Summary
Detta protokoll beskriver en reningsmetod för rekombinant taggfritt kalcium bindnings protein S100A12 och dess Jon-inducerad oligomerer för humana monocytstimuleringstester.
Abstract
I detta protokoll beskriver vi en metod för att rena humant kalcium-bindande protein S100A12 och dess Jon-inducerad oligomerer från Escherichia coli kultur för immun cell stimulationer. Detta protokoll är baserat på en tvåstegs kromatografistrategi, som omfattar protein för rening på en anjonbyteskromatografi och ett efterföljande polersteg på en hydrofoba-interaktionskolonn. Denna strategi producerar S100A12 protein med hög renhet och avkastning till hanterbara kostnader. För funktionella analyser på immunceller krävs en noggrann övervakning och ytterligare rengöringsåtgärder för att erhålla endotoxin-fritt protein. Merparten av endotoxinet kontamineringar kan uteslutas genom anjonbyteskromatografi. För att tömma rester av föroreningar, beskriver detta protokoll ett avlägsnande steg med centrifugalfilter. Beroende på den tillgängliga Jon-styrka S100A12 kan ordna i olika homomultimers. För att undersöka sambandet mellan struktur och funktion, beskriver detta protokoll ytterligare jonbehandling av S100A12 protein följt av kemisk tvärbindning för att stabilisera S100A12 oligomerer och deras efterföljande separation efter storleks uteslutning Kromatografi. Slutligen beskriver vi en cellbaserad analys som bekräftar den biologiska aktiviteten hos det renade proteinet och bekräftar LPS-fri beredning.
Introduction
S100A12 är ett kalcium bindnings protein som huvudsakligen framställs av humana granulocyter. Proteinet är överuttryckt under (systemisk) inflammation och dess serumnivåer, särskilt i (Auto) inflammatoriska sjukdomar som systemisk juvenil idiopatisk artrit (sJIA), familjär medelhavs feber (FMF) eller Kawasakis sjukdom (KD) kan informera om sjukdomsaktivitet och behandlingssvar. Beroende på mönsterigenkänning receptorer (PRRs) såsom Toll-liknande receptorer (TLRs), det medfödda immunförsvaret kan aktiveras av patogen-associerade molekylära mönster (PAMPs) som lipopolysackarider (LPS) eller skada associerade molekylära mönster (DAMPs; kallas också "alarmins"). DAMPs är endogena molekyler såsom cellulära proteiner, lipider eller nukleinsyror1. Fukt-funktioner är väl beskrivna för medlemmarna i calgranulin protein familjen, S100A8/A9 och S100A122, som också rapporteras att fungera som tvåvärda metall Ion-kelering antimikrobiella peptider3,4, 5,6. Beroende på tillgänglig jonstyrka kan S100A12, liksom andra medlemmar av S100 familjen, arrangera i olika homomultimers och tills nyligen effekterna av S100A12-oligomerisation på PRR-interaktion, särskilt TLR4, var okänd.
Proteinernas monomerform (92 aminosyror, 10,2 kDa) består av två EF-hand Helix-loop-Helix strukturer som förbinds med en flexibel länkare. C-terminalen EF-hand innehåller det klassiska ca2 +-bindande motivet medan N-terminalen EF-hand uppvisar en S100 proteinspecifik utökad loop struktur ("pseudo-EF-hand") och avslöjar reducerad ca2 +-affinitet. Ca2 +-bindning av S100A12 kan inducera en större konformationsförändring i proteinerna C-Terminus, vilket resulterar i exponering av ett hydrofoba plåster på varje monomer och bildar Dimerization gränssnittet. Sålunda, under fysiologiska förhållanden, den minsta kvartärgeologi struktur som bildas av S100A12 är en icke-kovalent dimer (ca 21 kDa) där enskilda monomerer är i antiparallell orientering. När arrangeras som dimer, S100A12 rapporteras till binda Zn2 + samt andra tvåvärda metalljoner, e.g., Cu2 + med hög affinitet7. Dessa joner koordineras på S100A12 dimer att samverka vid amino syror H15 och D25 av en subenhet och H85 as well as H89 av anti-parallellingen annan subenhet8,9,10. Medan tidigare studier föreslår att Zn2 +-Loaded S100A12 kan inducera proteiners organisation till Homo-tetramers (44 kDa) och att resultera i ökad ca2 +-affinitet11,12, senaste metalltitrering studier6 föreslå ca2 +-bindande av S100A12 att öka proteinens affinitet till Zn2 +. När S100A12 EF-händerna är fullt upptagna av ca2 +, är ytterligare ca2 + tänkt att binda mellan dimers, utlöser hexamer formation (ca 63 kDa). Arkitekturen av den hexameric kvartenär strukturerar är klart olik från det av tetrameren. Det föreslås att tetramer gränssnittet störs för att ge upphov till nya dimer-dimer gränssnitt som gynnar hexamer formation10. S100A12 är nästan uteslutande uttrycks av humana granulocyter där det utgör cirka 5% av alla cytosoliska protein13. I dess fuktigt fungera S100A12 beskrevs historically som agonist av mång--ligand receptor för avancerade glycation slut-produkter (ursinne), därefter kallat extracellulära nyidentifierat RAGE-binding protein (EN-RAGE)14. Även om vi tidigare rapporterat biokemiska S100A12-bindande för både RAGE och TLR415, vi visade nyligen mänskliga monocyter att reagera på S100A12 stimulering på ett TLR4-beroende sätt16. Detta kräver arrangemang av S100A12 i sin ca2 +/Zn2 +-inducerad hexameric kvartenär struktur16.
Här beskriver vi en renings procedur för rekombinant human S100A12 och dess Jon-inducerad oligomerer för immun cells stimuleringar16,17. Detta är baserat på en tvåstegs kromatografistrategi, som inledningsvis innehåller en anjonbyteskolumn för att isolera och koncentrera proteinet och ta bort bulkföroreningar (t. ex. endotoxiner/lipopolysackarider)18. Jonbyteskromatografi hartser separerar proteiner på grundval av olika netto ytladdningar. För sura proteiner som S100A12 (isoelektrisk punkt 5,81), ett buffertsystem med ett pH på 8,5 och en stark anjonbytarharts leder till en bra separation. Bundna proteiner var eluerade med en hög salt buffert gradient. Med en ökning av jonisk styrka negativa joner i elutionsbufferten konkurrera med proteiner för laddningar på ytan av hartset. Proteiner individuellt eluera beroende på deras netto avgift och i följd av detta, buffertarna beskrivs häri gör det möjligt att isolera och koncentrera överuttryckt S100A12 protein. På grund av negativt laddade grupper i lipopolysackarider, dessa molekyler binder också till anjonbytarhartser. Emellertid resulterar deras högre netto laddning i mer sistnämnd eluering i den applicerade High-salt lutningen. Det andra steget i renings förfarandet har införts för polering ändamål. Detta utnyttjar kalcium bindnings förmågan hos S100A12 och avlägsnar kvarvarande orenheter på en hydrofoba-interaktionskolonn. Kalcium bindning av S100A12 leder till en konformationsförändring och en exponering av hydrofoba fläckar på ytan av proteinet. På detta villkor, S100A12 interagerar med hydrofoba ytan av hartset. Vid kalcium-kelering av EDTA, denna interaktion är omvänd. I närvaro av joner, särskilt kalcium och zink, S100A12 arrangerar i homomeriska oligomerer. För att studera struktur-funktion relationer av de olika oligomererna, stabiliserades vi dimeric, tetrameriska och hexameric rekombinant S100A12 med en kemisk crosslinker och separerade komplexen på en storlek-uteslutning kromatografi kolonn. Slutligen, för att analysera funktionalitet och biologisk aktivitet av det renade proteinet och dess Jon-inducerad oligomerer, cytokin frisättning av S100A12 och LPS stimuleras monocyt kan jämföras.
Olika metoder för rening av S100A12 har hittills beskrivits. Jackson et al.19publicerade till exempel ett protokoll med rening via en anjonbyteskolumn och en efterföljande kromatografi med storleks uteslutning. Rening polering på en storlek-uteslutning kolumn leder till goda resultat, men ― på grund av till exempel begränsad lastning volymer ― är mindre flexibel i skalbarhet. En annan metod, publicerad av Kiss et al.20, beskriver rening av märkta protein via ni2 + affinitetskolonn som första reningssteg, följt av enzymatisk klyvning för att ta bort taggen och ytterligare reningssteg. I motsats till de aforecited studierna19,20, det producerade proteinet som beskrivs i detta protokoll bestäms för experiment på immunceller. Därför är rester av endotoxin från bakteriekulturen en utmaning. Även om olika metoder för avlägsnande av endotoxin har beskrivits hittills finns det ingen enhetlig metod som fungerar lika bra för en given proteinlösning21,22.
Sammanfattnings, vårt protokoll kombinerar fördelarna med en tagg-fritt uttryck i ett bakterie system med effektiv endotoxin avlägsnande och hög avkastning av rent protein.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Anmärkning: Se kompletterande tabell 1 för beredning av buffertar och lagerlösningar.
1. protein uttryck i E. coli
-
Kloning
- Klon tag-fri mänsklig S100A12 (NCBI hänvisningen ordningsföljd: NP_ 005612.1) in i bakteriell uttryck vektor pET11b. För att uttrycka proteinet, omvandla konstruktionen till E. coli BL21 (de3).
-
Kultur
- Förbered en förrätt kultur genom att vaccinera en enda koloni i 5 mL av odlingssubstrat (LB buljong med 100 μg/mL ampicillin) i en 14 mL rund-botten röret. Inkubera över natten vid 37 ° c med skakning vid 220 RPM. Överför 2 − 4 mL av natten kultur till 400 mL av odlingssubstrat i en 2 L Erlenmayer kolv och inkubera kulturen vid 37 ° c med skakning vid 220 RPM.
Anmärkning: Initial täthet av den huvudsakliga kulturen bör vara optisk täthet på 600 Nm (OD600) = 0,1. - Övervaka OD600 under tillväxt. Inducera proteinuttryck genom tillsats av 1 M isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG) till en slutlig koncentration av 1 mM vid OD600 = 0,5 − 0,6. Inkubera vid 37 ° c och 220 RPM för ytterligare 4 h.
Anmärkning: I allmänhet, en OD600 av 0,6 kommer att nås efter 1.5 − 2.5 h vid 37 ° c. - Förbered 50 mL ultraljudsbehandling buffert genom upplösning 50 mM Tris, 50 mM NaCl och 1 mM etylendiamamin tetraättiksyra (EDTA) i 40 mL avjoniserat vatten. Justera pH med HCl till 8,0 och gör upp till 50 mL. Tillsätt proteashämmare (1 tablett per 50 ml lösning) och jämvikt bufferten till 4 ° c.
- Överför bakteriekulturen till lämpliga centrifugflaskor och skörda cellerna vid 3 200 x g i 30 min vid 4 ° c. Kassera supernatanten och Omsuspendera pelleten i 25 mL iskall ultraljudsbehandling buffert. Hädanefter hålla cellerna på is.
Obs: återsuspenderade celler kan förvaras vid-20 ° c för korttids-och vid-80 ° c för långtids.
- Förbered en förrätt kultur genom att vaccinera en enda koloni i 5 mL av odlingssubstrat (LB buljong med 100 μg/mL ampicillin) i en 14 mL rund-botten röret. Inkubera över natten vid 37 ° c med skakning vid 220 RPM. Överför 2 − 4 mL av natten kultur till 400 mL av odlingssubstrat i en 2 L Erlenmayer kolv och inkubera kulturen vid 37 ° c med skakning vid 220 RPM.
-
Ultraljudsbehandling/lysis
- Sonikera cellerna i 6 cykler om 30 s på is. Efter varje cykel, vilo celler för 30 − 60 s för att skydda cellerna från överhettning.
- Överför cellsuspensionen till en pre-kyld 50 mL höghastighets centrifugering röret och Centrifugera i en fast vinkel rotor vid 15 000 x g i 30 min vid 4 ° c. Dekantera den rensade lysate som innehåller de lösliga cytosoliska proteinerna i ett nytt 50 mL-rör och kassera pelleten.
2. protein rening
- Anjonbyteskromatografi
- Dialys
- Förbered anjonbyteskromatografi (AIEX) buffert A genom att lösa upp 20 mM Tris, 1 mM EDTA och 1 mM etylenglykol-bis (2-aminoetylether)-N, N, N ',, N'-tetraättiksyra (EGTA) i avjoniserat vatten och justera pH till 8,5 med HCl. För dialys Förbered 2 x 5 L och för kromatografi 2x 1 L AIEX buffert A.
Anmärkning: Dialysatvolymen bör vara ungefär 100 gånger provvolymen. Alla buffertar som används för kromatografi ska filtreras (0,45 μm eller mindre) och avgasas (t. ex. genom ultraljudsbad eller vakuum avgasning). - Skär dialys slang (molekylvikt cut-off [MWCO]: 3,5 kDa) i en lämplig längd med extra utrymme för luft för att säkerställa prov bärighet ovanför roterande rör bar.
Anmärkning: Glycerol bevarar membranet och måste avlägsnas före användning. - För att minska viskositeten hos den renade proteinlösningen från steg 1.3.2 späds lösningen med 25 mL AIEX-buffert A för att underlätta efterföljande applicering på kromatografikolonnen. Fäst den första stängningen på slangen, Ladda provet i membranet och fäst den andra stängningen minst 1 cm från den övre änden av slangen.
- Placera 5 L behållaren med AIEX buffert A på en rör platta, tillsätt en rör bar och membranet fylld med proteinlösning. Justera hastigheten för att rotera provet genom att undvika störningar med roterande rör-bar. Dialyze i 12 − 24 timmar vid 4 ° c och byt sedan ut dialysatbufferten (AIEX buffer A) mot en ny, förkyld beredning och fortsätt i minst 4 ytterligare timmar. Överför den dialyserade proteinlösningen till ett 50 mL-rör och filtrera genom en 0,45 μm filterenhet.
Anmärkning: Lagring möjlig.
- Förbered anjonbyteskromatografi (AIEX) buffert A genom att lösa upp 20 mM Tris, 1 mM EDTA och 1 mM etylenglykol-bis (2-aminoetylether)-N, N, N ',, N'-tetraättiksyra (EGTA) i avjoniserat vatten och justera pH till 8,5 med HCl. För dialys Förbered 2 x 5 L och för kromatografi 2x 1 L AIEX buffert A.
- Kromatografi
- Starta vätskekromatografisystemet (FPLC) med allmänt underhåll, Anslut kolonnbuffertar AIEX A och AIEX B (AIEX buffert A med 1 M NaCl) och anjonbytarharts som innehåller kolonnen. Se tabell 1 för allmänna kromatografiska parametrar.
Anmärkning: buffertar, kolonnen och FPLC-utrustning bör jämställas med samma temperatur innan körningen påbörjas (se kromatografiska parametrar i tabell 1, tabell 2, tabell 3, tabell 4och tabell 5). - Equilibrate kolonnen med AIEX buffert A, därefter Ladda provet på kolonnen och eluera proteinerna med en linjär gradient från 0% till 100% hög salt buffert (AIEX B). Se tabell 2 för ett detaljerat metod protokoll.
- Samla in 2 mL fraktioner under elueringen och analysera 10 μL av varje fraktion på en Coomassie-målat 15% natriumdodecylsulfat polyakrylamidgelelektrofores (SDS-PAGE). Poolfraktioner som innehåller S100A12-protein för dialys.
Anmärkning: Molekylvikten för S100A12 är 10 575 da.
- Dialys
- Kalciumberoende hydrofoba-interaktionskromatografi (HIC)
- Dialys
- Dialysera proteinlösningen mot 20 mM Tris, 140 mM NaCl, pH 7,5 enligt det förfarande som beskrivs i avsnitt 2.1.1.
- Kromatografi
- Bered 1 L kromatografibuffert HIC A genom att lösa upp 20 mM Tris, 140 mM NaCl och 25 mM CaCl2 i avjoniserat vatten och justera pH till 7,5. För HIC buffert B, Lös 20 mM Tris, 140 mM NaCl och 50 mM EDTA. Justera pH till 7,0 och filtrera och avgasa buffertarna. Tillsätt CaCl2 till provet till en slutkoncentration på 25 mm och filtrera genom 0,45 μm. jämvikt och prov till 4 ° c (kolonntemperatur).
- Starta vätskekromatografisystemet med allmänt underhåll, Anslut kolonnbuffertar HIC A och B och kolonnen. Se tabell 3 för ytterligare kromatografiska parametrar.
- Equilibrate kolonnen, Ladda provet och förlänga "tvätta obundna provet" blocket tills UV-signalen når baslinjen igen. Börja sedan eluera med en kalciumchelator som innehåller buffert (EDTA). Se tabell 4 för ett detaljerat metod protokoll.
Anmärkning: Tidigare experiment har visat att ett överskott av kalcium verkar vara fördelaktigt för bindning av S100A12 till kromatografiharts. - Samla toppfraktioner av 2 mL och analysera 10 μL av varje fraktion på en Coomassie-färgade 15% SDS-sida. Pool Pure S100A12 fraktioner och dialyze mot Hepes-buffrad saltlösning (HBS; 20 mM Heper, 140 mM NaCl, pH 7,0) enligt beskrivningen i avsnitt 2.1.1.
Notera: den monomerska S100A12 är 2980 M-1 cm-1.
- Dialys
3. detektering och avlägsnande av endotoxin
-
Detektion av endotoxin
- För att bestämma endotoxin kontaminering, mäta koncentrationer av utspädd protein från steg 2.2.2.4. (t. ex. 1:10 och 1:100 i HBS) med hjälp av en enzymkopplad immunsorbent analys (ELISA)-baserad, fluorescerande endotoxin detektions analys (tabell över material). Utför denna analys genom att följa tillverkarens protokoll.
Anmärkning: Använd nyberedda HBS lösningar upplöst i ultrarent avjoniserat vatten för att undvika (ny) endotoxin förorening av bufferten.
- För att bestämma endotoxin kontaminering, mäta koncentrationer av utspädd protein från steg 2.2.2.4. (t. ex. 1:10 och 1:100 i HBS) med hjälp av en enzymkopplad immunsorbent analys (ELISA)-baserad, fluorescerande endotoxin detektions analys (tabell över material). Utför denna analys genom att följa tillverkarens protokoll.
-
Avlägsnande av endotoxin och koncentration av protein
- Fyll på 15 mL prov på en 50 kDa centrifugalfilterenhet och centrifugera vid 3 200 x g och 10 ° c i ca 10 min. överför genomflödet till ett nytt kärl (på is) och fyll på och centrifugera 50 kDa-filterröret så ofta som det behövs. Tvätta filtermembranet två gånger med HBS för att återvinna så mycket protein som möjligt efter varje steg.
- Koncentrera S100A12-innehållande genomflöde genom att använda ett 3-kDa centrifugalfilter tills volymen reduceras till en femtedel upp till en tiondel av den initiala laddnings volymen (centrifugering vid 3 200 x g, 10 ° c i ca 30 min). Fyll på filtret så ofta som det behövs, skölj membranet och överför den koncentrerade lösningen till ett nytt rör efter varje påfyllning. Kassera genomflödet. Filtrera igen genom 50 kDa enligt beskrivningen ovan.
Anmärkning: Under detta förfarande är förlusten av protein anmärkningsvärt (upp till 50%), men den återstående protein preparatet är helt uttömda från LP-skivor. Denna metod ger cirka 10 − 15 mg protein från 400 mL kultur. - Justera proteinlösningen till 1 mg/mL med endotoxin-fria HBS och mät LPS-halten enligt beskrivningen i steg 3.1.1. Om proteinlösningen fortfarande inte testas som LPS-fri (< 0,1 EU/mL), eliminera rester av föroreningar med hjälp av en endotoxin avlägsnande harts.
Anmärkning: Med en proteinkoncentration på 1 mg/mL är kontaminering av 0,1 EU/mL LPS lika med cirka 0,01 PG LPS/μg protein.
4. kemisk tvärbindning och Oligomerseparation
-
Kemisk tvärbindning
- Förbered mycket ren (endotoxin-fri) lagerlösningar av 1 M CaCl2 och 100 mm ZnCl2 i ultrarent avjoniserat vatten (tabell över material). Använd den här bufferten, nygjord, för nästa steg.
- Inkubera 10 mL renat endotoxin-fritt S100A12 (koncentration 1 mg/mL i HBS) i 30 min vid rumstemperatur (RT) med antingen 25 mM CaCl2 för dimeric/tetrameric, eller 25 mm CaCl2 och 1 mm ZnCl2 för HEXAMERIC/tetrameric S100A12 Oligomerer.
- Förbered crosslinker genom att lösa 8 mg BS3 i 500 μl av endotoxin-fritt vatten direkt före användning (8 mg crosslinker för 10 ml Jon-spetsade proteinlösning motsvarar en slutlig koncentration av 1,4 mm). Blanda crosslinker och prov genom att Pipettera och inkubera i ytterligare 30 min vid RT. släpa reaktionen genom att tillsätta 1 M Tris-HCl, pH 7,5 till en slutlig koncentration av 50 mM och filtrera genom 0,45 μm.
-
Kromatografi med undantag av storlek
- Equilibrate det tvärbundna provet till 12 − 15 ° c (kolonntemperatur) och starta vätskekromatografisystemet med allmänt underhåll. Anslut kolumnbuffert (HBS) och kolumnen för storleks uteslutning. Se tabell 5 för detaljerad information.
- Equilibrate kolonnen i HBS, Ladda prov och samla toppfraktioner (1 − 2 mL) under körningen. Analysera dessa fraktioner på en 4 − 20% gradient SDS-sida och poolfraktioner med stora band av den önskade proteinkomplex.
Anmärkning: Hydrolys av NHS Ester reagens som BS3 i vattenlösningar resulterar i en stark absorbans vid 280 nm. Obunden crosslinker (molekylvikt: 572 g/mol) eluera i slutet av körningen och resulterar i en stark topp. - Koncentrera lösningarna genom att använda centrifugal filterenheter med MWCOs av 10 kDa (dimer), 30 kDa (tetramer) eller 50 kDa (hexamer). Bestäm den endotoxin förorening som beskrivs i avsnitt 3,1. Om det behövs, ta bort kvarvarande LP-skivor med ett endotoxin avlägsnande harts enligt tillverkarens rekommendationer (tabell över material).
5. funktionella tester på monocyter
- Beredning av monocyter
- Isolera monocyter från mänskliga Buffy Coats med densitet gradient centrifugering och efterföljande monocyt berikning med hjälp av en magnetisk pärla separation Kit (tabell över material).
Anmärkning: Detta protokoll kommer att resultera i cirka 5 − 7 x 107 monocyter (ett Buffy Coat) med en renhet av 83 − 95%. Eftersom antalet, men också reaktionsförmågan hos cellerna beror starkt på givaren, kan protokollet behöva skalas upp (beroende på det antal celler som krävs). - För densitetscentrifugering, jämvikt separations lösningen (täthet = 1,077 g/mL) till RT och överför 20 mL till 50 mL centrifugrör (2 rör per Buffy Coat). Späd ut blod från humant Buffy Coat med Hank ' s buffrade saltlösning (HBSS) till en total volym på 60 mL och skikt 30 mL av denna blandning omsorgsfullt ovanpå separations mediet. Centrifugera vid 550 x g för 35 min vid RT. avaktivera centrifugbromsen.
- Efter centrifugering finns de mononukleära perifera blodkropparna (PBMCs) placerade direkt ovanpå separations mediet. Överför dessa celler till ett nytt 50 mL centrifugrör, gör upp till 50 mL med HBSS och centrifugera vid 170 x g i 10 min. aspirera på supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i en liten volym av Hbss genom pipettering.
- Fyll röret upp till 50 mL och centrifugera vid 290 x g i 10 min. Aspirera supernatanten igen, Omsuspendera cellerna i Hbss (50 ml) och centrifugera vid 170 x g i 10 min. räkna cellerna och Omsuspendera dem i Cellsepareringsbuffert (tabell över material < /C9 >) till en koncentration av 5 x 107 celler/ml.
Anmärkning: I stället för HBSS, fosfatbuffrad saltlösning (PBS) kan användas för att tvätta cellerna. - För monocyt isolering från pbmcs, Använd en magnetisk negativ cell isolering kit och följ tillverkarens protokoll. Räkna monocyter och Omsuspendera i monocyt medium (RPMI 1640, 15% Värmeinaktiverade fetalt kalv serum [FCS], 4 mm L-glutamin, 100 U/ml penicillin/streptomycin) till en koncentration av 2 x 106 celler/ml.
- Till kultur monocyter, päls kultur rätter (t. ex., 100 mm) med en hydrofob, gas-permeable film, lämplig för suspension celler (tabell över material). Sterilisera plattorna med hjälp av UV-ljus i cirka 30 min. överför cellerna till dessa odlings plåtar och låt dem vila över natten vid 37 ° c och 5% CO2.
Anmärkning: Använd 15 − 25 mL cellsuspension per belagd maträtt.
- Isolera monocyter från mänskliga Buffy Coats med densitet gradient centrifugering och efterföljande monocyt berikning med hjälp av en magnetisk pärla separation Kit (tabell över material).
- Monocyte stimulering
- Stimulering med S100A12 (wildtype)
Anmärkning: För att särskilja obehandlad S100A12 (slutprodukt från avsnitt 2.2.2) från tvärbunden protein, S100A12 i följande kallas "wildtype".- Överför de utvilade cellerna till en 50 mL centrifugalslang och centrifugera vid 350 x g i 10 min. Aspirera supernatanten och Omsuspendera cellpelleten i stimuleringsmediet (rpmi 1640, 5% VÄRMEINAKTIVERADE FCS, 4 mm L-glutamin, 100 U/ml penicillin/ streptomycin) vid en koncentration av 2 x 106 celler/ml.
- För stimulering, Använd 24 väl upphängnings plattor och tillsätt 250 μL cellsuspension per brunn (0,5 x 106 celler/brunn). Tillsätt 50 μg/ml polymyxin B till de avsedda brunnarna, följt av antingen LPS i olika koncentrationer (25, 50, 100 och 200 pg/ml) eller vildtyp S100A12 (10, 20, 40, 60 μg/ml). Ytterligare, tillämpa proteinet antingen obehandlad eller värmedenaturerad (99 ° c, 10 min) i olika koncentrationer till cellerna.
Anmärkning: En kort värmebehandling denaturerar S100A12 protein men har mindre till ingen effekt på LP-skivor. - Inkubera plattorna för 4 h vid 37 ° c och 5% CO2. Skörda cellerna genom att överföra cellsuspensionen av varje brunn till 1,5 mL reaktionsrör. Centrifugera vid 500 x g i 10 min. överför supernatanterna till nya rör och mät TNFα-frisättning i olika spädningar (t. ex. 1:2, 1:5, 1:10) med ett humant TNFΑ Elisa-kit enligt tillverkarens rekommendationer.
- Stimulering med S100A12 oligomerer
- Förbered och utsäde ut monocyter i 24 väl upphängnings plattor som beskrivs ovan. Stimulera celler genom att lägga S100A12 oligomerer från steg 4.2.3. i olika molar koncentrationer (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
Anmärkning: För att jämföra förmågor hos de olika oligomererna för att stimulera monocyter, tillämpades oligomerer på cellerna i jämförbara molar koncentrationer. - Inkubera i 4 timmar vid 37 ° c och 5% CO2, skörda cellerna och mät TNFα-frisättning i supernatanterna enligt beskrivningen ovan.
- Förbered och utsäde ut monocyter i 24 väl upphängnings plattor som beskrivs ovan. Stimulera celler genom att lägga S100A12 oligomerer från steg 4.2.3. i olika molar koncentrationer (125 nM, 250 nM, 500 nM, 1000 nM).
- Stimulering med S100A12 (wildtype)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Efter för rening på AIEX-kolonnen (figur 1a-C) och påföljande kalciumberoende HIC (figur 2a, B) erhölls mycket rent protein (figur 2C). Dessutom visade mätningar av endotoxin lyckad LPS-borttagning. LPS-halten efter AIEX mättes i en 1:10-utspädning över detektionsgränsen för analysen, det vill säga över 500 EU/mL. Efter den första filtreringen genom en 50 kDa-filterenhet reducerades LPS-halten till 1 EU/mL. Efter koncentrationen med en 3 kDa-filterenhet och ytterligare filtrering genom 50 kDa var den uppmätta LPS-föroreningen 0,08 EU/mL.
Som en ytterligare kontroll, humana monocyter stimulerades med det producerade vildtyp proteinet (figur 3A, B). Polymyxin B behandling som upphäver TNFα-frisättning från LPS-stimulerade monocyter, som inte kan observeras med S100A12. Å andra sidan, värmebehandling av både LPS och S100A12 avskaffar proteiners förmåga att stimulera celler, medan detta inte påverkar cellulära svar på LPS-stimulering.
Protein exponering för olika joner resulterar i arrangemang av olika S100A12 oligomerer (figur 4a). Kemisk crosslinking gör det möjligt att fånga definierade komplex såsom dimers, tetramers, och multihexamererna samt övergångs stater (t. ex., "trimers", band på cirka 30 kDa). För att framkalla en uttalad förskjutning av oligomerbalansen före tvärbindningen tillämpades ett överskott av joner (figur 4b).
Isolerade oligomerer i lika molar koncentrationer (figur 5A-C) användes sedan för monocytstimulering för att jämföra signaleringsförmåga via PRRS. monocyt-stimulering med hexameric S100A12 resulterade i uttalad TNFα-frisättning (figur 6 ). Rester av cytokinfrisättning kunde upptäckas från celler som stimulerades med tetrameriska S100A12, medan behandling med dimeriskt protein inte inducerar TNFα-frisättning.
Figur 1: resultat av anjonbyteskromatografi. A) ettkromatogram med absorbans vid 280 nm (A280) och procentandelen Elueringbuffert B (streckad linje). Metodblock indikeras med A = tvätta obundna prov, B = linjär gradient med elutionsbuffert (buffert B), C = tvätta ur med buffert B, och D = återjämning i buffert A. (b) fokusera på de relevanta topparna med fraktionsnummer i rött. (C) valda fraktioner analyserades på 15% Coomassie-färgade SDS-sida. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: resultat av hydrofoba-interaktionskromatografi. A) ettkromatogram med absorbans vid 280 nm (A280) och procentandelen Elueringbuffert B (streckad linje). Metodblock indikeras med A = tvätta obundet prov, B = eluering med buffert B, och C = återjämning i buffert A.b) fokusera på de relevanta topparna med antal fraktions rör i rött. (C) analyserade fraktioner på 15% Coomassie-färgade SDS-sida. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: primära humana monocyter stimulerades vid indikerade koncentrationer. LPS (a) eller S100A12 (Wildtype, B) lämnades obehandlade eller värmedenaturerade (99 ° c, 10 min). Båda villkoren testades i närvaro och frånvaro av polymyxin B. vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: S100A12-proteinet tvärbunden med BS3 efter inkubering i HBS-buffert innehållande 5 mm ca2 + och indikerade Zn2 + koncentrationer. (A) ökning av Zn2 + koncentrationer inducera arrangemang av S100A12 i tetramer och multihexamererna vid separation på 4 − 20% Coomassie-färgade SDS-sida. B) representativa resultat av tvärbundna oligomerer med villkor som används för separation på en kolumn med storleks uteslutning. S100A12 var tvärbunden i närvaro av antingen 25 mM ca2 + (Lane 1) eller 25 mm ca2 + och 1 mm Zn2 + (Lane 2). (S100A12) 2 = dimer; (S100A12) 4 = tetramer; (S100A12) 6 = hexamer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: S100A12 oligomerer separerades på en kolumn med storleks uteslutning. Akromatogram av hexamer/tetramerseparation efter tvärbindning i HBS-buffert med 25 mm CaCl2 och 1 mm ZnCl2. Bkromatogram för tetramer/dimer separation i HBS-buffert med 25 mm CaCl2. Cexempel på poolade och koncentrerade oligomerer efter separering på en 4 − 15% gradient SDS-sida med Coomassie-färgade. Lane 1 = dimer; Lane 2 = tetramer; Lane 3 = hexamer. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: stimulering av monocyter med RENADE S100A12 oligomerer. TNFα-frisättning efter 4 h-inkubering kvantifierades med ELISA. Data visar medelvärdet från två oberoende experiment. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Säng volym (CV) | 75 mL |
| Övervaka | Absorbans vid 280 nM |
| Tryck Max | 3 bar |
| Kolumnbuffert A | 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, pH 8,5 |
| Kolumn buffert B | 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 M NaCl, pH 8,5 |
| Provvolym | Variabel |
| Flöde | 1 − 2 mL/min |
| Temperatur | 4 ° c |
Tabell 1: detaljerad information om de tillämpade parametrarna för anjonbyteskromatografi.
| Blockera | Volym | Buffert | Utlopp |
| Jämvikts | 1 − 2 kolumn volymer (CVs) | A | Avfall |
| Provbelastning | n/a | A | Avfall |
| Tvätta ur obundet prov | 1 CV | A | Hög volym utlopp |
| Lutning – eluering | 0 − 100% buffert B i 1 CV | A till B | Fraktions samlare |
| Tvätta ur – buffert B | 1 CV | B | Avfall |
| Återjämning | 2 meritförteckningar | A | Avfall |
Tabell 2: detaljerad information om den använda metoden för anjonbyteskromatografi.
| Säng volym (CV) | 125 mL |
| Övervaka | Absorbans vid 280 nM |
| Tryck Max | 4 bar |
| Kolumnbuffert A | 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 25 mM CaCl2, pH 7,5 |
| Kolumn buffert B | 20 mM Tris, 140 mM NaCl, 50 mM EDTA, pH 7,5 |
| Provvolym | Variabel |
| Flöde | 1 − 2 mL/min |
| Temperatur | 4 ° c |
Tabell 3: detaljerad information om tillämpade parametrar för hydrofoba-interaktionskromatografi.
| Blockera | Volym | Buffert | Utlopp |
| Jämvikts | 1 − 2 kolumn volymer (CVs) | A | Avfall |
| Provbelastning | n/a | A | Avfall |
| Tvätta ur obundet prov | 1 − 2 meritförteckningar | A | Hög volym utlopp |
| Eluering | 100% buffert B | B | Fraktions samlare |
| Tvätta ur – buffert B | 1 CV | B | Avfall |
| Återjämning | 2 meritförteckningar | A | Avfall |
Tabell 4: detaljerad information om den använda metoden för hydrofoba-interaktionskromatografi.
| Säng volym (CV) | 320 mL |
| Övervaka | Absorbans vid 280 nm |
| Tryck Max | 3 bar |
| Kolumnbuffert A | 20 mM Heper, 140 mM NaCl, pH 7,2 |
| Provvolym | Upp till 13 mL |
| Flöde | 1 − 1,5 mL/min |
| Temperatur | 12 − 15 ° c |
Tabell 5: detaljerad information om tillämpade parametrar för kromatografi med storleks uteslutning.
Kompletterande tabell 1: beredning av buffertar och lagerlösningar. Vänligen klicka här för att ladda ner denna fil.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll beskriver vi taggfria bakteriella uttryck för Human S100A12 och dess rening samt separation i olika Jon-inducerad oligomerer för immun cell stimulering. Jämfört med publicerad litteratur om S100A12 Proteinrening8,23,24, användning av hög CaCl2 (25 mm) i hydrofoba-interaktionskromatografi är att vår kunskap unik. Flera protokoll som tillämpar koncentrationer från 1 till 5 mM producerar rent protein, men vi observerade en flera gånger högre avkastning efter vårt tillvägagångssätt med 25 mM CaCl2 istället. Detta kan förklaras av en hierarki av protein interaktion med kolonnen material: S100A12 kan direkt binda till kolonnen material men överskottet av ca2 + kan också underlätta indirekt bindning av S100A12-dimers till redan kolumn bundet protein 8. höga ca2 + koncentrationer kan således förstora ytan tillgänglig för S100A12 rening. Eluering (genom att använda en linjär gradient) av S100A12 från HIC som en tidig (indirekt bunden S100A12) och en mycket sen topp (kolumn material bundet protein) kan stödja denna spekulation (data som inte visas).
För produktion av rekombinant S100A12 (liksom andra proteiner) vid hög avkastning och hanterbara kostnader, proteinuttryck i E. coli är fortfarande den metod för val. Men den oundvikliga kontaminering med bakteriella endotoxiner är fortfarande ett problem, när proteiner bestäms för cellodling experiment, särskilt i studier med medfödda immunceller. Till vår erfarenhet, även kommersiellt tillgängliga proteiner som uttryckligen deklareras för cellkultur användning kan innehålla endotoxin föroreningar upp till 1 EU/μg protein, som avsevärt kan skeva analyser. Därför är ett fullständigt avlägsnande av endotoxiner obligatoriskt. Endotoxin monomerer i lösning sträcker sig från molekylvikter på 10 till 20 kDa, men de kan bilda miceller och strukturer med högre molekylvikter. Bildandet av mycket stora strukturer är till exempel främjas genom bivalent joner21,25.
Enligt vårt protokoll, Vi verifierar endotoxin-fri produktion av S100A12 protein genom att kombinera högkänsliga endotoxin mätningar med monocyt stimulering analyser. Vi anser att en sådan kombination är särskilt meningsfull som en) låg-nivå endotoxin kontaminering kan vara svårt att bedöma beroende på känsligheten hos analysen och b) användning av polymyxin B som LPS-hämmare på monocyter kan resultera i svår att tolka data på grund av till exklusiva polymyxin B-effekter på cellerna26,27. Polymyxin B samt andra katjoniska peptider rapporteras binda LPS via negativt laddade lipid A28. Eftersom den spädningsvätska exponerade ytan av S100A12 också innehåller stora negativt laddade fläckar den observerade minskningen av TNFα-frisättning från S100A12-stimulerade humana monocyter i närvaro av polymyxin B (figur 3b) kan bero på en) ospecifik direkt bindning av polymyxin b till S100A12 och/eller b) direkta effekter av polymyxin b på stimulerade celler26,27. På grund av de kända begränsningarna av både detektion av lågnivå endotoxin förorening samt ospecifikt polymyxin B effekter, vårt protokoll innehåller ytterligare en värme-inaktivering steg för att tydligt skilja mellan LPS-och protein-medierad TLR4-signalering.
Användning av LPS-fria S100A12 för generering och rening av definierade Jon-inducerad oligomerer är kritisk och extra uppmärksamhet bör ägnas åt deras efterföljande rening för att undvika eventuellt återinförande av endotoxin via buffertar eller kolumn material och därmed ytterligare protein krävande LPS-utarmning via endotoxin avlägsnande hartser.
Relevansen av oligomerisering för proteiners biologiska funktion kan bedömas på olika sätt. Vid S100A12 använde vi ytan plasmon resonans samt riktade aminosyran utbyten på Jon-bindande platser och ― för att mest exakt definiera protein-komplex kunna binda och signalera genom TLR4 ― vi anställda kemisk tvärbindning av ca2 +/Zn2 + -pulsad rekombinant S100A1216. Kemisk tvärbindning av S100A12 under olika Joniska förhållanden Snap-fryser ett momentan tillstånd inklusive flera oligomeriska former som är i övergången. Från Jon titrering experiment definierade vi villkor enligt vilka dimeric, tetrameriska eller hexameric oligomerer kunde bestämmas som de dominerande oligomererna16. Dessutom har tidigare experiment visat att ett överskott av joner är fördelaktigt för jämförbara, stabila tvärbindning och efterföljande rening, även om oligomerisering också kan induceras vid betydligt lägre jonkoncentrationer. Men att rena dessa oligomerer av kromatografi med storleks uteslutning resulterar i god, men inte absolut separation. Fortfarande, selektiv berikning av oligomerer möjliggör tillförlitlig nedströms analyser.
Sammanfattnings, detta protokoll ger en metod för rening av LPS-fri Human S100A12 eller relaterade kalcium bindande proteiner. För att fixera Ion-inducerad kon Formations förändringar, kemisk tvärbindning och efterföljande komplex separation av storleks uteslutnings kromatografi är ett användbart verktyg för att förstå relevansen av proteinoligomerisering för nedströms biologiska processer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Denna studie stöddes av bidrag från interna innovativa medicinska forskningsprogram av Muenster University Medical fakultet (KE121201 till C.K.) och den tyska Research Foundation (DFG, Fo354/3-1 till D.F.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET11b vector | Novagen | ||
| BL21(DE3) competent E. coli | New England Biolabs | C2527 | |
| 100x Non-essential amino acids | Merck | K 0293 | |
| 25% HCl | Carl Roth | X897.1 | |
| 4−20% Mini-PROTEAN TGX Protein Gels | BioRad | 4561093 | |
| Ampicillin sodium salt | Carl Roth | HP62.1 | |
| BS3 (bis(sulfosuccinimidyl)suberate) - 50 mg | ThermoFisher Scientific | 21580 | |
| Calciumchlorid Dihydrat | Carl Roth | 5239.1 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Destaining Solution | BioRad | 1610438 | |
| Coomassie Briliant Blue R250 Staining Solution | BioRad | 1610436 | |
| EasySep Human Monocyte Enrichment Kit | Stemcell | 19059 | Magnetic negative cell isolation kit |
| EDTA disodium salt dihydrate | Carl Roth | 8043.1 | |
| EGTA | Carl Roth | 3054.3 | |
| EndoLISA | Hyglos | 609033 | Endotoxin detection assay |
| Endotoxin-Free Ultra Pure Water | Sigma-Aldrich | TMS-011-A | Ultrapure water for preparation of endotoxin-free buffers |
| EndoTrap red | Hyglos | 321063 | Endotoxin removal resin |
| FBS (heat-inactivated) | Gibco | 10270 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher Scientific | 14175053 | |
| Hepes | Carl Roth | 9105 | |
| Hepes (high quality, endotoxin testet) | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| hTNF-alpha - OptEia ELISA Set | BD | 555212 | |
| IPTG (isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid) | Carl Roth | CN08.1 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Merck | K 0282 | |
| LB-Medium | Carl Roth | X968.1 | |
| Lipopolysaccharides from E. coli O55:B5 | Merck | L6529 | |
| Pancoll, human | PAN Biotech | P04-60500 | Separation solution (density gradient centrifugation) |
| Penicillin/Streptomycin (10.000 U/mL) | Merck | A 2212 | |
| Phenyl Sepharose High Performance | GE Healthcare | 17-1082-01 | Resin for hydrophobic interaction chromatography |
| Polymyxin B | Invivogen | tlrl-pmb | |
| Protease inhibitor tablets | Roche | 11873580001 | |
| Q Sepharose Fast Flow | GE Healthcare | 17-0510-01 | Resin for anion-exchange chromatography |
| RoboSep buffer | Stemcell | 20104 | Cell separation buffer (section 5.1.4) |
| RPMI 1640 Medium | Merck | F 1215 | |
| Sodium chloride (NaCl) | Carl Roth | 3957.2 | |
| Sodium hydroxide | Carl Roth | P031.1 | |
| Tris Base | Carl Roth | 4855.3 | |
| Zinc chloride | Carl Roth | T887 | |
| Labware | |||
| 0,45 µm syringe filter | Merck | SLHA033SS | |
| 14 mL roundbottom tubes | BD | 352059 | |
| 2 L Erlenmyer flask | Carl Roth | LY98.1 | |
| 24 well suspension plates | Greiner | 662102 | |
| 5 L measuring beaker | Carl Roth | CKN3.1 | |
| 50 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430829 | |
| 50 mL high-speed centrifuge tubes | Eppendorf | 3,01,22,178 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 3 kDa | Merck | UFC900324 | |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit MWCO 50 kDa | Merck | UFC905024 | |
| Culture dish (100 mm) | Sarstedt | 83.3902 | |
| Dialysis Tubing Closures | Spectrum | 132738 | |
| EasySep magnet 'The Big Easy` | Stemcell | 18001 | |
| Fraction collector tubes 5 mL | Greiner | 115101 | |
| Lumox film, 25 µm, 305 mm x 40 m | Sarstedt | 94,60,77,316 | Film for monocyte culture plates |
| Spectra/Por Dialysis Membrane (3.5 kDa) | Spectrum | 132724 | |
| Steritop filter unit | Merck | SCGPT01RE | |
| Equipment | |||
| 37 °C Incubator (with shaking) | New Brunswick Scientific | Innova 42 | |
| ÄKTA purifier UPC 10 | GE Healthcare | FPLC System | |
| Fraction collector | GE Healthcare | Frac-920 | |
| Centrifuge (with rotor A-4-81) | Eppendorf | 5810R | |
| Fixed angle rotor | Eppendorf | F-34-6-38 | |
| Mini Protean Tetra Cell | BioRad | 1658000EDU | |
| NanoPhotometer | Implen | P330 | |
| Sonicator | Brandelin | UW2070 | |
| Fluorescence reader | Tecan | infinite M200PRO | |
| pH meter | Knick | 765 |
References
- Liston, A., Masters, S. L. Homeostasis-altering molecular processes as mechanisms of inflammasome activation. Nature Reviews Immunology. 17 (3), 208-214 (2017).
- Kessel, C., Holzinger, D., Foell, D. Phagocyte-derived S100 proteins in autoinflammation: putative role in pathogenesis and usefulness as biomarkers. Clinical Immunology. 147 (3), 229-241 (2013).
- Baker, T. M., Nakashige, T. G., Nolan, E. M., Neidig, M. L. Magnetic circular dichroism studies of iron(ii) binding to human calprotectin. Chemical Science. 8 (2), 1369-1377 (2017).
- Nakashige, T. G., Zhang, B., Krebs, C., Nolan, E. M. Human calprotectin is an iron-sequestering host-defense protein. Nature Chemical Biology. 11 (10), 765-771 (2015).
- Nakashige, T. G., Zygiel, E. M., Drennan, C. L., Nolan, E. M. Nickel Sequestration by the Host-Defense Protein Human Calprotectin. Journal of the American Chemical Society. 139 (26), 8828-8836 (2017).
- Cunden, L. S., Gaillard, A., Nolan, E. M. Calcium Ions Tune the Zinc-Sequestering Properties and Antimicrobial Activity of Human S100A12. Chemical Science. 7 (2), 1338-1348 (2016).
- Moroz, O. V., et al. Structure of the human S100A12-copper complex: implications for host-parasite defence. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 59 (Pt 5), 859-867 (2003).
- Moroz, O. V., Blagova, E. V., Wilkinson, A. J., Wilson, K. S., Bronstein, I. B. The crystal structures of human S100A12 in apo form and in complex with zinc: new insights into S100A12 oligomerisation. Journal of Molecular Biology. 391 (3), 536-551 (2009).
- Korndorfer, I. P., Brueckner, F., Skerra, A. The crystal structure of the human (S100A8/S100A9)2 heterotetramer, calprotectin, illustrates how conformational changes of interacting alpha-helices can determine specific association of two EF-hand proteins. Journal of Molecular Biology. 370 (5), 887-898 (2007).
- Moroz, O. V., et al. Both Ca2+ and Zn2+ are essential for S100A12 protein oligomerization and function. BMC Biochemistry. 10, 11 (2009).
- Baudier, J., Glasser, N., Gerard, D. Ions binding to S100 proteins. I. Calcium- and zinc-binding properties of bovine brain S100 alpha alpha, S100a (alpha beta), and S100b (beta beta) protein: Zn2+ regulates Ca2+ binding on S100b protein. Journal of Biological Chemistry. 261 (18), 8192-8203 (1986).
- Dell’Angelica, E. C., Schleicher, C. H., Santome, J. A. Primary structure and binding properties of calgranulin C, a novel S100-like calcium-binding protein from pig granulocytes. Journal of Biological Chemistry. 269 (46), 28929-28936 (1994).
- Vogl, T., et al. S100A12 is expressed exclusively by granulocytes and acts independently from MRP8 and MRP14. Journal of Biological Chemistry. 274 (36), 25291-25296 (1999).
- Hofmann, M. A., et al. RAGE mediates a novel proinflammatory axis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides. Cell. 97 (7), 889-901 (1999).
- Foell, D., et al. Proinflammatory S100A12 Can Activate Human Monocytes via Toll-like Receptor 4. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 187 (12), 1324-1334 (2013).
- Kessel, C., et al. Calcium and zinc tune autoinflammatory Toll-like receptor 4 signaling by S100A12. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 142 (4), 1370-1373 (2018).
- Armaroli, G., et al. Monocyte-Derived Interleukin-1beta As the Driver of S100A12-Induced Sterile Inflammatory Activation of Human Coronary Artery Endothelial Cells: Implications for the Pathogenesis of Kawasaki Disease. Arthritis & Rheumatology. 71 (5), 792-804 (2019).
- GE Healthcare. Strategies for Protein Purification. Handbook. , Freiburg, Germany. (2010).
- Jackson, E., Little, S., Franklin, D. S., Gaddy, J. A., Damo, S. M. Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12. Journal of Visualized Experiments. (123), (2017).
- Kiss, B., Ecsedi, P., Simon, M., Nyitray, L. Isolation and Characterization of S100 Protein-Protein Complexes. Methods in Molecular Biology. 1929, 325-338 (2019).
- Magalhaes, P. O., et al. Methods of endotoxin removal from biological preparations: a review. Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 10 (3), 388-404 (2007).
- Petsch, D., Anspach, F. B. Endotoxin removal from protein solutions. Journal of Biotechnology. 76 (2-3), 97-119 (2000).
- Heilmann, R. M., Suchodolski, J. S., Steiner, J. M. Purification and partial characterization of canine S100A12. Biochimie. 92 (12), 1914-1922 (2010).
- Hung, K. W., Hsu, C. C., Yu, C. Solution structure of human Ca2+-bound S100A12. Journal of Biomolecular NMR. 57 (3), 313-318 (2013).
- Endotoxin Removal. Application Note - Sartorius Stedim Biotech. , (2010).
- Hogasen, A. K. M., Abrahamsen, T. G. Polymyxin-B Stimulates Production of Complement Components and Cytokines in Human Monocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (2), 529-532 (1995).
- Valentinis, B., et al. Direct effects of polymyxin B on human dendritic cells maturation - The role of I kappa B-alpha/NF-kappa B and ERK1/2 pathways and adhesion. Journal of Biological Chemistry. 280 (14), 14264-14271 (2005).
- Teuber, M., Miller, I. R. Selective Binding of Polymyxin-B to Negatively Charged Lipid Monolayers. Biochimica Et Biophysica Acta. 467 (3), 280-289 (1977).
