Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Antijenik Peptid ve Fc-III Mimetics (DCAF) Çift Fonksiyonlu Konjuge tarafından Hedefli Antikor Engelleme

Published: September 17, 2019 doi: 10.3791/60063
Automatic Translation
*1,2, *3, 2, 2, 2, 3, 1,2
1Key Laboratory of Structural Biology of Zhejiang Province, School of Life Sciences, Westlake University, 2Mass Spectrometry Core Facility, School of Life Sciences, Westlake University, 3MOE Key Laboratory of Bioinformatics, Center for Synthetic and Systems Biology, School of Life Sciences, Tsinghua University
* These authors contributed equally

Summary

Antijenik peptid ve Fc-III mimetik (DCAF) çift fonksiyonlu bir konjuge gelişimi zararlı antikorların ortadan kaldırılması için yeni bir yeniliktir. Burada, Dang virüsü enfeksiyonu sırasında antikorbağımlı geliştirme etkisini ortadan kaldırmak için seçici olarak 4G2 antikor engelleyebilir DCAF1 molekülünün sentezi için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Abstract

Zararlı antikorların organizmalardan uzaklaşması, Dang hemorajik ateş ve otoimmün hastalıklar gibi antikorilişkili hastalıkların müdahalesi için değerli bir yaklaşımdır. Farklı epitopslara sahip binlerce antikor kanda dolaştığından, antijenik peptid ve Fc-III mimetik (DCAF) çift fonksiyonlu konjuge dışında evrensel bir yöntemin spesifik zararlı antikorları hedef ettiği bildirilmiştir. DCAF moleküllerinin gelişimi, dang virüsü (DENV) enfeksiyon modelinde antikor bağımlı geliştirme (ADE) etkisini ortadan kaldırmak ve asetilkolinartırmak için gösterilmiştir hedefli tedavi, ilerlemesine önemli katkı yapar bir miyastenia gravis modelinde reseptör aktivitesi. Burada, Dang virüs enfeksiyonu sırasında ADE etkisini zayıflatmak için 4G2 antikorunu seçici olarak bloke eden ve DCAF1 ile 4G2 antikorunun ELISA testi ile bağlanmasını gösteren bir DCAF molekülünün (DCAF1) sentezine yönelik bir protokolü tanımlıyoruz. Yöntemimizde DCAF1, fc-III peptidin hidrat türevinin konjugasyonu ve doğal kimyasal ligasyon (NCL) yoluyla antijenik diziliuzun uzun α-sarlis ifade edilmesi yle sentezlenir. Bu protokol, cognate antikorlarını hedeflemek için DCAF1'e ve diğer DCAF moleküllerine başarıyla uygulanmıştır.

Introduction

Antikorlar patojenik bakteri ve virüslerin nötralizasyonu için humoral immün yanıt önemli rol oynamaktadır1. Ancak, bazı antikorlar organizmalar için zararlı etkiler sergiler, DENV enfeksiyonu sırasında ADE etkisi çapraz reaktif antikorlar ve miyasteni ait gravis aşırı reaktif antikorlar gibi, hangi bir otoimmünhastalıklar2,3. ADE etkisi DENV ve Fc reseptör sunan hücreleri bağlamak için köprü yapmak çapraz reaktif antikorlar aracılık edilir4,5, miyasteni gravis asetilkolin reseptörlerine saldıran aşırı antikorlar neden olurken kas dokusunda hücre-hücre kavşakları arasında6,7. Bu hastalıkların tedavisinde kısmen etkili yaklaşımlar geliştirilmiş olmasına rağmen8,9, şüphesiz bu zararlı antikorların doğrudan ortadan kaldırılması müdahaleler için ilerleme olacaktır.

Son zamanlarda, çift fonksiyonlu gruplara sahip DCAF molekülleri, hedefli antikor blokaj ı için geliştirilmiştir10. DCAF 3 bölümden oluşan uzun bir peptittir: 1) spesifik bir antijen parçası cognate antikor tanıyabilir, 2) fc-III veya Fc-III-4C etiketi güçlü antikor Fc bölgesine bağlı ya Fc reseptör veya kompleman bileşen proteinleri inhibe etmek için , 3) bu iki fonksiyonel grup10conjugates uzun bir α-sarmal bağlayıcı . Moesin FERM etki alanından tasarlanan bağlantı parçası, Bir DCAF molekülündeki antijen ve Fc-III kısmının aynı anda IgG'nin Fab ve Fc bölgelerine bağlanabilmesini sağlamak için Rosseta yazılımı tarafından optimize edildi. Dört DCAF molekülleri hedef 4 farklı antikorlar için sentezlenmiş, aralarında DCAF1 4G2 antikor ortadan kaldırmak için kullanılmıştır, Hangi DENV enfeksiyonu sırasında çapraz reaktif antikor ADE etkisine katkıda bulunmak için; ve DACF4 miyasteni ait gravis10mab35 antikor engelleyerek asetilkolin reseptörlerinin kurtarılması için tasarlanmıştır.

Örnek olarak DCAF1'i örnek alan bu çalışmada, DCAF molekülünün sentezi ve DCAF ve bilişli antikor arasındaki etkileşimin saptanması için protokolleri gösterdik. DCAF1 ncl yaklaşım11,12,13,14, bir Fc-III peptid hidrat türevi ve ifade bağlayıcı-antijen parçaları birlikte conjugates tarafından yarı sentezlenir. Her iki yöntem de düşük verim ve yüksek maliyetyol çünkü NCL yaklaşımı, tam kimyasal sentezve DCAF1 sentezi için tam rekombinant ifade üzerinde önemli avantajlara sahiptir. Mevcut yaklaşım sadece tam uzunlukta DCAF almak için en uygun maliyetli bir yoldur, ama aynı zamanda yerel formu olarak benzer bağlayıcı parçasının konformasyon koruyabilirsiniz. Farklı DCAF molekülleri antijen parçaları dışında benzer dizilere sahip olduğundan, DCAF1 sentezi ve DCAF1 ve 4G2 antikorları arasındaki etkileşim telimizden dolayı yöntemlerimiz diğer DCAF moleküllerine uygulanabilir ve bu moleküllerin biliş antikorlarını bloke etmek hedeflenebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Fc-III peptidin hidrazin türevinin kimyasal sentezi

  1. 2-Cl-(Trt)-Cl rezorinin 2-Cl-(Trt)-NHNH2 rezorne ye dönüştürülmesi
    1. 25 mL'lik peptid sentez damarına 625 mg 2-Cl-(Trt)-Cl reçine (0.25 mmol) ağırlığındadır.
    2. Geminin üst kısmından reçine 5 mL N,N-dimethylformamide (DMF) ekleyin, kapağı geri koyun, yavaşça 15 s için damar ıslayın ve sonra drenaj. DMF yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
    3. Damara 5 mL diklorometan (DCM) ekleyin, kapağı geri koyun, kabı hafifçe 15 s'lik sallayın ve sonra boşaltın. DCM yıkamayı iki kez daha tekrarlayın.
    4. Adımı 1.1.2'yi üç kez tekrarlayın.
    5. Rekarini 30 dakika boyunca şiştirmek için %50 (vol/vol) DMF/DCM'nin 6 mL'sini kullanın ve sonra boşaltın.
    6. DMF'de 6 mL %5 (vol/vol) NH2NH2'yi reaksiyon kabına aktarın, karışımı 120 rpm'de sallayın, 30 dakika 30 dakika boyunca 30 °C'de sallayın ve vakum pompası ile çözeltiyi boşaltın.
      NOT: %5 (vol/vol) NH2NH2almak için 5,7 mL DMF'ye 0,3 mL hidrat ekleyin. Kullanmadan önce NH2NH2'yi taze olarak hazırlayın.
      DİkKAT: Hidrazin hidrat tehlikeli bir maddedir ve kansere neden olabilir. Laboratuvar önlüğü, eldiven ve maske giy. Deneyleri duman kaputunda gerçekleştirin.
    7. Damara 5 mL DMF ekleyin, 15 s boyunca hafifçe sallayın ve sonra boşaltın.
    8. 1.1.6 adımını tekrarlayın ve 1.1.2-1.1.4 adımlarını iki kez tekrarlayarak rezorini yıkayın.
    9. Damara %5 (vol/vol) MeOH/DMF 6 mL ekleyin, 10 dakika hafifçe sallayın ve süzün.
      NOT: Bu adım, rezorin üzerindeki tepkisiz sitelerin kapatılmış olduğundan emin olmak için çok önemlidir.
    10. 1.1.2-1.1.4 adımlarını tekrarlayarak reçiyiyi iyice yıkayın.
    11. Resenin için 5 mL DCM ekleyin, 15 s boyunca hafifçe sallayın ve 2-Cl-(Trt)-NHNH2 resin elde etmek için süzün.
      NOT: Reçin, ikame başarılı olduğunda sarı veya açık yeşil olur.
  2. Peptit uzaması
    1. 1 mmol Fmoc-Ala-OH (934 mg) ve 0.95 mmol 1-[bis(dimethylamino)metilen]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b] piridinium heksaflorofoffat 3-oksit (HATU) (360 mg) içeren 5 mL'lik bir tüpe DFF 3 mL içeren 5 mL'lik bir tüp ekleyin.
      DİkKAT: HATU'ya maruz kalmak alerjik reaksiyona neden olabilir. Laboratuvar önlüğü, eldiven ve maske giy.
    2. Çözünmüş çözeltiye 2 mmol N,N-diisopropiletilemin (DIEA) (0.36 mL) ekleyin ve 0.5-1 dk.
      NOT: Kritik Adım: Aktivasyon en fazla 5 dakika sürmelidir, aktivasyon amino asitler zaman içinde daha aktif O-formları için daha aktif O-formları isomerize olarak.
    3. Adım 1.1'den hazırlanan 2-Cl-(Trt)-NHNH2 reçinesini içeren reaksiyon kabına aktif Fmoc-Ala-OH'u ekleyin. 120 rpm'de, 30 °C'de 20 dk sabit sıcaklıkta çalkalayıcıda hafifçe sallayın ve vakum pompası ile çözeltiyi boşaltın.
    4. Reçiyiyi yıkamak için 5 mL DMF ekleyin, 15 s boyunca hafifçe sallayın ve sonra süzün.
    5. 1 mmol Fmoc-Ala-OH (934 mg) ve 0.95 mmol 2-(6-kloro-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3-tetrametrileminim hekzaflorofoffosfat (HCTU) (390 mg) 3 mL dmL içeren 5 mL tüp içine ekleyin.
      DİkKAT: HCTU'ya maruz kalmak alerjik reaksiyona neden olabilir. Laboratuvar önlüğü, eldiven ve maske giy.
    6. Tüpün ve girdabın ait 2 mmol (0,36 mL) ilave edin ve çözülmesi için 0,5-1 dakika.
    7. Reaksiyon kabına aktif Olan Fmoc-Ala-OH'u ekleyin. 120 rpm' de, 30 °C' de 40-60 dk sabit sıcaklıkta çalkalayıcıda hafifçe sallayın ve vakum pompası ile çözeltiyi boşaltın.
    8. 1.1.2-1.1.4 adımlarını tekrarlayarak reçiyiyi yıkayın.
    9. Rezorin dmf% 20 (vol / vol) pipeiddine 4 mL ekleyin, yavaşça oda sıcaklığında 5 dakika sallayın ve sonra çözelti drenaj.
      DİkKAT: Piridin son derece yanıcı ve zehirlidir. Deneyleri duman kaputunda gerçekleştirin.
    10. Resenin dmf başka bir 4 mL (vol / vol) pipeiddine ekleyin, yavaşça oda sıcaklığında 15 dakika sallayın ve sonra çözelti drenaj.
    11. 1.2.1-1.2.10 adımlarını takip edin ve Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr-OH, Fmoc-Cys-OH, Fmoc-His-OH ve Fmoc-Ala-OH'u koruyun. 1.2.5-1.2.10 adımlarını çift ve fmoc-Trp-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Glu-OH, Fmoc-Gly-OH ve Fmoc-Asp-OH'u korumak için tekrarlayın.
    12. Rezorsu iyice yıkamak için 1.1.2-1.1.4 adımlarını tekrarlayın.
    13. Reçiyiyi yıkamak için 1.1.3 adımını tekrarlayın ve reçine 5 dk vakumla kurutun.
  3. Hydrazine türetilmiş Fc-III ham peptid dekolte
    1. 12 mL kokteyl trifloroasetik asit (TFA)/2,2′-(etilenedioksi)diethanethiol (DODT)/triisopropilsilane (TIPS)/H2O (92.5/2.5/2.5/2.5) reçine ye ekleyin ve sonra reçine den cleave için sabit sıcaklık shaker kullanın 20r, 20 r0 rpm 37 °C yaklaşık 2 saat. Karışımı 50 mL'lik bir santrifüj tüpüne süzün.
    2. Yıkamak için reçine içine kokteyller 1 mL ekleyin ve 50 mL santrifüj tüp içine filtrasyon toplamak. İki kez tekrarlayın.
    3. Karışımı bir duman kaputuna bir vaper rotor la 2 mL'ye konsantre edin ve ham peptidleri çökeltmek için tüpün içine 20 mL önceden soğutulmuş metil eter ekleyin.
      NOT: Susuz eter, ham peptidin yan reaksiyonlarına neden olabilecek şiddetli ısı salınımını önlemek için 0 °C'ye kadar önceden soğutulmalıdır.
    4. Peptit çökeltisi -20 °C'de 1-2 saat kuluçkaya yatırın.
    5. 10 dk için 5.000 x g, 4 °C'de santrifüj edin ve çözücüyü santrifüj tüpünden dikkatlice çıkarın.
    6. Çökeltiyi yıkamak için 1.3.3-1.3.5 basamaklarına göre tüpe 20 mL önceden soğutulmuş dietil eter ekleyin. Peptit ürünü bir saat bardağında yaklaşık 15 dakika kurutun. Daha fazla analiz için kurutulmuş ham peptidleri 4 °C'de saklayın.
  4. Fc-III peptidin hidrazin türevinin saflaştırılması
    1. Peptidin 30 dk degrade elüsyonu (0-1 dk, %5 B; 1-20 dk, %50 B; 20-25 dk, %85 B; 25-30 dk, %85 B) ile 1 mL/dk akış hızıyla arındırmak için yüksek performanslı sıvı kromatografi (HPLC) sistemini kullanın.
      NOT: Kolon 4,6 mm kimlik, 250 mm uzunluğunda, C-18 reçine ile paketlenmiştir. Mobil faz A suda %0.1 TFA, gezici faz B %100 asetonitril ve %0.1 TFA'dan oluşuyordu.

2. Bağlayıcı ve antijen parçaların protein ekspresyonu ve saflaştırılması

  1. Plazmid yapımı
    1. SUMO-linker-antijeni ifade edebilen tüm gen dizisini sentezle (bkz. Malzeme Tablosu).
    2. 3 7 °C'lik su banyosunda NcoI ve XhoI kullanarak 10 ng PET-28a boş vektörve sentezlenen SUMO-linker-antijen DNA parçasının 50 ng'sini 3 saat boyunca kesin.
    3. Çift enzimli sindirilmiş vektör ü ve DNA parçasını DNA Jel Ibçekimi Kiti ile arındırın.
    4. 5 μL DNA sindirilmiş DNA parçası, 5 μL sindirilmiş vektör, 1 μL T4 DNA ligaz, 2 μL 10x ligaz tampon ve 7 μL ddH2O bir reaksiyon tüpü ne zaman bir gecede kuluçkaya yatırın.
    5. Ligasyon ürününün 10 μL'sini 2,1,4'ten 100°L'lik yeterli hücreye (DH5α) karıştırın ve 30 dakika boyunca bir buz banyosuna koyun. LB sıvı orta (antibiyotik olmadan) tüp ve 37 °C, 1 80 rpm 1 h. Coat yetkili hücreleri bir Kanamycin LB plaka üzerine eşit dağıtılmış yapmak için yetkili hücreleri sallamak ve bir gecede 37 °C kuluçka içine plaka koymak.
    6. 37 °C'lik bir çalkalayıcı kullanarak bir test tüpünde 5 mL LB orta daki bakterileri plakadan 5 tek kolon seçin ve kültüredin.
    7. Plazmid Ekstraksiyon Kiti kullanarak adım 2.1.6 hasat bakterilerden plazmidler ayıklayın.
    8. Gen dizilimi için plazmidleri gönderin ve SUMO-linker-antijen füzyon proteinini ifade edebilen pozitif koloniyi seçin. Pozitif plazmidi BL21(DE3)plysS yetkili hücrelerine 2.1.5 adımını takiben dönüştürün.
  2. Protein arınması
    1. Kanamisin (50 μg/mL) içeren LB sıvı ortamın 2,1,7'den 5 mL'ye kadar tek bir transformant kolonisini seçin. 200 rpm, 37 °C'de kültürleri bir gecede sallayın.
    2. Kanamisin (50 μg/mL) içeren önceden ısınmış LB ortamının 1 L'sini bir şişede 5 mL'lik bir şişede inceleyin ve OD600 0,6 olana kadar 37 °C'de kuvvetli titreme ile büyüyün.
    3. 0,4 mM'lik son konsantrasyona orta içine isopropil β-D-tiogalaktoside (IPTG) ekleyin ve şişeyi 20 °C'de bir gecede 200 rpm'de sallayın.
      NOT: Protein indüksiyonu için düşük sıcaklık, vücut oluşumunu önlemek için önemlidir, bu nedenle sıcaklığın 22 °C'den fazla olmadığından emin olun.
    4. Hücreleri hasat sonra, hücreleri yeniden askıya almak için hücre peletlerine 50 mL lysis tampon ekleyin. 200 W'da 5 dakika boyunca iki kez hücre lysate sonicate, ultrason 3 s, buz üzerinde aralık 3 s. 15, 000 x g'de 4 °C'de 30 dakika boyunca santrifüj edin ve süpernatantları toplayın.
      NOT: Lysis tamponu 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM imidazolden oluşmaktadır. NaOH kullanarak pH değerini 8.0 olarak ayarlayın.
    5. Temizlenmiş süpernatantlara %50 Ni-NTA Sephoraz'ın 2 mL'sini ekleyin ve 4 °C'de 1 saat boyunca sallayarak hafifçe karıştırın.
    6. Lysate ve Ni-NTA karışımını alt çıkış kapaklı bir kolona yükleyin ve alt kapağı çıkarın ve kolon akışını atın.
    7. 6 mL yıkama tamponu ile üç kez yıkayın ve 1,5 mL elüsyon tamponu ile hedeflenen proteini 3 kez temizler. Bir tüp içinde eluate toplamak.
      NOT: Yıkama tamponu 50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl, 30 mM imidazolden oluşmaktadır. NaOH kullanarak pH değerini 8.0 olarak ayarlayın. Elüsyon tamponu 50 mM NaH2PO4,300 mM NaCl, 250 mM imidazolden oluşmaktadır. NaOH kullanarak pH değerini 8.0 olarak ayarlayın.
    8. Proteini tuzdan arındırmak için eluate'yi 4 °C'de 50 mM PBS'nin 1 L'inde bir diyaliz torbasına koyun. Yeni fosfat tamponlu salini (PBS) 3 kez değiştirin.
  3. SUMO etiketinin bölünmesi
    1. Reaksiyon çözeltisini hazırlamak için 1 mg/mL konsantrasyonunda 2 mL Küçük Ubiquitin Benzeri Değiştirici (SUMO) etiketli protein, 1 mL SUMO Proteaz (Bkz. Malzeme Tablosu),1 mL 10x SUMO Proteaz Tampon ve 6 mL ddH2O ekleyin.
      NOT: SUMO etiket protein konsantrasyonu yaklaşık 1 mg/mL'dir. Enzim sindiriminden sonra aşırı konsantrasyonlar proteinin pıhtılaşmasına neden olabilir.
    2. Karışımı 4 °C'de 12-16 saat kuluçkaya yatırın.
    3. Karışımı 15.000 x g'de 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin ve agregaları atın. 10 mL temizlenmiş süpernatanta %50 Ni-NTA bulamacının 0,5 mL'sini ekleyin ve 60 dk boyunca 4 °C'de 4 °C'de sallayarak hafifçe karıştırın .
    4. Lysate ve Ni-NTA karışımını alt çıkış kapaklı bir kolona yükleyin. Alt kapağı çıkarın ve daha sonra 15 mL santrifüj tüpü içine akışı kaydedin.
      NOT: Histagged SUMO proteini kolona bağlanır. NCL reaksiyonu için Cys ile başlayan bağlayıcı-antijen kısmı, akış içindedir.
    5. 4 °C'de 10 dakika boyunca 15.000 x g'de akışı santrifüj edin ve agregaları atın. 1 mL/dk akış hızıyla 25 dk degrade elüsyonu (0-1 dk, %5 B; 1-3 dk, %15 B; 3-20 dk, %45 B; 20-21 dk, %85 B; 21-25 dk, %85 B) hplc kullanarak bağlantı-antijen parçasını arındırın.
      NOT: Kolon 4,6 mm kimlik, 250 mm uzunluğunda, C-18 reçine ile paketlenmiştir. Mobil faz A suda %0.1 TFA, gezici faz B %100 asetonitril ve %0.1 TFA'dan oluşuyordu.
    6. HPLC saflaştırılmış ürün toplamak ve daha sonra linker-antijen ürün almak için gecede dondurularak-kuru.

3. DCAF1'in yerli kimyasal ligasyon ile montajı

  1. Fc-III peptid ve bağlayıcı-antijen parçasını bir arada birleştirme
    1. 2 mL EP tüp içine bir Fc-III peptid hidrazin türevi 1.8 mg (1 μmol) tartMak ve 0.2 M NaH2PO4 (pH 3.0) çözeltisi girdap ile eritmek için 6 M GnHCl 0.8 mL ekleyin.
      NOT: 0,2 M NaH2PO4 (pH 3.0) çözeltisinde 6 M GnHCl pH değeri HCl veya NaOH ile ayarlanarak hazırlanır.
      DİkKAT: NaOH ve HCl son derece aşındırıcıdır. Laboratuvar önlüğü, eldiven ve maske giy.
    2. Oda sıcaklığında 1 dakika için 7.200 x g tüp santrifüj sonra, bir buz-tuz banyosu tüp koymak ve hafifçe 15 dakika için çözelti ajite için manyetik karıştırma kullanın.
    3. Hydrazine grubunu okside etmek için çözeltiye 40 μL 0,5 M NaNO2 ekleyin. Yavaşça buz-tuz banyosunda başka bir 15 dakika için çözelti ajite.
    4. Tartmak ve adım 2.3 ve 13.6 mg 4-mercaptophenylacetic asit (MPAA) buz-tuz banyosu reaksiyon tüpü içine hazırlanan saflaştırılmış linker-antijen parçası 11 mg ekleyin, 5 dakika için karıştırın, ve sonra 6 M NaOH ile oda sıcaklığında 6.8-7.0 için pH değerini ayarlayın.
      NOT: pH değerini nötre ayarlamak ligasyon reaksiyonunu başlatmak için kritik bir adımdır.
    5. 12 saat sonra reaksiyon sistemine 0,4 mL 0,1 M tris (2-karboksitil)fosfin hidroklorür (TCEP) nötr çözeltisi (pH 7.0) ekleyin ve reaksiyonu sonlandırmak için 20 dakika karıştırın.
      NOT: 0,1 M TCEP nötr çözeltisi (pH 7.0) TCEP'in 6 M GnHCl'de 0,2 M NaH2PO4 (pH 3.0) çözeltisinde çözülmesi ve pH değerini 7.0'a ayarlamak için NaOH kullanılarak hazırlanır.
    6. Tüpü 10 dakika boyunca 15.000 x g'de santrifüj edin, daha sonra 10 mIn/mL/mL'lik bir akışla 26 dk degrade lisan (0-1 dk, %5 B; 1-21 dk, %45 B; 21-22 dk, %85 B; 22-26 dakika, %85 B) HPLC ile ligasyon ürününü analiz edin ve arındırın. Ligasyon reaksiyonu için beklenen verim %50'nin üzerindedir.
      NOT: Kolon 4,6 mm kimlik, 250 mm uzunluğunda, C-18 reçine ile paketlenmiştir. Mobil faz A suda %0.1 TFA, gezici faz B %100 asetonitril ve %0.1 TFA'dan oluşuyordu.
  2. Konjugenin desülfürizasyonu
    1. 0,2 M NaH2PO4 (pH 7.0) çözeltisinde 6 M GnHCl'nin 50 μL'inde 3.1.6'dan hazırlanan eşlenik (3.4 mg, 0.3 μmol) çözün.
    2. Yukarıdaki karışıma 50 μL 1 M TCEP, 10 μL tBuSH ve 5 μL 0,1 M VA-044 çözeltisi ekleyin.
      NOT: 0,1 M VA-044 çözeltisi 9,7 mg VA-044 tozunun 0,2 M NaH2PO4 (pH 7.0) çözeltisinde 6 M GnHCl 0,3 mL'ye çözülmesi yle hazırlanır. VA-044 çözeltisi kullanıma maruz kalarak kolayca oksitlendiği için kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır.
    3. Çözeltinin son pH'ını 6,9'a ayarlayın ve solutiomat 37 °C'yi yaklaşık 5 saat karıştırarak saklayın.
    4. Tüpü 10 dk için 15.000 x g'de santrifüj edin ve çözünmez maddeyi çıkarın. 1 mL/dk akış hızıyla (0-1 dk, %20 B; 1-21 dk, %45 B; 21-22 dk, %85 B; 22-26 dk, %85 B) HPLC ile ligasyon ürününü analiz edin ve arındırın. Desülfürizasyon reaksiyonu için beklenen verim yaklaşık %40'tır.
      NOT: Kolon 4,6 mm kimlik, 250 mm uzunluğunda, C-18 reçine ile paketlenmiştir. Mobil faz A suda %0.1 TFA, gezici faz B %100 asetonitril ve %0.1 TFA'dan oluşuyordu.
  3. Son ürün DCAF1 almak için Acm kaldırılması
    1. 32 mM AgOAc'ın 200 μL'sinde 3.2.4 adımdan hazırlanan peptiti (1.35 mg, 0.11 μmol) eritin ve reaksiyon karışımını oda sıcaklığında 4 saat karıştırın.
    2. 0,2 M NaH2PO4 (pH 7.0) çözeltisinde 6 M GnHCl'de 3 μL 1M Dithiothreitol (DTT) ekleyerek peptid üzerindeki gümüş tiyolitleri serbest tiyollere dönüştürün.
    3. 1 dakika boyunca şiddetle karıştırdıktan sonra, 15.000 x g'de tüpü çözünmez maddeyi atmak için 10 dk santrifüj edin. HPLC ile nihai ürünü 26 dk degrade elüsyonu (0-1 dk, %20 B; 1-21 dk, %45 B; 21-22 dk, %85 B; 22-26 dk, %85 B) 1 mL/dk akış hızıyla analiz edin ve arındırın. Acm deprotection reaksiyonu için beklenen verim yaklaşık% 30'dur.
      NOT: Kolon 4,6 mm kimlik, 250 mm uzunluğunda, C-18 reçine ile paketlenmiştir. Mobil faz A suda %0.1 TFA, gezici faz B %100 asetonitril ve %0.1 TFA'dan oluşuyordu.
    4. HPLC saflaştırma sonra, dondurma-bir gecede nihai ürün kuru ve PBS (50 mM NaH2PO4, 150 mM NaCl, pH 8.0) toz eritin. Tüpü 15.000 x g'de 4 °C'de 10 dakika santrifüj edin ve peleti atın.
    5. Nihai ürünün (adım 3.4'ten itibaren) ve bağlayıcı-antijen parçasının (adım 2.3.6'dan 10 μM'ye) konsantrasyonlarını ayarlayın, bu iki ürünün 260-195 nm arası dairesel dikroizm (CD) spektrumlarını 1 mm yol uzunluğuna sahip 25 °C'de bir CD spektrometresi kullanarak kaydedin.
      NOT: CD spektrumları, nihai üründeki α sarmal yapısının miktarını göstermek için rekombinanttaki ne kadar benzer olduğunu göstermek için kullanılır.

4. Ürünlerin kütle spektrometresi ile saptanması

  1. Ürünü her kimyasal reaksiyondan 60 dk degrade elüsyonu (0-8 dk, %2 B; 8-10 dk, %5 B; 10-35 dk, %30 B; 35-50 dk, %50 B; 50-52 dk, %80 B; 52-58 dk, %80 B; 58-59 dk, %2 B; 59-60 dk, %2 B) 0,300 μL/min akış hızında doğrudan yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile arayüz nano-HPLC sistemi.
    NOT: Analitik kolon 75 μm ID, 150 mm uzunluğunda, C-18 reçine ile paketlenmiştir. Mobil faz A suda %0.1 formik asit, gezici faz B ise %100 asetonitril ve %0.1 formik asitten oluşuyordu.
  2. Kütle spektrometresini tam tetkik modunda çalıştırın ve m/z aralığını 300-2.000 ve çözünürlüğü 60.000 olarak ayarlayın.
  3. Kütle spektrum verilerini açın ve kimyasal reaksiyonun başarılı bir şekilde önceden oluştuğunu doğrulamak için her adımda ürünün tepenoktalarını bulun.

5. DCAF1 ve 4G2 antikor arasındaki etkileşimin ELISA tsay

  1. 1pmol anti-GST antikorlu 96 kuyulu mikrotiter plakayı (Bkz. Malzeme Tablosu)100 μL kaplama tamponu/kuyusu yla kaplayın, plakayı kapatın ve bir shaker üzerinde bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
  2. PBS'de %1 BSA'nın 200 μL'si ile her kuyuyu bloke edin, plakayı kapatın ve bir çalkalayıcıda 1 saat oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın.
  3. % 0,05 Tween 20 ile PBS kullanarak her iyi 4 kez yıkayın.
  4. Gst-erimiş antijen proteinini (100 μL bloklama çözeltisinde 0,05 pmol) kuyulara ekleyin, tabağı kapatın ve oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: GST-erimiş antijen proteinbakterilerle ifade edilir ve GSH Sepharose tarafından saflaştırılır.
  5. Plakayı yıkamak için adım 5.3'u tekrarlayın.
  6. 1 pmol 4G2 antikor veya 1 pmol 4G2 antikor artı diğer ligandlar ekleyin: antijen, Fc-III veya DCAF1 seri miktarlarda (0.1 pmol, 1 pmol, 10 pmol, 100 pmol ve 1000 pmol) bloklama çözeltisi /iyi 100 μL, plaka mühür ve bir çalkalayıcı oda sıcaklığında 2 saat kuluçka.
  7. Plakayı yıkamak için adım 5.3'u tekrarlayın.
  8. Anti-fare IgG, HRP bağlantılı Antikor (1:20.000 seyreltme) bloklama çözeltisi / iyi 100 μL ekleyin, plaka mühür ve bir çalkalayıcı oda sıcaklığında 30 dakika kuluçka.
  9. % 0,05 Tween 20 ile PBS kullanarak her iyi 6 kez yıkayın.
  10. Kullanmadan hemen önce TMB reaktifA ve B 1:1'i hacim olarak karıştırın, 100 μL/kuyu ekleyin ve ardından karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika kuluçkaya yatırın.
  11. 100 μL/iyi stop çözeltisi ekleyin ve 30 dakika içinde her kuyu için OD450 değerlerini ölçmek için bir plaka okuyucu kullanın.

6. Fc-III ve IgG molekülü arasındaki etkileşimin ELISA tetkik

  1. 1pmol anti-CA antikora sahip 96 kuyulu mikrotiter plakayı (Bkz. Malzeme Tablosu)100 μL kaplama tamponu/kuyusu yla kaplayın, plakayı kapatın ve bir çalkalayıcı üzerinde bir gecede 4 °C'de kuluçkaya yatırın.
  2. 5,2'den 5,3'e kadar olan adımları yineleyin.
  3. Fc-III veya Fc-III-4C erimiş CA proteinini (0.01, 0.05, 0.1, 0.5 ve 1 pmol 100 μL bloklama çözeltisine) kuyulara ekleyin, plakayı kapatın ve oda sıcaklığında 2 saat kuluçkaya yatırın.
    NOT: Fc-III veya Fc-III-4C erimiş CA proteini bakterilerle ifade edilir ve Ni-NTA tarafından saflaştırılır.
  4. Adımları 5,7'den 5,11'e kadar tekrarlayın ve sonuçları kontrol edin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu makalede yerli kimyasal ligasyon ile sentez yolu için akış şeması Şekil 1'degösterilmiştir. Şekil 2-6, fc-III peptidin kimyasal sentezlenmiş hidrazin türevi kromatogramlarını (A) ve kütle spektrumlarını(B)gösterir, rekombinant ifade bağlayıcısı ve antijen parçası, NCL reaksiyonundan saflaştırılmış ürün, saflaştırılmış desülfürizasyon reaksiyonu ve saflaştırılmış nihai ürün DCAF1 ürün, sırasıyla. Kromatogramlar tüm ürünlerin saflıklarının %90'ın üzerinde olduğunu gösterirken, kütle spektrumları her reaksiyondan sonra ürünün moleküler ağırlığını gösterir. Dekonvolutional molekül ağırlıkları da Şekil 3-6gösterilir , her ürünün doğru moleküler ağırlığı yansıtan. Şekil 7, ELISA tahsini (A) prensibini ve 4G2 antikor bağlanmasını inhibe eden antijen peptid, Fc-III ve DCAF1 sonuçlarını göstermektedir. Hem antijen peptid hem de DCAF1 4G2 bağlanmasını önemli ölçüde engellerken, Fc-III peptid antijen-antikor etkileşimini etkilemez.

Figure 1
Şekil 1. DCAF1 molekülünün yarı sentezi için yerli kimyasal ligasyon yönteminin iş akışı.
İlk olarak, fc-III peptidin hidrazine türevi katı faz peptid sentezi ile elde edilir. Daha sonra, SUMO etiketi erimiş bağlayıcı ve antijen parçası ifade edilir ve bakterilerden arındırılır, SUMO etiket bölünmesi takip. İki parçanın NCL reaksiyonundan sonra ürün desülfürizasyona ve Acm gruplarını çıkararak DCAF1 molekülü haline gelir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2. Fc-III peptidin hidrazin türevinin kromatogramı ve kütle spektrumu.
Bu rakam, saflaştırılmış peptidin LC profilinin(A)ve m/z 915.92'deki mono-izotop zirvesinin duple yüklü peptidle(B)eşleşip eşleşdiğini göstermektedir. Bu rakam referans 10, Şekil 2'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3. Bağlayıcı ve antijen parçasının kromatogramı ve kütle spektrumu.
Bu şekil saflaştırılmış parçanın(A)LC profilini gösterir ve bu parçanın dekonvolutional molekül ağırlığı kütle spektrumundan(B)9429.0 olarak hesaplanır. Bu rakam referans 10, Şekil S2'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4. NCL reaksiyonu ile konjugasyon ürününün kromatogramı ve kütle spektrumu.
Bu rakam, ligasyon ürününü 0 saat (üst), 12 saat (orta) ve saflaştırılmış peptid (alt)(A)olarak izleyen LC profilini gösterir ve bu ürünün dekonvolutional molekül ağırlığı kütle spektrumundan 11227.0 olarak hesaplanır(B). Bu rakam referans 10, Şekil S2'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5. Desülfürizasyon reaksiyonu sonrası ürünün kromatogramı ve kütle spektrumu.
Bu rakam saflaştırılmış ürünün LC profilini gösterir(A) ve bu ürünün dekonvolutional molekül ağırlığı kütle spektrumundan 11195.0 olarak hesaplanır (B). Bu rakam referans 10, Şekil S2'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6. DCAF1 molekülünün kromatogramı, kütle spektrumu ve CD spektrumu.
Bu rakam, kütle spektrumundan(B)11053.0 olarak hesaplanan bu molekülün saflaştırılmış DCAF1(A)dekonvolutional molekül ağırlığının LC profilini ve nihai ürünün (katı çizgi) CD spektrumlarını ve bağlayıcı-antijen parçasını ( çizgi hattı) FCAF1 içinde. Bu rakam referans 10, Şekil 2'den değiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7. DCAF1 molekülünün ELISA tetki.
(A) Sandviç ELISA titretinin iş akışı. İlk anti-GST antikor iyi bir plaka üzerine kaplanır. Sonra GST-erimiş antijen peptid inküye edilir. Daha sonra farklı konsantrasyonlarda DCAF1, antijen veya Fc-III içeren 4G2 antikor, kolorimetrik analiz için eklenir. (B) Farklı ligand konsantrasyonları kullanılarak 4G2 bağlanmasının inhibisyon etkilerini gösteren antijen, Fc-III ve DCAF1'in ELSIA sonuçları. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Buradaki protokol, Şekil 1'degösterilen NCL yaklaşımı kullanılarak DCAF1'in yarı sentezini ve saptanması açıklanmaktadır. Kısaca, DCAF1'in iki parçası sırasıyla kimyasal sentezlenir ve yeniden ifade edilir; sonra, tam uzunlukta DCAF1 molekülü monte edilir, modifiye ve saflaştırılır. Hydrazine türetilen Fc-III parça sentezi için, düşük kapasiteli 2-Cl reçine kullanımı oldukça önemlidir, çünkü yüksek kapasiteli hidrazin üretimi için olumsuz bir etkiye sahiptir ve ürünün düşük verimine yol açar. Bağlayıcı ve antijen kısmı iki nedenden dolayı SUMO etiketi ile ifade edilir: birincisi, SUMO etiketi füzyon proteinlerinin çözünürlüğünü artırabilir; ikincisi, SUMO proteaz bir konformasyon tanınan proteaz, hangi serbest ürün daha fazla ligasyon reaksiyonu için Cys kalıntı ile başlamak için izin verir. Protein ekspresyonu ve arınmadaki en kritik adımlardan biri SUMO proteaz dekoltesidir. SUMO etiketli erimiş protein konsantrasyonu uygun aralıkta ayarlanmalıdır. Çok yüksek veya çok düşük konsantrasyon protein toplama veya sindirim sonrası daha fazla arıtma için zorluk yol açacaktır. Bu protokolün bir diğer kritik adımı, nötr tamponda gerçekleşmesi gereken tiyol-ester değişimine dayanan NCL reaksiyonu sırasında ki pH değerini ayarlamaktır. Reaksiyon arabelleğindeki pH değerinin ince kontrolü ligasyon verimliliğini artırmak için yararlıdır.

Farklı DCAF moleküllerinin dizileri oldukça benzer ve antijen parçası genellikle DCAF tüm yapısı ve doğasına çok az katkıda bulunduğundan, bu protokol, farklı antijen dizileri ile diğer DCAF moleküllerinin sentezi için uygundur. Örneğin, bu protokolü, cognate antikorlarını hedeflemek için üç DCAF molekülünü daha sentezlemek için kullandık. Bunlar arasında, DCAF4 mAb35 antikor engellemek için tasarlanmıştır, hangi asetilkolin reseptörü nötralize edebilir ve bir sıçan modelinde miyasteni gravis neden. Biz mAb35 kaynaklı miyasteni ait sıçankliniksemptomları azaltmak için DCAF4 kullanılan , ve kompleman bileşen proteinleri inhibe ederek asetilkolin reseptörü kurtarmak.

Tekniğimizin uygulanması çeşitli faktörlerle sınırlıdır: Birincisi, mevcut yaklaşımla sentezlenen DCAF molekülünün verimi düşüktür (%genellikle %10'dan az). birden fazla arıtma adımları nedeniyle; ikincisi, konformasyonel determinantlı antikorların DCAF tarafından hedeflenebilmek zordur; üçüncü, DCAF geleneksel küçük bileşik ilaç ile karşılaştırıldığında organizmalarda ekstra bağışıklık yanıtı neden olabilir. Bu protokolün diğer antikor kaynaklı patolojik durumlara uygulanmasının zararlı antikorları ortadan kaldırmak için daha fazla DCAF molekülünün sentezlenmesine yardımcı olacağını öngörüyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Acknowledgments

Bu çalışma kısmen Tsinghua Üniversitesi-Gates Vakfı (hayır. OPP1021992), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (no. 21502103, 21877068 ve 041301475) ve Çin Ulusal Anahtar Araştırma ve Geliştirme Programı (no. 2017YFA0505103).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2-Chlorotrityl resin Tianjin Nankai HECHENG S&T
1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo-[4,5-b]pyridinium hexafluorophosphate 3-oxide GL Biochem 00703
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminiumhexafluorophosphate GL Biochem 00706
2,2′-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl)propane] dihydrochloride J&K Scientific 503236
4G2 antibody Thermo MA5-24387
4-mercaptophenylacetic acid Alfa Aesar H27658
96-well microtiter plates NEST 701001
Acetonitrile Thermo-Fisher A955 MS Grade
AgOAc Sinopharm Chemical Reagent 30164324
anti-GST antibody Abclonal AE001
Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody Cell Signaling Technology 7076P2
BSA Beijing DINGGUO CHANGSHENG BOITECHNOL
CD spectrometer Applied Photophysics Ltd
dialysis bag Sbjbio SBJ132636
Dichloromethane Sinopharm Chemical Reagent 80047360
diethyl ether Sinopharm Chemical Reagent 10009318
DNA Gel Extraction Kit Beyotime D0056
Fusion Lumos mass spectrometer Thermo
GSH Sepharose GE Lifesciences
Guanidine hydrochloride Sinopharm Chemical Reagent 30095516
Hydrazine hydrate Sinopharm Chemical Reagent 80070418
Hydrochloric acid Sinopharm Chemical Reagent 10011018
imidazole SIGMA 12399-100G
Isopropyl β-D-Thiogalactoside SIGMA 5502-5G
kanamycin Beyotime ST101
Methanol Thermo-Fisher A456 MS Grade
N, N-Diisopropylethylamine GL Biochem 90600
N, N-Dimethylformamide Sinopharm Chemical Reagent 8100771933
NcoI Thermo ER0571
PBS buffer Solarbio P1022
Peptide BEH C18 Column Waters 186003625
piperidine Sinopharm Chemical Reagent 80104216
Plasmid Extraction Kit Sangon Biotech B611253-0002
QIAexpress Kit QIAGEN 32149
Rapid DNA Ligation Kit Beyotime D7002
Sodium dihydrogen phosphate dihydrate Sinopharm Chemical Reagent 20040718
Sodium hydroxide Sinopharm Chemical Reagent 10019762
Sodium nitrite Sinopharm Chemical Reagent 10020018
sodium chloride Sinopharm Chemical Reagent 10019318
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem
sterilizing pot Tomy SX-700
SUMO Protease Thermo Fisher 12588018
stop solution Biolegend 423001
the whole gene sequence that can express SUMO-linker-antigen Taihe Biotechnology Compay
TMB reagent Biolegend 421101
Trifluoroacetic acid SIGMA T6508
Triisopropylsilane GL Biochem 91100
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride Aladdin T107252-5g
tryptone OXOID LP0042
Tween 20 Solarbio T8220
Ultimate 3000 HPLC Thermo
vacuum pump YUHUA SHZ-95B
XhoI Thermo IVGN0086
yeast extract OXOID LP0021

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Rhoades, R. A., Pflanzer, R. G. Human Physiology (4th ed.). , Thomson Learning. (2003).
  2. Halstead, S. B., O’Rourke, E. J. Antibody-enhanced dengue virus infection in primate leukocytes. Nature. 265, 739-741 (1977).
  3. Gammon, G., Sercarz, E. How some T cells escape tolerance induction. Nature. 342, 183-185 (1989).
  4. Takada, A., Kawaoka, Y. Antibody-dependent enhancement of viral infection: molecular mechanisms and in vivo implications. Reviews in Medical Virology. 13, 387-398 (2003).
  5. Boonnak, K., et al. Role of Dendritic Cells in Antibody-Dependent Enhancement of Dengue Virus Infection. Journal of Virology. 82, 3939-3951 (2008).
  6. Gilhus, N. E., Skeie, G. O., Romi, F., Lazaridis, K., Zisimopoulou, P., Tzartos, S. Myasthenia gravis - autoantibody characteristics and their implications for therapy. Nature Reviews neurology. 12, 259 (2016).
  7. Contifine, B. M., Milani, M., Kaminski, H. J. Myasthenia gravis: past, present, and future. Journal of Clinical Investigation. 116, 2843-2854 (2006).
  8. Webster, D. P., Farrar, J., Rowland-Jones, S. Progress towards a dengue vaccine. The Lancet Infectious Diseases. 9, 678-687 (2009).
  9. Vikas, K., Kaminski, H. J. Treatment of Myasthenia Gravis. Current Neurology and Neuroscience Reports. 11, 89-96 (2011).
  10. Zhang, L., et al. Development of a dual-functional conjugate of antigenic peptide and Fc-III mimetics (DCAF) for targeted antibody blocking. Chemical Science. 10, 3271-3280 (2019).
  11. Bello, M. S., Rezzonico, R., Righetti, P. G. Use of taylor-aris dispersion for measurement of a solute diffusion coefficient in thin capillaries. Science. 266, 773-776 (1994).
  12. Fang, G. M., et al. Protein chemical synthesis by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 50, 7645-7649 (2011).
  13. Fang, G. M., Wang, J. X., Liu, L. Convergent chemical synthesis of proteins by ligation of peptide hydrazides. Angewandte Chemie. International Edition. 51, 10347-10350 (2012).
  14. Zheng, J. S., Tang, S., Qi, Y. K., Wang, Z. P., Liu, L. Chemical synthesis of proteins using peptide hydrazides as thioester surrogates. Nature Protocols. 8, 2483-2495 (2013).

Tags

Retraksiyon Sayı 151 DCAF hedefli tedavi antikor yerli kimyasal ligasyon katı faz peptid sentezi protein ekspresyonu ve saflaştırma ELISA
Antijenik Peptid ve Fc-III Mimetics (DCAF) Çift Fonksiyonlu Konjuge tarafından Hedefli Antikor Engelleme
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao,… More

Bai, X., Zhang, L., Hu, J., Zhao, X., Pan, J., Deng, H., Feng, S. Targeted Antibody Blocking by a Dual-Functional Conjugate of Antigenic Peptide and Fc-III Mimetics (DCAF). J. Vis. Exp. (151), e60063, doi:10.3791/60063 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter