Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Målrettet antistoff blokkering av en dual-funksjonell bøy av antigen peptid og FC-III Mimetics (DCAF)

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60063
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 2, 2, 3, 1,2
1Key Laboratory of Structural Biology of Zhejiang Province, School of Life Sciences, Westlake University, 2Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, 3MOE Key Laboratory of Bioinformatics, Center for Synthetic and Systems Biology, School of Life Sciences, Tsinghua University
* These authors contributed equally

Summary

Utvikling av en dual-funksjonell bøy av antigen peptid og FC-III mimetics (DCAF) er romanen for eliminering av skadelige antistoffer. Her beskriver vi en detaljert protokoll for syntesen av DCAF1 molekyl, som kan selektivt blokkere 4G2 antistoff for å eliminere antistoff avhengig ekstrautstyr effekt under Dengue virus infeksjon.

Abstract

Eliminering av skadelige antistoffer fra organismer er en verdifull tilnærming for intervensjon av antistoff-tilknyttede sykdommer, slik som Dengue hemoragisk feber og autoimmune sykdommer. Siden tusenvis av antistoffer med ulike epitopes sirkulerer i blod, ingen universell metode, med unntak av dual-funksjonell bøy av antigen peptid og FC-III mimetics (DCAF), ble rapportert å målrette spesifikke skadelige antistoffer. Utviklingen av DCAF-molekyler gir betydelig bidrag til fremdriften for målrettet behandling, som ble demonstrert for å eliminere den Dengue antistoff-effekten (ADE-avhengig forbedring) i en infeksjon modell av viruset (DENV) og for å øke acetylkolin reseptor aktivitet i en myasthenia gravis modell. Her beskriver vi en protokoll for syntesen av et DCAF-molekyl (DCAF1), som kan selektivt blokkere 4G2-antistoff til dempe ADE-effekt under Dengue virus infeksjon, og illustrere bindingen av DCAF1 til 4G2 antistoff ved en ELISA-analyse. I vår metode, DCAF1 er syntetisert av Bøyning av en hydrazin derivat av en FC-III peptid og et rekombinant uttrykt lang α-Helix med antigen sekvens gjennom native kjemiske ligation (NCL). Denne protokollen har blitt brukt på DCAF1 så vel som andre DCAF molekyler for målretting deres beslektet antistoffer.

Introduction

Antistoffer spille viktige roller i humoral immunrespons for nøytralisering av patogene bakterier og virus1. Noen antistoffer viser imidlertid skadelige virkninger på organismer, slik som tverr reaktive antistoffer i ADE-effekten under DENV infeksjon og over-reaktive antistoffer i myasthenia gravis, som er en autoimmun sykdom2,3. ADE effekten er formidlet av tverr reaktive antistoffer som gjør broen for å koble DENV og FC reseptoren presentere celler4,5, mens myasthenia gravis er forårsaket av overdreven antistoffer som angriper acetylkolin reseptorer mellom celle-celle veikryss i muskel vev6,7. Selv om delvis effektive tilnærminger har blitt utviklet for å behandle disse sykdommene8,9, utvilsomt direkte eliminering av disse skadelige antistoffer ville gjøre fremskritt for intervensjoner.

Nylig har DCAF molekyler, som har dual-funksjonelle grupper, blitt utviklet for målrettede antistoff blokkering10. DCAF er en lang peptid som består av 3 deler: 1) et antigen del som kan spesifikke gjenkjenne beslektet antistoff, 2) en FC-III eller FC-III-4C kode for sterkt bindende for FC regionen av antistoff å hemme enten FC reseptor eller utfylle komponent proteiner , 3) en lang α-spiral linker som konjugater disse to funksjonelle gruppene10. Den linker del, designet fra Moesin FERM domene, ble optimalisert av Rosseta programvare for å sikre antigen del og FC-III del i et DCAF molekyl kan binde til fab og FC regioner av IgG samtidig. Fire DCAF-molekyler har blitt syntetisert for å målrette mot 4 forskjellige antistoffer, blant dem DCAF1 ble brukt til å eliminere 4G2-antistoff, som er et tverr reaktiv antistoff under DENV-smitte for å bidra til ADE-effekten; og DACF4 ble designet for redning av acetylkolin reseptorer ved å blokkere mab35 antistoff i myasthenia gravis10.

I denne studien, tatt DCAF1 som eksempel, viste vi protokollene for syntesen av DCAF molekyl og påvisning av samspillet mellom en DCAF og dens beslektet antistoff. Den DCAF1 er halvt syntetisert av NCL tilnærming11,12,13,14, som konjugater den hydrazin derivat av en FC-III peptid og uttrykt linker-antigen deler sammen. Den NCL tilnærmingen har betydelige fordeler over fullt kjemisk syntese og fullt rekombinant uttrykk for DCAF1 syntese, fordi begge disse metodene føre til lav avkastning og høye kostnader. Den nåværende tilnærmingen er ikke bare den mest kostnadseffektive måten å få full lengde DCAF, men også kan opprettholde konformasjon av linker del lignende som sin opprinnelige form. Siden ulike DCAF molekyler har lignende sekvenser bortsett fra antigen deler, våre metoder for DCAF1 syntese og samspillet analysen mellom DCAF1 og 4G2 antistoff kan brukes til andre DCAF molekyler til målrettede blokkere sine beslektet antistoffer også.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. kjemisk syntese av hydrazin derivat av en FC-III peptid

  1. Konvertere 2-CL-(TRT)-CL harpiks til 2-CL-(TRT)-NHNH2 harpiks
    1. Veie 625 mg 2-CL-(TRT)-CL Resin (0,25 mmol) til en 25 mL peptid syntese fartøy.
    2. Tilsett 5 mL N, N-dimethylformamide (DMF) til harpiks fra toppen av fartøyet, sett hetten tilbake, rist fartøyet forsiktig i 15 s og tapp det deretter. Gjenta DMF vask for to ganger.
    3. Tilsett 5 mL diklormetan (DCM) til fartøyet, sett hetten tilbake, rist fartøyet forsiktig i 15 s og tapp det deretter. Gjenta DCM vask på to ganger.
    4. Gjenta trinn 1.1.2 tre ganger.
    5. Bruk 6 mL av 50% (Vol/Vol) DMF/DCM for å hovne opp harpiks i 30 minutter, og Tøm den.
    6. Overføring 6 mL 5% (Vol/Vol) NH2NH2 i DMF til reaksjons fartøyet, rist blandingen ved 120 RPM, 30 ° c i 30 min, og tøm deretter oppløsningen ved å støvsuge pumpen.
      Merk: Legg til 0,3 mL hydrazin hydrat til 5,7 mL med DMF for å få 5% (Vol/Vol) NH2NH2. Tilbered NH2NH2 før bruk.
      FORSIKTIG: Hydrazin hydrat er et farlig stoff og kan forårsake kreft. Bruk en Laboratoriefrakk, hansker og en maske. Utfør eksperimentene i en avtrekksvifte.
    7. Tilsett 5 mL DMF til fartøyet, rist den forsiktig i 15 s og Tøm den.
    8. Gjenta trinn 1.1.6 og vask deretter harpiks ved å gjenta trinnene 1.1.2-1.1.4 for to ganger.
    9. Tilsett 6 mL 5% (Vol/Vol) MeOH/DMF til fartøyet, rist den forsiktig i 10 minutter og Tøm den.
      Merk: dette trinnet er svært viktig å sikre ureagerte nettsteder på harpiks er avkortet.
    10. Vask harpiks grundig ved å gjenta trinnene 1.1.2-1.1.4.
    11. Tilsett 5 mL DCM til harpiks, rist den forsiktig for 15 s og deretter tappe den for å få 2-CL-(TRT)-NHNH2 harpiks.
      Merk: harpiks blir gul eller lys grønn når erstatningen er vellykket.
  2. Peptid forlengelse
    1. Tilsett 1 mmol av Fmoc-ala-OH (934 mg) og 0,95 mmol 1-[BIS (dimetylamino) metylen]-1H-1, 2, 3-triazolo-[4, 5-b] pyridinium heksafluorfosfat 3-oksid (HATU) (360 mg) i et 5 mL rør som inneholder 3 mL DMF.
      FORSIKTIG: eksponering for HATU kan føre til en allergisk reaksjon. Bruk en Laboratoriefrakk, hansker og en maske.
    2. Tilsett 2 mmol av N, N-diisopropylethylamine (DIEA) (0,36 mL) til den oppløste oppløsningen og Vortex for 0,5 – 1 min.
      Merk: kritisk trinn: aktiveringen bør ikke ta mer enn 5 min, da de aktiverte aminosyrer isomerize fra de mer aktive O-skjemaene til de mindre aktive N-skjemaene over tid.
    3. Legg den aktiverte Fmoc-ala-OH til reaksjons fartøyet inneholder 2-CL-(TRT)-NHNH2 harpiks, tilberedt fra trinn 1,1. Rist forsiktig på 120 RPM, 30 ° c i 20 minutter i en shaker med konstant temperatur, og tøm deretter oppløsningen ved å støvsuge pumpen.
    4. Tilsett 5 mL DMF for å vaske harpiks, rist den forsiktig i 15 s og Tøm den.
    5. Tilsett 1 mmol av Fmoc-ala-OH (934 mg) og 0,95 mmol av 2-(6-klor-1H-benzotriazole-1-YL)-1, 3, 3-tetramethylaminium heksafluorfosfat (HCTU) (390 mg) i et 5 mL rør som inneholder 3 mL DMF.
      FORSIKTIG: eksponering for HCTU kan føre til en allergisk reaksjon. Bruk en Laboratoriefrakk, hansker og en maske.
    6. Tilsett 2 mmol DIEA (0,36 mL) til slangen og Vortex for 0,5 – 1 min for å oppløse den.
    7. Legg den aktiverte Fmoc-ala-OH til reaksjons fartøyet. Rist forsiktig på 120 RPM, 30 ° c for 40-60 min i en konstant temperatur shaker, og tøm deretter oppløsningen ved å støvsuge pumpen.
    8. Vask harpiks ved å gjenta trinnene 1.1.2-1.1.4.
    9. Tilsett 4 mL 20% (Vol/Vol) piperidin i DMF til harpiks, rist den forsiktig i 5 min ved romtemperatur og Tøm oppløsningen.
      FORSIKTIG: pyridine er svært brannfarlig og giftig. Utfør eksperimentene i en avtrekksvifte.
    10. Tilsett ytterligere 4 mL av 20% (Vol/Vol) piperidin i DMF til harpiks, rist den forsiktig i 15 minutter ved romtemperatur og Tøm oppløsningen.
    11. Følg trinnene 1.2.1-1.2.10 til par og deprotect den Fmoc-ala-OH, Fmoc-THR-OH, Fmoc-cys-OH, Fmoc-hans-OH og Fmoc-ala-OH. Gjenta trinn 1.2.5-1.2.10 til par og deprotect den Fmoc-TRP-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-leu-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gly-OH og Fmoc-ASP-OH.
    12. Gjenta trinn 1.1.2-1.1.4 å vaske harpiks grundig.
    13. Gjenta trinn 1.1.3 å vaske harpiks og deretter vakuum-tørk harpiks i 5 min.
  3. Kløft av hydrazin avledet FC-III råolje peptid
    1. Tilsett 12 mL cocktails trifluoroacetic acid (TFA)/2, 2 ′-(ethylenedioxy) diethanethiol (DODT)/triisopropylsilane (TIPS)/H2O (92.5/2.5/2.5/2.5) til harpiks, og deretter bruke en konstant temperatur shaker å holde peptid fra harpiks ved 200 RPM, 37 ° c ca 2 h. Filtrer blandingen til et 50 mL sentrifugerør.
    2. Tilsett 1 mL cocktails i harpiks for å vaske den og samle Filtrer i 50 mL sentrifuge røret. Gjenta to ganger.
    3. Konsentrer blandingen til 2 mL av en vaper rotor i en avtrekks hette, og legg deretter til 20 mL forkjøles dietyl Eter inn i røret for å utløse råolje peptider.
      Merk: vannfri Eter bør være forkjøles til 0 ° c for å unngå voldelig varmeutslipp, som kan forårsake bivirkninger av råolje peptid.
    4. Ruge den peptid nedbør ved-20 ° c for 1-2 h.
    5. Sentrifuger ved 5 000 x g, 4 ° c i 10 min og fjern løsningsmidlet fra sentrifuge røret forsiktig.
    6. Tilsett 20 mL forkjøles dietyl Eter inn i røret to ganger i henhold til trinnene 1.3.3-1.3.5 å vaske nedbøren. Air-Dry peptid produkt i en klokke-glass i ca 15 min. lagre tørket råolje peptider ved 4 ° c for videre analyse.
  4. Rensing av hydrazin derivat av en FC-III peptid
    1. Bruk høy ytelse flytende kromatografi (HPLC) system for å rense peptid av en 30 min gradient eluering (0-1 min., 5% B; 1-20 min., 50% B; 20-25 min., 85% B; 25-30 min., 85% B) med en strømningshastighet på 1 mL/min.
      Merk: kolonnen er i 4,6 mm ID, 250 mm lengde, fullpakket med C-18 harpiks. Mobil fase A besto av 0,1% TFA i vann, og mobil fase B besto av 100% acetonitril og 0,1% TFA.

2. protein uttrykk og rensing av linker og antigen deler

  1. Plasmider konstruksjon
    1. Syntetisere hele gen sekvensen som kan uttrykke SUMO-linker-antigen (se tabell over materialer).
    2. Cut 10 ng av PET-28A tom vektor og 50 ng av syntetisert SUMO-linker-antigen DNA fragment ved hjelp NcoI og XhoI i en 37 ° c vannbad for 3 h.
    3. Rens dobbel-enzym fordøyd vektor og DNA fragment av DNA gel Extraction Kit.
    4. Tilsett 5 μL av DNA-fordøyd DNA-fragment, 5 μL av fordøyd vektor, 1 μL av T4 DNA-ligase, 2 μL av 10x ligase buffer og 7 μL av ddH2O til et reaksjons rør, og ruge det over natten ved 16 ° c.
    5. Bland 10 μL av det ligation produktet fra trinn 2.1.4 til 100 μL av kompetente celler (DH5α) og legg den på et is bad i 30 minutter. sett kompetente celler til en 42 ° c vannbad for 90 s og rask overføre den til et is bad i 2 min. Tilsett 800 mL LB flytende medium (uten antibiotika) til røret og rist det ved 37 ° c, 180 RPM for 1 t. Coat de kompetente cellene på en Kanamycin LB plate for å gjøre dem like fordelt, og sette platen inn i en 37 ° c inkubator over natten.
    6. Velg 5 enkelt kolonier fra platen og kultur bakteriene i 5 mL LB medium i et reagensrør ved hjelp av en 37 ° c shaker.
    7. Pakk ut plasmider fra bakteriene som høstes fra trinn 2.1.6 ved hjelp av plasmider Extraction Kit.
    8. Send plasmider for gen sekvensering og velg den positive kolonien som kan uttrykke SUMO-linker-antigen Fusion protein. Forvandle den positive plasmider til BL21 (DE3) plysS kompetente celler følgende trinn 2.1.5.
  2. Protein rensing
    1. Plukk en enkelt koloni av transformants fra trinn 2.1.7 inn i 5 mL LB flytende medium som inneholder kanamycin (50 μg/mL). Rist kulturene over natten på 200 RPM, 37 ° c.
    2. Vaksinere 1 L av prewarmed LB medium inneholdende kanamycin (50 μg/mL) i en kolbe med 5 mL av de over natten kulturer, og vokse ved 37 ° c med kraftig risting, inntil OD600 er 0,6.
    3. Legg isopropylalkohol β-D-thiogalactoside (IPTH) inn i mediet til den endelige konsentrasjonen av 0,4 mM, og rist flasken ved 200 RPM over natten ved 20 ° c.
      Merk: lav temperatur for protein induksjon er viktig for å unngå inkludering kropps dannelse, så sørg for at temperaturen er ikke mer enn 22 ° c.
    4. Etter høsting cellene, tilsett 50 mL lyseringsbuffer til celle pellets for å resuspend cellene. Sonikere cellen lysater to ganger i 5 min ved 200 W, ultralyd 3 s, intervall 3 s på is. Sentrifuger den på 15, 000 x g i 30 min ved 4 ° c for å samle inn supernatanter.
      Merk: lyseringsbufferen består av 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mm imidazole. Juster pH-verdien til 8,0 ved hjelp av NaOH.
    5. Tilsett 2 mL av 50% ni-NTA Sephorase, equilibrated av lyseringsbuffer, til den tomme supernatanter og bland forsiktig ved risting (200 RPM på en roterende shaker) ved 4 ° c for 1 time.
    6. Legg lysat og ni-NTA blandingen i en kolonne med bunnen utløpet avkortet, og fjerne bunn lokket og forkaste kolonnen Flow-through.
    7. Vask tre ganger med 6 mL vaskebuffer, og eluere deretter det målrettede proteinet 3 ganger med 1,5 mL eluering buffer. Samle eluatet i ett rør.
      Merk: vaske bufferen er sammensatt av 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 30 mm imidazole. Juster pH-verdien til 8,0 ved hjelp av NaOH. Eluering buffer er sammensatt av 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mm imidazole. Juster pH-verdien til 8,0 ved hjelp av NaOH.
    8. Sett eluatet i en pose med dialyse i 1 L av 50 mM PBS ved 4 ° c for å avsalte proteinet. Erstatt ny fosfat bufret saltvann (PBS) for 3 ganger.
  3. Kløft av SUMO tag
    1. Tilsett 2 mL Small Ubiquitin-like (SUMO) merket protein ved konsentrasjonen av 1 mg/mL, 1 mL SUMO protease (se tabell over materialer), 1 ml 10X Sumo protease buffer og 6 ml ddH2O for å klargjøre reaksjons løsningen.
      Merk: SUMO tag proteinkonsentrasjon er ca 1 mg/mL. Overdreven konsentrasjoner etter at enzymet fordøyelsen kan føre til at det er et protein.
    2. Ruge blandingen for 12-16 h ved 4 ° c.
    3. Sentrifuger blandingen ved 15 000 x g i 10 min ved 4 ° c og kast aggregater. Tilsett 0,5 mL av 50% ni-NTA slurry, equilibrated av 50 mM PBS, til 10 mL ryddet supernatanter og bland forsiktig ved risting (200 RPM på en roterende shaker) ved 4 ° c for 60 min.
    4. Legg lysat og ni-NTA blandingen i en kolonne med bunnen utløpet avkortet. Fjern den nederste hetten og deretter lagre strømmen gjennom i et 15 mL sentrifugerør.
      Merk: Histagged SUMO protein er bindende for kolonnen. Den linker-antigen del, som starter med cys for NCL reaksjon, er i flyten gjennom.
    5. Sentrifuger strømmen gjennom ved 15 000 x g i 10 min ved 4 ° c og kast aggregater. Rens linker-antigen delen ved hjelp av HPLC med en 25 min gradient eluering (0-1 min., 5% B; 1-3 min., 15% B; 3-20 min, 45% B; 20-21 min., 85% B; 21-25 min., 85% B) med en strømningshastighet på 1 mL/min.
      Merk: kolonnen er i 4,6 mm ID, 250 mm lengde, fullpakket med C-18 harpiks. Mobil fase A besto av 0,1% TFA i vann, og mobil fase B besto av 100% acetonitril og 0,1% TFA.
    6. Samle renset produktet fra HPLC, og deretter fryse-tørr over natten for å få linker-antigen produktet.

3. montering av DCAF1 av innfødte kjemiske ligation

  1. Bøye FC-III peptid og linker-antigen del sammen
    1. Veie 1,8 mg (1 mikromol) av hydrazin derivat av en FC-III peptid i en 2 mL EP tube og tilsett 0,8 mL 6 M GnHCl i 0,2 M NaH2PO4 (pH 3,0) løsning å oppløse den ved virvlingen.
      Merk: 6 M GnHCl i 0,2 M NaH2PO4 (pH 3,0) løsningen er utarbeidet ved å justere pH-verdien med HCL eller NaOH.
      FORSIKTIG: NaOH og HCl er svært etsende. Bruk en Laboratoriefrakk, hansker og en maske.
    2. Etter sentrifugering røret på 7 200 x g i 1 min ved romtemperatur, Legg røret i en is-salt bad og bruk magnetisk omrøring for å agitere løsningen for 15 min forsiktig.
    3. Tilsett 40 μL av 0,5 M NaNO2 til løsningen for å oksidere den hydrazin gruppen. Forsiktig agitere løsningen for en annen 15 min i isen-salt bad.
    4. Veie og legge til 11 mg renset linker-antigen del utarbeidet fra trinn 2,3 og 13,6 mg 4-mercaptophenylacetic acid (MPAA) inn i reaksjonsrøret i isen-salt bad, rør i 5 min, og deretter justere pH-verdien til 6,8-7.0 ved romtemperatur med 6 M NaOH.
      Merk: justering av pH-verdien til nøytral er det kritiske trinnet for å initiere den ligation reaksjonen.
    5. Etter 12 h, tilsett 0,4 mL 0,1 M Tris (2-carboxyethyl) fosfin hydroklorid (TCEP) nøytral oppløsning (pH 7,0) til reaksjonssystemet og rør i 20 min for å avslutte reaksjonen.
      Merk: 0,1 M TCEP nøytral oppløsning (pH 7,0) fremstilles ved å oppløse TCEP i 6 M GnHCl i 0,2 M NaH2PO4 (pH 3,0) løsning, og ved hjelp av NaOH for å justere pH-verdien til 7,0.
    6. Sentrifuger røret ved 15 000 x g for 10 min, deretter analysere og rense det ligation produktet med HPLC med en 26 min gradient eluering (0-1 min., 5% b; 1-21 min., 45% b; 21-22 min., 85% b; 22-26 min., 85% b) med en strømningshastighet på 1 ml/min. Den forventede avkastningen for ligation reaksjonen er over 50%.
      Merk: kolonnen er i 4,6 mm ID, 250 mm lengde, fullpakket med C-18 harpiks. Mobil fase A besto av 0,1% TFA i vann, og mobil fase B besto av 100% acetonitril og 0,1% TFA.
  2. Desulfurization av bøy
    1. Løs opp bøy (3,4 mg, 0,3 mikromol) fremstilt fra trinn 3.1.6 i 50 μL av 6 M GnHCl i 0,2 M NaH2PO4 (pH 7,0) løsning.
    2. Tilsett 50 μL av 1 M TCEP, 10 μL av tBuSH og 5 μL av 0,1 M VA-044 løsning på ovennevnte blanding.
      Merk: 0,1 M VA-044 løsning er utarbeidet ved oppløsning 9,7 mg VA-044 pulver til 0,3 mL 6 M GnHCl i 0,2 M NaH2PO4 (pH 7,0) løsning. Den VA-044 løsning bør tilberedes fersk før bruk, som VA-044 er lett oksidert av eksponering for luft.
    3. Juster den endelige pH-verdien i løsningen til 6,9, og hold solutiomat 37 ° c under omrøring i ca. 5 timer.
    4. Sentrifuger røret ved 15 000 x g for 10 min og fjerne uløselig substans. Analyser og rens det ligation produktet med HPLC med en 26 min gradient eluering (0-1 min., 20% B; 1-21 min., 45% B; 21-22 min., 85% B; 22-26 min., 85% B) med en strømningshastighet på 1 mL/min. Den forventede avkastningen for desulfurization reaksjonen er ca 40%.
      Merk: kolonnen er i 4,6 mm ID, 250 mm lengde, fullpakket med C-18 harpiks. Mobil fase A besto av 0,1% TFA i vann, og mobil fase B besto av 100% acetonitril og 0,1% TFA.
  3. Fjerning av ACM å få det endelige produktet DCAF1
    1. Oppløse peptid (1,35 mg, 0,11 mikromol) fremstilt fra trinn 3.2.4 i 200 μL av 32 mM AgOAc, og deretter røre reaksjonsblandingen ved romtemperatur i 4 timer.
    2. Tilsett 3 μL av 1M Dithiotreitol (DTT) i 6 M GnHCl i 0,2 M NaH2PO4 (pH 7,0) løsning for å konvertere sølv thiolates på peptid til gratis tioler.
    3. Etter voldsomt omrøring i 1 min, sentrifuger røret ved 15 000 x g for 10 min å forkaste uløselig substans. Analyser og rens sluttproduktet med HPLC med en 26 min gradient eluering (0-1 min., 20% B; 1-21 min., 45% B; 21-22 min., 85% B; 22-26 min., 85% B) med en strømningshastighet på 1 mL/min. Den forventede avkastningen for ACM deprotection reaksjonen er ca 30%.
      Merk: kolonnen er i 4,6 mm ID, 250 mm lengde, fullpakket med C-18 harpiks. Mobil fase A besto av 0,1% TFA i vann, og mobil fase B besto av 100% acetonitril og 0,1% TFA.
    4. Etter HPLC rensing, fryse-tørke det endelige produktet over natten, og oppløse pulveret i PBS (50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8,0). Sentrifuger røret ved 15 000 x g i 10 min ved 4 ° c og kast pellet.
    5. Juster konsentrasjonen av sluttproduktet (fra trinn 3,4) og linker-antigen del (fra trinn 2.3.6) til 10 μM, registrere sirkulær dichroism (CD) Spectra fra 260 til 195 NM av disse to produktene ved hjelp av en CD spektrometer ved 25 ° c med 1 mm banelengde.
      Merk: CD Spectra brukes til å demonstrere mengden av α-spiral strukturen i sluttproduktet er like lik som i rekombinant uttrykt en.

4. deteksjon av produktene ved masse massespektrometri

  1. Skill produktet fra hver kjemisk reaksjon med en 60 min gradient eluering (0-8 min, 2% B; 8-10 min., 5% B; 10-35 min., 30% B; 35-50 min., 50% B; 50-52 min., 80% B; 52-58 min., 80% B; 58-59 min., 2% B; 59-60 min., 2% b) ved en strømningshastighet på 0,300 μL/min med en Nano-HPLC system som er direkte tilkobles med høyoppløselig masse spektrometer.
    Merk: den analytiske kolonnen er i 75-ID, 150 mm lengde, fullpakket med C-18 harpiks. Mobil fase A besto av 0,1% maursyre syre i vann, og mobil fase B besto av 100% acetonitril og 0,1% maursyre syre.
  2. Betjen masse spektrometer i full-Scan-modus og sett m/z-området på 300-2000 og oppløsning på 60 000.
  3. Åpne massen Spectra data og finne toppene av produktet i hvert trinn for å bekrefte den kjemiske reaksjonen er vellykket preformed.

5. ELISA-analysen av samspillet mellom DCAF1 og 4G2 antistoff

  1. Coat en 96-brønn mikrotiterbrønnene plate med 1 pmol anti-GST antistoff (se tabell av materialer) i 100 μL av belegg buffer/godt, forsegle platen og ruge den ved 4 ° c over natten på en shaker.
  2. Blokker hver brønn med 200 μL av 1% BSA i PBS, forsegle platen og ruge den ved romtemperatur i 1 time på en shaker.
  3. Vask hver brønn 4 ganger ved hjelp av PBS med 0,05% mellom 20.
  4. Tilsett den GST-smeltet antigen protein (0,05 pmol i 100 μL av blokkering løsning) til brønnene, forsegle platen og ruge for 2 t ved romtemperatur.
    Merk: GST-smeltet antigen protein uttrykkes i bakterier og renset ved GSH Sepharose.
  5. Gjenta trinn 5,3 for å vaske platen.
  6. Tilsett 1 pmol 4G2-antistoff eller 1 pmol 4G2-antistoff pluss de andre ligander: antigen, FC-III eller DCAF1 i serie mengder (0,1 pmol, 1 pmol, 10 pmol, 100 pmol og 1000 pmol) i 100 μL av blokkerings løsning/brønn, forsegle platen og ruge 2 t ved romtemperatur på en shaker.
  7. Gjenta trinn 5,3 for å vaske platen.
  8. Legg til anti-mus IgG, HRP-koblet antistoff (1:20000 fortynning) i 100 μL av blokkerings løsning/brønn, forsegle platen og ruge 30 min ved romtemperatur på en shaker.
  9. Vask hver brønn 6 ganger ved hjelp av PBS med 0,05% mellom 20.
  10. Bland TMB reagens A og B 1:1 i volum umiddelbart før bruk, tilsett 100 μL/brønn, og ruge deretter 30 min ved romtemperatur i mørket.
  11. Tilsett 100 μL/brønn av stopp løsning, og bruk en plate leser for å måle OD450 verdier for hver brønn innen 30 min.

6. ELISA analysen av samspillet mellom FC-III og IgG molekyl

  1. Coat en 96-brønn mikrotiterbrønnene plate med 1 pmol anti-CA-antistoff (se tabell over materialer) i 100 μL av belegg buffer/brønn, forsegle platen og ruge den ved 4 ° c over natten på en shaker.
  2. Gjenta trinn fra 5,2 til 5,3.
  3. Legg til FC-III eller FC-III-4C smeltet CA-protein (0,01, 0,05, 0,1, 0,5 og 1 pmol i 100 μL av blokkerings løsning) til brønnene, forsegle platen og ruge for 2 t ved romtemperatur.
    Merk: FC-III eller FC-III-4C smeltet CA protein er uttrykt i bakterier og renset av ni-NTA.
  4. Gjenta trinnene fra 5,7 til 5,11, og kontroller resultatene.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Flytskjemaet for syntese ruten av innfødte kjemiske ligation i denne artikkelen er vist i figur 1. Tall 2-6 viser Kromatogrammene (A) og Mass Spectra (B) av kjemiske syntetisert HYDRAZIN derivat av en FC-III peptid, rekombinant uttrykt linker og ANTIGEN del, renset produktet fra NCL reaksjon, renset produktet fra desulfurization reaksjon og renset endelige produktet DCAF1, henholdsvis. Den kromatogrammene viser renser av alle produktene er over 90%, mens massen Spectra indikere Molekylvekten av produktet etter hver reaksjon. De deconvolutional molekyl vektene er også vist i figur 3-6, som reflekterer den nøyaktige Molekylvekten til hvert produkt. Figur 7 viser PRINSIPPET om Elisa-analysen (A) og resultatene av antigen peptid, FC-III og DCAF1 konkurransedyktig hemme 4G2 antistoff binding. Både antigen peptid og DCAF1 betydelig blokk 4G2 bindende, mens FC-III peptid ikke påvirker antigen-antistoff interaksjon.

Figure 1
Figur 1. Arbeidsflyten av de innfødte kjemiske ligation metode for semi-syntese av DCAF1 molekyl.
Først, den hydrazin derivat av en FC-III peptid oppnås ved solid fase peptid syntese. Deretter SUMO tag smeltet linker og antigen del uttrykkes og renset fra bakterier, etterfulgt av SUMO tag kløft. Etter NCL reaksjon av de to fragmenter, gjennomgår produktet desulfurization og fjerne ACM grupper for å bli DCAF1 molekyl. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2. Kromatogram og masse spekteret av hydrazin derivat av en FC-III peptid.
Denne illustrasjonen viser at LC profilen til renset peptid (A) og mono-isotop peak på m/z 915,92 matchet duple ladet peptid (B). Dette tallet er endret fra referanse 10, figur 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Den kromatogram og massen spekteret av linker og antigen del.
Denne illustrasjonen viser LC-profilen til renset fragmentet (A) og den deconvolutional Molekylvekten til dette fragmentet er beregnet som 9429,0 fra masse spekteret (B). Dette tallet er endret fra referanse 10, figur S2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4. Den kromatogram og masse spekteret av Bøyning produktet av NCL reaksjon.
Denne illustrasjonen viser LC profil overvåking ligation produktet på 0 h (topp), 12 h (midten) og renset peptid (nederst) (A) og deconvolutional molekylvekt av dette produktet er beregnet som 11227,0 fra massen spekteret (B). Dette tallet er endret fra referanse 10, figur S2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5. Kromatogram og masse spekteret av produktet etter desulfurization reaksjon.
Denne illustrasjonen viser LC-profilen til renset produktet (A) og deconvolutional molekylvekt av dette produktet er beregnet som 11195,0 fra masse spekteret (B). Dette tallet er endret fra referanse 10, figur S2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6. Kromatogram, masse spekteret og CD Spectra av DCAF1 molekylet.
Denne illustrasjonen viser LC profilen til renset DCAF1 (A), deconvolutional Molekylvekten av dette molekylet beregnet som 11053,0 fra massen spekteret (B) og CD Spectra av det endelige produktet (solid linje) og linker-antigen del ( strek linje) i FCAF1. Dette tallet er endret fra referanse 10, figur 2. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7. ELISA-analysen av DCAF1 molekyl.
(A) arbeidsflyten av sandwich Elisa analysen. Første anti-GST-antistoff er belagt på en brønn plate. Da GST-smeltet antigen peptid er inkubert. Deretter tilsettes 4G2 antistoff med ulike konsentrasjoner av DCAF1, antigen eller FC-III for fargemetrisk analyse. (B) ELSIA resultatene av antigen, FC-III og DCAF1 demonstrere hemming effekter av 4G2 binding ved hjelp av ulike ligand konsentrasjoner. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen her beskriver semi-syntese og påvisning av DCAF1 ved hjelp NCL tilnærming, som er vist i figur 1. Kort, de to fragmenter av DCAF1 er kjemisk syntetisert og recombinantly uttrykt, henholdsvis; deretter full lengde DCAF1 molekylet er montert, modifisert og renset. For hydrazin avledet FC-III fragment syntese, ved hjelp av lav kapasitet 2-CL harpiks er ganske viktig, fordi høy kapasitet har en negativ effekt for hydrazin generasjon og fører til lav avkastning av produktet. Den linker og antigen del uttrykkes med SUMO tag av to grunner: først, SUMO tag kan forbedre løselighet av Fusion proteiner; for det andre er SUMO protease en konformasjon-anerkjent protease, som gjør det mulig for utgitt produkt å starte med cys rester for den videre ligation reaksjon. En av de mest kritiske trinnene i protein uttrykk og rensing er SUMO protease kløft. Konsentrasjonen av SUMO tag-smeltet protein bør justeres til riktig område. En for høy eller for lav konsentrasjon ville føre til protein aggregering eller vanskeligheter for den videre rensing etter fordøyelsen. Et annet kritisk trinn i denne protokollen er å justere pH-verdien under NCL reaksjon, som er basert på tiolderivat-Ester utveksling som skal skje i nøytral buffer. Fin kontroll av pH-verdien i reaksjons bufferen er nyttig for å øke ligation effektivitet.

Denne protokollen er egnet for syntese av andre DCAF molekyler med ulike antigen sekvenser, fordi sekvensene av ulike DCAF molekyler er ganske like og antigen del vanligvis bidrar lite til hele strukturen og natur DCAF. For eksempel brukte vi denne protokollen til å syntetisere ytterligere tre DCAF-molekyler for å målrette beslektet antistoffer. Blant dem var DCAF4 designet for å blokkere mAb35 antistoff, som kan nøytralisere acetylkolin reseptor og forårsake myasthenia gravis i en rotte modell. Vi brukte DCAF4 å redusere kliniske symptomer i rotte med mAb35-indusert myasthenia gravis, og redde acetylkolin reseptoren ved å hemme komplement komponent proteiner.

Anvendelsen av vår teknikk er begrenset av flere faktorer: for det første, avkastningen av DCAF molekyl syntetisert av dagens tilnærming er lav (vanligvis mindre enn 10%) på grunn av flere rensing trinnene; for det andre er antistoffer med conformational faktorer vanskelige å målrette mot DCAF; tredje, DCAF kan indusere ekstra immunrespons i organismer i forhold til tradisjonelle små sammensatte stoffet. Vi ser for oss at anvendelsen av denne protokollen til andre antistoff-indusert patologiske tilstander vil bidra til å syntetisere flere DCAF molekyler til målrettede eliminere skadelige antistoffer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet delvis av Tsinghua University-Gates Foundation (nr. OPP1021992), National Natural Science Foundation i Kina (nr. 21502103, 21877068 og 041301475), og National Key forskning og utvikling program of China (no. 2017YFA0505103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Chlorotrityl resin Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide GL Biochem 00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate GL Biochem 00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride J&K Scientific 503236
4G2 antibody Thermo MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid Alfa Aesar H27658
96-well microtiter plates NEST 701001
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
AgOAc Sinopharm Chemical Reagent 30164324
anti-GST antibody Abclonal AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076P2
BSA Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer Applied Photophysics Ltd
dialysis bag Sbjbio SBJ132636
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent 80047360
diethyl ether Sinopharm Chemical Reagent 10009318
DNA Gel Extraction Kit Beyotime D0056
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
GSH Sepharose GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride Sinopharm Chemical Reagent 30095516
Hydrazine hydrate Sinopharm Chemical Reagent 80070418
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent 10011018
imidazole SIGMA 12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside SIGMA 5502-5G
kanamycin Beyotime ST101
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine GL Biochem 90600
N, N-Dimethylformamide Sinopharm Chemical Reagent 8100771933
NcoI Thermo ER0571
PBS buffer Solarbio P1022
Peptide BEH C18 Column Waters 186003625
piperidine Sinopharm Chemical Reagent 80104216
Plasmid Extraction Kit Sangon Biotech B611253-0002
QIAexpress Kit QIAGEN 32149
Rapid DNA Ligation Kit Beyotime D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent 20040718
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent 10019762
Sodium nitrite Sinopharm Chemical Reagent 10020018
sodium chloride Sinopharm Chemical Reagent 10019318
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem
sterilizing pot Tomy SX-700
SUMO Protease Thermo Fisher 12588018
stop solution Biolegend 423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent Biolegend 421101
Trifluoroacetic acid SIGMA T6508
Triisopropylsilane GL Biochem 91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Aladdin T107252-5g
tryptone OXOID LP0042
Tween 20 Solarbio T8220
Ultimate 3000 HPLC Thermo
vacuum pump YUHUA SHZ-95B
XhoI Thermo IVGN0086
yeast extract OXOID LP0021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. Human Physiology (4th ed.). , Thomson Learning. (2003).
  2. Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
  3. Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
  4. Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
  5. Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
  6. Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
  7. Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
  8. Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
  9. Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
  10. Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
  11. Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
  12. Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
  13. Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
  14. Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).

Tags

Tilbaketrekking DCAF målrettet terapi antistoff Native kjemisk ligation solid fase peptid syntese protein uttrykk og rensing ELISA
Målrettet antistoff blokkering av en dual-funksjonell bøy av antigen peptid og FC-III Mimetics (DCAF)
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao,… More

Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao, X., Pan, J., Deng, H., Feng, S. Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF). J. Vis. Exp. (151), e60063, doi:10.3791/60063 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter