragment ved hjælp af NcoI og XhoI i et 37 °C vandbad i 3 timer.
    3. Rense dobbelt-enzym fordøjet vektor og DNA fragment ved DNA gel Extraction kit.
    4. Der tilsættes 5 μL DNA-fordøjet DNA-fragment, 5 μL fordøjet vektor, 1 μL T4-DNA-ubiquitinligase, 2 μL 10x-ligasebuffer og 7 μL ddH2O til et reaktions slange, og derefter inkubateres den natten over ved 16 °c.
    5. Bland 10 μL af ligations produktet fra trin 2.1.4 til 100 μL af de kompetente celler (DH5α), og læg det på et isbad i 30 minutter. Sæt de kompetente celler til et 42 °C vandbad for 90 s og hurtigt Overfør det til et isbad i 2 min. Tilsæt 800 mL LB flydende medium (uden antibiotika) til røret og ryste det ved 37 °C, 180 rpm for 1 h. Coat de kompetente celler på en kanamycin LB plade for at gøre dem ligeligt fordelt, og sætte pladen i en 37 °C inkubator natten over.
    6. Pick 5 enkelt kolonier fra pladen og kultur bakterierne i 5 mL LB medium i en test tube ved hjælp af en 37 °C shaker.
    7. Ekstrakt plasmider fra bakterier høstet fra trin 2.1.6 ved hjælp af plasmid ekstraktions kit.
    8. Send plasmiderne til gensekvensering og vælg den positive koloni, der kan udtrykke SUMO-linker-antigen fusionsprotein. Omdanne de positive plasmid til BL21 (DE3) plysS kompetente celler efter trin 2.1.5.
  2. Protein rensning
    1. Vælg en enkelt koloni af transformanter fra trin 2.1.7 til 5 mL LB flydende medium indeholdende kanamycin (50 μg/mL). Ryst kulturerne natten over ved 200 rpm, 37 °C.
    2. Der inokuleres 1 L forvarmede lb-medium indeholdende kanamycin (50 μg/ml) i en kolbe med 5 ml natlige kulturer og vokser ved 37 °c med kraftig rystning, indtil OD600 er 0,6.
    3. Isopropyl β-D-thiogalactoside (IPTG) tilsættes til mediet til den endelige koncentration på 0,4 mM, og Kolben rystes ved 200 rpm natten over ved 20 °C.
      Bemærk: lav temperatur for protein induktion er vigtigt for at undgå inklusion krops dannelse, så sørg for, at temperaturen er ikke mere end 22 °C.
    4. Efter høst af cellerne tilsættes 50 mL lysis buffer til celle pillerne for at resuspendere cellerne. Soniker celle lysater to gange i 5 minutter ved 200 W, ultralyd 3 s, interval 3 s på is. Centrifugeres ved 15, 000 x g i 30 minutter ved 4 °c for at samle Supernatanterne.
      Bemærk: lysis buffer er sammensat af 50 mM NaH2po4, 300 mm NaCl, 10 mm imidazol. Juster pH-værdien til 8,0 ved hjælp af NaOH.
    5. Der tilsættes 2 mL af 50% ni-NTA-Sephorase, som er ækvibreret af lysis-buffer, til de clearede supernatanter og blandes forsigtigt ved omrystning (200 rpm på en rotations shaker) ved 4 °C i 1 time.
    6. Læg lysat-og ni-NTA-blandingen i en kolonne med det nederste udtag, og fjern bund hætten, og kassér spalte gennemstrømningen.
    7. Vask tre gange med 6 ml vaskebuffer, og elueres derefter det målrettede protein 3 gange med 1,5 ml elueringsbuffer. Eluatet opsamles i ét rør.
      Bemærk: vaskebufferen er sammensat af 50 mM NaH2po4, 300 mm NaCl, 30 mm imidazol. Juster pH-værdien til 8,0 ved hjælp af NaOH. Elueringsbufferen er sammensat af 50 mM NaH2po4, 300 mM NaCl, 250 mm imidazol. Juster pH-værdien til 8,0 ved hjælp af NaOH.
    8. Eluatet sættes i en dialysepose i 1 L 50 mM PBS ved 4 °C for at afalt proteinet. Udskift ny fosfatbuffer saltvand (PBS) i 3 gange.
  3. Kavalergang af SUMO-tag
    1. Tilsæt 2 mL lille Ubiquitin-lignende modifikator (SUMO) mærket protein ved koncentrationen af 1 mg/mL, 1 mL SUMO protease (Se tabel over materialer), 1 ml 10X Sumo Proteasebuffer og 6 ml DDH2O til klargøring af reaktions opløsningen.
      Bemærk: SUMO-tag proteinkoncentration er omkring 1 mg/mL. For høje koncentrationer efter enzym fordøjelsen kan forårsage koagulation af proteinet.
    2. Blandingen inkubates i 12-16 h ved 4 °C.
    3. Blandingen centrifugeres ved 15.000 x g i 10 minutter ved 4 °c, og aggregaterne kasseres. 0,5 mL af 50% ni-NTA gylle, der er ækvibreret med 50 mM PBS, tilsættes til de 10 mL clearede supernatanter og blandes forsigtigt ved omrystning (200 rpm på en rotations shaker) ved 4 °C i 60 min.
    4. Læg lysat-og ni-NTA-blandingen i en søjle med den nederste udløb. Fjern den nederste hætte, og Gem derefter flowet i et 15 mL centrifugeglas.
      Bemærk: Histagged SUMO protein er bindende på søjlen. Linker-antigen-delen, som starter med cys til NCL-reaktion, er i gennemstrømningen.
    5. Gennemstrømningen centrifugeres til 15.000 x g i 10 minutter ved 4 °c, og aggregaterne kasseres. Du renser link-antigen-delen ved hjælp af HPLC med en 25 min gradient eluering (0-1 min, 5% B; 1-3 min, 15% B; 3-20 min, 45% B; 20-21 min, 85% B; 21-25 min, 85% B) med en strømningshastighed på 1 mL/min.
      Bemærk: kolonnen er i 4,6 mm ID, 250 mm længde, pakket med C-18 harpiks. Mobile fase A bestod af 0,1% TFA i vand, og mobile fase B bestod af 100% acetonitril og 0,1% TFA.
    6. Saml det rensede produkt fra HPLC, og fryse tørre natten over for at få linker-antigen produktet.

3. montering af DCAF1 ved naturlig kemisk ligering

  1. Konjugering af FC-III peptid og link-antigen-del sammen
    1. 1,8 mg (1 μmol) af hydrazinderivat af et FC-III peptid vejes i en 2 mL EP-tube, og der tilsættes 0,8 mL 6 M GnHCl i 0,2 M NaH2po4 (pH 3,0) opløsning for at opløse det ved vortexing.
      Bemærk: 6 M GnHCl i 0,2 M NaH2po4 (pH 3,0) opløsning fremstilles ved at justere pH-værdien med HCL eller NaOH.
      Forsigtig: NaOH og HCl er meget ætsende. Bær en laboratorie frakke, handsker og en maske.
    2. Efter centrifugering af røret ved 7.200 x g i 1 min ved stuetemperatur, sæt røret i et issaltbad og brug den magnetiske omrøring til at agitere opløsningen i 15 min forsigtigt.
    3. Tilsæt 40 μL 0,5 M NaNO2 til opløsningen for at Oxide hydrazingruppen. Omrystes forsigtigt opløsningen i yderligere 15 minutter i issaltbadet.
    4. Veje og tilsæt 11 mg renset linker-antigen del fremstillet fra trin 2,3 og 13,6 mg 4-mercaptophenyleddikesyre (MPAA) ind i reaktionsrøret i issaltbad, rør i 5 min, og juster derefter pH-værdien til 6,8-7,0 ved stuetemperatur med 6 M NaOH.
      Bemærk: justering af pH-værdien til neutral er det kritiske trin til at initiere ligations reaktionen.
    5. Efter 12 timer tilsættes 0,4 mL 0,1 M tris (2-carboxyethyl) phosphinhydrochlorid (TCEP) neutral opløsning (pH 7,0) til reaktionssystemet og omrøres i 20 min for at afslutte reaktionen.
      Bemærk: 0,1 M TCEP neutral opløsning (pH 7,0) fremstilles ved at opløse TCEP i 6 M GnHCl i 0,2 M NaH2po4 (pH 3,0) opløsning og ved at bruge NaOH til at justere ph-værdien til 7,0.
    6. Centrifuger røret ved 15.000 x g i 10 minutter, analysér og rens derefter ligations produktet med HPLC med en 26 min gradient eluering (0-1 min., 5% b; 1-21 min, 45% b; 21-22 min, 85% b; 22-26 min, 85% b) med en strømningshastighed på 1 ml/min. Det forventede udbytte for ligations reaktionen er over 50%.
      Bemærk: kolonnen er i 4,6 mm ID, 250 mm længde, pakket med C-18 harpiks. Mobile fase A bestod af 0,1% TFA i vand, og mobile fase B bestod af 100% acetonitril og 0,1% TFA.
  2. Desulfurisering af konjugat
    1. Konjugaten (3,4 mg, 0,3 μmol) opløses fra trin 3.1.6 i 50 μL 6 M GnHCl i 0,2 M NaH2po4 (pH 7,0) opløsning.
    2. Tilsæt 50 μL 1 M TCEP, 10 μL tBuSH og 5 μL 0,1 M VA-044 opløsning til ovennævnte blanding.
      Bemærk: 0,1 M VA-044 opløsning tilberedes ved at opløse 9,7 mg VA-044 pulver i 0,3 mL 6 M GnHCl i 0,2 M NaH2po4 (pH 7,0) opløsning. VA-044 opløsningen skal tilberedes frisk før brug, da VA-044 let oxideres ved udsættelse for luft.
    3. Juster den endelige pH-værdi i opløsningen til 6,9, og opbevar den opløftiomat 37 °C med omrøring i ca. 5 timer.
    4. Centrifugeglasset centrifugeres ved 15.000 x g i 10 minutter, og det uopløselige stof fjernes. Analysér og rens ligations produktet med HPLC med en 26 min gradient eluering (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) med en strømningshastighed på 1 mL/min. Det forventede udbytte for desulfurisering reaktion er omkring 40%.
      Bemærk: kolonnen er i 4,6 mm ID, 250 mm længde, pakket med C-18 harpiks. Mobile fase A bestod af 0,1% TFA i vand, og mobile fase B bestod af 100% acetonitril og 0,1% TFA.
  3. Fjernelse af ACM for at få det endelige produkt DCAF1
    1. Peptid (1,35 mg, 0,11 μmol) opløses fra trin 3.2.4 i 200 μL 32 mM AgOAc, og derefter omrøres reaktionsblandingen ved stuetemperatur i 4 timer.
    2. Tilsæt 3 μL 1M dithiothreitol (DTT) i 6 M GnHCl i 0,2 M NaH2po4 (pH 7,0) opløsning for at omdanne sølvthiolaterne på peptid til gratis thioler.
    3. Efter en voldsom omrøring i 1 min. centrifugeres røret ved 15.000 x g i 10 minutter for at kassere det uopløselige stof. Analysér og rens det endelige produkt med HPLC med en 26 min gradient eluering (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) med en strømningshastighed på 1 mL/min. Det forventede afkast for ACM-debeskyttelses reaktionen er ca. 30%.
      Bemærk: kolonnen er i 4,6 mm ID, 250 mm længde, pakket med C-18 harpiks. Mobile fase A bestod af 0,1% TFA i vand, og mobile fase B bestod af 100% acetonitril og 0,1% TFA.
    4. Efter HPLC rensning, fryse-tørre det endelige produkt natten over, og opløse pulveret i PBS (50 mM NaH2po4, 150 mm nacl, pH 8,0). Centrifugeglasset centrifugeres ved 15.000 x g i 10 minutter ved 4 °c, og pellet kassetterne kasseres.
    5. Juster koncentrationerne af det endelige produkt (fra trin 3,4) og link-antigen del (fra trin 2.3.6) til 10 μM, Optag den cirkulære dichroism (CD) Spectra fra 260 til 195 nm af disse to produkter ved hjælp af et CD-spektrometer ved 25 °C med 1 mm stilængde.
      Bemærk: CD Spectra bruges til at påvise mængden af α spiralformet struktur i det endelige produkt er så ens som i den rekombinante udtrykte en.

4. påvisning af produkterne efter massespektrometri

  1. Produktet adskilles fra hver kemisk reaktion med en 60 min gradient eluering (0-8 min., 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 30% B; 35-50 min, 50% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) med en strømningshastighed på 0,300 μL/min med en Nano-HPLC-system, som er direkte forbundet med højopløsnings massespektrometer.
    Bemærk: den analytiske kolonne er i 75 μm ID, 150 mm længde, pakket med C-18 harpiks. Mobil fase A bestod af 0,1% myresyre i vand, og den mobile fase B bestod af 100% acetonitril og 0,1% myresyre.
  2. Betjen massespektrometer i Full-Scan-modus og Indstil m/z-intervallet til 300-2000 og opløsning ved 60.000.
  3. Åbn massespektre data og finde toppe af produktet i hvert trin for at bekræfte den kemiske reaktion er med succes præformeret.

5. ELISA-analyse af interaktionen mellem DCAF1 og 4G2 antistof

  1. Frakke en 96-brønd mikrotiterplade med 1 pmol anti-GST antistof (Se tabel over materialer) i 100 μl belægnings buffer/brønd, Forsegl pladen og Inkuber den ved 4 °c natten over på en shaker.
  2. Blokér hver brønd med 200 μL 1% BSA i PBS, Forsegl pladen og Inkuber den ved stuetemperatur i 1 time på en shaker.
  3. Vask hver brønd 4 gange ved hjælp af PBS med 0,05% Tween 20.
  4. Tilsæt GST-smeltet antigen protein (0,05 pmol i 100 μL blokerende opløsning) til brøndene, Forsegl pladen, og Inkuber i 2 timer ved stuetemperatur.
    Bemærk: GST-smeltet antigen protein udtrykkes i bakterier og renses ved GSH Sepharose.
  5. Gentag trin 5,3 for at vaske pladen.
  6. Der tilsættes 1 pmol 4G2 antistof eller 1 pmol 4G2 antistof plus andre ligands: antigen, FC-III eller DCAF1 i serie mængder (0,1 pmol, 1 pmol, 10 pmol, 100 pmol og 1000 pmol) i 100 μL blokerende opløsning/brønd, Forsegl pladen og Inkuber 2 timer ved stuetemperatur på en shaker.
  7. Gentag trin 5,3 for at vaske pladen.
  8. Tilføj anti-mus IgG, HRP-forbundet antistof (1:20000 fortynding) i 100 μL blokerende opløsning/brønd, Forsegl pladen og Inkuber 30 min ved stuetemperatur på en shaker.
  9. Vask hver brønd 6 gange ved hjælp af PBS med 0,05% Tween 20.
  10. Bland TMB reagens A og B 1:1 i volumen umiddelbart før brug tilsættes 100 μL/brønd og Inkuber derefter 30 min ved stuetemperatur i mørket.
  11. Tilsæt 100 μL/godt stopopløsning, og brug en plade læser til at måle OD450 værdierne for hver brønd inden for 30 minutter.

6. ELISA-analyse af interaktionen mellem FC-III-og IgG-molekyle

  1. Frakke en 96-brønd mikrotiterplade med 1 pmol anti-CA antistof (Se tabel over materialer) i 100 μl coating buffer/brønd, Forsegl pladen og Inkuber den ved 4 °c natten over på en shaker.
  2. Gentag trin fra 5,2 til 5,3.
  3. Tilsæt FC-III-eller FC-III-4C-CA-proteinet (0,01, 0,05, 0,1, 0,5 og 1 pmol i 100 μL blokerende opløsning) til brøndene, Forsegl pladen, og Inkubér i 2 timer ved stuetemperatur.
    Bemærk: FC-III eller FC-III-4C smeltet CA-protein udtrykkes i bakterier og renses af ni-NTA.
  4. Gentag trinene fra 5,7 til 5,11, og kontroller resultaterne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Rutediagrammet for syntese ruten efter Native Chemical ligering i denne artikel er vist i figur 1. Figur 2-6 viser kromatogrammer (A) og massespektre (B) af kemisk syntetiseret HYDRAZIN derivat af et FC-III peptid, rekombinant udtrykt linker og antigen del, det rensede produkt fra NCL-reaktion, den rensede produkt fra desulfurisering-reaktionen og det rensede endelige produkt DCAF1. Kromatogrammerne viser, at rensningen af alle produkterne er over 90%, mens massespektrene angiver produktets molekylvægt efter hver reaktion. De devolutionelle molekylvægte er også vist i figur 3-6, som afspejler den nøjagtige molekylvægt for hvert produkt. Figur 7 viser princippet om Elisa-assay (A) og resultaterne af antigen peptid, FC-III og DCAF1-konkurrencehæmmende 4G2-antistof binding. Både antigen peptid og DCAF1 signifikant blok 4G2 binding, mens FC-III peptid påvirker ikke antigen-antistof interaktion.

Figure 1
Figur 1. Arbejdsprocessen af den indfødte kemiske ligationsmetode til semi-syntesen af DCAF1 molekyle.
Første, hydrazin derivat af en FC-III peptid er opnået ved solid fase peptid syntese. Derefter, den SUMO tag smeltet linker og antigen del udtrykkes og renses fra bakterier, efterfulgt af SUMO tag kavalergang. Efter NCL reaktion af de to fragmenter, produktet gennemgår desulfurisering og fjernelse ACM grupper til at blive DCAF1 molekyle. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2. Kromatogrammet og masse spektret af hydrazinderivatet i et FC-III-peptid.
Dette tal viser, at REMBURS profilen for det rensede peptid (A) og mono-isotop toppen ved m/z 915,92 matchede det duple-ladede peptid (B). Dette tal er blevet ændret fra reference 10, figur 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3. Kromatogrammet og masse spektret af linker og antigen del.
Dette tal viser REMBURS profilen for det rensede fragment (A), og den devolutionelle molekylvægt af dette fragment beregnes som 9429,0 fra masse spektret (B). Dette tal er blevet ændret fra reference 10, figur S2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4. Konjugations produktets kromatogram og massespektrum ved NCL-reaktion.
Denne figur viser LC-profilen, der overvåger ligations produktet ved 0 h (top), 12 h (midten) og det rensede peptid (nederst) (A), og den devolutionelle molekylvægt af dette produkt beregnes som 11227,0 fra masse spektret (B). Dette tal er blevet ændret fra reference 10, figur S2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5. Kromatogrammet og masse spektret af produktet efter desulfurisering reaktion.
Dette tal viser REMBURS profilen for det rensede produkt (A), og den devolutionelle molekylvægt af dette produkt beregnes som 11195,0 fra masse spektret (B). Dette tal er blevet ændret fra reference 10, figur S2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6. Kromatogrammet, masse spektret og CD-spektre fra DCAF1 molekyle.
Dette tal viser REMBURS profilen for det rensede DCAF1 (A), den devolumendemolekylære vægt af dette molekyle beregnet som 11053,0 fra masse spektret (B) og CD-spektrene for det endelige produkt (solid Line) og link-antigen-delen ( streg linje) i FCAF1. Dette tal er blevet ændret fra reference 10, figur 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7. ELISA-analyse af DCAF1 molekyle.
A) arbejdsgangen for sandwich Elisa-analysen. Første anti-GST antistof er belagt på en brønd plade. Derefter inkuberes GST-fbrugt antigen peptid. Derefter tilsættes 4G2 antistof med forskellige koncentrationer af DCAF1, antigen eller FC-III for kolorimetrisk analyse. B) elsi's resultater af antigen, FC-III og DCAF1, som påviser hæmning af 4G2-binding ved hjælp af forskellige ligand-koncentrationer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen her beskriver semi-syntese og påvisning af DCAF1 ved hjælp af NCL tilgang, som er vist i figur 1. Kort, de to fragmenter af DCAF1 er kemiske syntetiseret og rekombinant udtrykt, henholdsvis; derefter, den fulde længde DCAF1 molekyle er samlet, modificeret og renset. For den hydrazin afledte FC-III fragment syntese, ved hjælp af lav kapacitet 2-CL harpiks er ganske vigtigt, fordi høj kapacitet har en negativ effekt for hydrazin generation og fører til lav udbytte af produktet. Den linker og antigen del er udtrykt med SUMO tag af to grunde: for det første, SUMO tag kan øge opløseligheden af fusions proteiner; for det andet, Sumo proteasehæmmere er en konstellation-anerkendt proteasehæmmere, som gør det muligt for det frigivne produkt til at starte med cys rester for yderligere ligering reaktion. Et af de mest kritiske trin i protein ekspression og rensning er SUMO proteasehæmmere spaltning. Koncentrationen af SUMO tag-smeltet protein bør justeres til det rette område. En for høj eller for lav koncentration ville føre til protein aggregering eller vanskeligheder for yderligere rensning efter fordøjelsen. Et andet kritisk trin i denne protokol er at justere pH-værdien under NCL-reaktion, som er baseret på thiol-ester udveksling, der bør ske i neutral buffer. Fin kontrol af pH-værdien i reaktions bufferen er nyttig til at forbedre ligations effektiviteten.

Denne protokol er velegnet til syntese af andre DCAF molekyler med forskellige antigen sekvenser, fordi sekvenser af forskellige DCAF molekyler er meget ens og antigen del normalt bidrager lidt til hele strukturen og arten af DCAF. For eksempel, vi brugte denne protokol til at syntetisere en anden tre DCAF molekyler til at målrette deres cognate antistoffer. Blandt dem, DCAF4 var designet til at blokere mAb35 antistof, som kan neutralisere acetylcholin receptor og forårsage myasthenia gravis i en rotte model. Vi brugte DCAF4 til at reducere de kliniske symptomer i rotte med mAb35-induceret myasthenia gravis, og redde acetylcholin receptor ved at hæmme komplement komponent proteiner.

Anvendelsen af vores teknik er begrænset af flere faktorer: for det første, udbyttet af DCAF molekyle syntetiseret af den nuværende tilgang er lav (normalt mindre end 10%) på grund af de mange rensningstrin; for det andet er antistoffer med konformationsmæssige determinanter svære at målrette mod af DCAF. for det tredje kan DCAF fremkalde ekstra immunrespons i organismer sammenlignet med traditionel lille sammensatte stof. Vi forestiller, at anvendelsen af denne protokol til andre antistof-induceret patologiske tilstande vil hjælpe syntetisere flere DCAF molekyler til målrettet eliminere skadelige antistoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette arbejde blev delvist støttet af Tsinghua University-Gates Foundation (nr. OPP1021992), den nationale naturvidenskabelige fond i Kina (nr. 21502103, 21877068 og 041301475), og det nationale centrale forsknings-og udviklings program i Kina (no. 2017YFA0505103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Chlorotrityl resin Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide GL Biochem 00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate GL Biochem 00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride J&K Scientific 503236
4G2 antibody Thermo MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid Alfa Aesar H27658
96-well microtiter plates NEST 701001
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
AgOAc Sinopharm Chemical Reagent 30164324
anti-GST antibody Abclonal AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076P2
BSA Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer Applied Photophysics Ltd
dialysis bag Sbjbio SBJ132636
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent 80047360
diethyl ether Sinopharm Chemical Reagent 10009318
DNA Gel Extraction Kit Beyotime D0056
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
GSH Sepharose GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride Sinopharm Chemical Reagent 30095516
Hydrazine hydrate Sinopharm Chemical Reagent 80070418
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent 10011018
imidazole SIGMA 12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside SIGMA 5502-5G
kanamycin Beyotime ST101
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine GL Biochem 90600
N, N-Dimethylformamide Sinopharm Chemical Reagent 8100771933
NcoI Thermo ER0571
PBS buffer Solarbio P1022
Peptide BEH C18 Column Waters 186003625
piperidine Sinopharm Chemical Reagent 80104216
Plasmid Extraction Kit Sangon Biotech B611253-0002
QIAexpress Kit QIAGEN 32149
Rapid DNA Ligation Kit Beyotime D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent 20040718
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent 10019762
Sodium nitrite Sinopharm Chemical Reagent 10020018
sodium chloride Sinopharm Chemical Reagent 10019318
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem
sterilizing pot Tomy SX-700
SUMO Protease Thermo Fisher 12588018
stop solution Biolegend 423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent Biolegend 421101
Trifluoroacetic acid SIGMA T6508
Triisopropylsilane GL Biochem 91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Aladdin T107252-5g
tryptone OXOID LP0042
Tween 20 Solarbio T8220
Ultimate 3000 HPLC Thermo
vacuum pump YUHUA SHZ-95B
XhoI Thermo IVGN0086
yeast extract OXOID LP0021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. Human Physiology (4th ed.). , Thomson Learning. (2003).
  2. Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
  3. Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
  4. Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
  5. Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
  6. Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
  7. Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
  8. Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
  9. Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
  10. Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
  11. Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
  12. Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
  13. Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
  14. Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).

Tags

Retraktion DCAF målrettet terapi antistof Native Chemical ligation solid fase peptid syntese protein ekspression og rensning ELISA
Målrettet antistof blokering ved et dobbelt funktionelt konjugat af antigene peptid og FC-III-Mimetika (DCAF)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao,… More

Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao, X., Pan, J., Deng, H., Feng, S. Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF). J. Vis. Exp. (151), e60063, doi:10.3791/60063 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter