Summary
Denne protokol beskriver en rensningsmetode for rekombinant tagfrit calcium bindende protein S100A12 og dets ioninducerede oligomerer for humane monocyt-stimulerings analyser.
Abstract
I denne protokol beskriver vi en metode til at rense humant calcium bindende protein S100A12 og dets ion-inducerede oligomerer fra Escherichia coli -kulturen for immuncelle stimuleringer. Denne protokol er baseret på en to-trins kromatografi strategi, som består af protein forrensning på en anion-udvekslings kromatografikolonne og et efterfølgende polerings trin på en hydrofobe-interaktions kolonne. Denne strategi producerer S100A12 protein af høj renhed og udbytte til overkommelige omkostninger. For funktionelle assays på immunceller en eventuel rest endotoksin forurening kræver omhyggelig overvågning og yderligere rengøring trin for at opnå endotoksin-fri protein. De fleste af endotoksin forureninger kan udelukkes ved anionbytnings kromatografi. For at nedbryder resterende forureninger, denne protokol beskriver en fjernelse trin med centrifugal filtre. Afhængigt af den tilgængelige ion-styrke S100A12 kan arrangere i forskellige homomultimere. For at undersøge forholdet mellem struktur og funktion beskriver denne protokol yderligere Ion-behandling af S100A12 protein efterfulgt af kemisk tværbinding for at stabilisere S100A12 oligomerer og deres efterfølgende adskillelse efter størrelses udelukkelse Kromatografi. Endelig beskriver vi en celle baseret analyse, der bekræfter den biologiske aktivitet af det rensede protein og bekræfter LPS-fri forberedelse.
Introduction
S100A12 er et calcium bindende protein, som overvejende produceres af humane granulocytter. Proteinet over udtrykkes under (systemisk) inflammation og dets serumniveauer, især i (Auto) inflammatoriske sygdomme som systemisk juvenil idiopatisk arthritis (sJIA), familiær middelhavsfeber (FMF) eller Kawasakis sygdom (KD) kan informere om sygdomsaktivitet og respons på behandlingen. Afhængigt af mønstergenkendelse receptorer (PRRs) såsom bompenge-lignende receptorer (TLRs), det medfødte immunsystem kan aktiveres ved patogen-associerede molekylære mønstre (pamper) som lipopolysaccharider (LPS) eller skade tilknyttede molekylære mønstre (DAMPs; også betegnet "alarmins"). DAMPs er endogene molekyler såsom cellulære proteiner, lipider eller nukleinsyrer1. Fugtige funktioner er godt beskrevet for medlemmerne af calgranulin protein familien, S100A8/A9 og S100A122, som også rapporteres at fungere som divalent metal ion-chelerende antimikrobielle peptider3,4, 5,6. Afhængigt af den tilgængelige ion-styrke S100A12 kan, ligesom andre medlemmer af S100 familien, arrangere i forskellige homomultimere, og indtil for nylig var virkningen af S100A12-oligomerisering på PRR-interaktion, især TLR4, ukendt.
Proteinets monomeriske form (92 aminosyrer, 10,2 kDa) består af to EF-Hand Helix-loop-Helix-strukturer forbundet med en fleksibel linker. C-TERMINALENS EF-hånd indeholder det klassiske ca2 +bindende motiv, mens N-terminalens EF-hånd udviser en S100 protein specifik udvidet sløjfe struktur ("pseudo-EF-hånd") og afslører reduceret ca2 +-affinitet. Ca2 +-binding af S100A12 kan inducere en større konformationsmæssige ændring i proteinerne C-Terminus, hvilket resulterer i eksponering af et hydrofobe plaster på hver monomer og danner denne-grænsefladen. Under fysiologiske forhold er den mindste kvaternære struktur dannet af S100A12 således en ikke-kovalent dimer (ca. 21 kDa), hvor individuelle monomerer er i antiparallel orientering. Når det er arrangeret som dimer, S100A12 er rapporteret til eller beslaglæggelse Zn2 + samt andre divalent metalioner, f. eks cu2 + med høj affinitet7. Disse ioner koordineres ved S100A12 dimer grænseflade af aminosyrer H15 og D25 af en underenhed og H85 samt H89 af anti-paralleling anden underenhed8,9,10. Mens tidligere undersøgelser foreslår, at Zn2 +-loaded S100A12 kan inducere proteinets organisation til homo-tetramers (44 kDa) og til at resultere i øget ca2 +-affinitet11,12, seneste metal titrering undersøgelser6 foreslår ca2 +-binding af S100A12 for at øge proteinets affinitet til Zn2 +. Når S100A12 EF-hænderne er fuldt besat af ca2 +, er yderligere ca2 + menes at binde mellem dimers, udløser hexamer formation (ca. 63 kDa). Arkitekturen i den hexameriske kvarternære struktur er klart forskellig fra den af tetramer. Det foreslås, at transthyretin-grænsefladen afbrydes for at give anledning til nye dimer-dimer-grænseflader, der gavner hexamer formation10. S100A12 er næsten udelukkende udtrykkes af humane granulocytter, hvor det udgør omkring 5% af alle cytosolisk protein13. I sin fugtige funktion S100A12 blev historisk beskrevet som agonist af multi-ligand-receptoren for avancerede glykering slutprodukter (Rage), derefter betegnet ekstracellulære nyligt identificerede Rage-binding protein (en-Rage)14. Omend vi tidligere rapporterede biokemiske S100A12-binding til både RAGE og TLR415, vi for nylig viste humane monocytter til at reagere på S100A12 stimulation i en TLR4-afhængig måde16. Dette kræver arrangement af S100A12 i sin ca2 +/Zn2 +-induceret hexameric Kvartære struktur16.
Her beskriver vi en rensnings procedure for rekombinant Human S100A12 og dens ion-inducerede oligomerer til immuncelle stimuleringer16,17. Dette er baseret på en to-trins kromatografi strategi, som i første omgang omfatter en anion-udvekslings kolonne for at isolere og koncentrere proteinet og fjerne masse forureninger (f. eks. endotoksiner/lipopolysaccharider)18. Ionbytningskromatografi harpiks udskille proteiner på grundlag af forskellige netto overflade ladninger. For sure proteiner som S100A12 (isoelektrisk punkt af 5,81), et buffersystem med en pH på 8,5 og en stærk anionbytter harpiks fører til en god adskillelse. Bundne proteiner blev elueret med et højsalt buffer forløb. Med en forøgelse af ionstyrke negative ioner i elueringsbufferen konkurrerer med proteiner for afgifter på overfladen af harpiks. Proteiner individuelt elueres afhængigt af deres netto ladning og i følge heraf, de buffere beskrevet heri gør det muligt at isolere og koncentrere det over udtrykte S100A12 protein. På grund af negativt ladede grupper i lipopolysaccharider binder disse molekyler sig også til anionbytter harpiks. Men deres højere netto ladning resulterer i senere eluering i den anvendte High-salt gradient. Det andet trin i rensningsproceduren er indført med henblik på polering. Dette gør brug af calcium binding evne S100A12 og fjerner resterende urenheder på en hydrofobe-interaktion kolonne. Calcium binding af S100A12 fører til en konformationel ændring og en eksponering af hydrofobe pletter på overfladen af proteinet. På denne betingelse, S100A12 interagerer med den hydrofobiske overflade af harpiks. Ved calcium-Chelat ved EDTA, denne interaktion er vendt. I nærværelse af ioner, især calcium og zink, S100A12 arrangerer til homomeriske oligomerer. For at studere struktur-funktion relationer af de forskellige oligomerer, stabiliserede vi dimeric, tetrameric og hexameric rekombinant S100A12 med en kemisk kryds linker og adskilte komplekser på en størrelses-udelukkelse kromatografikolonne. Endelig, at analysere funktionalitet og biologisk aktivitet af det rensede protein og dets ion-induceret oligomerer, cytokin frigivelse af S100A12 og LPS stimuleret monocyt kan sammenlignes.
Der er hidtil blevet beskrevet forskellige metoder til rensning af S100A12. F. eks. har Jackson et al.19udgivet en protokol med rensning via en anionbytnings kolonne og en efterfølgende kromatografi med størrelses udelukkelse. Rensning polering på en størrelse-udelukkelse kolonne fører til gode resultater, men-på grund af for eksempel begrænset lastning mængder-er mindre fleksibel i skalerbarhed. En anden tilgang, udgivet af Kiss et al.20, beskriver rensning af mærket protein via ni2 + affinitets kolonne som det første rensningstrin, efterfulgt af enzymatisk spaltning for at fjerne tagget og yderligere rensningstrin. I modsætning til de forlagte undersøgelser19,20, er det producerede protein som beskrevet i denne protokol bestemt til forsøg på immunceller. Derfor er rest endotoksin forurening fra bakteriel kultur en udfordring. Selv om der hidtil er blevet beskrevet forskellige tilgange til fjernelse af endotoksin, findes ingen ensartet metode, der fungerer lige godt for en given proteinopløsning21,22.
Sammenfattende kombinerer vores protokol fordelene ved et mærkat frit udtryk i et bakterie system med effektiv endotoksin fjernelse og højt udbytte af rent protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: Se supplerende tabel 1 for klargøring af buffere og stamopløsninger.
1. protein ekspression i E. coli
-
Kloning
- Klon tag-fri Human S100A12 (NCBI reference sekvens: NP_ 005612.1) i bakteriel udtryk vektor pET11b. For at udtrykke proteinet, omdanne konstruktionen til E. coli BL21 (DE3).
-
Kultur
- Forbered en start kultur ved at inokulere en enkelt koloni i 5 mL vækstmedium (LB bouillon med 100 μg/mL ampicillin) i en 14 mL rund bund tube. Inkuber natten over ved 37 °C med omrystning ved 220 rpm. 2 − 4 mL natkultur overføres til 400 mL vækstmedium i en 2 L Erlenmayer kolbe, og kulturen inkubates ved 37 °C med omrystning ved 220 rpm.
Bemærk: Start tætheden af hovedkulturen skal være optisk tæthed ved 600 nm (OD600) = 0,1. - Overvåge OD600 under vækst. Inducerer protein ekspression ved tilsætning af 1 M isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG) til en slutkoncentration på 1 mM ved OD600 = 0,5 − 0,6. Inkuber ved 37 °C og 220 rpm for yderligere 4 timer.
Bemærk: Generelt vil en OD600 af 0,6 nås efter 1,5 − 2,5 h ved 37 °c. - Forbered 50 mL sonikering buffer ved at opløse 50 mM Tris, 50 mM NaCl og 1 mM ethylenediamin tetraeddikesyre (EDTA) i 40 mL deioniseret vand. Justér pH med HCl til 8,0 og lav op til 50 mL. Tilsæt proteasehæmmer (1 tablet pr. 50 mL opløsning) og ækvibrere bufferen til 4 °C.
- Bakterie kulturen overføres til egnede Centrifugerings flasker, og cellerne høstes ved 3.200 x g i 30 minutter ved 4 °c. Kassér supernatanten og resuspension af pellet i 25 mL iskold sonikering buffer. Hold derefter cellerne på is.
Bemærk: resuspenderede celler kan opbevares ved-20 °C for kortvarig og ved-80 °C for langsigtet.
- Forbered en start kultur ved at inokulere en enkelt koloni i 5 mL vækstmedium (LB bouillon med 100 μg/mL ampicillin) i en 14 mL rund bund tube. Inkuber natten over ved 37 °C med omrystning ved 220 rpm. 2 − 4 mL natkultur overføres til 400 mL vækstmedium i en 2 L Erlenmayer kolbe, og kulturen inkubates ved 37 °C med omrystning ved 220 rpm.
-
Sonikering/lysis
- Soniker cellerne i 6 cyklusser af 30 s på is. Efter hver cyklus, hvile celler for 30 − 60 s at beskytte cellerne mod overophedning.
- Cellesuspensionen overføres til et forkølet 50 mL højhastigheds centrifugeglas og centrifugeres i en fast vinkel rotor ved 15.000 x g i 30 minutter ved 4 °c. Decant det clearede lysat, som indeholder de opløselige cytosolisk proteiner i en frisk 50 ml rør og kassere pellet.
2. protein rensning
- Anionbytnings kromatografi
- Dialyse
- Forbered anionbytnings kromatografi (AIEX) buffer A ved at opløse 20 mM Tris, 1 mM EDTA og 1 mM ethylenglycol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraeddikesyre (EGTA) i deioniseret vand og justere pH til 8,5 med HCl. Til dialyse klargøring 2 x 5 L og til kromatografi 2x 1 L AIEX buffer A.
Bemærk: Dialysatvolumenet skal være ca. 100 gange prøvevolumenet. Alle buffere, der anvendes til kromatografi, skal filtreres (0,45 μm eller mindre) og afgasses (f. eks. ved ultralydbad eller vakuum udslip). - Afskårne dialyse slanger (afskæring af molekylvægt [MWCO]: 3,5 kDa) i en passende længde med ekstra plads til luft for at sikre, at prøve opdrift over den roterende Stir bar.
Bemærk: Glycerol bevarer membranen og skal fjernes før brug. - For at reducere viskositeten af den ryddede proteinopløsning fra trin 1.3.2 fortyndes opløsningen med 25 mL AIEX buffer A for at lette efterfølgende påføring på kromatografi søjlen. Fastgør den første lukning på slangen, læg prøven i membranen og fastgør den anden lukning mindst 1 cm fra den øverste ende af slangen.
- Placer 5 L beholderen med AIEX buffer A på en omrøring, tilsæt en røre stang og membranen fyldt med proteinopløsning. Juster hastigheden for at rotere prøven ved at undgå interferens med den roterende røre bar. Dialyze for 12 − 24 timer ved 4 °C, og Udskift derefter dialysatbufferen (AIEX buffer A) med et frisk, forkølet præparat, og Fortsæt i mindst 4 ekstra timer. Den dialyserede proteinopløsning overføres til et 50 mL rør og filtreres gennem en 0,45 μm filterenhed.
Bemærk: Opbevaring muligt.
- Forbered anionbytnings kromatografi (AIEX) buffer A ved at opløse 20 mM Tris, 1 mM EDTA og 1 mM ethylenglycol-bis (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-tetraeddikesyre (EGTA) i deioniseret vand og justere pH til 8,5 med HCl. Til dialyse klargøring 2 x 5 L og til kromatografi 2x 1 L AIEX buffer A.
- Kromatografi
- Start væskekromatografi systemet (FPLC) med generel vedligeholdelse, Tilslut kolonne buffere AIEX A og AIEX B (AIEX buffer A med 1 M NaCl) og anionbytter harpiks, der indeholder kolonne. Se tabel 1 for generelle kromatografiske parametre.
Bemærk: buffere, kolonne-og FPLC-udstyr skal være ækvibreret til samme temperatur, inden kørslen påbegyndes (Se kromatografiske parametre i tabel 1, tabel 2, tabel 3, tabel 4og tabel 5). - Ækvibrere søjlen med aiex buffer A, derefter lægge prøven på kolonnen og elueres proteinerne med en lineær gradient fra 0% til 100% høj-salt buffer (aiex B). Se tabel 2 for en detaljeret metode protokol.
- Der opsamles 2 mL fraktioner under eluering og analyseres 10 μL af hver fraktion på en Coomassie-plettet 15% natriumdodecyl sulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-side). Samle fraktioner indeholdende S100A12 protein til dialyse.
Bemærk: Molekylvægten af S100A12 er 10.575 da.
- Dialyse
- Calcium afhængig hydrofobe-interaktions kromatografi (HIC)
- Dialyse
- Til dialyse af protein opløsningen mod 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,5 efter proceduren beskrevet i punkt 2.1.1.
- Kromatografi
- Der fremstilles 1 L kromatografi buffer HIC A ved at opløse 20 mM Tris, 140 mM NaCl og 25 mM CaCl2 i deioniseret vand og justere pH-værdien til 7,5. For HIC buffer B opløses 20 mM Tris, 140 mM NaCl og 50 mM EDTA. Juster pH-værdien til 7,0, og Filtrer og Degas bufferne. Tilsæt CaCl2 til prøven til en endelig koncentration på 25 mm, og filtrer gennem 0,45 μm. ÆKVIBRERE HIC buffere og prøve til 4 °c (kolonne temperatur).
- Start væskekromatografi systemet med generel vedligeholdelse, Forbind kolonne buffere HIC A og B og kolonnen. Se tabel 3 for yderligere kromatografiske parametre.
- Ækvibrere kolonnen, indlæse prøven og forlænge blokken ' vask ubundet prøve ', indtil UV-signalet når baseline-niveauet igen. Start derefter elueringsprocessen med en calciumchelator indeholdende buffer (EDTA). Se tabel 4 for en detaljeret metode protokol.
Bemærk: Tidligere eksperimenter har vist, at et overskud af calcium synes at være gavnlig for binding af S100A12 til kromatografi harpiks. - Saml peak fraktioner af 2 mL og analysere 10 μL af hver fraktion på en Coomassie-farvede 15% SDS-side. Pool Pure S100A12 fraktioner og dialyze mod Hepes-bufferet saltvand (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,0) som beskrevet i punkt 2.1.1.
Bemærk: ekstinktionskoefficienten for mono S100A12 er 2980 M-1 cm-1.
- Dialyse
3. påvisning og fjernelse af endotoxin
-
Påvisning af endotoksin
- For at bestemme endotoksin kontaminering måles koncentrationerne af fortyndet protein fra trin 2.2.2.4. (f. eks. 1:10 og 1:100 i HBS) ved hjælp af en enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA)-baseret, fluorescerende endotoksin detektionsassay (tabel over materialer). Udfør denne analyse ved at følge producentens protokol.
Bemærk: Brug frisk fremstillede HBS-opløsninger opløst i ultrarent deioniseret vand for at undgå (ny) endotoksin-kontaminering med bufferen.
- For at bestemme endotoksin kontaminering måles koncentrationerne af fortyndet protein fra trin 2.2.2.4. (f. eks. 1:10 og 1:100 i HBS) ved hjælp af en enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA)-baseret, fluorescerende endotoksin detektionsassay (tabel over materialer). Udfør denne analyse ved at følge producentens protokol.
-
Fjernelse af endotoksin og koncentration af protein
- 15 mL prøve påfyldes en 50 kDa centrifugal filterenhed og centrifugeres ved 3.200 x g og 10 °c i ca. 10 min. Overfør gennemstrømningen til et frisk fartøj (på is), og Genfyld og centrifuger 50 kDa-filter røret så ofte som nødvendigt. Vask filter membranen to gange med HBS for at genvinde så meget protein som muligt efter hvert trin.
- Den S100A12-holdige gennemstrømning koncentreres ved hjælp af et 3 kDa-centrifugal filter, indtil volumenet reduceres til en femtedel op til en tiendedel af den oprindelige laste volumen (centrifugering ved 3.200 x g, 10 °c i ca. 30 minutter). Genfyld filteret så ofte som nødvendigt, skyl membranen, og overfør den koncentrerede opløsning til et nyt rør efter hver påfyldning. Kassér gennemstrømnings strømmen. Filtrer igen gennem 50 kDa som beskrevet ovenfor.
Bemærk: Under denne procedure, tabet af protein er bemærkelsesværdigt (op til 50%), men den resterende protein præparat er helt opbrugt fra LPS. Denne metode giver omkring 10 − 15 mg protein fra 400 mL kultur. - Protein opløsningen justeres til 1 mg/mL med endotoksin frie HBS, og LPS-indholdet måles som beskrevet i trin 3.1.1. Hvis protein opløsningen stadig ikke testes som LPS-fri (< 0,1 EU/ml), elimineres rest-forureninger ved hjælp af en endotoksin fjernelse harpiks.
Bemærk: Med en proteinkoncentration på 1 mg/mL er kontaminering af 0,1 EU/mL LPS lig med ca. 0,01 PG LPS/μg protein.
4. kemisk crosslinking og oligomer adskillelse
-
Kemisk binding
- Forbered meget rene (endotoxin-fri) stamopløsninger på 1 M CaCl2 og 100 mm zncl2 i ultrarent deioniseret vand (tabel over materialer). Brug denne buffer, frisklavet, til næste trin.
- Inkubér 10 mL renset endotoxin-fri S100A12 (koncentration 1 mg/mL i HBS) i 30 min ved stuetemperatur (RT) med enten 25 mM CaCl2 for dimeric/tetrameric eller 25 mm CaCl2 og 1 mm zncl2 for HEXAMERIC/tetrameric S100A12 oligomerer.
- Forbered krydsbinderens ved at opløse 8 mg BS3 i 500 μl endotoxin-frit vand direkte før brug (8 mg krydsbinderens til 10 ml ion-spiked-proteinopløsning svarer til en slutkoncentration på 1,4 mm). Bland krydsbinderens og prøve ved pipettering og Inkuber i yderligere 30 minutter ved rt. Sluk for reaktionen ved at tilsætte 1 M Tris-HCl, pH 7,5 til en endelig koncentration på 50 mm og Filtrer gennem 0,45 μm.
-
Kromatografi af størrelses udelukkelse
- Den tvær tilknyttede prøve skal ækvibrere til 12 − 15 °C (kolonne temperatur) og starte væskekromatografi systemet med generel vedligeholdelse. Forbind kolonne buffer (HBS) og kolonnen størrelses udelukkelse. Se tabel 5 for detaljerede oplysninger.
- Kolonnen i HBS, belastnings prøven og Indsaml spids fraktioner (1 − 2 mL) i løbet af kørslen. Analysér disse fraktioner på en 4 − 20% gradient SDS-side og pulje fraktioner med større bånd af det ønskede protein kompleks.
Bemærk: Hydrolyse af NHS ester reagenser som BS3 i vandige opløsninger resulterer i en stærk absorbans ved 280 Nm. Ubundet krydsbinderens (molekylvægt: 572 g/mol) elutter i slutningen af kørslen og resulterer i en stærk top. - Koncentrer løsningerne ved hjælp af centrifugal filterenheder med MWCOs på 10 kDa (dimer), 30 kDa (tetramer) eller 50 kDa (hexamer). Endotoksin kontamination bestemmes som beskrevet i punkt 3,1. Hvis det er nødvendigt, fjerne resterende LPS med en endotoksin fjernelse harpiks efter producentens anbefalinger (tabel over materialer).
5. funktionel prøvning af monocytter
- Fremstilling af monocytter
- Isoler monocytter fra humane Buffy frakker ved tæthed gradient centrifugering og efterfølgende monocyt berigelse ved hjælp af en magnetisk perle adskillelse Kit (tabel over materialer).
Bemærk: Denne protokol vil resultere i ca. 5 − 7 x 107 monocytter (en Buffy coat) med en renhed på 83 − 95%. Da antallet, men også lydhørhed af celler afhænger stærkt på donor, kan protokollen skal skaleres op (afhængigt af det krævede celletal). - Ved tætheds Centrifugerings opløsning skal separations opløsningen (densitet = 1,077 g/mL) ækvibrere til RT og overføres 20 mL til 50 mL centrifugeglas (2 rør pr. Buffy coat). Fortyndet blod fra den menneskelige Buffy coat med Hank's Buffered saltopløsning (HBSS) til et samlet volumen på 60 mL og lag 30 mL af denne blanding omhyggeligt på toppen af separations mediet. Centrifuge ved 550 x g for 35 min ved rt. Deaktiver centrifuge bremsen.
- Efter centrifugering er mononukleære perifere blodlegemer (PBMCs) placeret direkte oven på separations mediet. Disse celler overføres til et frisk 50 mL centrifugeglas, der fremstiller op til 50 mL med HBSS, og centrifugeres ved 170 x g i 10 min. Aspirér supernatanten, og resuspender celle pellet i et lille volumen hbss ved pipettering.
- Fyld røret op til 50 mL og centrifugeres ved 290 x g i 10 min. Aspirér supernatanten igen, resuspender cellerne i hbss (50 ml) og centrifugeres ved 170 x g i 10 min. Tæl cellerne, og gensuspender dem i celle separations buffer (tabel over materialer < /C9 >) til en koncentration på 5 x 107 celler/ml.
Bemærk: I stedet for HBSS kan fosfat-bufferet saltvand (PBS) bruges til at vaske cellerne. - For monocytter isolering fra PBMCs, brug en magnetisk negativ celle isolation kit og følg producentens protokol. Tæl monocytter og resuspension i monocyt medium (rpmi 1640, 15% varme inaktiveret føtal kalv serum [FCS], 4 mm L-glutamin, 100 U/ml penicillin/streptomycin) til en koncentration på 2 x 106 celler/ml.
- Til kultur monocytter, coat kultur retter (fx 100 mm) med en hydrofobe, gas-permeable film, egnet til suspension celler (tabel over materialer). Steriliser pladerne ved hjælp af UV-lys i ca. 30 min. Overfør cellerne til disse kultur plader, og lad dem hvile over natten ved 37 °C og 5% CO2.
Bemærk: Brug 15 − 25 mL cellesuspension pr. belagt skål.
- Isoler monocytter fra humane Buffy frakker ved tæthed gradient centrifugering og efterfølgende monocyt berigelse ved hjælp af en magnetisk perle adskillelse Kit (tabel over materialer).
- Stimulering af monocyte
- Stimulering med S100A12 (wildtype)
Bemærk: For at skelne ubehandlet S100A12 (slutprodukt fra afsnit 2.2.2) fra tværbundet protein betegnes S100A12 i det følgende som» wildtype «.- De udhvilede celler overføres til et 50 mL centrifugal rør og centrifugeres ved 350 x g i 10 min. Aspirér supernatanten og resuspender celle pellet i stimulerings medium (rpmi 1640, 5% varme INAKTIVEREDE FCS, 4 mm L-glutamin, 100 U/ml penicillin/ streptomycin) i en koncentration på 2 x 106 celler/ml.
- Til stimulation anvendes 24 brønd ophængnings plader og tilsættes 250 μL cellesuspension pr. brønd (0,5 x 106 celler/brønd). Tilsæt 50 μg/ml polymyxin B til de tilsigtede brønde, efterfulgt af enten LPS i forskellige koncentrationer (25, 50, 100 og 200 pg/ml) eller dværg S100A12 (10, 20, 40, 60 μg/ml). Yderligere, anvende proteinet enten ubehandlet eller varme-denatureret (99 °C, 10 min) i forskellige koncentrationer til cellerne.
Bemærk: En kort varmebehandling denatureret S100A12 protein, men har mindre til ingen effekt på LPS. - Inkuber pladerne i 4 timer ved 37 °C og 5% CO2. Høst cellerne ved at overføre cellesuspensionen af hver brønd til 1,5 mL reaktions slanger. Centrifugeres ved 500 x g i 10 min. Overfør Supernatanterne til friske rør, og mål tnfα-frigivelse i forskellige fortyndinger (f. eks. 1:2, 1:5, 1:10) med et humant TNFΑ Elisa-sæt efter fabrikantens anvisninger.
- Stimulering med S100A12 oligomerer
- Forbered og frø ud monocytter i 24 godt suspension plader som beskrevet ovenfor. Stimulerer cellerne ved at tilføje S100A12 oligomerer fra trin 4.2.3. i forskellige molære koncentrationer (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
Bemærk: For at sammenligne de forskellige oligomeres evne til at stimulere monocytter blev der anvendt oligomerer på cellerne i sammenlignelige molære koncentrationer. - Inkuber i 4 timer ved 37 °C og 5% CO2, høst cellerne og mål TNFα-frigivelse i Supernatanterne som beskrevet ovenfor.
- Forbered og frø ud monocytter i 24 godt suspension plader som beskrevet ovenfor. Stimulerer cellerne ved at tilføje S100A12 oligomerer fra trin 4.2.3. i forskellige molære koncentrationer (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
- Stimulering med S100A12 (wildtype)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter forrensning på AIEX-søjlen (figur 1a-C) og efterfølgende calcium afhængige HIC (figur 2a, B) blev der opnået meget rent protein (figur 2c). Desuden, målinger af endotoksin afsløret vellykket LPS fjernelse. LPS-indholdet efter AIEX blev målt i en 1:10-fortynding over test detektionsgrænsen, dvs., over 500 EU/mL. Efter den første filtrering gennem en 50 kDa-filterenhed blev LPS-indholdet reduceret til 1 EU/mL. Efter koncentration med en 3 kDa-filterenhed og yderligere filtrering gennem 50 kDa var den målte LPS-kontamination 0,08 EU/mL.
Som en ekstra kontrol blev humane monocytter stimuleret med det producerede dværg protein (figur 3A, B). Behandling med polymyxin B ophæver TNFα-frigivelse fra LPS-stimulerede monocytter, som ikke kan observeres med S100A12. På den anden side, varmebehandling af både LPS og S100A12 afskaffer proteinets evne til at stimulere celler, mens dette ikke påvirker cellulære respons på LPS-stimulation.
Protein eksponering for forskellige ioner resulterer i arrangement af forskellige S100A12 oligomerer (figur 4a). Kemisk binding giver mulighed for at fange definerede komplekser såsom dimers, tetramers, og hexamerer samt overgangstilstande (f. eks, ' trimers ', band på ca. 30 kDa). For at inducere en markant forskydning af oligomer-ligevægt før kryds bindingen blev der anvendt et overskud af ioner (figur 4b).
Isolerede oligomerer i lige molære koncentrationer (figur 5A-C) blev derefter anvendt til monocyt stimulation til at sammenligne signalerings evner via PRRS. monocyt-stimulation med hexameric S100A12 resulterede i udtalt tnfα frigivelse (figur 6 ). Remnant cytokinfrigivelse kunne påvises fra celler stimuleret med tetrameric S100A12, mens behandling med dimeriske protein ikke inducerer tnfα frigivelse.
Figur 1: resultater af anionbytnings kromatografi. A) et kromatogram med absorbans ved 280 Nm (a280) og procentdelen af elueringsbuffer B (stiplet linje). Metoder blokke er indikeret med A = vask ubundet prøve, B = lineær gradient med elueringsbuffer (buffer B), C = skyl ud med buffer B, og D = re-equilibration i buffer A.b) Fokuser på de relevante toppe med brøk rørtal i rødt. C) udvalgte fraktioner blev analyseret på 15% Coomassie-PLETTET SDS-side. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: resultater af hydrofobe-interaktions kromatografi. A) et kromatogram med absorbans ved 280 Nm (a280) og procentdelen af elueringsbuffer B (stiplet linje). Metoder blokke er indikeret med A = vask ubundet prøve, B = eluering med buffer B, og C = re-ligevægt i buffer A.B) fokusere på de relevante toppe med brøk rørtal i rødt. C) analyserede fraktioner på 15% Coomassie-PLETTET SDS-side. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: primære humane monocytter blev stimuleret ved indikerede koncentrationer. LPS (A) eller S100A12 (wildtype, B) blev ubehandlet eller varme denatureret (99 °c, 10 min). Begge betingelser blev afprøvet ved tilstedeværelse og fravær af polymyxin B. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: S100A12 protein var tværbundet med BS3 efter inkubation i HBS buffer indeholdende 5 mm ca2 + og indikerede Zn2 + koncentrationer. A) stigende Zn2 + koncentrationer inducerer arrangement af S100A12 i tetramers og hexamerer ved adskillelse på 4 − 20% coomassie-farvede SDS-side. B) repræsentativt resultat af tvær tilknyttede oligomerer med betingelser, der anvendes til adskillelse i en kolonne med størrelses udelukkelse. S100A12 var tværbundet i nærværelse af enten 25 mm ca2 + (Lane 1) eller 25 mm ca2 + og 1 mm Zn2 + (Lane 2). (S100A12) 2 = dimer; (S100A12) 4 = tetramer; (S100A12) 6 = hexamer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: S100A12 oligomerer blev adskilt på en kolonne med størrelses udelukkelse. (A) kromatogram af hexamer/tetramer separation efter binding i HBS buffer med 25 mm CaCl2 og 1 mm zncl2. B) kromatogram til tetramer/dimerseparation i HBS-buffer med 25 mm CaCl2. C) eksempel på samlede og koncentrerede oligomerer efter adskillelse på en Coomassie-plettet 4 − 15% gradient SDS-side. Lane 1 = dimer; Lane 2 = tetramer; Lane 3 = hexamer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: stimulering af monocytter med rensede S100A12 oligomerer. TNFα-frigivelse efter 4 h inkubation blev kvantificeret ved ELISA. Dataene viser middelværdien fra to uafhængige eksperimenter. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Senge volumen (CV) | 75 mL |
| Skærm | Absorbans ved 280 nM |
| Tryk maks | 3 bar |
| Kolonne buffer A | 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,5 |
| Kolonne buffer B | 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 M NaCl, pH 8,5 |
| Prøvevolumen | Variabel |
| Strømningshastighed | 1 − 2 mL/min |
| Temperatur | 4 °C |
Tabel 1: detaljerede oplysninger om de anvendte parametre for anionbytnings kromatografi.
| Blok | Volumen | Buffer | Outlet |
| Ækvilibrering | 1 − 2 kolonne volumener (CVs) | A | Affald |
| Prøvebelastning | Nielsen | A | Affald |
| Udvaskes ubundet prøve | 1 CV | A | Stikkontakt med høj lydstyrke |
| Gradient – eluering | 0 − 100% buffer B i 1 CV | A til B | Fraktion samler |
| Vask ud – buffer B | 1 CV | B | Affald |
| Re-Equilibration | 2 CV'er | A | Affald |
Tabel 2: detaljerede oplysninger om den anvendte metode til anionbytnings kromatografi.
| Senge volumen (CV) | 125 mL |
| Skærm | Absorbans ved 280 nM |
| Tryk maks | 4 bar |
| Kolonne buffer A | 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 25 mM CaCl2, pH 7,5 |
| Kolonne buffer B | 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,5 |
| Prøvevolumen | Variabel |
| Strømningshastighed | 1 − 2 mL/min |
| Temperatur | 4 °C |
Tabel 3: detaljerede oplysninger om de anvendte parametre for hydrofobe-interaktions kromatografi.
| Blok | Volumen | Buffer | Outlet |
| Ækvilibrering | 1 − 2 kolonne volumener (CVs) | A | Affald |
| Prøvebelastning | Nielsen | A | Affald |
| Udvaskes ubundet prøve | 1 − 2 CV'er | A | Stikkontakt med høj lydstyrke |
| Eluering | 100% buffer B | B | Fraktion samler |
| Vask ud – buffer B | 1 CV | B | Affald |
| Re-Equilibration | 2 CV'er | A | Affald |
Tabel 4: detaljerede oplysninger om den anvendte metode til hydrofobe-interaktions kromatografi.
| Senge volumen (CV) | 320 mL |
| Skærm | Absorbans ved 280 Nm |
| Tryk maks | 3 bar |
| Kolonne buffer A | 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,2 |
| Prøvevolumen | Op til 13 mL |
| Strømningshastighed | 1 − 1,5 mL/min |
| Temperatur | 12 − 15 °C |
Tabel 5: detaljerede oplysninger om de anvendte parametre for størrelses udelukkelses kromatografi.
Supplerende tabel 1: fremstilling af buffere og stamopløsninger. Venligst klik her for at downloade denne fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokol beskriver vi tag-fri bakterielle udtryk for human S100A12 og dets rensning samt adskillelse i forskellige ion-induceret oligomerer til immuncelle stimulation. Sammenlignet med offentliggjort litteratur om S100A12 protein rensning8,23,24, brugen af høj CaCl2 (25 mm) i hydrofobe-interaktion kromatografi er at vores viden unik. Flere protokoller, der anvender koncentrationer fra 1 til 5 mM producerer rent protein, men vi observerede en flere gange højere afkast efter vores tilgang ved hjælp af 25 mM CaCl2 i stedet. Dette kan forklares ved et hierarki af protein interaktion med kolonnematerialet: S100A12 kan direkte binde sig til kolonnematerialet, men overskuddet på ca2 + kan også lette indirekte BINDING af S100A12-dimere til det allerede kolonne bundne protein 8. således kan høje ca2 + koncentrationer forstørre overfladen til rådighed for S100A12 rensning. Eluering (ved hjælp af en lineær gradient) af S100A12 fra HIC som en tidlig (indirekte bundet S100A12) og en meget sen Peak (kolonne materiale bundet protein) kan understøtte denne spekulation (data ikke vist).
Til produktion af rekombinant S100A12 (samt andre proteiner) ved høje udbytter og håndterbare omkostninger, protein ekspression i E. coli er stadig den foretrukne metode. Men den uundgåelige kontaminering med bakterielle endotoksiner er stadig et problem, når proteiner bestemmes for cellekultur eksperimenter, især i undersøgelser, der involverer medfødte immunceller. Til vores erfaring, selv kommercielt tilgængelige proteiner eksplicit erklæret for cellekultur brug kan indeholde endotoksin forureninger op til 1 EU/μg protein, som kan betydeligt skæv assays. Derfor er en fuldstændig fjernelse af endotoksiner obligatorisk. Endotoxin monomerer i opløsning spænder fra molekylvægte på 10 til 20 kDa, men de kan danne miceller og strukturer med højere molekylvægt. Dannelsen af meget store strukturer er for eksempel fremmet gennem bivalent ioner21,25.
I henhold til vores protokol verificerer vi den endotoksin-fri produktion af S100A12 protein ved at kombinere høj følsomhed endotoksin målinger med monocyt stimulation assays. Vi anser en sådan kombination for særlig betydningsfuld som en) lav-niveau endotoksin forurening kan være vanskeligt at vurdere afhængigt af følsomheden af analysen og b) brugen af polymyxin b som LPS-hæmmer på monocytter kan resultere i vanskeligt at fortolke data på grund til eksklusive polymyxin B-effekter på cellerne26,27. Polymyxin B samt andre kationiske peptider er rapporteret at binde LPS via negativt opladet lipid A28. Da opløsningsmidlets eksponerede overflade af S100A12 også indeholder store negativt ladede pletter, kan den observerede reduktion af TNFα-frigivelse fra S100A12-stimuleret humane monocytter ved tilstedeværelse af polymyxin B (figur 3b) skyldes a) uspecifik direkte binding af polymyxin b til S100A12 og/eller B) direkte virkninger af polymyxin b på stimulerede celler26,27. På grund af de kendte begrænsninger af både påvisning af lav-niveau endotoksin forurening samt uspecifikke polymyxin B effekter, vores protokol indeholder yderligere en varme inaktiverings trin til klart at skelne mellem LPS-og protein-medieret TLR4-signalering.
Brug af LPS-fri S100A12 til generering og rensning af definerede ion-inducerede oligomerer er kritisk, og der bør lægges ekstra vægt på deres efterfølgende rensning for at undgå eventuel genindførelse af endotoksin via buffere eller kolonne materiale og dermed yderligere protein krævende LPS-udtynding via endotoksin fjernelse harpiks.
Oligomeriserings relevans for proteiners biologiske funktion kan vurderes på forskellige måder. I tilfælde af S100A12 brugte vi overflade Plasmon resonans samt målrettede aminosyre udvekslinger på ion-bindingssteder og-til mest præcist at definere det protein-kompleks, der kunne binde og signalere gennem TLR4-vi beskæftigede kemisk binding af ca2 +/Zn2 + -pulseret rekombinant S100A1216. Kemisk binding af S100A12 under forskellige Ioniske forhold snap-fryser en momentan tilstand, herunder flere oligomeriske former, der er i forandring. Fra iontitrerings forsøg definerede vi betingelser, hvorunder dikemer, tetrameric eller hexameriske oligomerer kunne bestemmes som de fremherskende oligomerer16. Desuden har tidligere eksperimenter vist, at et overskud af ioner er gavnlig for sammenlignelig, stabil tværbinding og efterfølgende rensning, selv om oligomerisering også kan induceres ved signifikant lavere ionkoncentrationer. Men rensning af disse oligomerer ved størrelses udelukkelse kromatografi resulterer i god, men ikke absolut adskillelse. Den selektive berigelse af oligomerer giver dog mulighed for pålidelige downstream-analyser.
Sammenfattende, denne protokol giver en metode til rensning af LPS-fri Human S100A12 eller beslægtede calcium bindende proteiner. At fastsætte ion-induceret konformationsmæssige ændringer, kemisk binding og efterfølgende kompleks adskillelse af størrelses-udelukkelse kromatografi er et nyttigt redskab til at forstå relevansen af protein oligomerisering for downstream biologiske processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra det murene innovative Medical Research program fra Muenster University Medical Faculty (KE121201 to C.K.) og den tyske Research Foundation (DFG, Fo354/3-1 til D.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha - OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/mL) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
References
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
- Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
- Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
- Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
- Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).
- Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
- Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
- Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
- Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
- Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
- Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
- Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
- GE Healthcare. Strategies for Protein Purification. Handbook. , Freiburg, Germany. (2010).
- Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
- Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
- Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
- Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
- Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
- Endotoxin Removal. Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
- Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
- Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
- Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).
