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Immunology and Infection

항원 펩타이드 및 Fc-III 모방제(DCAF)의 이중 기능 성 컨쥬게이트에 의한 표적 항체 차단

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60063
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 2, 2, 3, 1,2
1Key Laboratory of Structural Biology of Zhejiang Province, School of Life Sciences, Westlake University, 2Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, 3MOE Key Laboratory of Bioinformatics, Center for Synthetic and Systems Biology, School of Life Sciences, Tsinghua University
* These authors contributed equally

Summary

항원 펩타이드 및 Fc-III 모방제(DCAF)의 이중 기능성 컨쥬게이트 개발은 유해한 항체의 제거를 위한 새로운 것입니다. 여기서, 우리는 뎅기열 바이러스 감염 동안 항체 의존성 증강 효과를 제거하기 위해 4G2 항체를 선택적으로 차단할 수 있는 DCAF1 분자의 합성을 위한 상세한 프로토콜을 기술한다.

Abstract

유기체에서 유해한 항체의 제거는 뎅기열 출혈열 및 자기 면역 질병과 같은 항체 관련 질병의 개입을 위한 귀중한 접근입니다. 상이한 에피토프를 가진 수천 개의 항체가 혈액에서 순환하기 때문에, 항원 펩타이드 및 Fc-III 모방제(DCAF)의 이중 기능적 컨쥬게이트를 제외한 보편적인 방법은 없으며, 특이적인 유해 항체를 표적으로 하는 것으로 보고되었다. DCAF 분자의 발달은 뎅기열 바이러스 (DENV) 감염 모델에서 항체 의존성 향상 (ADE) 효과를 제거하고 아세틸 콜린을 향상시키는 것으로 입증 된 표적 치료의 진행에 상당한 기여를합니다. 중증 근무모델의 수용체 활성. 여기서, 우리는 뎅기열 바이러스 감염 동안 ADE 효과를 감쇠시키기 위해 4G2 항체를 선택적으로 차단할 수 있는 DCAF 분자(DCAF1)의 합성을 위한 프로토콜을 설명하고, ELISA 분석에 의한 DCAF1 to 4G2 항체의 결합을 예시한다. 본 방법에서, DCAF1은 Fc-III 펩타이드의 히드라진 유도체의 컨쥬레이션에 의해 합성되고 재조합이 네이티브 화학 적 결찰(NCL)을 통해 항원 서열로 긴 α-나선을 발현한다. 이 프로토콜은 그들의 코그네이트 항체를 표적으로 하기 위한 DCAF1 및 그밖 DCAF 분자에 성공적으로 적용되었습니다.

Introduction

항체는 병원성 박테리아 및 바이러스의 중화에 대한 체액 면역 반응에 중요한 역할을 한다1. 그러나, 일부 항체는 자가면역 질환인 중증근무증에서 DENV 감염 및 과민반응성 항체 동안 ADE 효과에서 교차 반응성 항체와 같은 유기체에 유해한 영향을 나타낸다2,3. ADE 효과는 DENV와 Fc 수용체 제시 세포를 연결하는 다리를 만드는 교차 반응성 항체에 의해 매개되는반면,중증근무력증은 아세틸콜린 수용체를 공격하는 과도한 항체에 의해 유발됩니다. 근육 조직에 있는 세포 세포 접합 사이6,7. 부분적으로 효과적인 접근법이 이 질병을 취급하기 위하여 개발되었더라도8,9,의심할 여지없이 이러한 유해한 항체의 직접적인 제거는 내정간섭을 위한 진전을 만들 것입니다.

최근에는 이중 작용기가 있는 DCAF 분자가 표적 항체 차단10을위해 개발되었다. DCAF는 3부분으로 구성된 긴 펩티드이다: 1) 코그네이트 항체를 특이하게 인식할 수 있는 항원 부분, 2) Fc-III 또는 Fc-III-4C 태그는 Fc 수용체 또는 보체 성분 단백질중 하나를 억제하기 위해 항체의 Fc 영역에 강하게 결합한다. , 3) 이들 두 기능성그룹(10)을접합하는 긴 α-헬리칼 링커. Moesin FERM 도메인에서 설계된 링커 부품은 로세타 소프트웨어에 의해 최적화되어 DCAF 분자의 항원 부분과 Fc-III 부품이 IgG의 팹 및 Fc 영역에 동시에 결합할 수 있도록 합니다. 4개의 DCAF 분자가 4개의 상이한 항체를 표적으로 하기 위해 합성되었고, 그 중DCAF1은 4G2 항체를 제거하는데 사용되었으며, 이는 DENV 감염 동안 교차 반응성 항체가 ADE 효과에 기여한다; 및 DACF4는 중증 근무력증10에서mab35 항체를 차단하여 아세틸콜린 수용체의 구조를 위해 설계되었습니다.

본 연구에서, 예로서 DCAF1을 촬영, 우리는 DCAF 분자의 합성 및 DCAF와 그의 동체 항체 사이의 상호 작용의 검출을위한 프로토콜을 보여 주었다. DCAF1은 NCL 접근법11,12,13,14에의해 반합성되며, 이는 Fc-III 펩타이드 및 발현된 링커-항원 부분의 히드라진 유도체를 함께 접합한다. NCL 접근법은 이러한 두 방법 모두 낮은 수율 및 높은 비용으로 이어지기 때문에 DCAF1 합성을 위한 완전 화학적 합성 및 완전 재조합 발현에 비해 상당한 이점이 있다. 현재의 접근 방식은 전체 길이 DCAF를 얻는 가장 비용 효율적인 방법일 뿐만 아니라 링커 부품의 형태를 기본 형태와 유사하게 유지할 수 있습니다. 상이한 DCAF 분자는 항원 부품을 제외한 유사한 서열을 갖기 때문에, DCAF1 과 4G2 항체 사이의 DCAF1 합성 및 상호작용 분석법을 위한 우리의 방법은 그들의 코그네이트 항체를 표적화하기 위해 다른 DCAF 분자에도 적용될 수 있다.

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Protocol

1. Fc-III 펩타이드의 히드라진 유도체의 화학적 합성

  1. 2-Cl-(Trt)-Cl 수지 2-Cl-(Rt)-NHNH2 수지로 변환
    1. 25 mL 펩티드 합성 용기에 2-Cl-(Trt)-Cl 수지(0.25 mmol)의 625 mg을 계량합니다.
    2. 5 mL의 N,N-디메틸 포름 아미드 (DMF)를 용기 의 상단에서 수지에 넣고 캡을 다시 넣고 용기를 부드럽게 흔들어 15 s용 용기를 흔들어 배수하십시오. DMF 세척을 두 번 더 반복합니다.
    3. 용기에 디클로로메탄(DCM) 5mL를 넣고 캡을 다시 넣고 용기를 15s로 부드럽게 흔들어 서 빼냅니다. DCM 세척을 두 번 더 반복합니다.
    4. 1.1.2단계를 세 번 반복합니다.
    5. 50%(vol/vol) DMF/DCM의 6mL를 사용하여 수지를 30분 동안 팽창한 다음 배수합니다.
    6. 반응 용기에 DMF에서 6 mL 5 % (vol / vol) NH2를 전송하고 혼합물을 120 rpm, 30 °C에서 30 분 동안 흔들어 진공 펌프로 용액을 배출합니다.
      참고 : 5 %의 (vol / vol) NH2NH2를얻기 위해 DMF의 5.7 mL에 히드라진 수화물 0.3 mL을 추가하십시오. 사용하기 전에 NH2NH2를 신선하게 준비하십시오.
      주의: 히드라진 수화물은 위험한 물질이며 암을 유발할 수 있습니다. 실험실 코트, 장갑, 마스크를 착용하십시오. 연기 후드에서 실험을 수행합니다.
    7. 용기에 DMF 5 mL을 넣고 15s동안 부드럽게 흔들어서 물기를 빼냅니다.
    8. 1.1.6단계를 반복한 다음 1.1.2-1.4단계를 반복하여 수지와 2회 세척한다.
    9. 용기에 5% (vol/vol) MeOH/DMF6 mL을 넣고 10분 동안 부드럽게 흔들어서 물기를 빼냅니다.
      참고: 이 단계는 수지의 미반응 부위가 제한되도록 하는 데 매우 중요합니다.
    10. 1.1.2-1.4 단계를 반복하여 수지를 철저히 씻으십시오.
    11. 수지에 DCM 5 mL을 넣고 15s동안 부드럽게 흔들어서 2-Cl-(Trt)-NHNH2 수지수(Trt)를 얻습니다.
      참고: 대체가 성공하면 수지가 노란색 또는 연한 녹색이 됩니다.
  2. 펩티드 신장율
    1. Fmoc-Ala-OH (934 mg) 및 0.95 mmol의 1-[비스(디메틸아미노)메틸렌]-1H-1,2,3-트리아졸로-[4,5-b] 피리디늄 헥사플루오로포스페이트 3-산화물(HATU) (360 mg)을 ML 의 ML 튜브 3L에 추가합니다.
      주의: HATU에 노출되면 알레르기 반응을 일으킬 수 있습니다. 실험실 코트, 장갑, 마스크를 착용하십시오.
    2. 용해 된 용액과 소용돌이에 N,N-diisopropylethylamine (DIEA) (0.36 mL)의 2 mmol을 0.5-1 분 동안 추가하십시오.
      참고: 중요한 단계: 활성화된 아미노산이 더 활동적인 O-형태에서 시간이 지남에 따라 덜 활성 N-형태로 활성화되기 때문에 활성화는 5분 이상 걸리지 않아야 합니다.
    3. 활성화된 Fmoc-Ala-OH를 1.1단계에서 제조된 2-Cl-(Trt)-NHNH2 수지 함유 반응 용기에 첨가한다. 120rpm, 30°C에서 일정한 온도 셰이커에서 20분 동안 부드럽게 흔들어 준 다음 진공 펌프로 용액을 배출합니다.
    4. DMF 5 mL을 추가하여 수지세척을 하고, 15s를 부드럽게 흔들어서 물기를 빼냅니다.
    5. Fmoc-Ala-OH (934 mg) 및 0.95 mmol의 2-(6-클로로-1H-벤조트리졸-1-yl)-1,1,3,3-테트라메틸라미늄 헥사플루오로포스페이트(HCTU) (390 mg)를 DL 튜브의 5 mL튜브에 추가합니다.
      주의: HCTU에 노출되면 알레르기 반응을 일으킬 수 있습니다. 실험실 코트, 장갑, 마스크를 착용하십시오.
    6. 2 mmol의 DIEA (0.36 mL)를 튜브와 소용돌이에 0.5-1 분 동안 첨가하여 용해시십시오.
    7. 활성화된 Fmoc-Ala-OH를 반응 용기에 추가합니다. 120rpm, 30°C에서 일정한 온도 셰이커에서 40-60분 동안 부드럽게 흔들어 준 다음 진공 펌프로 용액을 배출합니다.
    8. 1.1.2-1.4 단계를 반복하여 수지세척한다.
    9. DMF에 20% (vol/vol) 피리딘 4mL를 넣고 실온에서 5분간 부드럽게 흔들어 용액을 배출합니다.
      주의: 피리딘은 인화성이 높고 독성이 있습니다. 연기 후드에서 실험을 수행합니다.
    10. DMF에 20% (vol/vol) 피리딘을 추가한 후 실온에서 15분간 부드럽게 흔들어 서 용액을 배출합니다.
    11. 1.2.1-1.2.10 단계를 따라 Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-His-OH 및 Fmoc-Ala-OH를 분리합니다. 1.2.5-1.2.10 단계를 반복하여 Fmoc-Trp-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gly-OH 및 Fmoc-Asp-OH를 분리합니다.
    12. 수지세척을 위해 1.1.2-1.4단계를 반복합니다.
    13. 1.1.3단계를 반복하여 수지세척후 5분 동안 수지에서 진공건조한다.
  3. 히드라진 유래 Fc-III 조펩티드의 분열
    1. 12 mL의 칵테일 트리플루오로아세트산(TFA)/2,2′-(에틸렌디옥시)디에탄에티올(DODT)/트리소프로필실란(TIPS)/H2 O(92.5/2.5/2.5)를 수지에 첨가 이어서 일정한 온도 셰이커를 사용하여 200 rpm에서 수지에서 펩티드를 갈라내고, 37°C 약 2시간. 혼합물을 50 mL 원심분리기 튜브로 여과한다.
    2. 수지에 칵테일 1 mL을 추가하여 세척하고 50mL 원심 분리튜브에 여과액을 수집합니다. 두 번 반복합니다.
    3. 혼합물을 연기 후드에 vaper 로터에 의해 2 mL로 농축한 다음 20 mL의 미리 냉각된 디에틸 에테르를 튜브에 추가하여 조잡한 펩티드를 침전시한다.
      참고 : 무수 에테르는 원유 펩티드의 측면 반응을 일으킬 수있는 격렬한 열 방출을 피하기 위해 0 °C로 미리 냉각해야합니다.
    4. 펩티드 침전을 -20°C에서 1-2시간 동안 배양한다.
    5. 5,000 x g,4 °C에서 10 분 동안 원심 분리기를 조심스럽게 원심 분리튜브에서 제거하십시오.
    6. 강수량을 세척하기 위해 1.3.3-1.3.5 단계에 따라 20 mL의 미리 냉각된 디에테르를 튜브에 2회 첨가한다. 펩타이드 생성을 약 15분 동안 시계 유리에 공기 건조시킨다.
  4. Fc-III 펩타이드의 히드라진 유도체의 정제
    1. 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC) 시스템을 사용하여 30분 그라데이션 용출(0-1 분, 5% B; 1-20분, 50% B; 20-25분, 85% B; 25-30분, 85% B)으로 펩티드를 1 mL/min의 유량으로 정제합니다.
      참고 : 기둥은 4.6mm ID, 250mm 길이로 C-18 수지로 포장되어 있습니다. 이별상 A는 물속의 TFA 0.1%, 이동상 B는 100% 아세토니트릴과 0.1% TFA로 구성되었다.

2. 링커 및 항원 부분의 단백질 발현 및 정제

  1. 플라스미드 건설
    1. SUMO-링커-항원을 발현할 수 있는 전체 유전자 서열을 합성합니다(재료 표참조).
    2. PET-28a 빈 벡터의 10 ng및 합성된 스모 링커-항원 DNA 단편의 50 ng를 37°C 수조에서 NcoI 및 XhoI를 사용하여 3시간 동안 수조에 사용하였다.
    3. DNA 겔 추출 키트에 의해 이중 효소 소화 벡터 및 DNA 단편을 정화한다.
    4. DNA 소화 된 DNA 단편 5 μL, 소화 벡터 5 μL, T4 DNA 리가제 1 μL, 10x 리가제 완충액 2 μL 및 ddH2O의 7 μL을 반응 튜브에 추가한 다음 16 °C에서 밤새 배양합니다.
    5. 결찰 생성물의 10 μL을 2.1.4 단계에서 100 μL의 유능한 세포 (DH5α)에 넣고 30 분 동안 얼음 욕조에 올려 놓습니다. LB 액체 배지(항생제 없이)를 튜브에 넣고 37°C, 180 rpm에서 1시간 동안 흔들어 관할 세포를 가나마이신 LB 플레이트상에 코팅하여 균등하게 분포시키고, 플레이트를 밤새 37°C 인큐베이터에 넣었다.
    6. 플레이트로부터 5개의 단일 콜로니를 선택하고 37°C 셰이커를 사용하여 시험관에서 LB 배지의 5 mL에서 박테리아를 배양한다.
    7. 플라스미드 추출 키트를 사용하여 2.1.6 단계에서 수확한 박테리아로부터 플라스미드추출물을 추출하였다.
    8. 유전자 염기서열 분석용 플라스미드를 보내고 SUMO-링커-항원 융합 단백질을 발현할 수 있는 양성 콜로니를 선택한다. 양성 플라스미드를 2.1.5단계 에 이어 BL21(DE3)plysS 유능한 세포로 변형시킨다.
  2. 단백질 정제
    1. 2.1.7 단계에서 카나마이신 (50 μg / mL)을 함유 한 LB 액체 배지의 5 mL로 변형제 단일 콜로니를 선택하십시오. 200 rpm, 37 °C에서 밤새 배양체를 흔들어 주세요.
    2. 1L의 미리 온난화된 LB 배지의 접종을 가나마이신(50 μg/mL)을 플라스크에서 5 mL의 하룻밤 배양물을 가진 플라스크에 접종하고, OD600이 0.6이 될 때까지 격렬한 흔들림으로 37°C에서 성장한다.
    3. 이소프로필 β-D-티오갈라크토사이드(IPTG)를 배지에 0.4 mM의 최종 농도로 넣고, 20°C에서 밤새 200 rpm에서 플라스크를 흔들어 줍니다.
      참고: 단백질 유도의 저온은 체내 형성을 피하는 것이 중요하므로 온도가 22°C 를 넘지 않도록 하십시오.
    4. 세포를 수확 한 후, 세포를 다시 중단하는 세포 펠릿에 50 mL의 라시스 버퍼를 추가하십시오. 세포는 200W에서 5 분 동안 두 번 용해, 초음파 3 s, 얼음에 간격 3 s. 원심분리기는 4°C에서 30분 동안 15, 000 x g에서 초자연자를 수집한다.
      참고: 라시스 버퍼는 50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl, 10 mM imidazole로 구성됩니다. NaOH를 사용하여 pH 값을 8.0으로 조정합니다.
    5. 용해 완충액으로 평형화된 50% Ni-NTA 세포라아제 2 mL를 제거된 초자연자에 넣고 4°C에서 1시간 동안 흔들어(회전 식 셰이커에서 200rpm)하여 부드럽게 섞습니다.
    6. 용해및 Ni-NTA 혼합물을 바닥 출구가 덮인 기둥에 로드하고 바닥 캡을 제거하고 컬럼 흐름을 통해 폐기합니다.
    7. 세척 완충액 6 mL로 세 번 세척한 다음 1.5 mL의 용출 완충액으로 표적 단백질을 3회 용출합니다. 하나의 튜브에 용루를 수집합니다.
      참고 : 세척 버퍼는 50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl, 30 mM imidazole로 구성됩니다. NaOH를 사용하여 pH 값을 8.0으로 조정합니다. 용출 완충제는 50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl, 250 mM imidazole로 구성된다. NaOH를 사용하여 pH 값을 8.0으로 조정합니다.
    8. 용출을 단백질을 탈염시키기 위해 4°C에서 50 mM PBS의 1 L에 투석 백에 넣습니다. 새로운 인산염 완충식염수(PBS)를 3회 교체합니다.
  3. 스모 태그의 분열
    1. 1 mg/mL의 농도에서 2 mL의 작은 유비퀴틴 모양의 수정자(SUMO) 태그단백질을 추가하고, 스모 프로테아제 1mL(재료 표참조), 1mL의 SUMO 프로티제 완충제 및 6 mL의 ddH2O를 첨가하여 반응 용액을 준비합니다.
      참고 : 스모 태그 단백질 농도는 약 1 mg / mL입니다. 효소 소화 후 과도 한 농도 단백질의 응고를 일으킬 수 있습니다.
    2. 4 °C에서 12-16 시간 동안 혼합물을 배양합니다.
    3. 혼합물을 4°C에서 10분 동안 15,000 x g에서 원심분리하고 응집체를 버린다. 50 mM PBS로 평형화 된 50 % Ni-NTA 슬러리의 0.5 mL를 10 mL 클리어 된 초월제에 넣고 4 °C에서 4 °C에서 흔들어 부드럽게 섞습니다 (회전 쉐이커에서 200 rpm).
    4. 용해및 Ni-NTA 혼합물을 바닥 콘센트가 덮인 기둥에 로드합니다. 바닥 캡을 제거한 다음 15 mL 원심 분리튜브로 흐르는 흐름을 저장합니다.
      참고: 히스타그드 스모 단백질은 컬럼에 결합합니다. NCL 반응을 위한 Cys로 시작하는 링커 항원 부분은, 통해 흐름에 있습니다.
    5. 4°C에서 10분 동안 15,000 x g에서 흐르는 원심분리기를 통해 응집체를 폐기한다. HPLC를 사용하여 링커-항원 부분을 25분 그라데이션 용출(0-1 분, 5% B; 1-3 분, 15% B; 3-20 분, 45% B; 20-21 분, 85% B; 21-25 분, 85% B)로 1 mL/min의 유량속도로 정제합니다.
      참고 : 기둥은 4.6mm ID, 250mm 길이로 C-18 수지로 포장되어 있습니다. 이별상 A는 물속의 TFA 0.1%, 이동상 B는 100% 아세토니트릴과 0.1% TFA로 구성되었다.
    6. HPLC에서 정제 된 제품을 수집 한 다음 링커 - 항원 제품을 얻기 위해 밤새 동결 건조하십시오.

3. 네이티브 화학 결찰에 의한 DCAF1 조립

  1. Fc-III 펩타이드와 링커-항원 파트를 함께 융합
    1. Fc-III 펩타이드의 히드라진 유도체의 1.8 mg(1 μmol)을 2 mL EP 튜브에 넣고 0.2 MNaH2PO4(pH 3.0) 용액에 6 MGnHCl의 0.8 mL을 첨가하여 소용돌이에 의해 용해시.
      참고: 0.2 M NaH2PO4(pH 3.0) 용액에서 6 M GnHCl은 HCl 또는 NaOH로 pH 값을 조정함으로써 제조된다.
      주의: NaOH 및 HCl은 부식성이 높습니다. 실험실 코트, 장갑, 마스크를 착용하십시오.
    2. 실온에서 7,200 x g에서 1 분 동안 튜브를 원심 분리 한 후, 얼음 소금 욕조에 튜브를 넣고 자석 교반을 사용하여 용액을 15 분 동안 부드럽게 교반하십시오.
    3. 히드라진 기를 산화시키기 위해 용액에 0.5 M NaNO2의 40 μL을 첨가합니다. 얼음 소금 욕조에서 15 분 동안 용액을 부드럽게 교반하십시오.
    4. 2.3 단계에서 제조된 정제된 링커-항원 부분 11 mg을 얼음 소금 목욕의 반응 튜브에 넣고 5분간 저은 다음 6 M NaOH로 실온에서 pH 값을 6.8-7.0으로 조정합니다.
      참고: pH 값을 중성으로 조정하는 것은 결찰 반응을 시작하는 중요한 단계입니다.
    5. 12시간 후, 반응 시스템에 0.1 Mtris(2-카박스체틸)인 포스핀 염화액(TCEP) 중성 용액(pH 7.0)을 넣고 20분 동안 저어 반응을 종료한다.
      참고: 0.1 M TCEP 중성 용액(pH 7.0)은 0.2 MNaH2PO4(pH 3.0) 용액에서 6 M GnHCl에서 TCEP를 용해시키고 NaOH를 사용하여 pH 값을 7.0으로 조정하여 제조한다.
    6. 10 분 동안 15,000 x g에서 튜브를 원심 분리한 다음 HPLC로 결찰 생성물을 26 분 그라데이션 용출 (0-1 분, 5 % B; 1-21 분, 45 % B; 21-22 분, 85 % B, 85 % B)의 유량 속도로 HPLC로 분석하고 정화합니다. 결찰 반응에 대한 예상 수율은 50% 이상이다.
      참고 : 기둥은 4.6mm ID, 250mm 길이로 C-18 수지로 포장되어 있습니다. 이별상 A는 물속의 TFA 0.1%, 이동상 B는 100% 아세토니트릴과 0.1% TFA로 구성되었다.
  2. 컨쥬게이트의 탈황
    1. 3.1.6단계에서 제조된 컨쥬게이트(3.4 mg, 0.3 μmol)를 0.2 MNaH2PO4(pH 7.0) 용액에 6 M GnHCl의 50 μL에서 용해한다.
    2. 상기 혼합물에 50 μL의 1 M TCEP, 10 μL의 tBuSH 및 0.1 M VA-044 용액의 5 μL을 첨가한다.
      참고: 0.1 M VA-044 용액은 VA-044 분말 9.7 mg을 0.2 MNaH2PO 4(pH 7.0) 용액에서 6 M GnHCl의 0.3 mL로 용해시킴으로써 제조된다. VA-044는 공기에 노출되어 쉽게 산화되기 때문에 VA-044 용액은 사용하기 전에 신선하게 준비되어야 합니다.
    3. 용액의 최종 pH를 6.9로 조정하고 솔루티오마트를 37°C정도 교반하여 유지한다.
    4. 튜브를 10 분 동안 15,000 x g으로 원심 분리하고 불용성 물질을 제거하십시오. HPLC로 결찰 생성물을 26분 그라데이션 용출(0-1 분, 20% B; 1-21분, 45% B; 21-22분, 85% B; 22-26분, 85% B)으로 분석하고 정제합니다. 탈황 반응에 대한 예상 수율은 약 40%이다.
      참고 : 기둥은 4.6mm ID, 250mm 길이로 C-18 수지로 포장되어 있습니다. 이별상 A는 물속의 TFA 0.1%, 이동상 B는 100% 아세토니트릴과 0.1% TFA로 구성되었다.
  3. 최종 제품 DCAF1을 얻기 위해 Acm제거
    1. 32 mM AgOAc의 200 μL에서 3.2.4 단계에서 제조된 펩타이드(1.35 mg, 0.11 μmol)를 용해한 다음, 4시간 동안 실온에서 반응 혼합물을 저어줍니다.
    2. 0.2 M NaH2PO4 (pH 7.0) 용액에서 6 M GnHCl에 1M 디티오트레이톨 (DTT)의 3 μL을 첨가하여 펩티드상의 은 티올을 프리 티올로 변환합니다.
    3. 1 분 동안 격렬하게 교반 한 후, 15,000 x g에서 튜브를 10 분 동안 원심 분리하여 불용성 물질을 폐기하십시오. HPLC로 최종 제품을 26분 그라데이션 용출(0-1 분, B 20% B, 1-21분, 45% B; 21-22분, 85% B; 22-26분, 85% B)으로 분석하고 정화합니다.1 mL/min의 유량. Acm 보호 해제 반응에 대한 예상 수율은 약 30%입니다.
      참고 : 기둥은 4.6mm ID, 250mm 길이로 C-18 수지로 포장되어 있습니다. 이별상 A는 물속의 TFA 0.1%, 이동상 B는 100% 아세토니트릴과 0.1% TFA로 구성되었다.
    4. HPLC 정제 후, 최종 생성물을 밤새 동결 건조시키고, 분말을 PBS(50 mM NaH2PO4,150 mM NaCl, pH 8.0)에 용해시다. 튜브를 4°C에서 10분 동안 15,000 x g으로 원심분리하고 펠릿을 버린다.
    5. 최종 제품(3.4단계에서)과 링커-항원 부분(2.3.6단계에서)의 농도를 10 μM으로 조정하고, 25°C에서 1mm 경로길이의 CD 분광계를 사용하여 이 두 제품의 원형 이색(CD) 스펙트럼을 260~195nm로 기록합니다.
      참고: CD 스펙트럼은 최종 생성물에서 α 헬리칼 구조의 양을 나타내기 위해 사용되며, 이는 발현된 재조합에서와 유사하다.

4. 질량 분석법에 의한 제품 검출

  1. 60 분 그라데이션 용출에 의해 각 화학 반응에서 제품을 분리 (0-8 분, 2% B; 8-10 분, 5% B; 10-35 분, 30% B; 35-50 분, 50% B; 50-52 분, 80% B; 52-58 분, 80% B; 58%B; 2% B; 59-60 분, 2% B) 0.30 μl의 유량에서 고분해능 질량 분석기와 직접 인터페이스되는 나노 HPLC 시스템.
    참고: 분석 컬럼은 75 μm ID, 길이 150mm, C-18 수지로 포장되어 있습니다. 이선상 A는 물속의 포산산0.1%, 이발상 B상으로 구성되었으며, 이면상 B는 100% 아세토니트릴과 0.1% 포르믹산으로 구성되었다.
  2. 전체 스캔 모드에서 질량 분석기작동을 하고 m/z 범위를 300-2,000, 해상도를 60,000으로 설정합니다.
  3. 질량 스펙트럼 데이터를 열고 각 단계에서 제품의 피크를 찾아 화학 반응이 성공적으로 미리 형성되어 있는지 확인합니다.

5. DCAF1과 4G2 항체 간의 상호 작용에 대한 ELISA 분석

  1. 1 pmol 항 GST 항체 (재료 표참조)로 96 웰 마이크로 티터 플레이트를 코팅 버퍼 / 웰의 100 μL로 코팅하고 접시를 밀봉하고 셰이커에서 밤새 4 °C에서 배양하십시오.
  2. PBS에서 1 % BSA의 200 μL로 각 우물을 차단하고 접시를 밀봉하고 셰이커에서 실온에서 1 시간 동안 배양하십시오.
  3. 0.05% 트웬 20으로 PBS를 사용하여 각 우물을 4회 세척하십시오.
  4. GST 융합 항원 단백질 (차단 용액 100 μL에서 0.05 pmol)을 웰에 넣고 플레이트를 밀봉하고 실온에서 2 시간 동안 배양하십시오.
    참고: GST 융합 항원 단백질은 박테리아로 발현되고 GSH 세파로즈에 의해 정제됩니다.
  5. 접시를 세척하기 위해 5.3 단계를 반복합니다.
  6. 1 pmol 4G2 항체 또는 1 pmol 4G2 항체와 다른 리간드를 추가하십시오 : 항원, Fc-III 또는 DCAF1을 시리즈 양 (0.1 pmol, 1 pmol, 10 pmol, 10 pmol, 100 pmol 및 1000 pmol)에 100 μL에 차단 용액 / 웰, 플레이트를 밀봉하고 실온에서 2 시간 인큐베이트 하십시오.
  7. 접시를 세척하기 위해 5.3 단계를 반복합니다.
  8. 안티 마우스 IgG를 추가, HRP 연결 된 항체 (1:20,000 희석) 차단 용액 /잘의 100 μL에, 접시를 밀봉하고 쉐이커에 실온에서 30 분 배양.
  9. 0.05% 트웬 20으로 PBS를 사용하여 각 우물을 6회 세척합니다.
  10. TMB 시약 A와 B를 사용 직전에 1:1부적부로 혼합하고, 100 μL/well을 추가한 다음, 어둠 속에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  11. 스톱 솔루션의 100 μL/well을 추가하고 플레이트 리더를 사용하여 30분 이내에 각 웰에 대한 OD450 값을 측정합니다.

6. Fc-III와 IgG 분자 사이의 상호 작용의 ELISA 분석

  1. 96웰 마이크로티터 플레이트를 1pmol 항CA 항체(재료 표참조)로 코팅 버퍼/웰 100 μL에 코팅하고, 플레이트를 밀봉하고 셰이커에서 밤새 4°C에서 배양합니다.
  2. 5.2에서 5.3까지 단계를 반복합니다.
  3. Fc-III 또는 Fc-III-4C 융합 CA 단백질(0.01, 0.05, 0.1, 0.5 및 1 pmol 의 차단 용액 100 μL)을 웰에 넣고 플레이트를 밀봉하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다.
    참고: Fc-III 또는 Fc-III-4C 융합 CA 단백질은 박테리아로 발현되고 Ni-NTA에 의해 정제된다.
  4. 5.7에서 5.11까지의 단계를 반복하고 결과를 확인합니다.

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Representative Results

이 문서에서 네이티브 화학 적 결찰에 의한 합성 경로에 대한 순서도는 그림 1에나와 있습니다. 도 2-6은 Fc-III 펩타이드의 화학적 합성 히드라진 유도체의 크로마토그램(A) 및 질량 스펙트럼(B)을 나타내며, 재조합 발현 링커 및 항원 부분, NCL 반응으로부터 정제된 생성물, 정제된 탈황 반응및 정제된 최종 제품 DCAF1로부터의 제품. 크로마토그램은 모든 제품의 정제물이 90% 이상임을 보여주고 질량 스펙트럼은 각 반응 후 제품의 분자량을 나타냅니다. 각 제품의 정확한 분자량을 반영하는 도면 3-6에도디톤볼루션 분자량이 표시됩니다. 도 7은 ELISA 분석(A) 및 항원 펩타이드, Fc-III 및 DCAF1의 결과를 경쟁적으로 억제하는 4G2 항체 결합을 나타낸다. 항원 펩티드와 DCAF1 모두 4G2 결합을 현저하게 차단하는 반면, Fc-III 펩티드는 항원-항체 상호작용에 영향을 미치지 않는다.

Figure 1
그림 1. DCAF1 분자의 반합성을 위한 네이티브 화학 결찰 방법의 워크플로우.
먼저, Fc-III 펩타이드의 히드라진 유도체는 고체 상 펩타이드 합성에 의해 수득된다. 이어서, 스모 태그 융합 링커와 항원 부분이 박테리아로부터 발현및 정제되고, 그 다음에 스모 태그 절단이 뒤따른다. 두 단편의 NCL 반응 후, 생성물은 탈황을 겪고 Acm 기를 제거하여 DCAF1 분자가 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2. Fc-III 펩티드의 하이드라진 유도체의 크로마토그램 및 질량 스펙트럼.
이 수치는 m/z에서 정제된 펩티드(A)와 모노동위원소 피크의 LC 프로파일이 이중 충전 펩티드(B)와일치한다는 것을 보여준다. 이 그림은 참조 10, 도 2로부터 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3. 링커 및 항원 부분의 크로마토그램 및 질량 스펙트럼.
이 수치는 정제된단편(A)의LC 프로파일을 나타내고 이 단편의 분멸 분자량은 질량스펙트럼(B)으로부터9429.0으로 계산된다. 이 도면은 참조 10, 도 S2로부터 수정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4. NCL 반응에 의한 컨쥬게이션 생성물의 크로마토그램 및 질량 스펙트럼.
이 수치는 결찰 생성물을 0시간(상단), 12h(middle) 및 정제된 펩티드(bottom)(A)에서 모니터링하는 LC 프로파일을 도시하고 이 제품의 분멸 분자량은 질량 스펙트럼(B)으로부터 11227.0으로 계산된다. 이 도면은 참조 10, 도 S2로부터 수정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 5
그림 5. 탈황 반응 후 제품의 크로마토그램 및 질량 스펙트럼.
이 수치는 정제된생성물(A)의LC 프로파일을 나타내고 이 제품의 분멸 분자량은 질량 스펙트럼(B)으로부터11195.0으로 계산된다. 이 도면은 참조 10, 도 S2로부터 수정되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 6
그림 6. DCAF1 분자의 크로마토그램, 질량 스펙트럼 및 CD 스펙트럼.
이 수치는 정제된 DCAF1(A)의LC 프로파일을 나타내며, 이 분자체의 감소 분자량은 질량스펙트럼(B)과최종 생성물(실선) 및 링커 항원 부분의 CD 스펙트럼으로부터 11053.0으로 계산됨) 대시 라인)을 FCAF1에서 사용합니다. 이 그림은 참조 10, 도 2로부터 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 7
그림 7. DCAF1 분자의 ELISA 분석.
(A)샌드위치 ELISA 분석의 워크플로우. 제 1 항-GST 항체는 웰 플레이트에 코팅된다. 그런 다음 GST 융합 항원 펩티드가 배양됩니다. 그런 다음 DCAF1, 항원 또는 Fc-III의 상이한 농도를 가진 4G2 항체가 색도 분석을 위해 첨가된다. (B)ELSIA 의 항원, Fc-III 및 DCAF1은 상이한 리간드 농도를 이용하여 4G2 결합의 억제 효과를 입증하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

여기서 프로토콜은 도 1에도시된 NCL 접근법을 사용하여 DCAF1의 반합성 및 검출에 대해 설명한다. 간략하게, DCAF1의 두 단편은 각각 화학적으로 합성되고 재조합적으로 발현되는; 그런 다음, 전체 길이 DCAF1 분자가 조립, 변형 및 정제된다. 히드라진 유래 Fc-III 단편 합성의 경우, 고용량이 히드라진 생성에 부정적인 영향을 미치고 제품의 낮은 수율을 유도하기 때문에 저용량 2-Cl 수지를 사용하는 것은 매우 중요하다. 링커 및 항원 부분은 두 가지 이유로 SUMO 태그로 발현됩니다: 첫째, 스모 태그는 융합 단백질의 용해도를 향상시킬 수 있습니다; 둘째, 스모 프로테아제는 형태 인식 프로테아제로서, 방출된 제품이 추가 결찰 반응을 위해 Cys 잔류물로 시작할 수 있게 합니다. 단백질 발현 및 정제에서 가장 중요한 단계 중 하나는 스모 프로테아제 분열입니다. 스모 태그 융합 단백질의 농도는 적절한 범위로 조정되어야 합니다. 너무 높거나 너무 낮은 농도는 소화 후 추가 정제를 위한 단백질 응집 또는 어려움으로 이끌어 낼 것입니다. 이 프로토콜의 또 다른 중요한 단계는 NCL 반응 동안 pH 값을 조정하는 것입니다, 이는 중립 버퍼에서 일어나야 티올 에스테르 교환을 기반으로. 반응 버퍼 에서 pH 값의 미세 한 제어는 결찰 효율을 향상시키는 데 도움이됩니다.

이 프로토콜은 상이한 DCAF 분자의 서열이 매우 유사하고 항원 부분이 일반적으로 DCAF의 전체 구조 및 특성에 거의 기여하지 못하기 때문에 상이한 항원 서열을 가진 다른 DCAF 분자의 합성에 적합합니다. 예를 들면, 우리는 그들의 cognate 항체를 표적으로 하기 위하여 다른 3개의 DCAF 분자를 종합하기 위하여 이 프로토콜을 이용했습니다. 그 중, DCAF4는 아세틸 콜린 수용체를 중화하고 쥐 모델에서 중증 근무를 일으킬 수있는 mAb35 항체를 차단하도록 설계되었습니다. 우리는 DCAF4를 사용하여 mAb35 유도 중증 근무력증을가진 쥐의 임상 증상을 줄이고 보체 성분 단백질을 억제하여 아세틸 콜린 수용체를 구출했습니다.

우리의 기술의 적용은 여러 가지 요인에 의해 제한됩니다 : 첫째, 현재 접근법에 의해 합성 된 DCAF 분자의 수율은 낮습니다 (일반적으로 10 % 미만). 인해 여러 정제 단계; 둘째, 형태 결정자를 가진 항체는 DCAF에 의해 표적으로 하기 어렵습니다; 셋째, DCAF는 기존의 작은 화합물 약물에 비해 유기체에서 추가면역 반응을 유도할 수 있다. 우리는 다른 항체 유도 병리학 조건에 이 프로토콜의 적용이 표적으로 한 유해한 항체를 제거하기 위하여 더 많은 DCAF 분자를 종합하는 것을 도울 것이라는 점을 구상합니다.

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Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

이 작품은 칭화 대학 - 게이츠 재단 (아니. OPP1021992), 중국 국립 자연 과학 재단 (번호 21502103, 21877068 및 041301475), 그리고 중국의 국가 핵심 연구 개발 프로그램 (번호 2017YFA0505103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Chlorotrityl resin Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide GL Biochem 00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate GL Biochem 00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride J&K Scientific 503236
4G2 antibody Thermo MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid Alfa Aesar H27658
96-well microtiter plates NEST 701001
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
AgOAc Sinopharm Chemical Reagent 30164324
anti-GST antibody Abclonal AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076P2
BSA Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer Applied Photophysics Ltd
dialysis bag Sbjbio SBJ132636
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent 80047360
diethyl ether Sinopharm Chemical Reagent 10009318
DNA Gel Extraction Kit Beyotime D0056
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
GSH Sepharose GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride Sinopharm Chemical Reagent 30095516
Hydrazine hydrate Sinopharm Chemical Reagent 80070418
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent 10011018
imidazole SIGMA 12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside SIGMA 5502-5G
kanamycin Beyotime ST101
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine GL Biochem 90600
N, N-Dimethylformamide Sinopharm Chemical Reagent 8100771933
NcoI Thermo ER0571
PBS buffer Solarbio P1022
Peptide BEH C18 Column Waters 186003625
piperidine Sinopharm Chemical Reagent 80104216
Plasmid Extraction Kit Sangon Biotech B611253-0002
QIAexpress Kit QIAGEN 32149
Rapid DNA Ligation Kit Beyotime D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent 20040718
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent 10019762
Sodium nitrite Sinopharm Chemical Reagent 10020018
sodium chloride Sinopharm Chemical Reagent 10019318
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem
sterilizing pot Tomy SX-700
SUMO Protease Thermo Fisher 12588018
stop solution Biolegend 423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent Biolegend 421101
Trifluoroacetic acid SIGMA T6508
Triisopropylsilane GL Biochem 91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Aladdin T107252-5g
tryptone OXOID LP0042
Tween 20 Solarbio T8220
Ultimate 3000 HPLC Thermo
vacuum pump YUHUA SHZ-95B
XhoI Thermo IVGN0086
yeast extract OXOID LP0021

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철회 문제 151 DCAF 표적 치료 항체 네이티브 화학 결찰 고체 상 펩타이드 합성 단백질 발현 및 정제 ELISA
항원 펩타이드 및 Fc-III 모방제(DCAF)의 이중 기능 성 컨쥬게이트에 의한 표적 항체 차단
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Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao,… More

Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao, X., Pan, J., Deng, H., Feng, S. Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF). J. Vis. Exp. (151), e60063, doi:10.3791/60063 (2019).

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