Summary
Denne protokollen beskriver en rensing metode for rekombinant tag-Free kalsium bindende protein S100A12 og Ion-indusert oligomers for menneskelig monocytt stimulering analyser.
Abstract
I denne protokollen, beskriver vi en metode for å rense humant kalsium-bindende protein S100A12 og Ion-indusert oligomers fra Escherichia coli kultur for immun celle stimuleringer. Denne protokollen er basert på en to-trinns kromatografi strategi, som består av protein pre-rensing på en anion kromatografi kolonne og en påfølgende polering trinn på en hydrofobe-kolonnen. Denne strategien produserer S100A12 protein av høy renhet og yield på håndterbare kostnader. For funksjonell analyser på immunceller eventuelt rest endotoksin forurensning krever nøye overvåking og ytterligere rengjøring trinn for å få endotoksin-fri protein. Flertallet av endotoksin forurensninger kan utelukkes ved anion-utveksling kromatografi. For å tømme gjenværende forurensninger, beskriver denne protokollen et fjernings trinn med sentrifugal filtre. Avhengig av tilgjengelige ion-styrke S100A12 kan arrangere i ulike homomultimers. For å undersøke sammenhengen mellom struktur og funksjon beskriver denne protokollen videre ion-behandling av S100A12 protein fulgt av kjemiske Cross Linking for å stabilisere S100A12 oligomers og deres påfølgende separasjon etter størrelses ekskludering kromatografi. Til slutt beskriver vi en celle-basert analyse som bekrefter biologisk aktivitet av renset protein og bekrefter LPS-fri forberedelse.
Introduction
S100A12 er en kalsium bindende protein som er overveiende produsert av humant granulocytter. Proteinet er overexpressed under (systemisk) betennelse og serum nivåer, spesielt i (Auto) inflammatoriske sykdommer som systemisk juvenil idiopatisk artritt (sJIA), Familiær middelhavsfeber (FMF) eller Kawasaki sykdom (KD) kan informere om sykdomsaktivitet og respons på behandlingen. Avhengig av mønster gjenkjennings reseptorer (PRRs) som bompenger-lignende reseptorer (TLRs), kan det medfødte immunsystemet aktiveres av patogen-assosierte molekylære mønstre (PAMPs) som lipopolysaccharides (LPS) eller skade forbundet molekylære mønstre (demper; også kalt ' alarmins '). Demper er endogene molekyler som cellulære proteiner, lipider eller nukleinsyre syrer1. Fuktig-funksjoner er godt beskrevet for medlemmer av calgranulin protein familien, S100A8/A9 og S100A122, som også rapporteres å operere som divalent metall ion-chelaterande antimikrobielle peptider3,4, 5,6. Avhengig av tilgjengelige ion styrke S100A12 kan, som andre medlemmer av S100 familien, arrangere i ulike homomultimers og inntil nylig virkningen av S100A12-oligomerisation på PRR-interaksjon, spesielt TLR4, var ukjent.
Proteinet ' s monomere form (92 aminosyrer, 10,2 kDa) består av to "EF-Hand Helix-loop-Helix"-strukturer koblet sammen med en fleksibel linker. C-terminalen EF-hånden inneholder det klassiske ca2 +-bindende motivet, mens N-Terminal EF-hånden har en S100 protein spesifikk utvidet SLØYFE struktur («pseudo-EF-Hand») og avslører redusert ca2 +-affinitet. Ca2 +-binding av S100A12 kan indusere en stor conformational endring i proteinene ' C-Terminus, som resulterer i eksponering av en hydrofobe patch på hver monomer og danner dimerization grensesnittet. Således, under fysiologiske forhold, er den minste kvartær strukturen dannet av S100A12 en ikke-kovalente dimer (ca. 21 kDa) der individuelle monomerer er i antiparallel orientering. Når arrangert som dimer, S100A12 rapporteres å beslaglegge Zn2 + samt andre divalent metall ioner, f. eks Cu2 + med høy affinitet7. Disse ioner koordineres ved S100A12 dimer Interface av aminosyrer H15 og D25 av en delenhet og H85 samt H89 av anti-parallelt andre delenhet8,9,10. Mens tidligere studier foreslår at Zn2 +-Loaded S100A12 kan indusere proteinet ' s organisasjon til homo-tetramers (44 KDA) og å resultere i økt ca2 +-affinitet11,12, siste metall titrering studier6 foreslår ca2 +-binding av S100A12 å øke protein affinitet til Zn2 +. Når S100A12 EF-hender er fullt okkupert av ca2 +, er det antatt at ytterligere ca2 + antas å binde mellom dimers, utløser heksamer formasjon (ca. 63 KDA). Arkitekturen i den hexameric quarternary strukturen er helt klart forskjellig fra tetramer. Det er foreslått at tetramer grensesnittet er forstyrret for å gi opphav til nye dimer-dimer grensesnitt som fordeler heksamer formasjon10. S100A12 er nesten utelukkende uttrykt av menneskelige granulocytter der det utgjør ca 5% av alle cytosolic protein13. I sin DAMP funksjon S100A12 ble historisk beskrevet som Agonistiske av multi-ligand reseptor for avanserte glycation sluttprodukter (RAGE), deretter betegnes ekstracellulære nylig identifiserte RAGE-binding protein (EN-RAGE)14. Riktignok vi tidligere rapportert biokjemiske S100A12-binding til både RAGE og TLR415, vi nylig demonstrerte menneskelige monocytter å svare på S100A12 stimulering i en TLR4-avhengig måte16. Dette krever arrangement av S100A12 i sin ca2 +/Zn2 +-indusert hexameric quarternary struktur16.
Her beskriver vi en rensing prosedyre for rekombinant humant S100A12 og Ion-indusert oligomers for immun celle stimuleringer16,17. Dette er basert på en to-trinns kromatografi strategi, som i utgangspunktet inkluderer en anion for å isolere og konsentrere proteinet og fjerne bulk forurensninger (f.eks. endotoksiner/lipopolysaccharides)18. Ion-Exchange kromatografi harpiks separate proteiner på grunnlag av ulike netto overflate kostnader. For sure proteiner som S100A12 (isoelectric punkt på 5,81), et buffer system med en pH på 8,5 og en sterk anion-utveksling harpiks fører til en god separasjon. Bound proteiner ble eluert med en høy-salt buffer gradient. Med en økning på ioniske styrke negative ioner i eluering buffer konkurrere med proteiner for kostnader på overflaten av harpiks. Proteiner individuelt eluere avhengig av deres netto ladning og i resultat av det, buffere beskrevet her tillater å isolere og konsentrere overexpressed S100A12 protein. På grunn av negativt ladet grupper i lipopolysaccharides, disse molekylene også binde til anion-utveksling harpiks. Men deres høyere netto kostnad resulterer i senere eluering i anvendt høy-salt gradient. Det andre trinnet i rensing prosedyren har blitt innført for polering formål. Dette gjør bruk av kalsium bindende evne til S100A12 og fjerner gjenværende urenheter på en hydrofobe-kolonne. Kalsium binding av S100A12 fører til en conformational endring og en eksponering av hydrofobe flekker på overflaten av proteinet. På denne betingelsen, S100A12 samhandler med hydrofobe overflaten av harpiks. Ved kalsium-chelaterande av EDTA, er denne interaksjonen reversert. I nærvær av ioner, spesielt kalsium og sink, S100A12 arrangerer inn homomeric oligomers. Å studere struktur-funksjon relasjoner av de ulike oligomers, stabilisert vi dimeric, tetramerisk og hexameric rekombinant S100A12 med en kjemisk tverrbinder og separert komplekser på en størrelse-eksklusjon kromatografi kolonne. Til slutt, for å analysere funksjonalitet og biologisk aktivitet av renset protein og Ion-indusert oligomers, den cytokin utgivelsen av S100A12 og LPS stimulert monocytt kan sammenlignes.
Ulike metoder for rensing S100A12 har blitt beskrevet så langt. Jackson et al.19, for eksempel, publiserte en protokoll med rensing via en anion-kolonne og en påfølgende størrelses ekskludering kromatografi. Rensing av polering på en kolonne med størrelses ekskludering fører til gode resultater, men – på grunn av for eksempel begrenset belastnings volum, er mindre fleksibel i skalerbarhet. En annen tilnærming, utgitt av Kiss et al.20, beskriver rensing av Tagged protein via ni2 + affinitet kolonnen som den første rensing trinn, etterfulgt av enzymatisk kløft å fjerne koden og ytterligere rensing trinn. I motsetning til de aforecited studiene19,20, den produserte protein som beskrevet i denne protokollen er bestemt for eksperimenter på immunceller. Derfor er rest endotoksin forurensning fra bakteriell kultur en utfordring. Selv om ulike tilnærminger for endotoksin fjerning har blitt beskrevet så langt, er det ingen ensartet metode som fungerer like godt for en gitt protein løsning21,22.
Oppsummert kombinerer vår protokoll fordelene med et kode fritt uttrykk i et bakteriell system med effektiv fjerning av endotoksin og høy utbytte av rent protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Merk: Vennligst referer til supplerende tabell 1 for utarbeidelse av buffere og lager løsninger.
1. protein uttrykk i E. coli
-
Kloning
- Klon tag-ledig Human S100A12 (NCBI henvisning orden: NP_ 005612.1) i bakteriell gjengivelsen vektor pET11b. For å uttrykke proteinet, forvandle konstruere til E. coli BL21 (DE3).
-
Kultur
- Forbered en for rett kultur ved å vaksinere en enkelt koloni i 5 mL vekstmedium (LB buljong med 100 μg/mL Ampicillin) i en 14 mL rund bunn tube. Ruge over natten ved 37 ° c med risting ved 220 RPM. Overfør 2 − 4 mL over natten kultur til 400 mL vekstmedium i en 2 L Erlenmayer kolbe og ruge kulturen ved 37 ° c med risting ved 220 RPM.
Merk: Initial tetthet av de viktigste kulturen bør være optisk tetthet på 600 NM (OD600) = 0,1. - Overvåk OD600 under vekst. Indusere protein uttrykk ved tilsetning av 1 M isopropylalkohol-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTH) til en endelig konsentrasjon på 1 mM ved OD600 = 0,5 − 0,6. Ruge ved 37 ° c og 220 RPM for ytterligere 4 h.
Merk: Generelt vil en OD600 på 0,6 nås etter 1,5 − 2,5 timer ved 37 ° c. - Klargjør 50 mL sonikering buffer ved å oppløse 50 mM Tris, 50 mM NaCl og 1 mM etylendiamin Tetraacetic syre (EDTA) i 40 mL deionisert vann. Juster pH med HCl til 8,0 og utgjør opptil 50 mL. Legg til protease inhibitor (1 tablett per 50 mL oppløsning) og likevekt bufferen til 4 ° c.
- Overfør bakterie kulturen til egnede sentrifuge flasker og høste cellene ved 3 200 x g i 30 min ved 4 ° c. Kast supernatanten og resuspend pellet i 25 mL iskald sonikering buffer. Heretter holde cellene på isen.
Merk: Resuspendert celler kan oppbevares ved-20 ° c for kortvarig og ved-80 ° c for lang sikt.
- Forbered en for rett kultur ved å vaksinere en enkelt koloni i 5 mL vekstmedium (LB buljong med 100 μg/mL Ampicillin) i en 14 mL rund bunn tube. Ruge over natten ved 37 ° c med risting ved 220 RPM. Overfør 2 − 4 mL over natten kultur til 400 mL vekstmedium i en 2 L Erlenmayer kolbe og ruge kulturen ved 37 ° c med risting ved 220 RPM.
-
Sonikering/lyse
- Sonikere cellene i 6 sykluser på 30 s på isen. Etter hver syklus, hvile celler for 30 − 60 s for å beskytte cellene mot overoppheting.
- Overfør celle fjæringen til en pre-kjølt 50 mL høyhastighets sentrifugering tube og sentrifuger i en fast vinkel rotor ved 15 000 x g i 30 min ved 4 ° c. Dekanter den ryddet lysat som inneholder oppløselige cytosolic proteiner til en frisk 50 mL rør og kast pellet.
2. protein rensing
- Anion-utveksling kromatografi
- Dialyse
- Forbered anion-Exchange kromatografi (AIEX) buffer A ved oppløsning 20 mM Tris, 1 mM EDTA og 1 mM etylen glykol-BIS (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-Tetraacetic acid (EGTA) i deionisert vann og justere pH til 8,5 med HCl. For dialyse forberede 2 x 5 L og for kromatografi 2x 1 L av AIEX buffer A.
Merk: Dializat volumet bør være på omtrent 100 ganger prøvevolumet. Alle buffere som brukes for kromatografi bør filtreres (0,45 μm eller mindre) og degassed (f.eks. ved ultralydbad eller vakuum avgassing). - Cut dialyse slange (molekylær vekt cut-off [MWCO]: 3,5 kDa) i en passende lengde med ekstra plass for luft for å sikre sample oppdrift over roterende røre bar.
Merk: Glyserol bevarer membranen og må fjernes før bruk. - For å redusere viskositet av den ryddet protein løsningen fra trinn 1.3.2, fortynne løsningen med 25 mL AIEX buffer A for å lette påfølgende søknad til kromatografi kolonnen. Fest den første nedleggelsen på slangen, Legg prøven i membranen og fest den andre nedleggelsen minst 1 cm fra den øverste enden av slangen.
- Plasser 5 L container med AIEX buffer A på en rør plate, tilsett en røre bar og membranen fylt med protein løsning. Juster hastigheten for å rotere prøven ved å unngå interferens med den roterende rør stangen. Dialyze for 12 − 24 timer ved 4 ° c, og erstatt deretter dializat buffer (AIEX buffer A) med en frisk, avkjølt forberedelse og fortsett i minst 4 ekstra timer. Overfør den dialyzed protein løsningen til et 50 mL rør og Filtrer gjennom en 0,45 μm Filterenhet.
Merk: Mulig lagring.
- Forbered anion-Exchange kromatografi (AIEX) buffer A ved oppløsning 20 mM Tris, 1 mM EDTA og 1 mM etylen glykol-BIS (2-aminoethylether)-N, N, N ', N'-Tetraacetic acid (EGTA) i deionisert vann og justere pH til 8,5 med HCl. For dialyse forberede 2 x 5 L og for kromatografi 2x 1 L av AIEX buffer A.
- Kromatografi
- Start det flytende kromatografi systemet (FPLC) med generelt vedlikehold, koble Kol onne buffere AIEX A og AIEX B (AIEX-buffer A med 1 M NaCl) og anion harpiks som inneholder kolonnen. Se tabell 1 for generelle kromatografiske parametre.
Merk: buffere, Kol onne-og FPLC-utstyr skal equilibrated til samme temperatur før du starter kjøringen (se kromatografiske parametere i tabell 1, tabell 2, tabell 3, Tabell 4og tabell 5). - Likevekt kolonnen med AIEX buffer A, deretter laste prøven på kolonnen og eluere proteiner med en lineær gradient fra 0% til 100% høy-salt buffer (AIEX B). Se tabell 2 for en detaljert metode protokoll.
- Samle 2 mL fraksjoner under eluering og analyser 10 μL av hver brøk på en Coomassie 15% natrium natriumdodecylsulfat sulfat polyakrylamid gel elektroforese (SDS-side). Pool fraksjoner som inneholder S100A12 protein for dialyse.
Merk: Molekylvekten av S100A12 er 10 575 da.
- Dialyse
- Kalsium-avhengig hydrofobe-interaksjon kromatografi (HIC)
- Dialyse
- Dialyze protein løsningen mot 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,5 ved å følge fremgangsmåten beskrevet i avsnitt 2.1.1.
- Kromatografi
- Forbered 1 L av kromatografi buffer HIC A ved oppløsning 20 mM Tris, 140 mM NaCl og 25 mM CaCl2 i deionisert vann og Juster pH til 7,5. For HIC buffer B, oppløse 20 mM Tris, 140 mM NaCl og 50 mM EDTA. Juster pH-verdien til 7,0 og Filtrer og Degas av buffere. Legg til CaCl2 i prøven til en endelig konsentrasjon på 25 mm og filtrer gjennom 0,45 μm. likevekt hic buffere og prøvetaking til 4 ° c (Kol onne temperatur).
- Start det flytende kromatografi systemet med generelt vedlikehold, koble kolonne buffere HIC A og B og kolonnen. Se tabell 3 for ytterligere kromatografiske parametre.
- Likevekt kolonnen, Last prøven og Forleng blokken med ubundet utvalg til UV-signalet når Baseline-nivået igjen. Deretter starter eluering med en kalsium chelator som inneholder buffer (EDTA). Se Tabell 4 for en detaljert metode protokoll.
Merk: Tidligere eksperimenter har vist at et overskudd av kalsium synes å være gunstig for binding av S100A12 til kromatografi harpiks. - Samle topp deler på 2 mL og analyser 10 μL av hver brøk på en Coomassie 15% SDS-side. Pool ren S100A12 fraksjoner og dialyze mot Hepes-bufret saltvann (HBS; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,0) som beskrevet i avsnitt 2.1.1.
Merk: utryddelse koeffisient av monomere S100A12 er 2980 M-1 cm-1.
- Dialyse
3. oppdagelse og fjerning av Endotoksin
-
Påvisning av endotoksin
- For å bestemme endotoksin forurensning, måle konsentrasjoner av utvannet protein fra trinn 2.2.2.4. (f.eks. 1:10 og 1:100 i HBS) ved hjelp av en enzym koblet immunosorbentanalyse-analyse (ELISA)-basert, fluorescerende endotoksin deteksjons analyse (tabell med materialer). Utfør denne analysen ved å følge produsentens protokoll.
Merk: Bruk ferskt tilberedte HBS løsninger oppløst i ultrarent deionisert vann for å unngå (ny) endotoksin forurensning av bufferen.
- For å bestemme endotoksin forurensning, måle konsentrasjoner av utvannet protein fra trinn 2.2.2.4. (f.eks. 1:10 og 1:100 i HBS) ved hjelp av en enzym koblet immunosorbentanalyse-analyse (ELISA)-basert, fluorescerende endotoksin deteksjons analyse (tabell med materialer). Utfør denne analysen ved å følge produsentens protokoll.
-
Fjerning av endotoksin og konsentrasjon av protein
- Legg 15 mL av prøven på en 50 kDa sentrifugal Filterenhet og sentrifuger ved 3 200 x g og 10 ° c i ca. 10 min. Overfør Gjennomstrømningsmengden til et nytt fartøy (på is) og fyll på og sentrifuger filter røret på 50 så ofte som nødvendig. Vask filter membranen to ganger med HBS for å gjenvinne så mye protein som mulig etter hvert trinn.
- Konsentrer S100A12 som inneholder gjennomstrømning, ved å bruke 3 kDa sentrifugal filter til volumet er redusert til en femtedel opp til en tiendedel av det første laste volumet (sentrifugering ved 3 200 x g, 10 ° c i ca. 30 min). Fyll filteret så ofte som nødvendig, skyll membranen og overfør den konsentrerte løsningen til et nytt rør etter hver påfylling. Kast flyten gjennom. Filtrer igjen gjennom 50 kDa som beskrevet ovenfor.
Merk: Under denne prosedyren, tap av protein er bemerkelsesverdig (opp til 50%), men den resterende protein preparatet er helt utarmet fra LPS. Denne metoden gir ca 10 − 15 mg protein fra 400 mL kultur. - Juster protein oppløsningen til 1 mg/mL med endotoksin HBS og mål LPS-innholdet som beskrevet i trinn 3.1.1. I tilfelle protein løsningen er fortsatt ikke testet som LPS-Free (< 0.1 EU/mL), eliminere rest forurensninger ved hjelp av en endotoksin fjerning harpiks.
Merk: Med en proteinkonsentrasjon på 1 mg/mL, er forurensning av 0,1 EU/mL LPS lik ca. 0,01 PG LPS/μg protein.
4. kjemisk Cross Linking og oligomer separasjon
-
Kjemisk Cross Linking
- Forbered svært ren (endotoksin) lager løsninger på 1 M CaCl2 og 100 mm ZnCl2 i Ultrarent deionisert vann (tabell av materialer). Bruk denne bufferen, ferskt laget, for neste trinn.
- Ruge 10 mL renset endotoksin S100A12 (konsentrasjon 1 mg/mL i HBS) i 30 min ved romtemperatur (RT) med enten 25 mM CaCl2 for dimeric/tetramerisk, eller 25 mm CaCl2 og 1 mm ZnCl2 for hexameric/tetramerisk S100A12 oligomers.
- Forbered tverrbinder ved å oppløse 8 mg BS3 i 500 μL av endotoksin-fritt vann direkte før bruk (8 mg tverrbinder for 10 ml ion-piggete protein løsning er lik en endelig konsentrasjon på 1,4 mm). Bland tverrbinder og prøven ved pipettering og ruge for ytterligere 30 min ved RT. slukke reaksjonen ved å legge til 1 M Tris-HCl, pH 7,5 til en endelig konsentrasjon på 50 mM og filter gjennom 0,45 μm.
-
Størrelse-utelukkelse kromatografi
- Likevekt den krysskoblet prøven til 12 − 15 ° c (Kol onne temperatur) og start det flytende kromatografi systemet med generelt vedlikehold. Koble til Kol onne bufferen (HBS) og kolonnen for størrelses ekskludering. Se tabell 5 hvis du vil ha mer informasjon.
- Likevekt kolonnen i HBS, Last prøven og samle topp fraksjoner (1 − 2 mL) under kjøringen. Analysere disse fraksjoner på en 4 − 20% gradient SDS-side og pool fraksjoner med store band av ønsket protein kompleks.
Merk: Hydrolyse av NHS Ester reagenser som BS3 i vandige oppløsninger resulterer i en sterk absorbansen ved 280 NM. Ubundet tverrbinder (molekylvekt: 572 g/mol) elutes på slutten av kjøringen og resulterer i en sterk topp. - Konsentrer løsningene ved å bruke sentrifugal filter enheter med MWCOs på 10 kDa (dimer), 30 kDa (tetramer) eller 50 kDa (heksamer). Bestem endotoksin forurensning som beskrevet i avsnitt 3,1. Om nødvendig, Fjern gjenværende LPS med en endotoksin fjerning harpiks etter produsentens anbefalinger (tabell av materialer).
5. funksjonell testing på monocytter
- Utarbeidelse av monocytter
- Isolere monocytter fra menneskelig Buffy strøk av tetthet gradient sentrifugering og påfølgende monocytt berikelse ved hjelp av en magnetisk perle separasjon Kit (tabell av materialer).
Merk: Denne protokollen vil resultere i ca 5 − 7 x 107 monocytter (en Buffy coat) med en renhet på 83 − 95%. Siden antallet, men også responsen til cellene avhenger sterkt på donor, kan protokollen må skaleres opp (avhengig av nødvendig celle telling). - For tetthet sentrifugering, likevekt separasjon løsning (tetthet = 1,077 g/mL) til RT og overføre 20 mL i 50 mL sentrifugerør (2 rør per Buffy coat). Fortynne blod fra det Human Buffy belegge med Hank ' bufret saltløsning (HBSS) å en sum kvantum av 60 mL og lag 30 mL av denne blanding forsiktig på toppen av separasjon medium. Sentrifuger på 550 x g for 35 min ved RT. Deaktiver sentrifuge bremsen.
- Etter sentrifugering er de mononukleære perifere blodcellene (Pbmc) plassert direkte oppå skille mediet. Overfør disse cellene til et friskt 50 mL sentrifugerør, gjør opptil 50 mL med HBSS, og sentrifuger ved 170 x g i 10 min. aspirer supernatanten og resuspend celle pellet i et lite volum av HBSS ved pipettering.
- Fyll røret opp til 50 mL og sentrifuger ved 290 x g i 10 min. aspirer supernatanten igjen, resuspend CELLENE i HBSS (50 ml) og sentrifuge ved 170 x g i 10 min. telle cellene og resuspend dem i celle separasjon buffer (tabell over materialer < /C9 >) til en konsentrasjon på 5 x 107 celler/ml.
Merk: I stedet for HBSS, fosfat-bufret saltvann (PBS) kan brukes til å vaske cellene. - For monocytt isolering fra Pbmc, bruk en magnetisk negativ celle isolasjons sett og følg produsentens protokoll. Count monocytter og resuspend i monocytt medium (RPMI 1640, 15% varme-deaktivert fosterets kalv serum [FCS], 4 mM L-glutamin, 100 U/mL penicillin/Streptomycin) til en konsentrasjon av 2 x 106 celler/ml.
- Til kultur monocytter, frakk kultur retter (f. eks, 100 mm) med en hydrofobe, gass gjennomtrengelig film, egnet for suspensjon celler (tabell av materialer). Sterilisere platene ved hjelp av UV-lys i ca 30 min. Overfør cellene til disse kultur platene og la dem hvile over natten ved 37 ° c og 5% CO2.
Merk: Bruk 15 − 25 mL celle oppheng per belagt fat.
- Isolere monocytter fra menneskelig Buffy strøk av tetthet gradient sentrifugering og påfølgende monocytt berikelse ved hjelp av en magnetisk perle separasjon Kit (tabell av materialer).
- Monocytt stimulering
- Stimulering med S100A12 (wildtype)
Merk: For å skille ubehandlet S100A12 (sluttprodukt fra Seksjon 2.2.2) fra krysskoblet protein, er S100A12 i det følgende referert til som "wildtype".- Overfør de hvilte cellene til en 50 mL sentrifugal slange og sentrifuger ved 350 x g i 10 min. aspirer supernatanten og resuspend celle pellet i stimulering medium (RPMI 1640, 5% varme-deaktivert FCS, 4 mm L-glutamin, 100 U/ml penicillin/ Streptomycin) ved en konsentrasjon på 2 x 106 celler/ml.
- For stimulering, bruk 24 brønn opphengs plater og tilsett 250 μL av celle oppheng per brønn (0,5 x 106 celler/brønn). Tilsett 50 μg/mL polymyxin B til de tiltenkte brønnene, etterfulgt av enten LPS i forskjellige konsentrasjoner (25, 50, 100 og 200 PG/mL) eller wildtype S100A12 (10, 20, 40, 60 μg/mL). Videre gjelder proteinet enten ubehandlet eller denaturert (99 ° c, 10 min) i forskjellige konsentrasjoner til cellene.
Merk: En kort varmebehandling denatures S100A12 protein, men har mindre til ingen effekt på LPS. - Ruge plater for 4 t ved 37 ° c og 5% CO2. Høste cellene ved å overføre celle suspensjonen av hver brønn til 1,5 mL reaksjons rør. Sentrifuger på 500 x g i 10 min. Overfør supernatanter til nye rør og mål TNFα-utgivelse i forskjellige fortynninger (f.eks. 1:2, 1:5, 1:10) med et HUMANT TNFα Elisa-sett som følger produsentens anbefalinger.
- Stimulering med S100A12 oligomers
- Forbered og frø ut monocytter i 24 godt suspensjon plater som beskrevet ovenfor. Stimulere cellene ved å legge til S100A12 oligomers fra trinn 4.2.3. i forskjellige molar konsentrasjoner (125 NM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
Merk: For å sammenligne evnene til de forskjellige oligomers for å stimulere monocytter, ble oligomers påført cellene i sammenlignbare molar konsentrasjoner. - Ruge for 4 t ved 37 ° c og 5% CO2, høste cellene og måler TNFα utgivelse i supernatanter som beskrevet ovenfor.
- Forbered og frø ut monocytter i 24 godt suspensjon plater som beskrevet ovenfor. Stimulere cellene ved å legge til S100A12 oligomers fra trinn 4.2.3. i forskjellige molar konsentrasjoner (125 NM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
- Stimulering med S100A12 (wildtype)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Etter pre-rensing på AIEX kolonnen (figur 1A-C) og påfølgende kalsium-avhengige hic (figur 2a, B), svært rent protein ble oppnådd (figur 2C). I tillegg, målinger av endotoksin avdekket vellykket LPS fjerning. LPS-innholdet etter AIEX ble målt i en 1:10 fortynning over analysen oppdagelsen grensen, det vil si, over 500 EU/mL. Etter den første filtreringen gjennom en 50 kDa Filterenhet, ble LPS-innholdet redusert til 1 EU/mL. Etter konsentrasjon med en 3 kDa Filterenhet og ytterligere filtrering gjennom 50 kDa, ble den målte LPS-forurensningen 0,08 EU/mL.
Som en ekstra kontroll, ble menneskelige monocytter stimulert med produsert wildtype protein (Figur 3A, B). Polymyxin B-behandling opphever TNFα Release fra LPS-stimulert monocytter, som ikke kan observeres med S100A12. På den annen side, varme-behandling av både LPS og S100A12 opphever protein evne til å stimulere celler, mens dette ikke påvirker cellulær respons til LPS-stimulering.
Protein eksponering for ulike ioner resulterer i arrangement av ulike S100A12 oligomers (figur 4a). Kjemisk Cross Linking gjør det mulig å fange opp definerte komplekser som dimers, tetramers, og hexamers samt overgangs stater (f. eks ' trimers ', band på ca 30 kDa). For å indusere en uttalt forskyvning av oligomer-likevekt før Cross Linking, ble det brukt et overskudd av ioner (figur 4b).
Isolerte oligomers i like molar konsentrasjoner (figur 5A-C) ble deretter brukt til monocytt stimulering for å sammenligne signal ferdigheter via PRRs. monocytt-stimulering med hexameric S100A12 resulterte i uttalt TNFα utgivelse (figur 6 ). Rest cytokin utgivelse kan oppdages fra celler stimulert med tetramerisk S100A12, mens behandling med dimeric protein ikke induserer TNFα utgivelse.
Figur 1: resultater av anion-utveksling kromatografi. (A) en kromatogram med absorbansen ved 280 NM (a280) og prosentandelen av eluering buffer B (stiplet linje). Metode blokker indikeres med A = vask ubundet utvalg, B = lineær gradering med eluering buffer (buffer B), C = vask med buffer B, og D = re-likevekts i buffer A. (B) Fokuser på de relevante toppene med brøk rør tall i rødt. (C) utvalgte fraksjoner ble analysert på 15% Coomassie-flekket SDS-Page. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: resultater av hydrofobe-interaksjon kromatografi. (A) en kromatogram med absorbansen ved 280 NM (a280) og prosentandelen av eluering buffer B (stiplet linje). Metoder blokker er angitt med A = vask ubundet utvalg, B = eluering med buffer B, og C = re-likevekts i buffer A. (B) fokus på de relevante toppene med brøk rør tall i rødt. (C) analysert fraksjoner på 15% Coomassie-farget SDS-side. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: primære menneskelige monocytter ble stimulert ved angitte konsentrasjoner. LPS (A) eller S100A12 (wildtype, B) ble etterlatt ubehandlet eller varme-skuremiddel (99 ° c, 10 min). Begge forholdene ble testet i nærvær og fravær av polymyxin B. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: S100A12 protein ble krysskoblet med BS3 etter INKUBASJONS i HBS buffer som inneholder 5 mm ca2 + og indikerte Zn2 + konsentrasjoner. (A) økende Zn2 + konsentrasjoner induserer arrangement av S100A12 i tetramers og hexamers ved separasjon på 4 − 20% COOMASSIE-farget SDS-side. (B) representativt resultat av krysskoblet oligomers med vilkår som brukes for separasjon på en størrelse-utelukkelse kolonne. S100A12 var krysskoblet i nærvær av enten 25 mM ca2 + (Lane 1) eller 25 mm ca2 + og 1 mm Zn2 + (Lane 2). (S100A12) 2 = dimer; (S100A12) 4 = tetramer; (S100A12) 6 = heksamer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: S100A12 oligomers ble separert i en kolonne for størrelses ekskludering. (A) kromatogram av heksamer/tetramer separasjon etter Cross LINKING i HBS buffer med 25 mm CaCl2 og 1 mm ZnCl2. (B) kromatogram for tetramer/dimer SEPARASJON i HBS buffer med 25 mm CaCl2. (C) eksempel på samlet og konsentrert oligomers etter separasjon på en Coomassie-beiset 4 − 15% gradient SDS-side. Lane 1 = dimer; Lane 2 = tetramer; Lane 3 = heksamer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: stimulering av monocytter med RENSET S100A12 oligomers. TNFα-Release etter 4 h inkubasjons ble kvantifisert av ELISA. Dataene viser middelverdien fra to uavhengige eksperimenter. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Seng volum (CV) | 75 mL |
| Skjerm | Absorbansen for 280 nM |
| Trykk maks | 3 bar |
| Kol onne buffer A | 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,5 |
| Kol onne buffer B | 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 M NaCl, pH 8,5 |
| Eksempel på volum | Variabel |
| Strømningshastighet | 1 − 2 mL/min |
| Temperatur | 4 ° c |
Tabell 1: detaljert informasjon om de anvendte parametrene av anion-utveksling kromatografi.
| Blokkere | Volum | Buffer | Stikkontakt |
| Likevekts | 1 − 2 Kol onne volumer (CVs) | A | Avfall |
| Eksempel på Last | N/a | A | Avfall |
| Vask ut ubundet prøve | 1 EN CV | A | Høyt volum utløp |
| Gradering – eluering | 0 − 100% buffer B i 1 CV | A til B | Brøk samler |
| Vask ut – buffer B | 1 EN CV | B | Avfall |
| Re-Likevekts | 2 en CV | A | Avfall |
Tabell 2: detaljert informasjon om den brukte metoden for anion-utveksling kromatografi.
| Seng volum (CV) | 125 mL |
| Skjerm | Absorbansen for 280 nM |
| Trykk maks | 4 bar |
| Kol onne buffer A | 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 25 mM CaCl2, pH 7,5 |
| Kol onne buffer B | 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,5 |
| Eksempel på volum | Variabel |
| Strømningshastighet | 1 − 2 mL/min |
| Temperatur | 4 ° c |
Tabell 3: detaljert informasjon om de anvendte parametrene av hydrofobe-interaksjon kromatografi.
| Blokkere | Volum | Buffer | Stikkontakt |
| Likevekts | 1 − 2 Kol onne volumer (CVs) | A | Avfall |
| Eksempel på Last | N/a | A | Avfall |
| Vask ut ubundet prøve | 1 − 2 CV-er | A | Høyt volum utløp |
| Eluering | 100% buffer B | B | Brøk samler |
| Vask ut – buffer B | 1 EN CV | B | Avfall |
| Re-Likevekts | 2 en CV | A | Avfall |
Tabell 4: detaljert informasjon om den brukte metoden for hydrofobe-interaksjon kromatografi.
| Seng volum (CV) | 320 mL |
| Skjerm | Absorbansen for 280 NM |
| Trykk maks | 3 bar |
| Kol onne buffer A | 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,2 |
| Eksempel på volum | Opptil 13 mL |
| Strømningshastighet | 1 − 1.5 mL/min |
| Temperatur | 12 − 15 ° c |
Tabell 5: detaljert informasjon for de anvendte parametrene av størrelses ekskludering kromatografi.
Supplerende tabell 1: utarbeidelse av buffere og lager løsninger. Vennligst klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen, beskriver vi tag-Free bakteriell uttrykk for menneskelig S100A12 og dens rensing samt separasjon i ulike ion-indusert oligomers for immun celle stimulering. Sammenlignet med publisert litteratur om S100A12 protein rensing8,23,24, bruk av høy CaCl2 (25 mm) i hydrofobe-interaksjon kromatografi er vår kunnskap unike. Flere protokoller som bruker konsentrasjoner fra 1 til 5 mM gjøre produsere rent protein, men vi observert en flere ganger høyere avkastning etter vår tilnærming med 25 mM CaCl2 i stedet. Dette kan forklares med et hierarki av protein interaksjon med kolonnen materiale: S100A12 kan direkte binde til kolonnen materialet, men det overskytende av ca2 + kan også tilrettelegge indirekte binding av S100A12-dimers til den allerede kolonne-bundet protein 8. dermed høy ca2 + konsentrasjoner kan forstørre overflaten tilgjengelig for S100A12 rensing. Eluering (ved å bruke en lineær gradient) av S100A12 fra HIC som en tidlig (indirekte bundet S100A12) og en svært sen topp (kolonne materiale bundet protein) kan støtte denne spekulasjoner (data ikke vist).
For produksjon av rekombinant S100A12 (så vel som andre proteiner) ved høye avlinger og håndterbare kostnader, protein uttrykk i E. coli er fortsatt metoden for valg. Men den uunngåelige forurensning med bakteriell endotoksiner fortsatt et problem, når proteiner er bestemt for cellekultur eksperimenter, spesielt i studier som involverer medfødte immunceller. Til vår erfaring, selv kommersielt tilgjengelige proteiner eksplisitt erklært for cellekultur bruk kan inneholde endotoksin forurensninger opp til 1 EU/mikrogram protein, noe som kan betydelig skew analyser. Derfor er en fullstendig fjerning av endotoksiner obligatorisk. Endotoksin monomerer i løsningen spenner fra molekylære vekter på 10 til 20 kDa, men de kan danne miceller og strukturer med høyere molekyl vekter. Dannelsen av svært store strukturer er, for eksempel, fremmet gjennom bivalent ioner21,25.
Ifølge vår protokoll, bekrefter vi endotoksin-fri produksjon av S100A12 protein ved å kombinere høy følsomhet endotoksin målinger med monocytt stimulering analyser. Vi anser slik kombinasjon spesielt meningsfylt som en) lavt nivå endotoksin forurensning kan være vanskelig å vurdere avhengig av følsomheten til analysen og b) bruk av polymyxin B som LPS inhibitor på monocytter kan føre til vanskelig å tolke data på grunn til eksklusive polymyxin B effekter på cellene26,27. Polymyxin B så vel som andre kationiske peptider er rapportert å binde LPS via negativt ladet lipid A28. Som løsningsmiddel eksponert overflate av S100A12 inneholder også store negativt ladet patcher den observerte reduksjonen av TNFα-Release fra S100A12-stimulert menneskelige monocytter i nærvær av polymyxin B (figur 3b) kan skyldes a) løs direkte binding av polymyxin b til S100A12 og/eller B) direkte effekter av polymyxin B på stimulert celler26,27. På grunn av den kjente begrensninger av både påvisning av lavt nivå endotoksin forurensning samt løs polymyxin B effekter, vår protokoll videre inneholder en varme-inaktive skritt for å tydelig skille mellom LPS-og protein-mediert TLR4-signalering.
Bruk av LPS-Free S100A12 for generering og rensing av definerte ion-indusert oligomers er kritisk og ekstra oppmerksomhet bør vies til deres påfølgende rensing for å unngå eventuelle Re-introduksjon av endotoksin via buffere eller kolonne materiale og dermed ytterligere protein-krevende LPS-tømming via endotoksin fjerning harpiks.
Relevansen av oligomerisering for biologisk funksjon av proteiner kan vurderes på forskjellige måter. I tilfelle S100A12, brukte vi overflate Plasmon resonans samt målrettede aminosyre utvekslinger på ion-bindende områder og-for å mest presist definere protein-komplekset i stand til å binde og signalisere gjennom TLR4-vi ansatt kjemiske Cross Linking av ca2 +/Zn2 + -pulserende REKOMBINANT S100A1216. Kjemisk Cross Linking av S100A12 under ulike ioniske forhold snap-fryser en kortvarig tilstand, inkludert flere oligomer former som er i overgangen. Fra eksperimenter med ion-titrering definerte vi betingelser der dimeric, tetramerisk eller hexameric oligomers kan fastslås som den dominerende oligomers16. I tillegg har tidligere eksperimenter vist at et overskudd av ioner er gunstig for sammenlignbare, stabile Cross Linking og påfølgende rensing, selv om oligomerisering kan også bli indusert ved betydelig lavere ion konsentrasjoner. Imidlertid, rensing disse oligomers av størrelse-utelukkelse kromatografi resultater inne fint, bortsett fra ikke absolutt atskillelse. Likevel, den selektive berikelse av oligomers gir pålitelig nedstrøms analyser.
Oppsummert gir denne protokollen en metode for rensing av LPS-Free Human S100A12 eller relaterte kalsium bindende proteiner. For å fikse ion-indusert conformational endringer, kjemiske Cross Linking og påfølgende komplekse separasjon av størrelse-utelukkelse kromatografi er et nyttig verktøy for å forstå relevansen av protein oligomerisering for nedstrøms biologiske prosesser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av tilskudd fra intramural innovative medisinske forskningsprogram av Muenster University medisinsk fakultet (KE121201 til C.K.) og den tyske Research Foundation (DFG, Fo354/3-1 til D.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha - OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/mL) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
References
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
- Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
- Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
- Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
- Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).
- Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
- Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
- Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
- Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
- Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
- Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
- Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
- GE Healthcare. Strategies for Protein Purification. Handbook. , Freiburg, Germany. (2010).
- Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
- Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
- Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
- Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
- Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
- Endotoxin Removal. Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
- Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
- Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
- Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).
