Summary
इस प्रोटोकॉल पुनः संयोजक टैग मुक्त कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन S100A12 और मानव monocyte उत्तेजना परख के लिए अपने आयन प्रेरित oligomers के लिए एक शुद्धि विधि का वर्णन करता है.
Abstract
इस प्रोटोकॉल में, हम मानव कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन S100A12 और प्रतिरक्षा सेल उत्तेजनाओं के लिए Escherichia कोलाई संस्कृति से अपने आयन प्रेरित oligomers शुद्ध करने के लिए एक विधि का वर्णन. यह प्रोटोकॉल एक दो कदम क्रोमैटोग्राफी रणनीति पर आधारित है, जिसमें एक आयन-विनिमय क्रोमैटोग्राफी कॉलम पर प्रोटीन पूर्व-शुद्धि और हाइड्रोफोबिक-इंटरैक्शन कॉलम पर बाद में पॉलिश करने का चरण शामिल है। इस रणनीति प्रबंधनीय लागत पर उच्च शुद्धता और उपज के S100A12 प्रोटीन का उत्पादन. प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर कार्यात्मक परख के लिए अंतिम अवशेष endotoxin संदूषण सावधान निगरानी और आगे की सफाई कदम endotoxin मुक्त प्रोटीन प्राप्त करने की आवश्यकता है. एंडोटॉक्सिन संदूषण के बहुमत anion-exchange क्रोमैटोग्राफी द्वारा बाहर रखा जा सकता है। अवशिष्ट संदूषण को कम करने के लिए, यह प्रोटोकॉल केन्द्रापसारक फ़िल्टर के साथ एक हटाने के चरण का वर्णन करता है। उपलब्ध आयन शक्ति S100A12 के आधार पर विभिन्न homomultimers में व्यवस्था कर सकते हैं. संरचना और समारोह के बीच संबंधों की जांच करने के लिए, इस प्रोटोकॉल आगे S100A12 प्रोटीन के आयन उपचार का वर्णन करता है उसके बाद रासायनिक crosslinking S100A12 oligomers और आकार-निष्कर्ष द्वारा उनके बाद जुदाई को स्थिर करने के लिए क्रोमैटोग्राफी. अंत में, हम एक सेल आधारित परख है कि शुद्ध प्रोटीन की जैविक गतिविधि की पुष्टि करता है और LPS मुक्त तैयारी की पुष्टि का वर्णन.
Introduction
S100A12 एक कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन है जो मुख्य रूप से मानव granulocytes द्वारा उत्पादित है. प्रोटीन (प्रणालीगत) सूजन और उसके सीरम के स्तर के दौरान overexpressed है, विशेष रूप से (ऑटो) भड़काऊ रोगों जैसे प्रणालीगत किशोर अज्ञातहेतुक गठिया (sJIA), पारिवारिक भूमध्य बुखार (FMF) या कावासाकी रोग (KD) के बारे में सूचित कर सकते हैं रोग गतिविधि और चिकित्सा के लिए प्रतिक्रिया. पैटर्न मान्यता रिसेप्टर्स (पीआरआर) जैसे टोल-जैसे रिसेप्टर्स (TLRs) के आधार पर, जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली रोगजनक-संबद्ध आणविक पैटर्न (पीएएमपी) जैसे lipopolissaccharides (LPS) या क्षतिग्रस्त संबंधित आणविक पैटर्न (DAMPs; इसे 'अलार्मिन्स' भी कहा जाता है। DAMPs कोशिकीय प्रोटीन, लिपिड या न्यूक्लिक एसिड1जैसे अंतर्जात अणु हैं। DAMP-कार्यअच्छी calgranulin प्रोटीन परिवार के सदस्यों के लिए अच्छी तरह से वर्णित हैं, S100A8/A9 और S100A122, जो भी divalent धातु आयन-चेलेटिंग एंटीमाइक्रोबियल पेप्टाइड्स3,4, के रूप में संचालित करने के लिए सूचित कर रहे हैं 5,6. उपलब्ध आयन शक्ति S100A12 पर निर्भर करता है, S100 परिवार के अन्य सदस्यों की तरह कर सकते हैं, विभिन्न homomultimers में व्यवस्था और हाल ही में जब तक PRR-इंटरैक्शन पर S100A12-ओलिगोमेरण के प्रभाव, विशेष रूप से TLR4, अज्ञात था.
प्रोटीन के monomeric रूप (92 एमिनो एसिड, 10.2 kDa) दो EF हाथ हेलिक्स-लूप-हेलिक्स संरचनाओं के होते हैं एक लचीला linker द्वारा जुड़े. सी-टर्मिनलEF-hand में क्लासिकल Ca2+-बाइंडिंग आकृति शामिल है, जबकि N-टर्मिनलEF-hand एक S100 प्रोटीन-विशिष्ट विस्तारित लूप संरचना ('pseudo-EF-hand') को दर्शाती है और कम Ca2+-एफ़िनिटी का पता चलता है। Ca2 +- S100A12 द्वारा बाध्यकारी प्रोटीन 'सी-टर्मिनस, जो प्रत्येक मोनोमर पर एक हाइड्रोफोबिक पैच के जोखिम में परिणाम में एक प्रमुख अनुरूप परिवर्तन प्रेरित कर सकते हैं और dimerization इंटरफ़ेस रूपों. इस प्रकार, शारीरिक परिस्थितियों के तहत, S100A12 द्वारा गठित सबसे छोटी चतुष्क संरचना एक गैर-सहसंयोजक dimer (लगभग 21 केडीए) जिसमें व्यक्तिगत monomers antiparallel अभिविन्यास में हैं. जब dimer के रूप में व्यवस्था की, S100A12 सेक्यूलर n2 + के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अन्य divalent धातु आयनों, जैसे, Cu2 + उच्च संबंध7के साथ सूचित किया जाता है। इन आयनों को एस 100ए12 डाइमर अंतराफलक में एमिनो एसिड ्सएच15 तथा एक उपइकाई तथा एच 85 के साथ-साथ अन्य उपइकाई8,9,10के एच 89 के एमिनो एसिडों H15 तथा D25 के साथ-साथ H89 में समन्वित किया जाता है । जबकि पहले के अध्ययनों का प्रस्ताव है कि n2 +-लोडS12 होमो-tetramers (44 kDa) में प्रोटीन के संगठन प्रेरित कर सकते हैं और वृद्धि हुई Ca2 +-affinity11,12, हाल ही में धातु अनुमापन में परिणाम अध्ययन6 सुझाव Ca2 +-s100A12 द्वारा बाध्यकारी करने के लिए $n 2+के लिए प्रोटीन की आत्मीयता बढ़ाने के लिए . एक बार S100A12 EF-हाथों पूरी तरह से Ca2 +द्वारा कब्जा कर रहे हैं, अतिरिक्त Ca2 + dimers के बीच बाँध करने के लिए सोचा है, hexamer गठन ट्रिगर (लगभग 63 kDa). हेक्सामेरिक क्वार्टरनारी संरचना की वास्तुकला टेट्रामर से स्पष्ट रूप से भिन्न है। यह प्रस्ताव है कि टेट्रामर इंटरफेस को नए डाइमर-डिमर इंटरफेस को जन्म देने के लिए बाधित किया जाता है जो हेक्सामेर गठन10को लाभ पहुंचाता है। S100A12 लगभग विशेष रूप से मानव granulocytes द्वारा व्यक्त की है, जहां यह सभी साइटोसोलिक प्रोटीन13के बारे में 5% का गठन . अपने DAMP समारोह में S100A12 ऐतिहासिक उन्नत ग्लाइकेशन अंत उत्पादों (RAGE) के लिए बहु-लिगंड रिसेप्टर के एगोनिस्ट के रूप में वर्णित किया गया था, तो अतिरिक्त कोशिकीय नव पहचान RAGE बाध्यकारी प्रोटीन (EN-RAGE)14कहा जाता है. Albeit हम पहले दोनों RAGE और TLR415के लिए जैव रासायनिक S100A12 बाध्यकारी की सूचना दी, हम हाल ही में मानव monocytes का प्रदर्शन करने के लिए एक TLR4 पर निर्भर तरीके से16में S100A12 उत्तेजना का जवाब . इसके लिए S100A12 की व्यवस्था की आवश्यकता है इसके Ca2+/n2 +-प्रेरित हेक्सामेरिक तिमाही संरचना16में ।
यहाँ हम पुनः संयोजक मानव S100A12 और प्रतिरक्षा सेल उत्तेजनाओं के लिए अपने आयन प्रेरित oligomers के लिए एक शुद्धि प्रक्रिया का वर्णन16,17. यह एक दो कदम क्रोमैटोग्राफी रणनीति पर आधारित है, जो शुरू में एक anion विनिमय स्तंभ को अलग करने और प्रोटीन ध्यान केंद्रित करने और थोक संदूषण को दूर करने के लिए भी शामिल है (उदा., endotoxins /lipopolysaccharides)18. आयन विनिमय क्रोमैटोग्राफी रेजिन अलग-अलग शुद्ध सतह शुल्क के आधार पर अलग प्रोटीन। S100A12 की तरह अम्लीय प्रोटीन के लिए (5.81 के isoelectric बिंदु), 8.5 के पीएच के साथ एक बफर प्रणाली और एक मजबूत anion विनिमय राल एक अच्छा जुदाई की ओर जाता है. बाउंड प्रोटीन एक उच्च नमक बफर ढाल के साथ eluted थे. एल्यूशन बफर में आयनिक शक्ति नकारात्मक आयनों की वृद्धि के साथ राल की सतह पर शुल्क के लिए प्रोटीन के साथ प्रतिस्पर्धा करते हैं। प्रोटीन व्यक्तिगत रूप से अपने शुद्ध प्रभारी के आधार पर और उसके परिणाम स्वरूप, यहाँ वर्णित बफ़र्स को अलग करने और overexpressed S100A12 प्रोटीन ध्यान केंद्रित करने की अनुमति देते हैं. लिपोपॉलिसैकेराइड में ऋणावेशित समूहों के कारण, ये अणु ओनियन-विनिमय रेजिन से भी बांधते हैं। तथापि, उनके उच्च निवल आवेश के परिणामस्वरूप बाद में अनुप्रयुक्त उच्च लवण प्रवणता में निरूपित हो जाता है। शुद्धीकरण प्रक्रिया का दूसरा चरण पॉलिश करने के उद्देश्यों के लिए शुरू किया गया है। यह S100A12 के कैल्शियम बाध्यकारी क्षमता का उपयोग करता है और एक हाइड्रोफोबिक-इंटरैक्शन कॉलम पर शेष अशुद्धियों को हटा देता है। S100A12 के कैल्शियम बाध्यकारी एक अनुरूप परिवर्तन और प्रोटीन की सतह पर हाइड्रोफोबिक पैच के एक जोखिम की ओर जाता है. उस हालत पर, S100A12 राल के हाइड्रोफोबिक सतह के साथ सूचना का आदान-इन. EDTA द्वारा कैल्शियम-chelating पर, इस बातचीत उलट है. आयनों की उपस्थिति में, विशेष रूप से कैल्शियम और जस्ता, S100A12 homomeric oligomers में व्यवस्था. विभिन्न ओलिगोमर की संरचना-फ़ंक्शन संबंधों का अध्ययन करने के लिए, हम एक रासायनिक क्रॉसलिंकर के साथ डिमेरिक, टेट्रामेरिक और हेक्सामेरिक पुनः संयोजक S100A12 स्थिर हो गए और एक आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी कॉलम पर परिसरों को अलग कर दिया। अंत में, शुद्ध प्रोटीन और उसके आयन प्रेरित oligomers की कार्यक्षमता और जैविक गतिविधि का विश्लेषण करने के लिए, S100A12 के cytokine रिलीज और एलपीएस प्रेरित monocyte तुलना की जा सकती है.
S100A12 को शुद्ध करने के लिए विभिन्न तरीकों अब तक वर्णित किया गया है. जैक्सन एट अल19, उदाहरण के लिए, एक anion विनिमय स्तंभ और बाद में आकार बहिष्कार क्रोमैटोग्राफी के माध्यम से शुद्धि के साथ एक प्रोटोकॉल प्रकाशित किया. एक आकार-निष्कर्ष स्तंभ पर शुद्धीकरण पॉलिश करने से अच्छे परिणाम प्राप्त होते हैं, लेकिन उदाहरण के लिए सीमित लोडिंग वॉल्यूम के कारण यह मापनीयता में कम लचीला होता है। Kiss et al.20द्वारा प्रकाशित एक अलग दृष्टिकोण, Ni2 + आत्मीयता कॉलम के माध्यम से टैग किए गए प्रोटीन की शुद्धि का वर्णन पहले शुद्धि कदम के रूप में, एंजाइमी दरार द्वारा पीछा टैग और आगे शुद्धि कदम को दूर करने के लिए. पहले से किए गए अध्ययनों के विपरीत19,20, इस प्रोटोकॉल में वर्णित उत्पादित प्रोटीन प्रतिरक्षा कोशिकाओं पर प्रयोगों के लिए निर्धारित किया जाता है। इसलिए, जीवाणु संस्कृति से अवशेष एंडोटॉक्सिन संदूषण एक चुनौती है। यद्यपि एंडोटॉक्सिन हटाने के लिए विभिन्न दृष्टिकोणों का अब तक वर्णन नहीं किया गया है , फिर भी ऐसी कोई एक समान विधि नहीं है जो किसी भी प्रोटीन समाधान21,22के लिए समान रूप से अच्छी तरह से कार्य करती है .
संक्षेप में, हमारे प्रोटोकॉल कुशल endotoxin हटाने और शुद्ध प्रोटीन की उच्च उपज के साथ एक जीवाणु प्रणाली में एक टैग मुक्त अभिव्यक्ति के फायदे को जोड़ती है.
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Protocol
नोट: बफ़र्स और स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए पूरक तालिका 1 देखें।
1. ई. कोलाई में प्रोटीन अभिव्यक्ति
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क्लोनिंग
- क्लोन टैग मुक्त मानव S100A12 (NCBI संदर्भ अनुक्रम: NP ]005612.1) जीवाणु अभिव्यक्ति वेक्टर pET11b में. प्रोटीन व्यक्त करने के लिए, ई. कोलाई BL21 (DE3) में निर्माण को बदलना.
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संस्कृति
- एक 14 एमएल गोल-नीचे ट्यूब में 5 एमएल विकास माध्यम (एलबी शोरबा 100 ग्राम/एमएल एम्फिसिलिन के साथ) में एक एकल कॉलोनी को टीका लगाकर एक स्टार्टर संस्कृति तैयार करें। 220 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट। एक 2 एल Erlenmayer फ्लास्क में विकास के माध्यम के 400 एमएल में रात भर संस्कृति के 2 डिग्री 4 एमएल स्थानांतरण और 220 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति incubate।
नोट: मुख्य संस्कृति का प्रारंभिक घनत्व 600 दउ (ओड600) पर ऑप्टिकल घनत्व होना चाहिए। - विकास के दौरान OD600 की निगरानी करें। 1 M isopropyl-जेड-डी-थायोगालैक्टोपाइरानोसिड (IPTG) के अलावा 1 mM की अंतिम सांद्रता के लिए प्रोटीन अभिव्यक्ति को प्रेरित करता है OD600 पर $ 0.5 $0.6. अतिरिक्त 4 ज के लिए 37 डिग्री सेल्सियस और 220 आरपीएम पर इनक्यूबेट।
नोट: सामान्य तौर पर, 0.6 का एक OD600 37 डिग्री सेल्सियस पर 1.5 डिग्री 2.5 एच के बाद पहुँचा जाएगा। - 50 एमएल ट्राइस, 50 एमएम नैक्ल और 1 मीटर एथिलीनडायमिन टेट्राऐसीटिक एसिड (EDTA) को 40 एमएल में डिओनीकृत पानी में भंग करके 50 एमएल sonication बफर तैयार करें। एचसीएल के साथ पीएच को 8.0 तक समायोजित करें और 50 एमएल तक बनाएं। प्रोटीज़ अवरोधक जोड़ें (1 गोली प्रति 50 एमएल समाधान) और बफर को 4 डिग्री सेल्सियस तक बराबर करें।
- जीवाणु संस्कृति को उपयुक्त अपकेंद्रित्र की बोतलों में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को 30 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 3,200 x ग्राम पर फसल करें। सुपरनेंट को छोड़ दें और बर्फ-ठंडा sonication बफर के 25 एमएल में गोली को फिर से शुरू करें। इसके बाद कोशिकाओं को बर्फ पर रखें।
नोट: निलंबित कोशिकाओं को अल्पकालिक के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर और लंबी अवधि के लिए -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।
- एक 14 एमएल गोल-नीचे ट्यूब में 5 एमएल विकास माध्यम (एलबी शोरबा 100 ग्राम/एमएल एम्फिसिलिन के साथ) में एक एकल कॉलोनी को टीका लगाकर एक स्टार्टर संस्कृति तैयार करें। 220 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर रात में इनक्यूबेट। एक 2 एल Erlenmayer फ्लास्क में विकास के माध्यम के 400 एमएल में रात भर संस्कृति के 2 डिग्री 4 एमएल स्थानांतरण और 220 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर संस्कृति incubate।
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Sonication/lysis
- बर्फ पर 30 s के 6 चक्र के लिए कोशिकाओं Sonicate. प्रत्येक चक्र के बाद, कोशिकाओं को ओवरहीटिंग से बचाने के लिए 30 डिग्री 60 एस के लिए बाकी कोशिकाओं।
- सेल निलंबन को एक पूर्व ठंडा 50 एमएल उच्च गति सेंट्रीफ्यूगेशन ट्यूब और एक निश्चित कोण रोटर में अपकेंद्रित्र को 30 मिनट के लिए 30 मिनट पर 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थानांतरित करें। एक ताजा 50 एमएल ट्यूब में घुलनशील साइटोसोलिक प्रोटीन होता है जो मंजूरी दे दी lysate decant और गोली त्यागें.
2. प्रोटीन शोधन
- अनियन-विनिमय वर्णलेखिकी
- डायलिसिस
- 20 एमएम ट्राइस, 1 एमएम एटेट और 1 एमएम एथिलीन ग्लाइकोल-बिस (2-एमिनोएथिलथेर)-एन,एन,एन,एन',एन'-टेट्रासेटिक एसिड (ईजीटीए) को डिलिजन्ड वाटर में भंग करके और एचसीएल के साथ 8.5 को पीएच को समायोजित करके एआईएन-एक्सईएक्स बफर तैयार करें। डायलिसिस के लिए तैयार 2 x 5 एल और क्रोमैटोग्राफी के लिए 2x 1 एल AIEX बफर ए.
नोट: डायलिसेट वॉल्यूम पर होना चाहिए के बारे में 100 बार नमूना मात्रा. क्रोमैटोग्राफी के लिए इस्तेमाल किया सभी बफ़र्स फ़िल्टर किया जाना चाहिए (0.45 मीटर या छोटे) और degassed (उदाहरण के लिए, अल्ट्रासोनिक स्नान या वैक्यूम degassing द्वारा)। - डायलिसिस ट्यूबिंग कट (आण्विक वजन कट-ऑफ [MWCO]: 3.5 kDa) हवा के लिए अतिरिक्त स्थान के साथ एक उचित लंबाई में घूर्णन हलचल पट्टी के ऊपर नमूना उछाल सुनिश्चित करने के लिए।
नोट: ग्लिसरोल झिल्ली को बरकरार रखता है और उपयोग करने से पहले हटाया जाना चाहिए। - चरण 1.3.2 से स्वीकृत प्रोटीन समाधान की चिपचिपापन को कम करने के लिए, क्रोमैटोग्राफी कॉलम के बाद के आवेदन को सुविधाजनक बनाने के लिए एआईईएक्स बफर ए के 25 एमएल के साथ समाधान को पतला करें। ट्यूबिंग पर पहले बंद संलग्न, झिल्ली में नमूना लोड और ट्यूबिंग के शीर्ष अंत से कम से कम 1 सेमी दूसरे बंद देते हैं.
- AIEX बफर ए के साथ 5 एल कंटेनर एक हलचल प्लेट पर रखें, एक हलचल पट्टी और प्रोटीन समाधान से भरा झिल्ली जोड़ें। घूर्णन हलचल-बार के साथ हस्तक्षेप से बचने के द्वारा नमूना बारी बारी से करने के लिए गति समायोजित करें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 12 डिग्री 24 एच के लिए Dialyze, तो एक ताजा पूर्व ठंडा तैयारी से डायलिसेट बफर (AIEX बफर ए) की जगह और कम से कम 4 अतिरिक्त घंटे के लिए जारी है। एक 50 एमएल ट्यूब के लिए dialyzed प्रोटीन समाधान स्थानांतरण और एक 0.45 डिग्री मीटर फिल्टर इकाई के माध्यम से फिल्टर.
नोट: संग्रहण संभव है.
- 20 एमएम ट्राइस, 1 एमएम एटेट और 1 एमएम एथिलीन ग्लाइकोल-बिस (2-एमिनोएथिलथेर)-एन,एन,एन,एन',एन'-टेट्रासेटिक एसिड (ईजीटीए) को डिलिजन्ड वाटर में भंग करके और एचसीएल के साथ 8.5 को पीएच को समायोजित करके एआईएन-एक्सईएक्स बफर तैयार करें। डायलिसिस के लिए तैयार 2 x 5 एल और क्रोमैटोग्राफी के लिए 2x 1 एल AIEX बफर ए.
- क्रोमैटोग्राफी
- सामान्य रखरखाव के साथ तरल क्रोमैटोग्राफी सिस्टम (FPLC) शुरू, कॉलम बफ़र्स AIEX A और AIEX बी (AIEX बफर A के साथ 1 एम NaCl) और आयन विनिमय राल युक्त कॉलम कनेक्ट करें। सामान्य क्रोमैटोग्राफी पैरामीटर के लिए तालिका 1 देखें.
नोट: बफ़र्स, कॉलम और एफपीएलसी उपकरण रन शुरू करने से पहले एक ही तापमान पर समान होना चाहिए (तालिका 1, तालिका 2, तालिका 3 , तालिका 4, और तालिका 5में वर्णलेखीय पैरामीटरों को देखें)। - AIEX बफर A के साथ स्तंभ को समान करें, बाद में नमूना को कॉलम पर लोड करें और एक रेखीय ढाल के साथ प्रोटीन को 0% से 100% उच्च-लवण बफर (AIEX B) से पतला करें। विस्तृत विधि प्रोटोकॉल के लिए तालिका 2 देखें.
- एलुशन के दौरान 2 एमएल अंश एकत्र करें और एक कोमासी-सना हुआ 15% सोडियम डोडिसिल सल्फेट पॉलीऐक्रिलमाइड जेल इलेक्ट्रोफोरोसिस (एसडीएस-पेज) पर प्रत्येक अंश के 10 डिग्री सेल्सियस का विश्लेषण करें। डायलिसिस के लिए S100A12 प्रोटीन युक्त भिन्नों पूल.
नोट: S100A12 के आणविक वजन 10,575 दा है.
- डायलिसिस
- कैल्शियम पर निर्भर हाइड्रोफोबिक-इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी (एचआईसी)
- डायलिसिस
- 20 एमएम ट्राइस, 140 एमएम नैकल, पीएच 7.5 के खिलाफ प्रोटीन समाधान को धारा 2.1.1 में वर्णित प्रक्रिया का पालन करते हुए।
- क्रोमैटोग्राफी
- 20 एमएम ट्राइस, 140 एमएम नैकल और 25 एमएम केसीएल2 को डिओनीकृत पानी में भंग करके क्रोमैटोग्राफी बफर एचआईसी ए के 1 एल तैयार करें और पीएच को 7.5 में समायोजित करें। एचआईसी बफर बी के लिए, 20 एमएम ट्राइस, 140 एमएम नैकल और 50 एमएम एडीसीटीए को भंग करें। 7.0 करने के लिए पीएच समायोजित करें और बफ़र्स degas. 25 MM की एक अंतिम एकाग्रता के लिए नमूने के लिए CaCl2 जोड़ें और 0.45 डिग्री मीटर के माध्यम से फिल्टर। बराबर HIC बफ़र्स और नमूना करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस (स्तंभ तापमान) के लिए।
- सामान्य रखरखाव के साथ तरल क्रोमैटोग्राफी सिस्टम प्रारंभ करें, स्तंभ बफ़र्स HIC A और B और स्तंभ कनेक्ट करें. आगे क्रोमैटोग्राफी पैरामीटर के लिए तालिका 3 को देखें।
- स्तंभ बराबर, नमूना लोड और यूवी संकेत फिर से आधाररेखा स्तर तक पहुँच जाता है जब तक 'धोने अनबाउंड नमूना' ब्लॉक का विस्तार। फिर बफर (EDTA) युक्त एक कैल्शियम chelator के साथ elution शुरू करते हैं. विस्तृत विधि प्रोटोकॉल के लिए तालिका 4 को देखें।
नोट: पिछले प्रयोगों से पता चला है कि कैल्शियम की एक अतिरिक्त क्रोमैटोग्राफी राल के लिए S100A12 के बंधन के लिए फायदेमंद लगता है. - 2 एमएल के शिखर अंश ोंलीजिए और एक Coomassie-सना हुआ 15% एसडीएस-पेज पर प्रत्येक अंश के 10 डिग्री सेल्सियस का विश्लेषण। पूल शुद्ध S100A12 भिन्न और Hepes-बफर नमकीन के खिलाफ dilyze (HBS; 20 एमएम Hepes, 140 m NaCl, पीएच 7.0) के रूप में अनुभाग 2.1.1 में वर्णित है.
नोट: एकमेरिक S100A12 के विलुप्त गुणांक 2980 M-1 सेमी-1है।
- डायलिसिस
3. एंडोटॉक्सिन का पता लगाने और हटाने
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एंडोटॉक्सिन का पता लगाना
- endotoxin संदूषण का निर्धारण करने के लिए, कदम से पतला प्रोटीन की सांद्रता को मापने 2.2.2.4. (जैसे, 1:10 और 1:100 HBS में) एक एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) आधारित, फ्लोरोसेंट एंडोटॉक्सिन का पता लगाने परख(सामग्री की तालिका) काउपयोग कर। निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करके इस परख निष्पादित करें।
नोट: बफर द्वारा (नया) endotoxin संदूषण से बचने के लिए ultrapure deionized पानी में भंग ताजा तैयार HBS समाधान का प्रयोग करें।
- endotoxin संदूषण का निर्धारण करने के लिए, कदम से पतला प्रोटीन की सांद्रता को मापने 2.2.2.4. (जैसे, 1:10 और 1:100 HBS में) एक एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोर्बेंट परख (एलिसा) आधारित, फ्लोरोसेंट एंडोटॉक्सिन का पता लगाने परख(सामग्री की तालिका) काउपयोग कर। निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करके इस परख निष्पादित करें।
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एंडोटॉक्सिन और प्रोटीन की एकाग्रता को हटाना
- लगभग 10 मिनट के लिए 3,200 x ग्राम और 10 डिग्री सेल्सियस पर 50 केडीए केन्द्रापसारक फिल्टर यूनिट और अपकेंद्रण पर नमूना के 15 एमएल लोड करें। प्रवाह को एक ताजा पोत (बर्फ पर) में स्थानांतरित करें और फिर से भरना और 50 केडीएच फिल्टर ट्यूब को आवश्यक के रूप में 50 केडीए फिल्टर ट्यूब को स्थानांतरित करें। प्रत्येक चरण के बाद जितना संभव हो उतना प्रोटीन पुनर्प्राप्त करने के लिए एचबीएस के साथ फिल्टर झिल्ली को दो बार धोएं।
- S100A12 युक्त प्रवाह के माध्यम से एक 3 kDa केन्द्रापसारक फिल्टर का उपयोग करके ध्यान केंद्रित जब तक मात्रा प्रारंभिक लोड हो रहा है मात्रा के एक दसवें करने के लिए एक पांचवें तक कम है (लगभग 30 मिनट के लिए 3,200 x g,10 डिग्री सेल्सियस पर केंद्रीकरण). आवश्यकताके रूप में अक्सर के रूप में फिल्टर फिर से भरना, झिल्ली कुल्ला और प्रत्येक फिर से भरना के बाद एक नई ट्यूब के लिए केंद्रित समाधान हस्तांतरण. प्रवाह के माध्यम से छोड़ें. ऊपर वर्णित के रूप में 50 kDa के माध्यम से फिर से फ़िल्टर करें.
नोट: इस प्रक्रिया के दौरान, प्रोटीन की हानि उल्लेखनीय है (अप करने के लिए 50%), लेकिन शेष प्रोटीन तैयारी पूरी तरह से एलपीएस से समाप्त हो गया है. इस विधि के बारे में पैदावार 10-15 मिलीग्राम प्रोटीन से 400 एमएल संस्कृति. - एंडोटॉक्सिन मुक्त एचबीएस के साथ 1 mg/mL करने के लिए प्रोटीन समाधान समायोजित करें और चरण 3.1.1 में वर्णित के रूप में एलपीएस सामग्री को मापने। मामले में प्रोटीन समाधान अभी भी LPS मुक्त के रूप में परीक्षण नहीं किया है ([lt;0.1 यूरोपीय संघ / mL), एक endotoxin हटाने राल का उपयोग करके अवशेष संदूषण को खत्म.
नोट: 1 मिलीग्राम/एमएल की प्रोटीन सांद्रता के साथ, 0.1 EU/एमएल एलपीएस का संदूषण लगभग 0.01 pg LPS/जेडजी प्रोटीन के बराबर होता है।
4. रासायनिक क्रॉसलिंकिंग और ओलिगोमर पृथक्करण
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रासायनिक क्रॉसलिंकिंग
- अतिशुद्ध deionized पानी में 1 एम CaCl2 और 100 m nCl2 के अत्यधिक शुद्ध (endotoxin मुक्त) शेयर समाधान तैयार करें(सामग्री की तालिका)। इस बफर का प्रयोग करें, हौसले से बनाया, अगले चरण के लिए.
- शुद्ध endotoxin मुक्त S100A12 के 10 एमएल इनक्यूबेट (केंद्र 1 HBS में 1 mg/mL) कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए (आरटी) या तो 25 एम एम CaCl2 के लिए dimeric/tetrameric, या 25 एम एम CaCl2 और 1 एम एम nCl2 के लिए hexameric/ ऑलिगोमर्स।
- उपयोग से पहले सीधे 500 डिग्री सेल्सियस एंडोटॉक्सिन मुक्त पानी में बीएस 3 की 8 मिलीग्राम बीएस3 को भंग करके क्रॉसलिंकर तैयार करें (8 मिलीग्राम क्रॉसलिंकर 10 एमएल आयन-स्पिक प्रोटीन समाधान के लिए 1.4 एम की अंतिम सांद्रता के बराबर होता है)। मिश्रण crosslinker और RT पर अतिरिक्त 30 मिनट के लिए incubate द्वारा नमूना. 1 एम Tris-HCl, पीएच 7.5 50 m M की एक अंतिम एकाग्रता के लिए जोड़कर प्रतिक्रिया को पंक्तिबद्ध करें और 0.45 डिग्री के माध्यम से फिल्टर.
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आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी
- क्रॉसलिंक किए गए नमूने को 12 डिग्री 15 डिग्री सेल्सियस (स्तंभ तापमान) के बराबर करें और सामान्य रखरखाव के साथ तरल क्रोमैटोग्राफी सिस्टम शुरू करें। कनेक्ट स्तंभ बफ़र (HBS) और आकार-बहिष्करण स्तंभ। विस्तृत जानकारी के लिए तालिका 5 देखें.
- HBS में स्तंभ बराबर, नमूना लोड और रन के दौरान पीक भिन्न (1 डिग्री 2 एमएल) इकट्ठा। वांछित प्रोटीन परिसर के प्रमुख बैंड के साथ एक 4 डिग्री 20% ढाल एसडीएस-पेज और पूल अंशों पर इन अंशों का विश्लेषण करें।
नोट: जलीय समाधान में बी एस3 की तरह एनएचएस एस्टर अभिकर्मकों के हाइड्रोलिसिस 280 एनएम पर एक मजबूत अवशोषण में परिणाम है। अनबाउंड क्रॉसलिंकर (आण्विक भार: 572 ग्राम/मोल) रन के अंत में elutes और एक मजबूत चोटी में परिणाम. - 10 केडीए (डिमर), 30 केडीए (टेट्रामर) या 50 केडीए (हेक्सामेर) के MWCOs के साथ केन्द्रापसारक फिल्टर इकाइयों का उपयोग करके समाधान ोंकेंद्रित। खंड 3.1 में वर्णित के रूप में endotoxin संदूषण निर्धारित करते हैं. यदि आवश्यक हो, निर्माता की सिफारिशों के बाद एक endotoxin हटाने राल के साथ शेष एलपीएस निकालें(सामग्री की तालिका).
5. मोनोसाइट्स पर कार्यात्मक परीक्षण
- मोनोसाइट्स तैयार करना
- एक चुंबकीय मनका जुदाई किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन और बाद में मोनोसाइट संवर्धन द्वारा मानव भोंके कोट से एककोशिका ओंकारता ।
नोट: इस प्रोटोकॉल में परिणाम होगा लगभग 5 "7 x 107 monocytes (एक buffy कोट) 83 की शुद्धता के साथ 95%. संख्या के बाद से, लेकिन यह भी कोशिकाओं की जवाबदेही दाता पर दृढ़ता से निर्भर करता है, प्रोटोकॉल को बढ़ाया जा सकता है (आवश्यक सेल गिनती के आधार पर). - घनत्व अपकेंद्रण के लिए पृथक्करण विलयन (घनत्व $ 1ण्077 ग्राम/एमएल) को आरटी में विभाजित करें तथा 20 एमएल को 50 एमएल अपकेंद्रित्र ट्यूबों (2 ट्यूब प्रति बफी कोट) में स्थानांतरित कर दें। हांक के बफर नमक समाधान (HBSS) के साथ मानव buffy कोट से रक्त को 60 एमएल की कुल मात्रा और इस मिश्रण की परत 30 एमएल को जुदाई माध्यम के शीर्ष पर ध्यान से पतला करें। आरटी पर 35 मिनट के लिए 550 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज अपकेंद्रण ब्रेक को अक्षम करें।
- अपकेंद्रण के बाद, मोनोन्यूक्लियर परिधीय रक्त कोशिकाओं (पीबीएमसी) सीधे जुदाई माध्यम के शीर्ष पर स्थित हैं। इन कोशिकाओं को एक ताजा 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें, एचबीएस के साथ 50 एमएल तक बनाएं, और 10 मिनट के लिए 170 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र बनाएं। सुपरनेंट को श्वास लें और एचबीएसएस की एक छोटी मात्रा में सेल गोली को पाइपिंग द्वारा पुन: तैयार करें।
- ट्यूब को 50 एमएल तक भरें और 10 मिनट के लिए 290 x ग्राम पर अपर्णा करें। सुपरनेंट को फिर से प्रेरित करें, एचबीएस (50 एमएल) में कोशिकाओं को फिर से भर दें और 10 मिनट के लिए 170 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र ी को भरें। कोशिकाओं की गणना करें और उन्हें सेल जुदाई बफर में फिर से भर दें (सामग्री की तालिका) /c9]) की एकाग्रता के लिए 5 x 107 कोशिकाओं /
नोट: HBSS के बजाय, फॉस्फेट-बफर नमकीन (पीबीएस) कोशिकाओं को धोने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। - PBMCs से monocyte अलगाव के लिए, एक चुंबकीय नकारात्मक सेल अलगाव किट का उपयोग करें और निर्माता के प्रोटोकॉल का पालन करें. मोनोसाइट्स की गणना करें और मोनोसाइट माध्यम (आरपीएमआई 1640, 15% गर्मी-निष्क्रिय भ्रूण बछड़ा सीरम [एफसीएस], 4 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 100 यू/एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन) में 2 x 106 कोशिकाओं/
- संस्कृति monocytes के लिए, कोट संस्कृति व्यंजन (उदाहरण के लिए, 100 मिमी) एक हाइड्रोफोबिक, गैस पारगम्य फिल्म के साथ, निलंबन कोशिकाओं के लिए उपयुक्त(सामग्री की तालिका). लगभग 30 मिनट के लिए यूवी प्रकाश का उपयोग करके प्लेटों को स्टरलाइज़ करें। कोशिकाओं को इन संस्कृति प्लेटों में स्थानांतरित करें और उन्हें 37 डिग्री सेल्सियस और 5% ब्व्2पर रात भर आराम करने दें।
नोट: लेपित पकवान प्रति सेल निलंबन के 15 डिग्री 25 एमएल का उपयोग करें।
- एक चुंबकीय मनका जुदाई किट (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके घनत्व ढाल सेंट्रीफ्यूजेशन और बाद में मोनोसाइट संवर्धन द्वारा मानव भोंके कोट से एककोशिका ओंकारता ।
- मोनोसाइट उद्दीपन
- उत्तेजना के साथ S100A12 (जंगली प्रकार)
नोट: अनुपचारित S100A12 (अनुभाग 2.2.2 से अंत उत्पाद) को क्रॉसलिंक्ड प्रोटीन से अलग करने के लिए, निम्न में S100A12 को 'वाइल्डटाइप' के रूप में संदर्भित किया जाता है.- बाकी कोशिकाओं को 50 एमएल केन्द्रापसारक ट्यूब में स्थानांतरित करें और 10 मिनट के लिए 350 x ग्राम पर अपकेंद्रण करें और उत्तेजना माध्यम में सेल पेलेट को फिर से चालू करें (आरपीएमआई 1640, 5% गर्मी-इनएक्टिव्ड एफसीएस, 4 एमएम एल-ग्लूटामाइन, 100 यू/ स्ट्रेप्टोमाइसिन) 2 x 106 कोशिकाओं/एमएल की एकाग्रता पर।
- उत्तेजना के लिए, 24 अच्छी तरह से निलंबन प्लेटों का उपयोग करें और अच्छी तरह से प्रति सेल निलंबन के 250 $L जोड़ें (0.5 x 106 कोशिकाओं / इरादा कुओं में 50 ग्राम/एमएल पॉलीमाइक्सिन बी जोड़ें, इसके बाद विभिन्न सांद्रता (25, 50, 100 और 200 pg/mL) या वाइल्डटाइप S100A12 (10, 20, 40, 60 g/mL) में एलपीएस का पालन किया जाता है। इसके अलावा, कोशिकाओं के लिए विभिन्न सांद्रता में या तो अनुपचारित या गर्मी-विकृत (99 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) प्रोटीन लागू करें।
नोट: एक छोटी गर्मी उपचार denatures S100A12 प्रोटीन लेकिन LPS पर कोई प्रभाव नहीं करने के लिए कम है. - 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 एच के लिए इनक्यूबेट प्लेटें और 5% सीओ2. प्रत्येक कुएं के सेल निलंबन को 1.5 एमएल प्रतिक्रिया ट्यूबों में स्थानांतरित करके कोशिकाओं को फसलित करें। 10 मिनट के लिए 500 x ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज, सुपरनेट्स को ताजा ट्यूबों में स्थानांतरित करें और निर्माता की सिफारिशों के बाद एक मानव टीएनएफ एलासा किट के साथ विभिन्न कमजोर पड़ने (उदाहरण के लिए, 1:2, 1:5, 1:10) में टीएनएफ को मापें।
- उत्तेजना के साथ S100A12 oligomers
- ऊपर वर्णित के रूप में 24 अच्छी तरह से निलंबन प्लेटों में monocytes बाहर तैयार और बीज. कदम 4.2.3 से S100A12 oligomers जोड़कर कोशिकाओं को उत्तेजित. विभिन्न मोलर सांद्रता (125 एनएम, 250 एनएम, 500 एनएम, 1000 एनएम)।
नोट: monocytes को प्रोत्साहित करने के लिए विभिन्न oligomers की क्षमताओं की तुलना करने के लिए, oligomers तुलनीय मोलर सांद्रता में कोशिकाओं के लिए लागू किया गया. - 37 डिग्री सेल्सियस पर 4 एच के लिए इनक्यूबेट और 5% सीओ2, कोशिकाओं को काट लें और ऊपर बताए गए के रूप में supernatants में TNF को मापते हैं।
- ऊपर वर्णित के रूप में 24 अच्छी तरह से निलंबन प्लेटों में monocytes बाहर तैयार और बीज. कदम 4.2.3 से S100A12 oligomers जोड़कर कोशिकाओं को उत्तेजित. विभिन्न मोलर सांद्रता (125 एनएम, 250 एनएम, 500 एनएम, 1000 एनएम)।
- उत्तेजना के साथ S100A12 (जंगली प्रकार)
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Representative Results
एआईईएक्स कॉलम पर पूर्व-शुद्धि के बाद (चित्र 1ए -सी) और उसके बाद कैल्शियम पर निर्भर एच आईसी (चित्र 2ए, बी) अत्यधिक शुद्ध प्रोटीन प्राप्त किया गया था ( चित्र 2ब्) इसके अलावा, endotoxin के माप सफल LPS हटाने का पता चला. AIEX निम्नलिखित LPS सामग्री परख का पता लगाने की सीमा से ऊपर एक 1:10 कमजोर पड़ने में मापा गया था, यानी, ऊपर 500 यूरोपीय संघ / एक 50 kDa फ़िल्टर इकाई के माध्यम से पहले निस्पंदन के बाद, LPS सामग्री 1 EU/mL करने के लिए कम किया गया था। 50 केडीए के माध्यम से एक 3 केडीए फिल्टर यूनिट और अतिरिक्त निस्पंदन के साथ एकाग्रता के बाद, मापा एलपीएस संदूषण 0.08 यूरोपीय संघ /
एक अतिरिक्त नियंत्रण के रूप में, मानव monocytes उत्पादित wildtype प्रोटीन के साथ प्रेरित किया गया (चित्र 3ए, बी) . Polymyxin बी उपचार एलपीएस-उत्तेजित monocytes, जो S100A12 के साथ नहीं देखा जा सकता से TNF से रिहाई abrogates. दूसरी ओर, दोनों एलपीएस और S100A12 की गर्मी उपचार कोशिकाओं को प्रोत्साहित करने के लिए प्रोटीन की क्षमता को समाप्त, जबकि यह एलपीएस-उत्तेजना के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया को प्रभावित नहीं करता है.
विभिन्न आयनों के लिए प्रोटीन के संपर्क में विभिन्न S100A12 ओलिगोमर की व्यवस्था में परिणाम (चित्र 4ए) . रासायनिक crosslinking ऐसे dimers, tetramers, और hexamers के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संक्रमण राज्यों (जैसे, 'trimers', बैंड लगभग 30 kDa पर के रूप में परिभाषित परिसरों पर कब्जा करने की अनुमति देता है). क्रॉसलिंकिंग से पहले ओलिगोमर-समानता का स्पष्ट परिवर्तन करने के लिए आयनों की अधिकता लागू की गई (चित्र 4ठ)।
समान मोलर सांद्रता में पृथक अल्पाधिकारियोंकाप्रयोग तब मोनोसाइट उत्तेजना के लिए पीआरआर के माध्यम से संकेतन क्षमताओं की तुलना करने के लिए किया जाता था। हेक्सामेरिक एस100A12 के साथ मोनोसाइट-उत्तेजना के परिणामस्वरूप स्पष्ट टीएनएफ रिलीज (चित्र 6 ). अवशेष cytokine रिलीज tetrameric S100A12 के साथ प्रेरित कोशिकाओं से पता लगाया जा सकता है, जबकि dimeric प्रोटीन के साथ उपचार TNF ] रिलीज प्रेरित नहीं करता है.
चित्रा 1: आयन विनिमय क्रोमैटोग्राफी के परिणाम। (क) 280 एनएम (ए280) पर अवशोषण के साथ एक क्रोमैटोग्राम और एल्यूशन बफर बी (डैश्ड लाइन ) का प्रतिशत । तरीके ब्लॉक के साथ संकेत दिया जाता है ए - धोने असीम नमूना, बी - elution बफर के साथ रैखिक प्रवणता (बफर बी), ब् - बफर बी के साथ बाहर धोने, और डी - बफर ए में फिर से समानता(बी) लाल रंग में भिन्न ट्यूब संख्या के साथ प्रासंगिक चोटियों पर ध्यान केंद्रित. (ग)चयनित अंशों का विश्लेषण 15% कोमासी-सना हुआ एसडीएस-पेज पर किया गया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: हाइड्रोफोबिक-इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी के परिणाम। (क) 280 एनएम (ए280) पर अवशोषण के साथ एक क्रोमैटोग्राम और एल्यूशन बफर बी (डैश्ड लाइन ) का प्रतिशत । प्रबन्धक ए. (ठ)में बफर ए ( ठ ) में पुनः समानता के साथ ए - धुलाई अनबाउंड नमूना, ठ - ए ए ए ए ए ए ए के साथ-साथ संकेतित किए जाते हैं। (ग) 15% Coomasie-सना हुआ एसडीएस-पेज पर भिन्नों का विश्लेषण किया। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: प्राथमिक मानव monocytes संकेत सांद्रता पर प्रेरित किया गया. एलपीएस (ए) या S100A12 (जंगली प्रकार, बी) अनुपचारित या गर्मी denaturated (99 डिग्री सेल्सियस, 10 मिनट) छोड़ दिया गया था. दोनों स्थितियों की उपस्थिति और polymyxin बी की अनुपस्थिति में परीक्षण किया गया कृपया यहाँ क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए.
चित्रा 4: S100A12 प्रोटीन बीबीएस बफर में ऊष्मायन के बाद बी एस3 के साथ crosslinked किया गया था जिसमें 5 m Ca2 + और संकेत दिया n2 + सांद्रता. (ए) बढ़ाना $छ2+ सांद्रता को टेट्रामर और हेक्सामेसर में 4$20% कोमासी-सना हुआ एसडीएस-पेज पर अलग करने पर S100A12 की व्यवस्था को प्रेरित करता है। (बी)एक आकार बहिष्कार स्तंभ पर जुदाई के लिए इस्तेमाल किया शर्तों के साथ crosslinked oligomers के प्रतिनिधि परिणाम. S100A12 या तो 25 mM Ca2 + (लेन 1) या 25 m Ca 2+ और 1 m N n2 + (लेन 2) की उपस्थिति में crosslinked किया गया था. (S100A12) 2 ] डिमर; (S100A12) 4 ] टेट्रामर; (S100A12) 6 ] हेक्सामेनर। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: S100A12 oligomers एक आकार-बहिष्करण स्तंभ पर अलग किए गए थे। (क)एचबीएस बफर में 25 एम एम सी सीएल2 और 1 एम एम एन सीएल2के साथ क्रॉसलिंकिंग के बाद हेक्सामेअर/टेट्रामर पृथक्करण का क्रोमेटोग्राम । (ख) एचबीएस बफर में 25 एम सी एल2के साथ टेट्रामर/डिमर पृथक्करण के लिए क्रोमेटोग्राम . (ग)एक कोमासी पर अलगाव के बाद जमा और संकेंद्रित अल्पाधिकारियों का उदाहरण 4$15% ढाल एसडीएस-पेज। लेन 1 ] dimer; लेन 2 ] टेट्रामर; लेन 3 ] हेक्सामेर. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6: शुद्ध S100A12 oligomers के साथ monocytes की उत्तेजना. 4 एच इनक्यूबेशन के बाद टीएनएफ- रिलीज को एलिसा द्वारा मात्रा निर्धारित किया गया था। डेटा दो स्वतंत्र प्रयोगों से माध्य मान दिखाते हैं. कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
| बिस्तर वॉल्यूम (सीवी) | 75 एमएल |
| मॉनिटर | 280 एनएम पर अवशोषण |
| दबाव अधिकतम | 3 बार |
| स्तंभ बफ़र A | 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 1 एमएम एड्टा, 1 एमएम ईजीटीए, पीएच 8.5 |
| स्तंभ बफ़र B | 20 एमएम ट्रिस-एचसीएल, 1 एमएम एड्टा, 1 एमएम ईजीटीए, 1 एम एन सीएल, पीएच 8.5 |
| नमूना वॉल्यूम | चर |
| प्रवाह दर | 1 $ 2 एमएल/ |
| तापमान | 4 डिग्री सेल्सियस |
तालिका 1: anion-exchange क्रोमैटोग्राफी के लागू मापदंडों पर विस्तृत जानकारी.
| ब्लॉक | आयतन | बफ़र | आउटलेट |
| समानता | 1 $2 स्तंभ वॉल्यूम (CVs) | एक | अपशिष्ट |
| नमूना लोड | n/a | एक | अपशिष्ट |
| बिना असीमित नमूना बाहर धोएं | 1 सीवी | एक | उच्च मात्रा आउटलेट |
| ग्रैडिएंट-इल्यूशन | 0 $100 % बफर बी में 1 सीवी | A से B | भिन्न संग्राहक |
| बाहर धो-बफर बी | 1 सीवी | बी | अपशिष्ट |
| पुन: समानता | 2 CVs | एक | अपशिष्ट |
तालिका 2: ओन-विनिमय क्रोमैटोग्राफी के उपयोग की विधि पर विस्तृत जानकारी।
| बिस्तर वॉल्यूम (सीवी) | 125 एमएल |
| मॉनिटर | 280 एनएम पर अवशोषण |
| दबाव अधिकतम | 4 बार |
| स्तंभ बफ़र A | 20 एमएम ट्रिस, 140 एमएम नैकल, 25 एमएम CaCl2, पीएच 7.5 |
| स्तंभ बफ़र B | 20 एमएम ट्रिस, 140 एमएम नैकल, 50 एमएम एडीसी, पीएच 7.5 |
| नमूना वॉल्यूम | चर |
| प्रवाह दर | 1 $ 2 एमएल/ |
| तापमान | 4 डिग्री सेल्सियस |
तालिका 3: हाइड्रोफोबिक-इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी के लागू मापदंडों पर विस्तृत जानकारी।
| ब्लॉक | आयतन | बफ़र | आउटलेट |
| समानता | 1 $2 स्तंभ वॉल्यूम (CVs) | एक | अपशिष्ट |
| नमूना लोड | n/a | एक | अपशिष्ट |
| बिना असीमित नमूना बाहर धोएं | 1 डिग्री 2 सीवी | एक | उच्च मात्रा आउटलेट |
| Elution (एल्यूशन) | 100 % बफर बी | बी | भिन्न संग्राहक |
| बाहर धो-बफर बी | 1 सीवी | बी | अपशिष्ट |
| पुन: समानता | 2 CVs | एक | अपशिष्ट |
तालिका 4: हाइड्रोफोबिक-इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी के उपयोग की विधि पर विस्तृत जानकारी।
| बिस्तर वॉल्यूम (सीवी) | 320 एमएल |
| मॉनिटर | 280 एनएम पर अवशोषण |
| दबाव अधिकतम | 3 बार |
| स्तंभ बफ़र A | 20 एमएम हेप्स, 140 एमएम नैकल, पीएच 7.2 |
| नमूना वॉल्यूम | 13 एमएल तक |
| प्रवाह दर | 1$1.5 एमएल/ |
| तापमान | 12]15 डिग्री सेल्सियस |
तालिका 5: आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी के लागू मापदंडों के लिए विस्तृत जानकारी।
पूरक तालिका 1: बफ़र्स और स्टॉक समाधान की तैयारी. इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल में, हम मानव S100A12 के टैग मुक्त जीवाणु अभिव्यक्ति और इसके शुद्धि के साथ ही प्रतिरक्षा सेल उत्तेजना के लिए विभिन्न आयन प्रेरित oligomers में जुदाई का वर्णन. S100A12 प्रोटीनशुद्धि8 , 23,24पर प्रकाशित साहित्य की तुलना में , हाइड्रोफोबिक-इंटरैक्शन क्रोमैटोग्राफी में उच्च CaCl2 (25 m) का उपयोग हमारे ज्ञान अद्वितीय है. कई प्रोटोकॉल से सांद्रता लागू करने के लिए 1 से 5 एमएम शुद्ध प्रोटीन का उत्पादन करते हैं, फिर भी हम एक कई बार हमारे दृष्टिकोण का उपयोग कर उच्च उपज मनाया 25 m CaCl2 के बजाय. यह स्तंभ सामग्री के साथ प्रोटीन बातचीत के एक पदानुक्रम द्वारा समझाया जा सकता है: S100A12 सीधे स्तंभ सामग्री के लिए बाध्य कर सकतेहैं, लेकिन Ca 2 की अधिक + भी पहले से ही स्तंभ-बाउंड प्रोटीन के लिए S100A12-dimers के अप्रत्यक्ष बंधन की सुविधा हो सकती है 8. इस प्रकार, उच्च Ca2 + सांद्रता S100A12 शुद्धि के लिए उपलब्ध सतह विस्तार कर सकते हैं. Elution (एक जल्दी के रूप में HIC से S100A12 के एक रैखिक ढाल का उपयोग करके) (अप्रत्यक्ष रूप से बाध्य S100A12) और एक बहुत देर चोटी (स्तंभ सामग्री बाध्य प्रोटीन) इस अटकलें (डेटा नहीं दिखाया) का समर्थन कर सकते हैं.
रिकॉमबिनेंट S100A12 के उत्पादन के लिए (के रूप में अच्छी तरह से अन्य प्रोटीन) उच्च पैदावार और प्रबंधनीय लागत पर, ई. कोलाई में प्रोटीन अभिव्यक्ति अभी भी पसंद की विधि है. हालांकि, जीवाणु endotoxins के साथ अपरिहार्य संदूषण एक समस्या बनी हुई है, जब प्रोटीन सेल संस्कृति प्रयोगों के लिए निर्धारित कर रहे हैं, विशेष रूप से जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं को शामिल अध्ययन में. हमारे अनुभव के लिए, यहां तक कि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोटीन स्पष्ट रूप से सेल संस्कृति के उपयोग के लिए घोषित endotoxin संदूषण अप करने के लिए शामिल कर सकते हैं 1 यूरोपीय संघ / इसलिए, एंडोटॉक्सिन को पूरी तरह से हटाना अनिवार्य है। समाधान में एंडोटॉक्सिन मोनोमर 10 से 20 केडीए के आणविक भार से लेकर, लेकिन वे उच्च आणविक भार के साथ मिसेल और संरचनाओं का निर्माण कर सकते हैं। उदाहरण के लिए, बहुत बृहत् संरचनाओं के निर्माण को द्विसंयोजक आयनों21,25के माध्यम से प्रमोट किया जाता है।
हमारे प्रोटोकॉल के अनुसार, हम मोनोसाइट उत्तेजना परख के साथ उच्च संवेदनशीलता endotoxin माप के संयोजन से S100A12 प्रोटीन के endotoxin मुक्त उत्पादन सत्यापित करें. हम इस तरह के संयोजन पर विचार विशेष रूप से सार्थक के रूप में एक) निम्न स्तर endotoxin संदूषण परख और ख की संवेदनशीलता के आधार पर आकलन करने के लिए मुश्किल हो सकता है) monocytes पर एलपीएस अवरोधक के रूप में polymyxin बी का उपयोग कारण डेटा की व्याख्या करने के लिए मुश्किल हो सकता है कोशिकाओं पर अनन्य polymyxin बी प्रभाव के लिए26,27. Polymyxin बी के रूप में अच्छी तरह से अन्य cationic पेप्टाइड्स नकारात्मक आरोप लिपिड ए28के माध्यम से एलपीएस बाँध की सूचना दी है. के रूप में S100A12 के विलायक उजागर सतह भी बड़े नकारात्मक आरोप लगाया पैच शामिल हैं S100A12 से TNF-रिलीज की मनाया कमी polymyxin बी की उपस्थिति में प्रेरित मानव monocytes (चित्र 3B) एक के कारण हो सकता है) unspecific प्रत्यक्ष बाध्यकारी की बाध्यकारी polymyxin B से S100A12 और/या ख) प्रेरित कोशिकाओं पर polymyxin बी का सीधा प्रभाव26,27. कम स्तर endotoxin संदूषण के साथ ही विशिष्ट polymyxin बी प्रभाव का पता लगाने के दोनों की ज्ञात सीमाओं के कारण, हमारे प्रोटोकॉल आगे LPS के बीच स्पष्ट रूप से भेद करने के लिए एक गर्मी-निष्क्रियता कदम शामिल हैं- और प्रोटीन मध्यस्थता TLR4-संकेतन.
पीढ़ी और परिभाषित आयन प्रेरित oligomers की शुद्धि के लिए LPS मुक्त S100A12 का उपयोग महत्वपूर्ण है और अतिरिक्त ध्यान उनके बाद शुद्धि करने के लिए बफर्स या स्तंभ सामग्री के माध्यम से endotoxin के अंतिम फिर से परिचय से बचने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए और इस प्रकार एंडोटॉक्सिन हटाने रेजिन के माध्यम से आगे प्रोटीन की मांग एलपीएस-डिप्रन।
प्रोटीन के जैविक कार्य के लिए ओलिगोमराइजेशन की प्रासंगिकता का मूल्यांकन विभिन्न साधनों से किया जा सकता है। S100A12 के मामले में, हम सतह प्लाज्मन अनुनाद के रूप में के रूप में अच्छी तरह से लक्षित एमिनो एसिड आदान-प्रदान आयन बाध्यकारी स्थलों पर इस्तेमाल किया और सबसे ठीक से प्रोटीन जटिल को परिभाषित करने के लिए बाध्य करने में सक्षम और TLR4-हम के माध्यम से रासायनिक crosslinking कार्यरत Ca2 +/ -पल्स्ड रिकॉमबिनेंट S100A1216| विभिन्न आयनिक परिस्थितियों के तहत S100A12 के रासायनिक crosslinking तस्वीर कई oligomeric रूपों है कि संक्रमण में हैं सहित एक क्षणिक राज्य फ्रीज. आयन अनुमापन प्रयोगों से, हमने उन परिस्थितियों को परिभाषित किया है जिनके अंतर्गत द्वि-अंगी, टेट्रामिक या हेक्सामेरिक ओलिगोमर को प्रमुख ओलिगोमर्स16के रूप में निर्धारित किया जा सकता है। इसके अलावा, पिछले प्रयोगों से पता चला है कि आयनों की एक अतिरिक्त तुलनीय, स्थिर crosslinking और बाद में शुद्धि के लिए फायदेमंद है, हालांकि oligomerization भी काफी कम आयन सांद्रता में प्रेरित किया जा सकता है. हालांकि, आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी द्वारा इन ओलिगोमर को शुद्ध करने से अच्छा होता है, लेकिन पूर्ण पृथक्करण नहीं होता है। फिर भी, oligomers के चयनात्मक संवर्धन विश्वसनीय बहाव विश्लेषण के लिए अनुमति देता है.
संक्षेप में, इस प्रोटोकॉल LPS मुक्त मानव S100A12 या संबंधित कैल्शियम बाध्यकारी प्रोटीन के शुद्धिकरण के लिए एक विधि प्रदान करता है. आयन प्रेरित conformational परिवर्तन को ठीक करने के लिए, रासायनिक crosslinking और आकार-निष्कर्ष क्रोमैटोग्राफी द्वारा बाद में जटिल जुदाई डाउनस्ट्रीम जैविक प्रक्रियाओं के लिए प्रोटीन ओलिगोमराइजेशन की प्रासंगिकता को समझने के लिए एक उपयोगी उपकरण है।
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
इस अध्ययन Muenster विश्वविद्यालय चिकित्सा संकाय के intramural अभिनव चिकित्सा अनुसंधान कार्यक्रम से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था (KE121201 सी.के.) और जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन (DFG, Fo354/
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha - OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/mL) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
References
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