Summary
该协议演示如何为在猪生命不同阶段安置在板条地板上的猪提供实用、有意义的环境富集，以及如何以非侵入性方式收集唾液样本，以测量皮质醇浓度，作为急性应激的生物标志物。
Abstract
由于猪肉是全球消费最多的肉类，养猪业的动物福利日益成为公众关注的主要问题，这带来了来自消费者、立法者和其他利益相关者的巨大压力，要求它们进行管理改革。改善这些动物的福祉。几项研究表明，为猪提供环境丰富，可以表达它们的自然行为，如生根和探索，以及在前筑巢，并且与减轻压力和改善产量有关和福利。然而，在提供环境富集时，应考虑许多因素，例如地板类型、排水和污水系统、猪的生活阶段、材料以及笔内的悬挂方法、高度和位置。本文的目的是（1）提供方法学信息，说明如何为猪提供相对简单和实用的有意义的环境富集，这些猪在猪的寿命的不同阶段被安置在板条地板上，（2）演示如何收集唾液样本以测量皮质醇浓度，作为急性应激的生物标志物。协议包括有关使用黄麻、棉绳、机架中的稻草以及可咀嚼的硅胶棒设备的信息，作为法工和哺乳笔、断奶剂和精加工笔中的环境浓缩。此外，还详细介绍了使用棉绳进行非侵入性唾液样本采集的皮质醇浓度分析。所提供的协议适用于旨在改善和监测动物福利的专业人员，包括研究和工业养猪业。
Introduction
猪肉是全世界消费最多的肉类，每年饲养和屠宰的生猪超过13亿头。近年来，养猪业的动物福利日益成为公众关注的主要问题，来自客户、立法者和其他利益相关者的巨大压力，要求它们进行管理改革，以改善其福祉。这些动物。几项研究表明，为猪提供环境富集与减轻压力、改善生产和福利有关，因为它允许猪表达其自然行为，如生根和探索，以及筑巢前远行3，4，5，6，7。
猪被认为是聪明的动物，具有高度好奇的性质;因此，如果没有一个合适的环境，猪可能会表现出立体行为和直接操纵社会行为对笔伴侣，这可能导致尾巴咬，以及其他伤害和压力8，9。因此，提供有意义的环境丰富是由专业人士建议的，在一些国家，甚至根据法规和立法，如欧盟理事会指令2008/120/EC5强制实施。
提供有意义的环境富集可能具有挑战性;它应满足猪在生活每个阶段的自然行为需求，并考虑到实际和技术的限制。在之前，提供筑巢材料与较短的持续时间以及在整个哺乳期和哺乳期新生小猪的存活率较高有关。此外，在具有环境富集的自由笔中，母体行为得到改善，以及小猪3、10、11、12、13的认知表现和体重增加。发完后，将猪（钳子、生长或完成者）从不同的垃圾或钢笔中分组，可能会有压力，对其它笔友造成攻击性，这可能导致14、15的伤害。因此，当混合不熟悉的猪时，提供有意义的环境丰富可以潜在地减少因挫折和攻击性或重定向生根行为而导致的不良行为的发生。
根据欧洲联盟理事会第2008/120/EC号指令（2001/93/EC设立），要求猪必须永久获得足够数量的材料，以便能够进行适当的调查和操纵活动，如稻草、干草、木材、锯末，蘑菇堆肥，泥炭或这5，6的混合物。然而，在许多农场，使用这些材料可能难以管理，因为它可能导致排水和污水系统的堵塞，特别是在地板板条的农场。不过，根据欧盟理事会的指令，只要允许猪进行适当的调查和操纵活动，农民就可以提供替代浓缩材料。
缺乏环境富集可能导致沮丧和压力3，这可能激活下丘脑垂体肾上腺（HPA）轴。在猪，以及人类和其他动物，压力通常导致从脑垂体分泌腺皮质激素（ACTH）。ACTH 与肾上腺皮质上的受体结合，刺激糖皮质激素皮质醇的肾上腺释放，该皮质醇被认为是压力的主要生物标志物，可在血液、尿液、唾液和头发中测量。唾液皮质醇是急性应激的标记物，因为它反映了其在血液中的生物活性浓度4。它的优点是非侵入性样品收集，不处理动物，通过棉绳提供作为环境富集16，17。头发皮质醇被用作慢性压力的标记，因为皮质醇随着时间的推移在头发中积累，可以提取和测量18，19;然而，它需要动物处理，重复取样的数量受头发生长速率的限制，而且分析更麻烦，因为它需要漫长的提取过程。尽管如此，唾液和头发皮质醇可能为动物福利提供补充信息。
本文的目的是（ 1 ）提供方法学信息，说明如何为猪提供相对简单和实用、有意义的环境富集，这些猪在猪生命的不同阶段被安置在板条地板上（和哺乳，和（2）演示如何非侵入性地收集唾液样本以测量皮质醇浓度，作为急性应激的生物标志物。
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Protocol
研究协议得到了希伯来大学机构动物护理和使用委员会（MD-16-14754-2）的道德认可。这项研究于2017年在以色列拉哈夫动物研究所和以色列耶路撒冷希伯来大学进行。
1 . 和哺乳期的环境富集协议
注：在这项研究中，母猪被安置在 / 哺乳笔中，在有限的时间内，从预计放生日期前的 3 - 5 天到放飞后 10 天 ;之后，将禁栏移除，允许母猪和小猪之间的自由移动和互动（如图1A所示）。然而，以下协议也适用于传统的板箱，其中母猪在整个哺乳期被限制。
- 在母猪移入其之前，将浓缩材料（黄麻和棉绳）挂在笔中，以便让母猪在前有筑巢式的行为。
- 对于每根放飞的钢笔/箱子，准备两块黄麻（20厘米宽，一米长）和两块100%天然、无色棉绳（直径2-3厘米），每根约一米长。
- 将黄麻和棉绳（双上手结）绑在笔/板条上，如图 1所示，从中间连接，使每块的两个自由端悬挂在地板上。黄麻和棉绳结的高度应略低于母猪的肩膀，而其自由端正好在地板上方（图1B-C）。
- 母猪通常对黄麻和棉绳感兴趣;他们经常拉和咀嚼它。因此，在脏污或成品时更换或重新填充材料。
注：在本研究中，材料每4-5天检查一次，并在需要时进行更换或重新填充。 - 小猪出生后，将黄麻和棉绳挂上，这样母猪和小猪就可以在安全的地方到达。通常，当两者都能接触到这些材料时，小猪从很小的时候就模仿他们的水坝。
注：作为补充，碎纸也可以作为环境富集，为母猪和小猪，在板条地板上。然而，排水系统和排污系统的兼容性，应严格审查在具体的农场。
2. 用于使用的用于使用的用于使用的用于使用草的环保方案（当无法提供吸管时）
注：在这项研究中，在分阴后，每两个垃圾被分组成一支一支的钳子。最佳办法是，在屠宰之前，群群应保持静态，无需将新的笔配合混合或引入笔中，以避免与等级相关的斗争和伤害。根据欧洲理事会第2008/120/EC号指令和以色列立法，笔中的空间津贴包括每头猪约20头猪，每头猪可使用0.3米2的无遮挡地面面积。由于技术原因，稻草无法为钳工提供，甚至在机架中也提供。当可以提供稻草时，使用从断尼到屠宰的完成者协议，详见协议第3节。
- 每支钢笔，准备一米长的100%天然无色棉绳，直径2-3厘米;每10头猪至少一块。将棉绳系在悬挂在天花板上的链子上或悬挂在吊杆上（使其与墙保持距离），如图 2 B所示。
- 将绳索最好放置在笔的"活动"区域的中心，靠近进纸器和饮酒者，远离笔壁（如图 2A所示），以便 360° 进入，这可以防止因竞争。
- 把绳子挂在高处，让猪用嘴很容易地到达。通常，结应该低于猪的肩膀，而绳索的自由端应刚到地板的正上方，不要碰它（图2）。
- 脏污或完污时更换或重新加注绳索。
注：本研究材料每4-5天检查一次，必要时进行更换或重新填充。 - 除了棉绳外，还提供可咀嚼的硅胶棒或类似可咀嚼设备（图2）。使用的设备（见材料表）包含四根可咀嚼棒，允许至少四头猪同时与设备交互。每10到15头猪提供一台设备。
- 用吊带吊住可咀嚼设备（包含在套件中），允许设备摆动移动;这增加了猪的活动和挑战，也允许更多的猪一次参与。
- 将设备放置在笔的活动区域的中心，远离笔壁，允许 360° 进入，这可以防止因竞争而导致的攻击行为。硅胶棒的末端应位于距地面 10 到 20 厘米的高度。
- 完成或脏污时更换硅胶棒。
注：在本研究中，只有在从换手笔移到精加工笔时，才需要更换硅胶棒。
3. 精加工器的环境浓缩协议
注：当稻草可以在整个期间提供时，从发工到屠宰，开始使用此协议，而不是只在完成者的笔中。
- 如图2C所示，将每支笔与放在机架、挂网或塔中的吸管一起。当提供在这样的设备，只有少量的稻草是提供给猪一次，其中大部分被咀嚼。因此，当稻草不能作为床上用品提供时，这种浓缩可用于板条地板。
注：在这项研究中，稻草被提供在商业机架（图2C）。 - 将草架悬挂在所有猪都能到达的高度，通常略低于肩部水平。将它们贴在墙上，让尽可能多的猪能够最方便地进入，最好是在"活动区"内。确保机架正确、安全地固定在墙上，以避免设备破损和受伤。
- 确保机架开始时完全充满吸管;每1-3天可添加少量新鲜稻草。或者，当机架为空时重新填充，通常每 7-10 天一次。
注：长稻草比切碎的稻草更好，以减少在组的进攻性，并满足猪的行为需要生根和探索20。 - 在适用的情况下，考虑在地板板条时，在机架下方放置一个收集托盘或垫子，以避免稻草被分散，并阻塞排水和污水系统（图2C）。由于稻草是主要为猪提供其生根和探索行为，垫子可以允许一些自由稻草的存在，在地面探索。
- 除了吸管外，还提供可咀嚼设备，如第 2 节所述。
- 当棉绳用于唾液收集时（详见下一节）时，在收集唾液后将绳索留在笔中，作为额外的浓缩。也可以提供其他棉绳，如第 2 节所述。
4. 唾液样本收集，用于皮质醇浓度分析
注：本节提供如何非侵入性收集唾液进行皮质醇浓度分析，作为急性应激的生物标志物;然而，唾液样本也可用于分析其他生物标志物，甚至用于筛选潜在的病原体。此外，头发皮质醇应测量，如果适用。
- 计划唾液采样为一天中的同一时间，以避免偏置，因为皮质醇分泌改变沿日由于生理昼夜节律，或由于喂养21。取样通常更容易在喂食前，最好是在一天的第二次喂食之前。
- 使用无色棉绳（直径为 2-3 厘米）。每12-15头猪通常需要一根绳子。
注：在这项研究中，商业，准备使用工具包用于收集唾液样本。 - 把绳子系在笔的中心，远离笔的壁。出于卫生原因，确保用于悬挂的绳索（棉绳和棒之间）无法由猪咀嚼，并且棉绳的自由端不接触地板（图 3A）。
- 解开绳索的自由端，以增加可用的可咀嚼表面（图3B）。
- 把绳子挂上15-30分钟。通常，猪对新提供的绳子感兴趣，并会在这段时间里咀嚼。通常，绝大多数的猪会接近绳子。
- 要从绳索中提取唾液，将绳索的游离部分放入无菌塑料袋中（如图 3D所示），然后从上到下从袋子外部施加压力，挤压绳索，直到有足够的液体（建议在至少2 mL）积聚在袋子的底部（图3E），然后从袋子上取下绳子。
注：在这项研究中，一个30厘米x40厘米的袋子包含在套件中。如果可能，此步骤应在笔中执行，而不切割悬挂线。这样，唾液提取通常更容易，绳子可以留在笔作为浓缩。如果唾液不足，可以使用绞刑剂（本研究不需要）。 - 要将唾液从袋子转移到无菌管中，请拉出绳索，并小心地将袋子的底部角落切至 50 mL 无菌塑料管上方（尽管每次重复分析通常只需要 400 μL，但建议至少 2 ml 用于收集n;图 3F.密封管子，用永久标记或预先准备好的贴纸（动物/笔、日期、时间、农场等）标记。
- 将唾液样品储存在装有冰袋的绝缘容器中，直到送到实验室。
- 在实验室中，离心唾液样品，直到污垢可以分离（8分钟在3000 x g）。清洁的唾液应用干净的一次性巴斯德移液器转移到体积较小的预标记无菌管中（例如，2 mL 螺钉盖冷冻管），以方便使用。样品可以立即分析，也可以保持冷冻在-20°C或以下的温度，直到分析。
- 在进行皮质醇浓度分析之前，应确认相关样品的身份，如果冷冻，应在室温下解冻样品。轻轻混合每个样品，然后在分析前再次离心，以去除可能干扰测定的污垢（3000 x g时8分钟）。
- 根据特定的试剂盒协议，使用经过验证的测定执行皮质醇浓度分析。
注：在这项研究中，唾液皮质醇样本通过酶链接免疫吸附剂测定，根据制造商指南以重复的方式测量。对于以前用绳子作为浓缩的猪来说，收集唾液会很容易，因为猪对绳子表现出浓厚的兴趣。然而，对于不熟悉绳子的猪来说，可能需要一段时间进行训练;因此，从第一次收集足够的唾液可能是不可能的。如果需要，绳索可以浸泡在苹果汁中进行训练（显然，在这种情况下，唾液不能用于分析）。如果需要从单独存放的猪身上提取唾液样本，则采集可能比从小组中采集的要更具挑战性，并且通常需要使用苹果汁浸泡绳索进行训练。由于模仿，对彼此挨家挨的个体进行取样，也可以鼓励咀嚼收集绳。
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Representative Results
在目前的研究中，16个垃圾（170头小猪）被随机分成两组处理;在一组，向8个垃圾（议定书第1-3节所述为"富集组"）提供了环境浓缩，而未提供给其他8个垃圾（"未富集类"）。两只垃圾在分在一组约20头猪中。每两周在每支笔中收集和分析唾液样本，以检测皮质醇浓度，如协议第4节所述。
在这项研究中，如果提供得当，母猪、小猪和猪对所有浓缩装置都表现出兴趣。母猪在前使用黄麻和棉绳。在哺乳期，当黄麻和棉绳都够到大坝和她的小猪时，小猪从2-3天大的时候就模仿他们的水坝;然而，当无法接触到母猪的材料时，小猪开始使用这种材料，通常是在超过一周的年龄之后。在哺乳和断奶笔中，黄麻和棉绳通常每4-5天更换或重新填充一次，而可咀嚼的硅胶棒只更换一次，当猪在70岁时从断奶笔移到完成者的笔。在精加工笔中，没有记录有排水和污水堵塞的记录。
与富集组相比，在屠宰前整个期间，非富集组的仔猪/猪死亡几率明显较高（OR = 3.38，95% CI = 1.05-10.83;P = 0.004）。在研究期间，每两周，即当天第二次喂食之前，成功采集唾液皮质醇样本。富足组的猪从一开始就对唾液收集棉绳表现出浓厚的兴趣;然而，在未富集的组唾液量在初始收集通常较低（2-10 mL），但从第二或第三次收集会话，它是类似的组之间。通常，从每根绳索中可轻松提取大于 30-40 mL 的体积。样品被冷冻储存（-80°C），直到分析。根据ELISA测量，与未富足的猪相比，富足猪的皮质醇浓度总体显著较低（P = 0.0044;图 4.
图 1 ：和哺乳期的环境富集。（A） 设计远行笔插图，演示了禁种栏的两个阶段，当母猪被限制时（阶段 R）或禁闭杆被移除（F级）后，允许母猪和她的自由移动和互动仔猪。黄麻和棉绳在远行前后的建议位置分别标为绿色和蓝色。（B） 母猪和她的小猪与棉绳 （CR） 和黄麻 （J） 的相互作用的图像，在远行/哺乳笔中作为环境富集。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：用于换装剂和精加工剂的环境富集。（A） 笔的示意图，显示"活动区"（蓝色 X）中悬挂环境材料的建议位置。（B-C）猪的图像丰富建议。（B） 在断尼笔中，棉绳 （CR） 作为环境浓缩或唾液样本收集，从天花板或杆 （P） 悬挂，使其与笔壁距离，可咀嚼硅胶棒装置 （BR） 悬挂在天花板的链条上（HC）。（C） 在完成者的笔中，稻草在机架（SR）、稻草塔（ST）或草篮（SB）中提供;垫子（M）可以覆盖每个稻草装置下面的板条地板。请点击此处查看此图的较大版本。
图3：使用棉绳的唾液取样过程。（A-F）唾液取样的六个主要阶段是图示的：悬挂绳子，解开绳子的自由端，让猪咀嚼它，从绳子中提取唾液进入塑料袋，然后转移到塑料管中。请点击此处查看此图的较大版本。
图4：富足和非富足猪的唾液皮质醇浓度。每两周用棉绳采集唾液样本，在笔的水平，从产间到屠宰，从浓缩和非富集的猪;皮质醇浓度由ELISA测量。对于此分析，所有样本都按组聚集在一起，而不考虑采样日期。与未富集组相比，富集组中的皮质醇浓度明显较低（曼恩·惠特尼测试;P = 0.0044）。结果以平均值 = SEM 显示。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
本文详细介绍了如何为猪提供简单实用的环境富集，这些猪在它们生命的不同阶段被安置在板条地板上，以及如何非侵入性地收集唾液样本以测量皮质醇浓度，作为急性应激的生物标志物。稻草作为床上用品被认为是最适合猪的环境富集之一，但在板条地板上可能不切实际。然而，相对便宜的替代品，如黄麻、棉绳、架子中的稻草和可咀嚼设备，可以实际、安全地应用。
这项研究中的唾液皮质醇浓度范围与以前的出版物17、22、23相当。富足和非富集动物之间唾液皮质醇浓度的显著差异符合环境富集可以减轻猪在点样本上的急性压力的假设，如以前的研究所示，至少达到一定年龄，只要昼夜节律不因长期慢性压力而受损24，25。如前所述，皮质醇可以在血液、尿液和唾液中作为急性应激的标记物，在头发中作为慢性压力的标记物。Meyers等人曾描述过测量头发皮质醇的规程，在评估动物福利时可能具有相关性。然而，在寻找急性应激的标记物时，应考虑任何取样本身可能会增加皮质醇释放，由于动物处理或手术16、26过程中引起的疼痛。因此，如目前研究所建议，非侵入性唾液取样是一种相关方法，可用于皮质醇分析，以及分析其他生物标志物，甚至用于筛选潜在的病原体27。
根据此协议收集唾液的主要挑战可能是从不熟悉绳索的猪身上收集唾液，因为它们可能避免咀嚼绳索，因此可能需要培训。训练可以使用浸泡在苹果汁中的绳索进行（在这种情况下，这些唾液样本不能用于分析）。如果需要从单独存放的猪身上提取唾液样本，则采集可能比从小组中采集的液样更具挑战性，通常需要使用苹果汁浸泡绳索进行训练。由于模仿，对彼此身边的个体进行取样，也可以鼓励咀嚼绳索。为了训练小猪，应该挂上绳子，让妈妈可以伸手，鼓励学习和早咀嚼。另一个可能的障碍，当使用棉绳致富或唾液收集是，它可以被捕获在某些品牌的耳标。如果发生，必须更换耳标或浓缩方法。
使用棉绳可以测量组水平的唾液皮质醇浓度，这为这种激素提供了适用的筛查。这种收集方法的一个可能缺点是，它可能不是对组内所有个体的代表性测量，因为它受每头猪在绳子中吸收的唾液量的影响。为了尽量减少这种缺点，建议提供足够的绳索数量，以留出足够的收集时间，以及执行多个重复收集。与现有的单独取样方法相比，收集本身对猪来说并不紧张，因为它被作为环境丰富，而不处理猪。
总之，猪可以在所有生命阶段，即使在板条地板上，使用黄麻，棉绳，稻草在机架和可咀嚼的设备环境丰富。浓缩的类型、悬挂方法以及笔内的高度和位置对其有效性非常重要。关于棉被的唾液采集，时间和悬挂建议对于成功取样至关重要。这些协议适用于旨在改善和监测动物福利的专业人员，包括研究和工业养猪业。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢 Lahav CRO 在其农场开展研究，并感谢农场团队在整个研究中提供了宝贵的技术帮助。这项研究由以色列农业和农村发展部首席科学家资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bite-Rite | Ikadan System USA Inc. | Consider ordering additional replaceable silicone sticks | |
| ELISA; Saliva Cortisol Kit | DRG International Inc. NJ, USA | Slv2930 | |
| HALM 60/80 CM | W. Domino A/S, DK | 49084/ 85 | |
| TEGO Swine Oral Fluids Kit | ITL BioMedical, USA | A100930 | Including everything needed for the saliva sampling protcol |
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