Summary
यहाँ प्रस्तुत प्लाज्मिड डीएनए वितरण और वयस्क ज़ेब्राफ़िश टेलीनसेफेलॉन में ependymoglial सेल लेबलिंग के लिए एक इलेक्ट्रोपोट्रेशन विधि है। इस प्रोटोकॉल कल्पना और व्यक्तिगत ependymoglial कोशिकाओं का पता लगाने और आनुवंशिक जोड़तोड़ की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए इलेक्ट्रोपोट्रेशन लागू करने के लिए नई संभावनाओं को खोलता है करने के लिए एक त्वरित और कुशल तरीका है।
Abstract
विद्युत-संश्लेषण एक संक्रमण विधि है जिसमें कोशिका झिल्ली में अस्थायी छिद्र बनाने और इसकी पारगम्यता बढ़ाने के लिए कोशिकाओं पर विद्युत क्षेत्र लागू किया जाता है, जिससे कोशिका में विभिन्न अणुओं को पेश किया जा सकता है। इस पेपर में, इलेक्ट्रोपोरोनेशन का उपयोग एपेन्डीमोग्लियल कोशिकाओं को प्लाज्मिड ्सवेश करने के लिए किया जाता है, जो वयस्क जेब्राफिश टेलीनसेफेलॉन के वेंट्रिकुलर क्षेत्र को लाइन करते हैं। इन कोशिकाओं का एक अंश स्टेम सेल गुणों से पता चलता है और ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क में नए न्यूरॉन्स उत्पन्न करता है; इसलिए, उनके व्यवहार का अध्ययन neurogenesis और पुनर्जनन में उनकी भूमिका निर्धारित करने के लिए आवश्यक है. इलेक्ट्रोपोरिओशन के माध्यम से प्लाज्मिड की शुरूआत एक एकल ependymoglial सेल की लंबी अवधि के लेबलिंग और ट्रैकिंग सक्षम बनाता है। इसके अलावा, इस तरह के क्रे recombinase या Cas9 के रूप में प्लाज्मिड एकल ependymoglial कोशिकाओं को दिया जा सकता है, जो जीन पुनर्संयोजन या जीन संपादन सक्षम बनाता है और एक नियंत्रित में सेल के स्वायत्त जीन समारोह का आकलन करने के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है, प्राकृतिक वातावरण. अंत में, यह विस्तृत, कदम दर कदम electroporation प्रोटोकॉल एकल ependymoglial कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या में प्लाज्मिड के सफल परिचय प्राप्त करने के लिए प्रयोग किया जाता है.
Introduction
ज़ेब्राफ़िश एक चाकू घाव चोट के बाद मस्तिष्क पुनर्जनन की जांच करने के लिए उत्कृष्ट पशु मॉडल हैं। स्तनधारियों की तुलना में, विकासवादी सीढ़ी पर, कम विकसित प्रजातियों जैसे ज़ेब्राफ़िश आम तौर पर गठन neurogenesis और वयस्क तंत्रिका स्टेम सेल निवास के व्यापक क्षेत्रों की उच्च दर दिखाने के लिए, भर में नए न्यूरॉन्स की निरंतर पीढ़ी के लिए अग्रणी वयस्क जीवन में सबसे अधिक मस्तिष्क क्षेत्रों. यह सुविधा स्तनधारियों की तुलना में जेब्राफ़िश की काफी अधिक पुनर्योजी क्षमता के साथ सहसंबंधित प्रतीत होता है1, के रूप में ज़ेब्राफ़िश सबसे मस्तिष्क चोट मॉडल में नए न्यूरॉन्स कुशलतापूर्वक उत्पन्न करने के लिए उल्लेखनीय क्षमता है2का अध्ययन किया, 3,4,5,6,7,8. यहाँ, ज़ेब्राफ़िश टेलीनेसेलॉन का अध्ययन किया जाता है, क्योंकि यह वयस्कता में प्रमुख न्यूरोजेनेसिस के साथ एक मस्तिष्क क्षेत्र है। वयस्क तंत्रिकाजनन के ये क्षेत्र वयस्क स्तनधारी मस्तिष्क9,10,11में न्यूरोजेनिक क्षेत्रों के लिए समजात हैं .
जेब्राफिश टेलीनसेफेलॉन में प्रचुर तंत्रिकाजन्य क्षेत्र कोशिकाओं या एपेन्डीमोग्लिया कोशिकाओं जैसे रेडियल ग्लिया के अस्तित्व के कारण मौजूद होते हैं। Ependymoglial कोशिकाओं निवासी वयस्क तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं के रूप में कार्य और दोनों बरकरार और regenerating मस्तिष्क3,5में नए न्यूरॉन्स की पीढ़ी के लिए जिम्मेदार हैं . वंश अनुरेखण प्रयोगों से पता चला है कि वेंट्रिकुलर ependymoglia चोट के लिए प्रतिक्रिया है, तो proliferate और नए neuroblasts कि घाव साइट5की ओर पलायन उत्पन्न करते हैं. कारण जेब्राफिश टेलिफेलॉन की उत्क्रमित प्रकृति के कारण, एपेन्डीमोग्लियल कोशिकाएं वेंट्रिकुलर सतह को लाइन करती हैं और वेंट्रिकल दीवार का निर्माण करती हैं। पृष् ठ वेंट्रिकुलर भित् ति एक पृष् ठ एपेन्डीमल कोशिका परत द्वारा बनाई जाती है (चित्र 1क) महत्वपूर्ण बात यह है कि जेब्राफ़िश एपेन्डीमोग्लिया दोनों स्तनधारी रेडियल ग्लिया और एपेन्डीमल कोशिकाओं की विशेषताओं का प्रतीक है। लंबी रेडियल प्रक्रमों में रेडियल ग्लिया कोशिकाओं की एक विशिष्ट विशेषता होती है, जबकि कोशिकीय विस्तार और तंग संधि (साथ ही उनके वेंट्रिकुलर स्थिति) एपेन्डीमल कोशिकाओं की विशिष्ट विशेषताएं हैं12,13,14. इसलिए, इन कोशिकाओं को ependymoglial कोशिकाओं के रूप में संदर्भित कर रहे हैं.
पुनर्जनन के दौरान एकल ependymoglial कोशिकाओं के विवो व्यवहार में पालन करने के लिए, वे मज़बूती से लेबल की जरूरत है. फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी के लिए विवो सेल लेबलिंग के विभिन्न तरीकों का पहले वर्णन किया गया है, जैसे अंतर्जात पत्रकारों या लिपोफिलिकरंगों 15. इन विधियों, इलेक्ट्रोपोट्रेशन के विपरीत, समय की लंबी अवधि की आवश्यकता हो सकती है और अक्सर एकल सेल लेबलिंग या स्थायी दीर्घकालिक अनुरेखण की संभावना की पेशकश नहीं करते. इलेक्ट्रोपोरेशन, हालांकि (एकल सेल लेबलिंग के अलावा), मेजबान सेल में नए डीएनए शुरू करने की संभावना प्रदान करता है। इसके अतिरिक्त, कोशिकाओं में डी एन ए अंतरण के अन्य विधियों की तुलना में विद्युत-प्रचालकन को16,17,18,19के सर्वाधिक कुशल विधियों में से एक माना गया है ।
यहाँ प्रस्तुत एक इलेक्ट्रोपोरोनेशन प्रोटोकॉल है कि वयस्क ज़ेब्राफ़िश telencephalon में एकल ependymoglial कोशिकाओं लेबलिंग के उद्देश्य के लिए परिष्कृत किया गया है. इस प्रोटोकॉल एकल ependymoglial कोशिकाओं की लेबलिंग के लिए अनुमति देता है ताकि उन्हें एक लंबी अवधि20 पर पालन करने के लिए या एक सेल स्वायत्त तरीके से विशिष्ट रास्ते में हेरफेर करने के लिए21,22.
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Protocol
इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त सभी जानवरों को मानक पशुपालन शर्तों के तहत रखा गया था, और यूरोपीय संघ और ऊपरी बवेरिया की सरकार के हैंडलिंग दिशानिर्देशों और विनियमों के अनुसार प्रयोग किए गए हैं (एजेड 55.2-1-54-2532-0916)।
1. इलेक्ट्रोपोरेशन के लिए प्लास्मिड मिश्रण की तैयारी
- बाँझ पानी में ब्याज की प्लाज्मिड को कम करें और तेजी से हरे दाग स्टॉक समाधान जोड़ें [1 मिलीग्राम/ सुनिश्चित करें कि प्लाज्मिड की अंतिम सांद्रता 1 डिग्री ग्राम/जेडएल है। दाग को 3% से अधिक की सांद्रता में जोड़ें, क्योंकि इसका एकमात्र उद्देश्य समाधान को रंगना और वेंट्रिकुलर इंजेक्शन को विज़ुअल ामाल करना है।
- एक बार तैयार है, ऊपर और नीचे कई बार या उंगली दोहन से pipeting द्वारा प्लाज्मिड समाधान मिश्रण. उपयोग तक कमरे के तापमान (आरटी) पर स्टोर।
नोट: एक ही सेल में दो प्लाज्मिड के सह-इलेक्ट्रोपोरैशन के लिए, यह सुनिश्चित करें कि मिश्रण में प्रयुक्त प्रत्येक व्यक्ति प्लाज्मिड की सांद्रता कम से कम 0.8 एनजी/जेडएल है जिसमें 80%-90% सह-इलेक्ट्रोपोरेशन दक्षता प्राप्त करने के लिए 1:1 के मोलर अनुपात के साथ कम से कम 0.8 एनजी/जेडएल है।
2. इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन प्रक्रिया के लिए तैयारी
- सुई खींच उपकरण में इंजेक्शन के लिए आवश्यक ग्लास केशिकाओं (बाहरी व्यास 1 मिमी, आंतरिक व्यास 0.58 मिमी) तैयार करें।
- प्लाज्मिड की सही मात्रा इंजेक्ट करने के लिए (ऊपर देखें), दो प्रकाश और दो भारी भार के साथ 68.5 डिग्री सेल्सियस के तापमान पर केशिका खींचें (पुलर विनिर्देशों के लिए सामग्री की तालिका देखें)।
नोट: मामले में एक अलग खींचने का उपयोग किया जाता है, विद्युत वितरण मिश्रण की उचित मात्रा देने के लिए केशिका जांचना. - मैन्युअल रूप से 200 hPa (पी घुंडी मोड़ द्वारा) और 0 hPa के लगातार दबाव के एक इंजेक्शन दबाव के लिए इंजेक्शन डिवाइस सेट. मैन्युअल मैनुअल मोड के लिए इंजेक्शन समय सेट और पैर पेडल के साथ दबाव को नियंत्रित।
- इलेक्ट्रोपोट्रेशन डिवाइस को 54-57 V पर पांच दालों के साथ "LV मोड" पर सेट करें (25 एमएस प्रत्येक 1 s अंतराल के साथ). इलेक्ट्रोड डिवाइस से कनेक्ट करें।
- साफ मछली पानी के साथ एक मछली टैंक तैयार करें, जहां मछली इलेक्ट्रोपोट्रेशन प्रक्रिया के बाद संज्ञाहरण से जागृत किया जाएगा। मछली पूरी तरह से जागृत है जब तक पूरे वसूली अवधि के लिए हवा पंप से जुड़ी हवा पत्थर रखने के द्वारा पानी Aerate.
- एक नियमित रूप से रसोई स्पंज ले लो और स्पंज में एक अनुदैर्घ्य कटौती करने के लिए इंजेक्शन और electroporation प्रक्रिया के दौरान मछली पकड़ (पिछले प्रकाशनदेखें 3).
नोट: संभावित जहरीले रसायनों को हटाने के लिए रसोई स्पंज को नियमित रूप से धोया या आदान-प्रदान किया जाना चाहिए। - इंजेक्शन और इलेक्ट्रोपोरेशन सेटअप के बगल में अत्यधिक प्रवाहकीय बहुउद्देश्यीय अल्ट्रासाउंड जेल की एक छोटी राशि रखें।
नोट: यह पर्याप्त विद्युत चालकता सुनिश्चित करेगा, और इसके परिणामस्वरूप, पूरे टेलीनसेफेलॉन में इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं का वितरण।
3. ज़ेब्राफ़िश संज्ञाहरण
- एनेस्थेटिकेशन से पहले, आसुत जल में 0.2% MS222 के साथ संज्ञाहरण का स्टॉक समाधान तैयार करें और pH को Tris-HCl बफर के साथ 7 में समायोजित करें। इस शेयर को पतला करें 1:10 (यानी, करने के लिए 0.02% MS222) मछली के पानी का उपयोग कर.
- उन्हें इस काम के समाधान में रखने के द्वारा मछली Anesthetize जब तक शरीर और gills के आंदोलन को कम (आमतौर पर मिनट के एक जोड़े के लिए).
4. प्लाज़्मिड समाधान इंजेक्शन
- माइक्रोलोडर युक्तियों का उपयोग करके तैयार कांच केशिका को 10 डिग्री सेल्सियस प्लाज्मिड घोल के साथ भरें। केशिका के अंदर हवा के बुलबुले के गठन से बचें।
- इंजेक्शन डिवाइस पर मेनू/परिवर्तन कैपिलरी दबाएँ। सुई धारक में सुई डालें और सुरक्षित करें।
- 3.2x या 4x के आवर्धन के साथ एक स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत, ठीक अंत forceps का उपयोग कर केशिका की केवल टिप में कटौती. इंजेक्शन मोड में बदलें कैपिलरी मोड से इंजेक्शन डिवाइस स्विच, तो प्लाज्मिड समाधान सुई से बाहर और बिना किसी बाधा के आसानी से चल रहा है कि यह सुनिश्चित करने के लिए एक पैर पेडल के साथ दबाव लागू होते हैं।
- पशुपालन टैंक से मछली को संवेदनाहारी समाधान के साथ कंटेनर (प्लास्टिक बॉक्स) में स्थानांतरित करें। कुछ मिनट तक प्रतीक्षा करें जब तक कि गिलों की आवाजाही कम न हो जाए।
- पृष्ठीय पक्ष का सामना करना पड़ के साथ पूर्व गीला स्पंज में मछली प्लेस. प्रक्रिया की सटीकता सुनिश्चित करने के लिए स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत सभी निम्नलिखित इंजेक्शन चरणों को पूरा करें।
- 40 मिमी काटने बढ़त और 0.5 मिमी मोटाई के साथ स्टेनलेस स्टील से एक विच्छेदन सूक्ष्म चाकू का उपयोग करना, telencephalon के पीछे की ओर मछली खोपड़ी में एक छोटा सा छेद बनाने के लिए (चित्र 1B),बस ऑप्टिक tectum के साथ सीमा के बगल में.
नोट: यह कदम सावधानी से किया जाना चाहिए क्योंकि छेद बहुत छोटा और सतही होना चाहिए, मस्तिष्क क्षति से बचने के लिए केवल खोपड़ी में प्रवेश करना चाहिए। - मछली को आवश्यक के रूप में झुकाएं और छेद के माध्यम से केशिका टिप के प्रवेश को सुविधाजनक बनाने के लिए सही कोण में खोपड़ी की ओर कांच केशिका की नोक को उन्मुख करें।
- खोपड़ी में छेद के माध्यम से केशिका की नोक को सावधानी पूर्वक तब तक सम्मिलित करें जब तक कि यह टेलीनेसेफेलिक वेंट्रिकल तक न पहुँच जाए (चित्र 1खदेखें )। यह पृष्ठीय ependymal सेल परत के माध्यम से प्रवेश की आवश्यकता होगी. मस्तिष्क के ऊतकों के साथ संपर्क से बचने के लिए केशिका को बहुत गहराई से न डालें, विशेष रूप से सावधान रहें। गोलार्द्धों के बीच में केशिका को ठीक रखें, जो पृष्ठीय एपेन्डीमल परत को भेदने के बाद वेंट्रिकल के अंदर शेष है।
नोट: यह एक बहुत ही नाजुक कदम है। इस प्रक्रिया की सटीकता इस तरह के पीतल24के रूप में pigmentation उत्परिवर्ती लाइनों का उपयोग कर सुधार हुआ है, इंजेक्शन के दौरान कांच केशिका स्थिति के बेहतर दृश्य की अनुमति. - वेंट्रिकल के अंदर केशिका टिप के साथ, के बारे में के लिए पैर पेडल के साथ दबाव लागू करने से प्लाज्मिड समाधान इंजेक्ट 10 s, जो लगभग 1 $L के लिए मेल खाती है.
नोट: यदि सुई खींचने, केशिकाओं या इंजेक्टर को बदलते हुए, सिस्टम को हमेशा 1 $L प्लाज्मिड समाधान वितरित करने के लिए कैलिब्रेट किया जाना चाहिए। अंशांकन एक खनिज तेल (उदा., पैराफिन तेल) में निष्कासित प्लाज्मिड छोटी बूंद के व्यास को मापने और बाद में छोटी बूंद की मात्रा की गणना करके किया जा सकता है। इंजेक्शन के 10 s के बाद, वहाँ होना चाहिए $1 $L प्लाज्मिड तरल खनिज तेल में निष्कासित. - निलय भर में तरल के प्रसार को देखकर पिछले कदम की सफलता की पुष्टि करें।
5. विद्युत
- अभी भी स्पंज में पकड़े हुए इंजेक्शन सेट अप से मछली निकालें.
- अल्ट्रासाउंड जेल में इलेक्ट्रोड की नोक के भीतरी पक्ष को विसर्जित कर दिया।
- अल्ट्रासाउंड जेल की एक छोटी राशि के साथ मछली telencephalon कवर.
- इलेक्ट्रोड के बीच मछली के सिर की स्थिति, मछली के सिर के अधर पक्ष पर सकारात्मक इलेक्ट्रोड रखने और पृष्ठीय पक्ष पर नकारात्मक इलेक्ट्रोड (चित्र 1C),जबकि अभी भी स्पंज में मछली के शरीर पकड़े. यह उपवेंट्रिकुलर क्षेत्र में स्थित विद्युतपोरेट एपेन्डीमोग्लिया के लिए आवश्यक धारा के प्रवाह की दिशा निर्धारित करता है।
- इलेक्ट्रोडों को धीरे-धीरे और ठीक से टेलीनसेफेलॉन के विरुद्ध दबाएं (चित्र 1ै) । पैर पेडल के साथ धारा प्रशासन. सभी पांच दालों समाप्त कर रहे हैं जब तक जगह में इलेक्ट्रोड पकड़ो.
6. मछली वसूली
- मछली पहले से तैयार, लगातार वातित टैंक में ठीक होने जब तक यह उठता है. किसी भी संभवतः विकसित दर्द से छुटकारा पाने के लिए खोपड़ी पर लिडकेन जेल लागू किया जा सकता है।
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Representative Results
वर्णित इलेक्ट्रोपोरोनेशन विधि में प्लाज्मिड डीएनए की डिलीवरी की अनुमति देता है ependymoglial कोशिकाओं में, जो सतही रूप से ज़ेब्राफ़िश टेलीनेफेलॉन में स्थित हैं और सिर्फ पृष्ठीय ependymal कोशिका परत के तहत (चित्र 1A)।
यदि वैद्युतस्थिति का परिणाम धनात्मक है, तो एकल ependymoglial कोशिकाओं को लेबल किया गया है (चित्र 2A,Bमें लाल कोशिकाओं ) अन्य ependymoglial कोशिकाओं के बीच देखा जा सकता है (चित्र 2क में सफेद,B). इलेक्ट्रोपोरेशन प्रक्रिया की दक्षता के आधार पर, एक उच्च (चित्र 2ए) या निम्न (चित्र 2ख) ependymoglial कोशिकाओं की संख्या लेबल किया जा सकता है. फिर भी, यह प्रोटोकॉल पहले प्रकाशित20की तुलना में लेबल ित कोशिकाओं की अधिक संख्या देता है, जो चित्र 3क और वीडियो 1में स्पष्ट है। यह उल्लेखनीय है कि लेबल कोशिकाओं के उच्चतम घनत्व ज्यादातर आंतरिक में उभरने के लिए जाता है, दोनों गोलार्द्धों के वेंट्रिकुलर पक्ष (चित्र 3A),जिस तरह से इंजेक्शन प्लाज्मिड तरल गोलार्द्धों के बीच वितरित करने के कारण. वीडियो 1 में,ज़ेब्राफ़िश टेलीनसेफेलॉन का एक गोलार्द्ध 3 डी में प्रस्तुत किया जाता है, और रेडियल प्रक्रियाओं के साथ ependymoglial कोशिकाओं की ओर से देखा जा सकता है। कोशिकाओं को सह electroporated और दो प्लाज्मिड, tdTomato-mem (लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन कोशिका झिल्ली के लिए लंगर) और H2B-YFP प्लाज्मिड (लेबलिंग नाभिक) के साथ लेबल कर रहे हैं. पीले घेरे से घिरे दो नाभिकों के कोशिका विभाजन का उल्लेख किया जाना चाहिए।
असफल विद्युतपोर्शन बहुत कम संख्या में परिणाम या कोई लेबल ependymoglial कोशिकाओं. यह परिणाम आम तौर पर गलत इंजेक्शन द्वारा समझाया जा सकता है, जिसमें केशिका की नोक पृष्ठीय ependymal सेल परत घुसना नहीं है. इस मामले में, प्लाज़्मिड समाधान टेलीनसेफेलिक वेंट्रिकल भरने के बजाय पृष्ठीय ependymal सेल परत के ऊपर फैलता है। इससे केवल एपेन्डीमल कोशिकाओं को केवल लेबल किया जा सकता है (चित्र 3ख)। पृष् ठ एपेन्डिमल कोशिकाएं (चित्र 3खमें नीले तीर ) इपेन्डीमोग्लियल कोशिकाओं से आकृति विज्ञान के अनुसार भिन्न होती हैं (चित्र 3कमें पीला तीर )। उनका सोमा बड़ा और घनाभ है, और उनके पास रेडियल, लम्बी प्रक्रियाएं नहीं हैं। यह एपेन्डीमोग्लिय ल परत के एक पार्श्व दृश्य की तुलना करने से स्पष्ट है (चित्र 4क,बी)। TdTomato-mem लेबल कोशिकाओं सबसे अधिक संभावना ependymal कोशिकाओं, जो ependymoglia की परत के ऊपर स्थित हैं (चित्र 4B) कर रहे हैं. इसके विपरीत, चित्र 4कमें, एक tdTomato-mem व्यक्त प्लाज्मिड व्यक्तिगत ependymoglial कोशिकाओं के लिए पेश किया है. इस प्रकार, वे अपने प्रारंभिक लेबलिंग के अलावा tdTomato-mem व्यक्त (इस मामले में, transgenic gfap:GFP मछली लाइन, सफेद में यहाँ देखा).
इस प्रोटोकॉल लेबलिंग और बाद में एक छोटी21 या लंबी अवधिके समय की अवधि में चोट के बाद ज़ेब्राफ़िश telencephalon में ependymoglial कोशिकाओं के व्यवहार के बाद सक्षम बनाता है. यह लाइव के माध्यम से पूरा किया है, विवो इमेजिंग में और पुनर्जनन और neurogenesis में उनकी भूमिकाओं के सवाल का पता करने में मदद करताहै.
चित्र 1: उत्क्रमित जेब्राफिश टेलेन्सेफेलॉन के कोरोनल अनुभाग का योजनाबद्ध निरूपण। (क)जेब्राफिश टेलीनसेफेलॉन के कोरोनल खंड की योजना, जो एन्टीमोग्लियाल कोशिकाओं की स्थिति पर प्रकाश डालती है, जो वेंट्रिकुलर सतह को अस्तर और अधर वेंट्रिकुलर दीवार का निर्माण कर रही है। डोर्सल एपेंडीमल परत दो गोलार्द्धों को पाटने और वेंट्रिकल (वी), दो सेल परतों के बीच में स्थित कवर कर रही है: एपेन्डीमोग्लियल और एपेन्डीमल। काले तीर और आंख का प्रतिनिधित्व संकेत दृश्य चित्र 2 और चित्र 3में दिखाए गए हैं। (ख) बाईं ओर, ऊपर से ली गई जेब्राफ़िश सिर की एक तस्वीर, एक सफेद डैश्ड लाइन के साथ टेलीनसेफेलॉन की स्थिति पर प्रकाश डालती है। एक कांच केशिका लाल रंग में चित्रित किया गया है, केशिका प्रविष्टि के लिए लक्ष्य साइट के साथ. सही पर चित्र ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क का एक योजनाबद्ध है जो लाल रंग में प्लाज्मिड इंजेक्शन की स्थिति को दर्शाता है। यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि कांच केशिका टेलीनसेफेलॉन को स्पर्श नहीं करता है और यह कि प्लाज्मिड को वेंट्रिकल में टेलीनेसिलॉन के ठीक ऊपर इंजेक्ट किया जाता है। टी - टेलिनेफेलॉन, ओटी - ऑप्टिक टेकम। (ग) बाईं ओर चित्रित जेब्राफ़िश शीर्ष (पक्ष दृश्य) की एक तस्वीर है, और दाईं ओर सिर (पक्ष दृश्य) का चित्रण है जो टेलीनसेफेलॉन को लक्षित करने के लिए इलेक्ट्रोड की स्थिति को दर्शाता है। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 2: माइक्रोग्राफ प्रभावी इलेक्ट्रोपोरेशन परिणाम दिखा. वयस्क जेब्राफिश टेलीनसेफेलॉन में इलेक्ट्रोपोरेटेड एपेन्डीमोग्लियल कोशिकाओं की एक (ए) बड़ा या (बी) की त्रि-आयामी प्रतिनिधित्व, जैसा कि ऊपर से देखा गया है। इलेक्ट्रोपोट्रेशन Tg में किया गया (gfap:GFP) मछली लाइन GFP फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त (सफेद में चित्रित) सभी ependymoglial कोशिकाओं में. अलग-अलग इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को pCS2-tdTomato-mem प्लाज्मिड3के साथ लेबल किया गया है। स्केल बार्स ] 50 $m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: Confocal micrographs सफल और असफल इलेक्ट्रोपोट्रेशन के बीच अंतर का चित्रण. (क)बड़ी संख्या में पीसीएस-टीडीटोमेटो-मेइलेक्ट्रोपोरेटेड इपेन्डीमोग्लिलियल कोशिकाओं के साथ BABB-स्पष्ट जेब्राफिश टेलीनसेफेलॉन (आरईएफ) की त्रि-आयामी शंख छवि। लंबे, लम्बी प्रक्रियाओं (पीले तीर) के साथ ependymoglial कोशिकाओं की आकृति विज्ञान ध्यान दिया जाना चाहिए। दोनों telencephalic गोलार्द्धों, पीले डैश्ड लाइनों के साथ प्रकाश डाला, देखा जा सकता है. (बी)पीसीएस2-टीडीटमाटर-मेम प्लाज़्मिड के असफल इलेक्ट्रोपोट्रेशन की कन्फोकल छवि। ज्यादातर पृष्ठीय ependymal कोशिकाओं लेबल रहे हैं, और कुछ ependymoglial कोशिकाओं tdTomato-mem प्लाज्मिड व्यक्त करते हैं. ependymal कोशिकाओं की आकृति विज्ञान में स्पष्ट अंतर (नीले तीर) ध्यान दिया जाना चाहिए. स्केल बार्स ] 50 $m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 4: इलेक्ट्रोपोरेटेड और गैर-इलेक्ट्रोपोरेटेड एपेन्डीमोग्लियाल कोशिकाओं के 3 डी पार्श्व दृश्य। (अ)त्रि-आयामी पार्श्व निरूपण विद्युतीकृत एपेन्डीमोग्लियल कोशिकाओं, दोनों Tg(gfap:GFP)और pCS2-tdTomato-mem (पीला तीर) के लिए सकारात्मक है। (ख) असफल विद्युतपोर्शन का 3डी पार्श्वीय निरूपण। Tg(gfap:GFP)ependymoglia परत के ऊपर pCS2-tdTomato-mem सकारात्मक कोशिकाओं के स्थान पर ध्यान दिया जाना चाहिए. सबसे अधिक संभावना पृष्ठीय ependymal परत कोशिकाओं विद्युतपोरेट (नीले तीर) थे. स्केल बार्स ] 30 m. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
वीडियो 1: ज़ेबराफ़िश टेलीनसेफेलॉन और इलेक्ट्रोपोरेटेड एपेन्डीमोग्लियल कोशिकाओं की 3 डी फिल्म। वीडियो 3 डी में ज़ेबराफ़िश telencephalon के एक गोलार्द्ध से पता चलता है. Ependymoglial कोशिकाओं को सह दो प्लाज्मिड के साथ electroporated हैं: tdTomato-mem (लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन कोशिका झिल्ली के लिए लंगर डाले) और H2B-YFP प्लाज्मिड (लेबलिंग नाभिक). व्यक्तिगत रूप से लेबल ependymoglia रेडियल प्रक्रियाओं है कि एक तरफ से देखा जा सकता है के साथ. येलो सर्कलएच 2बी-वाईएफपी लेबल वाले क्रोमैटिन द्वारा विज़ुअल किए गए माइटोटिक फिगर के साथ एपेन्डीमोग्लियल सेल को हाइलाइट करते हैं। कृपया यहाँ क्लिक करें इस वीडियो को देखने के लिए. (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)
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Discussion
यह इलेक्ट्रोपोट्रेशन प्रोटोकॉल व्यक्तिगत ependymoglial कोशिकाओं लेबलिंग की vivo विधि में एक विश्वसनीय है. प्रोटोकॉल न्यूरॉन्स या oligodendrocytes के रूप में अन्य सेल प्रकार लेबल करने के लिए एक और अनुकूलन की आवश्यकता हो सकती है. सफल लेबलिंग प्राप्त करने के लिए, विभिन्न प्रमोटरों वाले प्लाज्मिड का उपयोग किया जा सकता है। चिकन-बीटा actin प्रमोटर, eF1alpha, CMV और ubicuitin प्रमोटर पहले ependymoglia और उनकी संतति23में विभिन्न transgenes की अभिव्यक्ति ड्राइव करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. तथापि, ट्रांसजीन अभिव्यक्ति की विभिन्न गतिजता देखी गई जिन्हें ध्यान में रखा जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, CMV प्रमोटर संचालित transgene अभिव्यक्ति बहुत तेजी से है (अभिव्यक्ति 24 ज के बाद देखा जा सकता है), जबकि eF1alpha अधिक समय लगता है. लेबलिंग के अलावा, इलेक्ट्रोपोर्शन प्रोटोकॉल का उपयोग क्रे रिकॉमग्नेस या CRISPR Cas9तकनीक22के उपयोग के साथ जीन संपादन के एक तेज और सरल मंच के रूप में किया जा सकता है। इसके अलावा, फ्लिप-कैसेट25युक्त प्लाज्मिड और सेल प्रकार-विशिष्ट क्रे लाइनों में उनके इलेक्ट्रोपोरेशन का उपयोग एक विधि का स्पष्ट विस्तार के रूप में काम कर सकता है जो इसके बाद उत्पन्न एपेंडिमोग्लियल संतति में लेबलिंग या जीन-संपादन की अनुमति देता है। विद्युत्-पूजन।
इस प्रोटोकॉल में कई महत्वपूर्ण चरण हैं. सबसे पहले, इंजेक्शन कदम के दौरान, प्रयोगात्मक सावधान रहना चाहिए कि इंजेक्शन प्लाज्म राशि प्रत्येक व्यक्ति मछली के लिए बराबर है, इस तरह है कि लेबल कोशिकाओं की संख्या तुलनात्मक रूप से समान रहता है. यह कांच केशिका खोलने के आकार को नियंत्रित करके प्राप्त किया जा सकता है, जिसका अर्थ है कि प्रत्येक टिप की कटौती विभिन्न केशिकाओं के बीच स्थिर होना चाहिए या अंशांकन प्रत्येक व्यक्ति केशिका के लिए किया जाना चाहिए। इसके अतिरिक्त, इंजेक्शन की अवधि, एक पैर पेडल द्वारा विनियमित, प्रत्येक व्यक्ति इंजेक्शन के लिए एक ही होना चाहिए. दूसरा, सूक्ष्म चाकू के साथ बनाई गई खोपड़ी में एक छेद की उचित स्थिति टेलीनसेफेलॉन भर में प्लाज्मिड तरल के उचित फैलाव के लिए महत्वपूर्ण है। यह केशिका टिप के साथ पृष्ठीय ependymal सेल परत घुसना करने के लिए समान रूप से महत्वपूर्ण है, प्रोटोकॉल में कहा गया है के रूप में. इसके अलावा, यह भी आवश्यक है कि बनाया छेद बहुत बड़ा नहीं है के लिए प्लाज्मिड मिश्रण और मस्तिष्कमेरु द्रव telencephalon से बाहर लीक से रोकने के लिए. एक अन्य महत्वपूर्ण कदम लागू विद्युत धारा की ताकत है. यह सुनिश्चित करें कि इलेक्ट्रोपोरेशन डिवाइस के रूप में संभव के रूप में ठीक से काम कर रहा है बनाने के लिए महत्वपूर्ण है, इस तरह है कि लागू वर्तमान की ताकत स्क्रीन पर प्रदर्शित होने वोल्टेज से ज्यादा विचलित नहीं करता है, जो हमेशा सही नहीं है. यदि ये मान संगत नहीं हैं, तो इलेक्ट्रोपोरोनेशन डिवाइस पर विद्युत धारा की शक्ति को समायोजित करना आवश्यक है, क्योंकि अनुशंसित 54-57 वी की तुलना में एक प्रशासित धारा मछली के अस्तित्व से समझौता कर सकती है।
एक प्लाज्मिड वितरण और सेल लेबलिंग आमतौर पर क्षेत्र में इस्तेमाल के लिए अन्य तरीकों की तुलना में, electroporation स्पष्ट लाभ है. ऊपर उल्लिखित महत्वपूर्ण चरणों के बावजूद, यह बहुत कम होता है कि कोई इलेक्ट्रोपोरेटेड कोशिकाओं को नहीं देखा जा सकता है या पृष्ठीय एपेन्डीमल कोशिकाओं को गलती से विद्युतीकृत किया जाता है। आम तौर पर, इस इलेक्ट्रोपोट्रेशन प्रोटोकॉल की सफलता दर 90%-95% है और हम इलेक्ट्रोपोकेशन के बाद लगभग कोई TUNEL + कोशिकाओं का निरीक्षण करते हैं। उदाहरण के लिए lipofection के विपरीत, इलेक्ट्रोपोरेशन के दौरान, धनायनी liposomes (उदाहरण के लिए, lipofectamine) का उपयोग नहीं कर रहे हैं और इस प्रकार इसके उपयोग के साथ जुड़े विषाक्तता पूरी तरह से बचा जाता है26. पहले यह बताया गया था कि लिपोफेक्शन और इलेक्ट्रोपोरोन की समान दक्षता दर (20-50 सेल प्रति टेलिनेसिफेलॉन)27है। हालांकि, इस अनुकूलित प्रोटोकॉल आम तौर पर telencephalon प्रति 100-200 कोशिकाओं पैदावार. वायरल सदिशों की तुलना में, जैव सुरक्षा इलेक्ट्रोपोरेशन के साथ एक मुद्दा नहीं है।
इसके अलावा, आमतौर पर इस्तेमाल किया AAVs या lentiviruses ज़ेब्राफ़िश मस्तिष्क17,28में transgenes का पता लगाने योग्य अभिव्यक्ति का उत्पादन करने में विफल . अंत में, हालांकि क्रे-लोक्स प्रणाली आजकल आमतौर पर ज़ेब्राफ़िश में प्रयोग किया जाता है, प्लाज्मिड इलेक्ट्रोपोट्रेशन तेजी से है क्योंकि यह मछली प्रजनन और बढ़ रही है और व्यक्तिगत सेल लेबलिंग और अनुरेखण के लिए आवश्यक लंबे समय से इंतजार कर समय की आवश्यकता नहीं है। हालांकि, इस तरह की एक तकनीक सफल विद्युत पोर्शन और प्रयोगात्मक जानवरों के उच्च अस्तित्व दरों को प्राप्त करने के लिए अत्यधिक कुशल वैज्ञानिकों की आवश्यकता है (हम आम तौर पर 70%-80% की जीवित रहने की दर का अनुभव). यह दर भी प्रयोगकर्ता के आधार पर उतार-चढ़ाव की प्रवृत्ति होती है। प्रक्रिया सीखना अभ्यास की आवश्यकता है और आम तौर पर तीन परीक्षण लेता है. हालांकि, यह व्यक्ति की मैन्युअल निपुणता पर निर्भर है और कुछ मामलों में अधिक समय लग सकता है।
प्रस्तुत इलेक्ट्रोपोट्रेशन प्रोटोकॉल इष्टतम परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक सावधानियों के साथ ependymoglial कोशिकाओं की एक बड़ी संख्या electroporating के लिए एक तेजी से, अत्यधिक कुशल विधि है। वयस्क ज़ेब्राफ़िश टेलीनसेफेलॉन का विद्युतीकरण व्यक्तिगत एपेन्डीमोग्लियल कोशिकाओं को विज़ुअलाइज़ करने और न्यूरोजेनेसिस और पुनर्जनन प्रक्रियाओं में उनकी भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए महत्वपूर्ण है। हाल ही में, इलेक्ट्रोपोरोनेशन और StagR-Cas9 तकनीक22के माध्यम से जीन संपादन के माध्यम से वयस्क ज़ेब्राफ़िश टेलीनसेफेलॉन के कई जीनों के एक साथ विघटन में सफलता हासिल की गई है। यह आनुवंशिक जोड़तोड़ की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए विद्युत चोरी के कई संभावनाओं और भविष्य के अनुप्रयोगों को खोलता है.
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Disclosures
लेखकों को खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.
Acknowledgments
पांडुलिपि के संपादन के लिए जेम्स Copti के लिए विशेष धन्यवाद. हम भी आभारी जर्मन अनुसंधान फाउंडेशन (DFG) से जेएन के लिए धन SFB 870 और एसपीपी द्वारा "Olfaction के एकीकृत विश्लेषण" और SPP 1738 "नर्वस सिस्टम के विकास में गैर-कोडिंग आरएनए की भूमिका, प्लास्टिक और रोग", SPP1757 " Glial विषमता", और उत्कृष्टता रणनीति सिस्टम न्यूरोलॉजी के लिए म्यूनिख क्लस्टर के ढांचे के भीतर (EXC 2145 SyNergy - आईडी 390857198).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagent/Material | |||
| Fast Green | Sigma-Aldrich | F7258-25G | For coloring plasmid solution |
| MS222 | Sigma-Aldrich | A5040-25G | MS222 should be stored at RT (up to two weeks) and protected from light |
| Ultrasound gel | SignaGel, Parker laboratories INC. | 15-60 | Electrode Gel |
| Equipment | |||
| Air pump | TetraTec APS 50, 10l-60l | Can be bought in the pet shops | |
| BTX Tweezertrodes Electrodes | Platinum Tweezertrode, BTX Harvard Apparatus | 45-0486 | 1 mm diameter |
| Electroporation device | BTX ECM830 Square Wave Electroporation System, BTX Harvard Apparatus | 45-0662 | |
| Injection device | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | |
| Standard Wall Borosillicate Glass Capillary | Warner Instruments | 64-0766 | Model No: G100-4 |
| Microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Micro-knife | Fine Science Tools | 10056-12 | |
| Joystick micromanipulator | Narishige Japan | MN - 151 | |
| Needle holder | FemtoJet 4i, Eppendorf | 5252000013 | Needle holder comes together with the injection device |
| Needle pulling device | Narishige Japan | Model No: PC-10 | The PC-10 was discontinued by Narishige in 2017 and replaced by the PC-100 |
| Petri dishes | Greiner Bio-One International | 633161 |
References
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