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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

Bloqueo de anticuerpos dirigido por un conjugado dual-funcional de péptido antigénico y méticos Fc-III (DCAF)

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60063
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 2, 2, 3, 1,2
1Key Laboratory of Structural Biology of Zhejiang Province, School of Life Sciences, Westlake University, 2Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, 3MOE Key Laboratory of Bioinformatics, Center for Synthetic and Systems Biology, School of Life Sciences, Tsinghua University
* These authors contributed equally

Summary

El desarrollo de un conjugado dual-funcional de péptido antigénico y miméticos Fc-III (DCAF) es novedoso para la eliminación de anticuerpos dañinos. Aquí, describimos un protocolo detallado para la síntesis de la molécula DCAF1, que puede bloquear selectivamente el anticuerpo 4G2 para eliminar el efecto de mejora dependiente de anticuerpos durante la infección por el virus del dengue.

Abstract

La eliminación de anticuerpos nocivos de los organismos es un enfoque valioso para la intervención de enfermedades asociadas a anticuerpos, como la fiebre hemorrágica del dengue y las enfermedades autoinmunes. Dado que miles de anticuerpos con diferentes epítopos están circulando en la sangre, no se informó ningún método universal, excepto el conjugado dual-funcional de péptido antigénico y miméticos Fc-III (DCAF), dirigidos a anticuerpos dañinos específicos. El desarrollo de moléculas DCAF hace una contribución significativa al progreso de la terapia dirigida, que se demostró para eliminar el efecto de mejora dependiente de anticuerpos (ADE) en un modelo de infección por el virus del dengue (DENV) y para aumentar la acetilcolina actividad del receptor en un modelo de miastenia grave. Aquí, describimos un protocolo para la síntesis de una molécula DCAF (DCAF1), que puede bloquear selectivamente el anticuerpo 4G2 para atenuar el efecto ADE durante la infección por el virus del dengue, e ilustrar la unión del anticuerpo DCAF1 a 4G2 mediante un ensayo ELISA. En nuestro método, DCAF1 se sintetiza por la conjugación de un derivado de la hidrazina de un péptido Fc-III y un recombinante expresado largo-hélice con secuencia antigénica a través de la ligación química nativa (NCL). Este protocolo se ha aplicado con éxito a DCAF1, así como a otras moléculas DCAF para apuntar a sus anticuerpos cognados.

Introduction

Los anticuerpos desempeñan un papel importante en la respuesta inmune humoral para la neutralización de bacterias y virus patógenos1. Sin embargo, algunos anticuerpos presentan impactos nocivos para los organismos, como los anticuerpos reactivos cruzados en el efecto ADE durante la infección por DENV y los anticuerpos sobrerreactivos en la miastenia grave, que es una enfermedad autoinmune2,3. El efecto ADE está mediado por los anticuerpos reactivos cruzados que hacen que el puente para conectar las células de presentación del receptor DENV y Fc4,5, mientras que la miastenia grave es causada por los anticuerpos excesivos que atacan los receptores de acetilcolina entre las uniones celulares en el tejido muscular6,7. Aunque se han desarrollado enfoques parcialmente eficaces para tratar estas enfermedades8,9, sin duda, la eliminación directa de estos anticuerpos nocivos haría progresos para las intervenciones.

Recientemente, las moléculas DCAF, que tienen grupos dual-funcionales, se han desarrollado para el bloqueo de anticuerposdirigidos 10. DCAF es un péptido largo que se compone de 3 partes: 1) una parte de antígeno que puede reconocer específicamente el anticuerpo cognado, 2) una etiqueta Fc-III o Fc-III-4C para unirse fuertemente a la región Fc del anticuerpo para inhibir el receptor Fc o complementar las proteínas componentes , 3) un vinculador largo-helical que conjuga estos dos grupos funcionales10. La parte del vinculador, diseñada a partir del dominio Moesin FERM, fue optimizada por el software Rosseta para asegurar que la parte del antígeno y la parte Fc-III en una molécula DCAF puedan unirse a las regiones Fab y Fc de IgG simultáneamente. Cuatro moléculas DCAF se han sintetizado para apuntar a 4 anticuerpos diferentes, entre ellos DCAF1 se utilizó para eliminar el anticuerpo 4G2, que es un anticuerpo reactivo cruzado durante la infección DENV para contribuir al efecto ADE; y DACF4 fue diseñado para el rescate de receptores de acetilcolina mediante el bloqueo de anticuerpos mab35 en miastenia grave10.

En el presente estudio, tomado DCAF1 como ejemplo, mostramos los protocolos para la síntesis de molécula DCAF y la detección de la interacción entre un DCAF y su anticuerpo cognado. El DCAF1 está semisintetizado por NCL approach11,12,13,14, que conjuga el derivado de la hidrazina de un péptido Fc-III y las partes expresadas del antígeno vinculador. El enfoque NCL tiene ventajas significativas sobre la síntesis totalmente química y la expresión totalmente recombinante para la síntesis DCAF1, porque ambos métodos conducen a un bajo rendimiento y un alto costo. El enfoque actual no sólo es la forma más rentable de obtener el DCAF de longitud completa, sino que también puede mantener la conformación de la parte del vinculador similar a su forma nativa. Dado que las diferentes moléculas dCAF tienen secuencias similares a excepción de las partes del antígeno, nuestros métodos para la síntesis dCAF1 y el ensayo de interacción entre el anticuerpo DCAF1 y 4G2 se pueden aplicar a otras moléculas DCAF a bloques dirigidos también sus anticuerpos cognados.

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Protocol

1. Síntesis química del derivado de la hidrazina de un péptido Fc-III

  1. Conversión de resina 2-Cl-(Trt)-Cl a 2-Cl-(Trt)-NHNH2 resina
    1. Pesar 625 mg de resina 2-Cl-(Trt)-Cl (0,25 mmol) en un recipiente de síntesis de péptidos de 25 ml.
    2. Añadir 5 ml de N,N-dimetilformamida (DMF) a la resina de la parte superior del recipiente, volver a colocar la tapa, agitar suavemente el recipiente durante 15 s y luego drenarlo. Repita el lavado DMF dos veces más.
    3. Añadir 5 ml de diclorometano (DCM) al recipiente, volver a colocar la tapa, agitar suavemente el recipiente durante 15 s y luego drenarlo. Repita el lavado de DCM dos veces más.
    4. Repita el paso 1.1.2 tres veces.
    5. Utilice 6 ml de DMF/DCM al 50% (vol/vol) para hinchar la resina durante 30 minutos y luego drenarla.
    6. Transfiera 6 ml 5% (vol/vol) NH2NH2 en DMF al recipiente de reacción, agite la mezcla a 120 rpm, 30 oC durante 30 minutos y, a continuación, drene la solución mediante bomba de vacío.
      NOTA: Añadir 0,3 ml de hidrazina hidrazina hidrazina a 5,7 ml de DMF para obtener 5% (vol/vol) NH2NH2. Recién preparado NH2NH2 antes de usar.
      ADVERTENCIA: El hidrazina hidrahidrato es una sustancia peligrosa y puede causar cáncer. Use un abrigo de laboratorio, guantes y una máscara. Realiza los experimentos en una campana de humos.
    7. Añadir 5 ml de DMF al recipiente, agitar suavemente durante 15 s y luego escurrirlo.
    8. Repita el paso 1.1.6 y luego lave la resina repitiendo los pasos 1.1.2-1.1.4 dos veces.
    9. Añadir 6 ml de 5% (vol/vol) MeOH/DMF al recipiente, agitar suavemente durante 10 minutos y luego escurrirlo.
      NOTA: Este paso es muy importante para garantizar que los sitios no reaccionados en la resina estén tapados.
    10. Lave bien la resina repitiendo los pasos 1.1.2-1.1.4.
    11. Añadir 5 ml de DCM a la resina, agitar suavemente durante 15 s y luego drenarla para obtener 2-Cl-(Trt)-NHNH2 resina.
      NOTA: La resina se vuelve amarilla o verde claro cuando la sustitución es exitosa.
  2. Alargamiento de péptidos
    1. Añadir 1 mmol del Fmoc-Ala-OH (934 mg) y 0,95 mmol de 1-[bis(dimethylamino)metileno]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b] hexafluorofosfato de piridinio 3-óxido (HATU) (360 mg) en un tubo de 5 ml que contiene 3 ml de DMF.
      ADVERTENCIA: La exposición a HATU puede causar una reacción alérgica. Use un abrigo de laboratorio, guantes y una máscara.
    2. Añadir 2 mmol de N,N-diisopropililamina (DIEA) (0,36 mL) a la solución disuelta y vórtice durante 0,5-1 min.
      NOTA: Paso crítico: La activación no debe tardar más de 5 minutos, ya que los aminoácidos activados isomerizan de las formas O más activas a las formas N menos activas con el tiempo.
    3. Agregue el Fmoc-Ala-OH activado al recipiente de reacción que contiene la resina 2-Cl-(Trt)-NHNH2, preparada a partir del paso 1.1. Agitar suavemente a 120 rpm, 30 oC durante 20 minutos en un agitador de temperatura constante, y luego drenar la solución mediante bomba de vacío.
    4. Añadir 5 ml de DMF para lavar la resina, agitarla suavemente durante 15 s y luego escurrirla.
    5. Añadir 1 mmol del Fmoc-Ala-OH (934 mg) y 0,95 mmol de 2-(6-cloro-1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametilaminio hexafluorofosfato (HCTU) (390 mg) en un tubo de 5 ml que contiene 3 ml de DMF.
      ADVERTENCIA: La exposición a HCTU puede causar una reacción alérgica. Use un abrigo de laboratorio, guantes y una máscara.
    6. Añadir 2 mmol de DIEA (0,36 ml) al tubo y al vórtice durante 0,5-1 min para disolverlo.
    7. Agregue el Fmoc-Ala-OH activado al recipiente de reacción. Agitar suavemente a 120 rpm, 30 oC durante 40-60 minutos en un agitador de temperatura constante, y luego drenar la solución mediante bomba de vacío.
    8. Lavar la resina repitiendo los pasos 1.1.2-1.1.4.
    9. Añadir 4 ml de piperidina (vol/vol) en DMF a la resina, agitar suavemente durante 5 minutos a temperatura ambiente y luego drenar la solución.
      ADVERTENCIA: La piridina es altamente inflamable y tóxica. Realiza los experimentos en una campana de humos.
    10. Añadir otros 4 ml de piperidina (vol/vol) en DMF a la resina, agitar suavemente durante 15 minutos a temperatura ambiente y luego drenar la solución.
    11. Siga los pasos 1.2.1-1.2.10 para acoplar y desproteger los Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-His-OH y Fmoc-Ala-OH. Repita los pasos 1.2.5-1.2.10 para acoplar y desproteger los fmoc-Trp-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gly-OH y Fmoc-Asp-OH.
    12. Repita los pasos 1.1.2-1.1.4 para lavar bien la resina.
    13. Repita el paso 1.1.3 para lavar la resina y luego secar al vacío la resina durante 5 min.
  3. Escisión del péptido crudo derivado de la hidrazina Fc-III
    1. Añadir 12 ml de cócteles de ácido trifluoroacético (TFA)/2,2o-(etilendioxi)diethanethiol (DODT)/triisopropylsilane (TIPS)/H2O (92.5/2.5/2.5/2.5) a la resina, y luego utilizar un agitador de temperatura constante para cortar el péptido de la resina a 200, 37 oC alrededor de 2 h. Filtrar la mezcla en un tubo centrífugo de 50 ml.
    2. Añadir 1 ml de cócteles en la resina para lavarla y recoger el filtrado en el tubo centrífugo de 50 ml. Repita dos veces.
    3. Concentrar la mezcla a 2 ml por un rotor vaper en una campana de humo, y luego añadir 20 ml de éter dietílico preenfriado en el tubo para precipitar péptidos crudos.
      NOTA: El éter anhidro debe ser preenfriado a 0 oC para evitar la liberación violenta de calor, lo que puede causar reacciones laterales del péptido crudo.
    4. Incubar la precipitación del péptido a -20 oC para 1-2 h.
    5. Centrifugar a 5.000 x g,4oC durante 10 min y retirar el disolvente del tubo centrífuga con cuidado.
    6. Añadir 20 ml de éter dietílico preenfriado en el tubo dos veces de acuerdo con los pasos 1.3.3-1.3.5 para lavar la precipitación. Secar al aire el producto peptídico en un reloj-vidrio durante unos 15 minutos.
  4. Purificación del derivado de la hidrazina de un péptido Fc-III
    1. Utilice el sistema de cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para purificar el péptido mediante una elución de gradiente de 30 minutos (0-1 min, 5% B; 1-20 min, 50% B; 20-25 min, 85% B; 25-30 min, 85% B) a un caudal de 1 ml/min.
      NOTA: La columna está en ID de 4,6 mm, 250 mm de longitud, embalado con resina C-18. La fase móvil A consistió en 0,1% de AFC en agua, y la fase móvil B consistió en 100% acetonitrilo y 0,1% TFA.

2. Expresión de proteínas y purificación de partes de vinculador y antígeno

  1. Construcción de plásmido
    1. Sintetizar toda la secuencia genética que puede expresar SUMO-linker-antígeno (ver Tabla de Materiales).
    2. Corte 10 ng de vector vacío PET-28a y 50 ng del fragmento sintetizado de ADN de ANtígeno SUMO-linker usando NcoI y XhoI en un baño de agua de 37 oC durante 3 h.
    3. Purificar el vector digerido de doble enzima y el fragmento de ADN por DNA Gel Extraction Kit.
    4. Añadir 5 ml de fragmento de ADN digerido, 5 l de vector digerido, 1 l de ligasa de ADN T4, 2 ml de tampón de ligasa de 10x y 7 l de ddH2O a un tubo de reacción, y luego incubarlo durante la noche a 16 oC.
    5. Mezclar 10 l del producto de ligadura del paso 2.1.4 a 100 l de células competentes (DH5) y ponerlo en un baño de hielo durante 30 minutos. Medio líquido LB (sin antibióticos) en el tubo y agítelo a 37 oC, 180 rpm durante 1 h. Recubrir las células competentes en una placa de Kanamycin LB para hacerlas distribuidas por igual, y colocar la placa en una incubadora de 37 oC durante la noche.
    6. Escoge 5 colonias individuales de la placa y cultiva las bacterias en 5 ml de medio LB en un tubo de ensayo usando una coctelera de 37oC.
    7. Extraiga los plásmidos de las bacterias cosechadas a partir del paso 2.1.6 mediante el uso del kit de extracción de plásmido.
    8. Envíe los plásmidos para la secuenciación genética y elija la colonia positiva que puede expresar la proteína de fusión SUMO-linker-antígeno. Transforme el plásmido positivo a células competentes BL21(DE3)plysS siguiendo el paso 2.1.5.
  2. Purificación de proteínas
    1. Escoja una sola colonia de transformadores del paso 2.1.7 en 5 ml de medio líquido LB que contenga kanamicina (50 g/ml). Agitar los cultivos durante la noche a 200 rpm, 37 oC.
    2. Inocular 1 L de medio LB precalentado que contiene kanamicina (50 g/ml) en un matraz con 5 ml de los cultivos nocturnos, y crecer a 37 oC con agitación vigorosa, hasta que el OD600 sea 0,6.
    3. Añadir isopropilo-D-tiogalactoside (IPTG) en el medio a la concentración final de 0,4 mM, y agitar el matraz a 200 rpm durante la noche a 20 oC.
      NOTA: La baja temperatura para la inducción de proteínas es importante para evitar la formación del cuerpo de inclusión, así que asegúrese de que la temperatura no sea superior a 22 oC.
    4. Después de cosechar las células, agregue 50 ml de tampón de lisis a los gránulos celulares para resuspender las células. Sonicar la célula se lisia dos veces durante 5 min a 200 W, ultrasonido 3 s, intervalo 3 s en hielo. Centrifugarlo a 15.000 x g durante 30 min a 4oC para recoger los supernatos.
      NOTA: El tampón de lisis se compone de 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazol. Ajuste el valor de pH a 8.0 utilizando NaOH.
    5. Añadir 2 ml de la setorasa 50% Ni-NTA, equilibrada por tampón de lisis, a los sobrenatantes despejados y mezclar suavemente agitando (200 rpm en una coctelera rotativa) a 4 oC durante 1 h.
    6. Cargue el lisado y la mezcla de Ni-NTA en una columna con la salida inferior tapada, y retire la tapa inferior y deseche el flujo de la columna.
    7. Lavar tres veces con 6 ml de tampón de lavado, y luego eluyar la proteína objetivo 3 veces con 1,5 ml de tampón de elución. Recoger el eluido en un tubo.
      NOTA: El tampón de lavado se compone de 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 30 mM imidazol. Ajuste el valor de pH a 8.0 utilizando NaOH. El búfer de elución se compone de 50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl, 250 mM imidazol. Ajuste el valor de pH a 8.0 utilizando NaOH.
    8. Poner el eluido en una bolsa de diálisis en 1 L de 50 mM PBS a 4 oC para desalar la proteína. Reemplace la nueva solución salina tamponada de fosfato (PBS) por 3 veces.
  3. Escote de la etiqueta SUMO
    1. Añadir 2 ml de proteína etiquetada Small Ubiquitin-Like Modifier (SUMO) a la concentración de 1 mg/ml, 1 mL de SUMO Protease (ver Tabla de Materiales),1 mL de 10x SUMO Protease Buffer y 6 mL de ddH2O para preparar la solución de reacción.
      NOTA: La concentración de proteína de la etiqueta SUMO es de aproximadamente 1 mg/ml. Las concentraciones excesivas después de la digestión enzimática pueden causar la coagulación de la proteína.
    2. Incubar la mezcla durante 12-16 h a 4oC.
    3. Centrifugar la mezcla a 15.000 x g durante 10 min a 4oC y desechar los agregados. Añadir 0,5 ml de la suspensión de Ni-NTA al 50%, equilibrada por 50 mM PBS, a los sobrenadores despejados de 10 ml y mezclar suavemente agitando (200 rpm en una coctelera rotativa) a 4 oC durante 60 min.
    4. Cargue el lisado y la mezcla de Ni-NTA en una columna con la salida inferior tapada. Retire la tapa inferior y luego guarde el flujo a través de un tubo centrífugo de 15 ml.
      NOTA: La proteína SUMO con etiquetas está encuadernación en la columna. La parte del antígeno del vinculador, que comienza con Cys para la reacción NCL, está en el flujo a través.
    5. Centrifugar el flujo a través de 15.000 x g durante 10 min a 4 oC y desechar los agregados. Purificar la parte del antígeno vinculador usando HPLC por una elución de gradiente de 25 min (0-1 min, 5% B; 1-3 min, 15% B; 3-20 min, 45% B; 20-21 min, 85% B; 21-25 min, 85% B) a un caudal de 1 mL/min.
      NOTA: La columna está en ID de 4,6 mm, 250 mm de longitud, embalado con resina C-18. La fase móvil A consistió en 0,1% de AFC en agua, y la fase móvil B consistió en 100% acetonitrilo y 0,1% TFA.
    6. Recoja el producto purificado del HPLC y luego seque durante la noche para obtener el producto vinculador-antígeno.

3. Montaje de DCAF1 por ligadura química nativa

  1. Conjugando el péptido Fc-III y la parte del antígeno vinculador juntos
    1. Pesar 1,8 mg (1 mol) de derivado de la hidrazina de un péptido Fc-III en un tubo EP de 2 ml y añadir 0,8 ml de 6 M de GnHCl en 0,2 M NaH2PO4 (pH 3.0) solución para disolverlo por vórtice.
      NOTA: 6 M GnHCl en 0,2 M NaH2PO4 (pH 3.0) solución se prepara ajustando el valor de pH con HCl o NaOH.
      ADVERTENCIA: NaOH y HCl son altamente corrosivos. Use un abrigo de laboratorio, guantes y una máscara.
    2. Después de centrifucar el tubo a 7.200 x g durante 1 min a temperatura ambiente, coloque el tubo en un baño de sal de hielo y utilice la agitación magnética para agitar la solución durante 15 minutos suavemente.
    3. Añadir 40 ml de 0,5 M DeNaNO2 a la solución para oxidar el grupo de hidrazina. Agitar suavemente la solución durante otros 15 minutos en el baño de sal helada.
    4. Pesar y añadir 11 mg de parte de antígeno eslabón purificado preparado a partir de los pasos 2.3 y 13,6 mg de ácido 4-mercaptofenilacético (MPAA) en el tubo de reacción en el baño de sal de hielo, remover durante 5 min, y luego ajustar el valor de pH a 6.8-7.0 a temperatura ambiente con 6 M NaOH.
      NOTA: Ajustar el valor de pH a neutro es el paso crítico para iniciar la reacción de ligadura.
    5. Después de 12 h, añadir 0,4 ml de 0,1 M tris(2-carboxiletil)solución neutra de clorhidrato de fosfina (TCEP) (pH 7.0) al sistema de reacción y agitar durante 20 minutos para terminar la reacción.
      NOTA: La solución neutra TCEP de 0,1 M (pH 7.0) se prepara disolviendo TCEP en 6 M GnHCl en una solución de 0,2 M NaH2PO4 (pH 3.0) y utilizando NaOH para ajustar el valor de pH a 7,0.
    6. Centrifugar el tubo a 15.000 x g durante 10 min, luego analizar y purificar el producto de ligadura con HPLC por una elución de gradiente de 26 min (0-1 min, 5% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) a un caudal de 1 ml/min. El rendimiento esperado para la reacción de ligadura es superior al 50%.
      NOTA: La columna está en ID de 4,6 mm, 250 mm de longitud, embalado con resina C-18. La fase móvil A consistió en 0,1% de AFC en agua, y la fase móvil B consistió en 100% acetonitrilo y 0,1% TFA.
  2. Desulfuración del conjugado
    1. Disolver el conjugado (3,4 mg, 0,3 mmol) preparado a partir del paso 3.1.6 en 50 ml de 6 M GnHCl en 0,2 M NaH2PO4 (pH 7.0) solución.
    2. Añadir 50 ml de 1 M de TCEP, 10 ml de tBuSH y 5 ml de solución VA-044 de 0,1 M a la mezcla anterior.
      NOTA: 0,1 M VA-044 solución se prepara mediante la disolución de 9,7 mg de VA-044 polvo en 0,3 ml de 6 M GnHCl en 0,2 M NaH2PO4 (pH 7.0) solución. La solución VA-044 debe prepararse recién antes de su uso, ya que el VA-044 se oxida fácilmente por la exposición al aire.
    3. Ajustar el pH final de la solución a 6,9 y mantener el solutiomat 37 oC con agitación durante aproximadamente 5 h.
    4. Centrifugar el tubo a 15.000 x g durante 10 min y retirar la sustancia insoluble. Analizar y purificar el producto de ligadura con HPLC por una elución de gradiente de 26 min (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) a un caudal de 1 ml/min. El rendimiento esperado para la reacción de desulfuración es de alrededor del 40%.
      NOTA: La columna está en ID de 4,6 mm, 250 mm de longitud, embalado con resina C-18. La fase móvil A consistió en 0,1% de AFC en agua, y la fase móvil B consistió en 100% acetonitrilo y 0,1% TFA.
  3. Eliminación de Acm para obtener el producto final DCAF1
    1. Disolver el péptido (1,35 mg, 0,11 omol) preparado a partir del paso 3.2.4 en 200 éL de 32 mM agOAc, y luego agitar la mezcla de reacción a temperatura ambiente durante 4 h.
    2. Añadir 3 l de ditiothreitol de 1M (TDT) en 6 M GnHCl en 0,2 M NaH2PO4 (pH 7.0) solución para convertir los tiolatos de plata en péptido en tioles libres.
    3. Después de agitar violentamente durante 1 min, centrifugar el tubo a 15.000 x g durante 10 minutos para desechar la sustancia insoluble. Analizar y purificar el producto final con HPLC por una elución de gradiente de 26 min (0-1 min, 20% B; 1-21 min, 45% B; 21-22 min, 85% B; 22-26 min, 85% B) a un caudal de 1 ml/min. El rendimiento esperado para la reacción de desprotección de Acm es de aproximadamente 30%.
      NOTA: La columna está en ID de 4,6 mm, 250 mm de longitud, embalado con resina C-18. La fase móvil A consistió en 0,1% de AFC en agua, y la fase móvil B consistió en 100% acetonitrilo y 0,1% TFA.
    4. Después de la purificación de HPLC, liofilínelo durante la noche y disuelva el polvo en PBS (50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8.0). Centrifugar el tubo a 15.000 x g durante 10 min a 4 oC y desechar el pellet.
    5. Ajustar las concentraciones del producto final (del paso 3.4) y de la parte del antígeno del vinculador (del paso 2.3.6) a 10 oM, registrar los espectros del dicroísmo circular (CD) de 260 a 195 nm de estos dos productos utilizando un espectrómetro de CD a 25 oC con 1 mm de longitud de trayecto.
      NOTA: Los espectros de CD se utilizan para demostrar que la cantidad de estructura helicoidal en el producto final es tan similar a la del recombinante expresado.

4. Detección de los productos por espectrometría de masas

  1. Separe el producto de cada reacción química por una elución de gradiente de 60 minutos (0-8 min, 2% B; 8-10 min, 5% B; 10-35 min, 30% B; 35-50 min, 50% B; 50-52 min, 80% B; 52-58 min, 80% B; 58-59 min, 2% B; 59-60 min, 2% B) a un caudal de 0.300 l/min con un caudal de 0.300 l/min con un caudal de 0.300 l/min con un caudal de 0.300 l/min con un caudal de 0.300 l/min con un caudal de 0.300 l/min con un caudal de 0.300 l/min con un caudal de 0.300 l/min con un caudal de 0.300 l/min con un caudal de 0.300 l/min con un caudal de 0.300 l/min con un caudal de 0.300 l/min con un caudal de 0.300 l/min con un caudal de 0.300 l/min con un caudal de 0.300 l/min con un caudal de 0.300 l/min con un caudal de 0.300 l/min con un caudal de 0.300 l/min con un sistema nano-HPLC que se interconecta directamente con el espectrómetro de masas de alta resolución.
    NOTA: La columna analítica está en ID de 75 mm, 150 mm de longitud, embalado con resina C-18. La fase móvil A consistía en 0,1% de ácido fórmico en agua, y la fase móvil B consistía en 100% acetonitrilo y 0,1% ácido fórmico.
  2. Opera el espectrómetro de masas en el modo de exploración completa y establece el rango m/z en 300-2.000 y la resolución en 60.000.
  3. Abra los datos de espectros de masa y encuentre los picos del producto en cada paso para confirmar que la reacción química está preformada con éxito.

5. Ensayo ELISA de la interacción entre el anticuerpo DCAF1 y 4G2

  1. Recubrir una placa microtíter de 96 pocillos con 1 anticuerpo anti-GST pmol (ver Tabla de Materiales)en 100 l de tampón/pozo de recubrimiento, sellar la placa e incubarla a 4oC durante la noche en una coctelera.
  2. Bloquee cada pozo con 200 ol de 1% de BSA en PBS, selle la placa e incubarla a temperatura ambiente durante 1 h en una coctelera.
  3. Lave cada pocá 4 veces usando PBS con 0.05% Tween 20.
  4. Añadir la proteína antígeno fusionada con GST (0,05 pmol en 100 ml de solución de bloqueo) a los pozos, sellar la placa e incubar durante 2 horas a temperatura ambiente.
    NOTA: La proteína de antígeno fusionada con GST se expresa en bacterias y se purifica con GSH Sepharose.
  5. Repita el paso 5.3 para lavar el plato.
  6. Añadir 1 pmol 4G2 anticuerpo o 1 pmol 4G2 anticuerpo más los otros ligandos: antígeno, Fc-III o DCAF1 en cantidades de serie (0,1 pmol, 1 pmol, 10 pmol, 100 pmol y 1000 pmol) en 100 l de solución de bloqueo / pozo, sellar la placa e incubar 2 horas a temperatura ambiente en un agitador.
  7. Repita el paso 5.3 para lavar el plato.
  8. Añadir IgG antiratón, Anticuerpo vinculado a HRP (1:20,000 dilución) en 100 l de solución de bloqueo / pozo, sellar la placa e incubar 30 minutos a temperatura ambiente en una coctelera.
  9. Lave cada pocá 6 veces usando PBS con 0.05% Tween 20.
  10. Mezclar el reactivo TMB A y B 1:1 en volumen inmediatamente antes de usar, añadir 100 l /bien, y luego incubar 30 minutos a temperatura ambiente en la oscuridad.
  11. Agregue 100 l/pozo de solución de parada y utilice un lector de placas para medir los valores de OD450 para cada pozo en un plazo de 30 minutos.

6. Ensayo ELISA de la interacción entre la molécula Fc-III e IgG

  1. Recubrir una placa microtíter de 96 pocillos con 1 anticuerpo anti-CA pmol (ver Tabla de Materiales)en 100 ml de tampón/pozo de recubrimiento, sellar la placa e incubarla a 4oC durante la noche en una coctelera.
  2. Repita los pasos de 5.2 a 5.3.
  3. Añadir la proteína CA fusionada Fc-III o Fc-III-4C (0.01, 0.05, 0.1, 0.5 y 1 pmol en 100 sal de solución de bloqueo) a los pozos, sellar la placa e incubar durante 2 horas a temperatura ambiente.
    NOTA: La proteína CA fusionada Fc-III o Fc-III-4C se expresa en bacterias y es purificada por Ni-NTA.
  4. Repita los pasos de 5.7 a 5.11 y compruebe los resultados.

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Representative Results

El diagrama de flujo para la ruta de síntesis por ligadura química nativa en este artículo se muestra en la Figura 1. Las figuras 2-6 muestran los cromatogramas (A) y los espectros de masa(B) de derivados químicos de hidrazina sintetizados de un péptido Fc-III, el vinculador y la parte de antígeno expresados recombinantes, el producto purificado de la reacción NCL, el producto de la reacción de desulfuración y el producto final purificado DCAF1, respectivamente. Los cromatogramas muestran que los purificadores de todos los productos son superiores al 90%, mientras que los espectros de masa indican el peso molecular del producto después de cada reacción. Los pesos moleculares deconvolucionales también se muestran en las Figuras 3-6,que reflejan el peso molecular preciso de cada producto. La Figura 7 muestra el principio del ensayo ELISA (A) y los resultados del péptido antígeno, Fc-III y DCAF1 inhibiendo competitivamente la unión a anticuerpos 4G2. Tanto el péptido de antígeno como el DCAF1 bloquean significativamente la unión 4G2, mientras que el péptido Fc-III no afecta a la interacción antígeno-anticuerpo.

Figure 1
Figura 1. El flujo de trabajo del método de ligadura química nativa para la semisíntesis de la molécula DCAF1.
En primer lugar, el derivado de la hidrazina de un péptido Fc-III se obtiene mediante la síntesis de péptidos de fase sólida. A continuación, la etiqueta SUMO fusionado vinculador y la parte de antígeno se expresa y purifica a partir de bacterias, seguido de la escisión de la etiqueta SUMO. Después de la reacción NCL de los dos fragmentos, el producto se somete a desulfuración y elimina los grupos acm para convertirse en molécula DCAF1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2. El cromatograma y el espectro de masas del derivado de la hidrazina de un péptido Fc-III.
Esta figura muestra que el perfil LC del péptido purificado (A) y el pico mono-isótopo en m/z 915.92 coincidieron con el péptido cargado de dupla (B). Esta figura se ha modificado de la referencia 10, Figura 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. El cromatograma y el espectro de masas de la parte del vinculador y del antígeno.
Esta figura muestra el perfil LC del fragmento purificado (A) y el peso molecular desconvolución de este fragmento se calcula como 9429.0 del espectro de masas (B). Esta figura se ha modificado de la referencia 10, Figura S2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4. El cromatograma y el espectro de masas del producto de conjugación por reacción NCL.
Esta figura muestra el perfil LC que monitorea el producto de ligadura a 0 h (arriba), 12 h (medio) y el péptido purificado (abajo) (A) y el peso molecular desconvolución de este producto se calcula como 11227.0 del espectro de masas (B). Esta figura se ha modificado de la referencia 10, Figura S2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5. El cromatograma y el espectro de masadel producto después de la reacción de desulfuración.
Esta figura muestra el perfil LC del producto purificado (A) y el peso molecular desconvolución de este producto se calcula como 11195.0 del espectro de masas (B). Esta figura se ha modificado de la referencia 10, Figura S2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6. El cromatograma, el espectro de masas y los espectros de CD de la molécula DCAF1.
Esta figura muestra el perfil LC del DCAF1 purificado (A), el peso molecular deconvolución de esta molécula calculado como 11053.0 del espectro de masa (B) y los espectros de CD del producto final (línea sólida) y la parte del vinculador-antígeno ( línea de guión) en FCAF1. Esta figura se ha modificado de la referencia 10, Figura 2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7. Ensayo ELISA de la molécula DCAF1.
(A) El flujo de trabajo del ensayo ELISA sándwich. El primer anticuerpo anti-GST está recubierto en una placa de pozo. Luego se incuba el péptido de antígeno fusionado con GST. A continuación, se añade un anticuerpo 4G2 con diferentes concentraciones de DCAF1, antígeno o Fc-III para el análisis colorimétrico. (B) Los resultados ELSIA del antígeno, Fc-III y DCAF1 demuestran los efectos de inhibición de la unión 4G2 utilizando diferentes concentraciones de ligando. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

El protocolo aquí describe la semisíntesis y la detección de DCAF1 mediante el enfoque NCL, que se muestra en la Figura 1. En resumen, los dos fragmentos de DCAF1 son sintetizados químicamente y expresados de forma recombinante, respectivamente; entonces, la molécula DCAF1 de longitud completa se ensambla, modifica y purifica. Para la síntesis de fragmentos de Fc-III derivada de la hidrazina, el uso de resina de baja capacidad 2-Cl es bastante importante, porque la alta capacidad tiene un efecto negativo para la generación de hidrazina y conduce a un bajo rendimiento del producto. El vinculador y la parte del antígeno se expresan con la etiqueta SUMO por dos razones: primero, la etiqueta SUMO puede mejorar la solubilidad de las proteínas de fusión; en segundo lugar, la proteasa SUMO es una proteasa reconocida por la conformación, que permite que el producto liberado comience con el residuo de Cys para la reacción de ligadura adicional. Uno de los pasos más críticos en la expresión y purificación de proteínas es el escote de proteasa SUMO. La concentración de proteína fusionada con etiqueta SUMO debe ajustarse al rango adecuado. Una concentración demasiado alta o demasiado baja conduciría a la agregación de proteínas o dificultad para la purificación posterior después de la digestión. Otro paso crítico de este protocolo es ajustar el valor de pH durante la reacción NCL, que se basa en el intercambio de tiolés éster que debe ocurrir en el búfer neutro. El control preciso del valor de pH en el búfer de reacción es útil para mejorar la eficiencia de la ligadura.

Este protocolo es adecuado para la síntesis de otras moléculas DCAF con diferentes secuencias de antígenos, ya que las secuencias de diferentes moléculas DCAF son bastante similares y la parte del antígeno generalmente contribuye poco a toda la estructura y naturaleza del DCAF. Por ejemplo, utilizamos este protocolo para sintetizar otras tres moléculas DCAF para apuntar a sus anticuerpos cognados. Entre ellos, DCAF4 fue diseñado para bloquear el anticuerpo mAb35, que puede neutralizar el receptor de acetilcolina y causar miastenia grave en un modelo de rata. Utilizamos DCAF4 para reducir los síntomas clínicos en rata con miastenia graveinducida por mAb35, y rescatar el receptor de acetilcolina mediante la inhibición de las proteínas componentes de complemento.

La aplicación de nuestra técnica está limitada por varios factores: primero, el rendimiento de la molécula DCAF sintetizada por el enfoque actual es bajo (generalmente menos del 10%) debido a los múltiples pasos de purificación; en segundo lugar, los anticuerpos con determinantes conformacionales son difíciles de atacar por el DCAF; en tercer lugar, el DCAF puede inducir una respuesta inmune adicional en los organismos en comparación con los fármacos compuestos pequeños tradicionales. Prevemos que la aplicación de este protocolo a otras condiciones patológicas inducidas por anticuerpos ayudará a sintetizar más moléculas DCAF para eliminar anticuerpos dañinos.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado en parte por la Fundación Tsinghua University-Gates (no. OPP1021992), la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (n. 21502103, 21877068 y 041301475), y el Programa Nacional de Investigación y Desarrollo Clave de China (n. 2017YFA0505103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Chlorotrityl resin Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide GL Biochem 00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate GL Biochem 00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride J&K Scientific 503236
4G2 antibody Thermo MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid Alfa Aesar H27658
96-well microtiter plates NEST 701001
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
AgOAc Sinopharm Chemical Reagent 30164324
anti-GST antibody Abclonal AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076P2
BSA Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer Applied Photophysics Ltd
dialysis bag Sbjbio SBJ132636
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent 80047360
diethyl ether Sinopharm Chemical Reagent 10009318
DNA Gel Extraction Kit Beyotime D0056
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
GSH Sepharose GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride Sinopharm Chemical Reagent 30095516
Hydrazine hydrate Sinopharm Chemical Reagent 80070418
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent 10011018
imidazole SIGMA 12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside SIGMA 5502-5G
kanamycin Beyotime ST101
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine GL Biochem 90600
N, N-Dimethylformamide Sinopharm Chemical Reagent 8100771933
NcoI Thermo ER0571
PBS buffer Solarbio P1022
Peptide BEH C18 Column Waters 186003625
piperidine Sinopharm Chemical Reagent 80104216
Plasmid Extraction Kit Sangon Biotech B611253-0002
QIAexpress Kit QIAGEN 32149
Rapid DNA Ligation Kit Beyotime D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent 20040718
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent 10019762
Sodium nitrite Sinopharm Chemical Reagent 10020018
sodium chloride Sinopharm Chemical Reagent 10019318
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem
sterilizing pot Tomy SX-700
SUMO Protease Thermo Fisher 12588018
stop solution Biolegend 423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent Biolegend 421101
Trifluoroacetic acid SIGMA T6508
Triisopropylsilane GL Biochem 91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Aladdin T107252-5g
tryptone OXOID LP0042
Tween 20 Solarbio T8220
Ultimate 3000 HPLC Thermo
vacuum pump YUHUA SHZ-95B
XhoI Thermo IVGN0086
yeast extract OXOID LP0021

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References

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Retracción Número 151 DCAF terapia dirigida anticuerpos ligadura química nativa síntesis de péptidos de fase sólida expresión y purificación de proteínas ELISA
Bloqueo de anticuerpos dirigido por un conjugado dual-funcional de péptido antigénico y méticos Fc-III (DCAF)
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Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao,… More

Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao, X., Pan, J., Deng, H., Feng, S. Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF). J. Vis. Exp. (151), e60063, doi:10.3791/60063 (2019).

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