Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

منصة زرع نخاع العظم للتحقيق في دور الخلايا التطبيب في مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف

Published: March 17, 2020 doi: 10.3791/60083
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف هو أحد المضاعفات الرئيسية بعد زرع نخاع العظم اللوجيني. تلعب الخلايا التطبيبية دورًا حاسمًا في الإمراض لمرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف. المادة الحالية يصف جديدة زرع نخاع العظم منصة للتحقيق في دور الخلايا التشجرات في تطوير مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف وتأثير الكسب غير المشروع مقابل سرطان الدم.

Abstract

زرع نخاع العظم الأوجيني (BMT) هو علاج فعال للأورام الدموية بسبب تأثير الكسب غير المشروع مقابل سرطان الدم (GVL) للقضاء على الأورام. ومع ذلك ، يقتصر تطبيقه على تطور مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GVHD) ، وهو أحد المضاعفات الرئيسية لـ BMT. يتم استحضار GVHD عندما الخلايا التائية في الطعوم المانحة الاعترافالوانتيجين التي تعبر عنها الخلايا المتلقية ويشن الهجمات المناعية غير المرغوب فيها ضد الأنسجة السليمة المتلقي. وهكذا، تم تصميم العلاجات التقليدية لقمع المتبرع T-خلية alloreactivity. ومع ذلك، فإن هذه النُهج تضعف إلى حد كبير تأثير GVL بحيث لا يتم تحسين بقاء المتلقي. وبالتالي فإن فهم آثار النهج العلاجية على BMT و GVL و GVHD أمر ضروري. بسبب قدرات التبذير وإفراز السيتوكين لتحفيز الخلايا التائية المانحة، تلعب الخلايا التطبيبة المتلقية (DCs) دورًا مهمًا في تحريض GVHD. ولذلك، يصبح استهداف البلدان النامية المتلقية نهجاً محتملاً للسيطرة على الـ GVHD. يقدم هذا العمل وصفاً لمنصة BMT جديدة للتحقيق في كيفية تنظيم البلدان النامية المضيفة لاستجابات GVH وGVL بعد الزرع. كما يقدم نموذج BMT فعال لدراسة بيولوجيا GVHD وGVL بعد الزرع.

Introduction

زرع الخلايا الجذعية الدموية الأنجينية (BMT) هو علاج فعال لعلاج الأورام الخبيثة الدموية1،2 من خلال تأثير الكسب غير المشروع مقابل سرطان الدم (GVL)3. ومع ذلك ، فإن الخلايا اللمفاوية المانحة دائما ً ما تشن هجمات مناعية غير مرغوب فيها ضد الأنسجة المتلقية ، وهي عملية تسمى مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف (GVHD)4.

نماذج المورين من GVHD هي أداة فعالة لدراسة بيولوجيا GVHD واستجابة GVL5. الفئران هي نموذج الحيوان البحوث فعالة من حيث التكلفة. فهي صغيرة وفعالة مبوئيمع الجزيئات والبيولوجية في المراحل المبكرة من التنمية6. الفئران هي الحيوانات البحثية المثالية لدراسات التلاعب الجيني لأنها محددة وراثيا، وهو مثالي لدراسة المسارات البيولوجية والآليات6. وقد تم العديد من الفأرة الرئيسية المعقدة histocompatibility (MHC) نماذج غير متطابقة من GVHD راسخة، مثل C57BL/6 (H2ب)إلى BALB/c (H2د)وFVB (H2 q)→C57BL/6q(H2ب)5،,7. هذه هي نماذج قيمة بشكل خاص لتحديد دور أنواع الخلايا الفردية والجينات والعوامل التي تؤثر على GVHD. زرع من C57/BL/6 (H2ب)المتبرعين الوالدين إلى المتلقين مع الطفرات في MHC I (B6.C-H2bm1)و / أو MHC الثاني (B6.C-H2bm12)كشفت أن عدم التطابق في كل من الفئة MHC الأول والفئة الثانية هو شرط مهم لتطوير GVHD الحادة. وهذا يشير إلى أن كل من CD4+ وCD8+ الخلايا التائية مطلوبة لتطوير المرض7،8. وتشارك GVHD أيضا في سلسلة التهابية تعرف باسم 'عاصفة السيتوكين الموالية للالتهابات'9. طريقة التكييف الأكثر شيوعا في نماذج المورين هو تشعيع الجسم الكلي (TBI) عن طريق الأشعة السينية أو 137Cs. وهذا يؤدي إلى استئصال نخاع العظم للمتلقي، مما يسمح للمتبرع بتطعيم الخلايا الجذعية ومنع رفض الكسب غير المشروع. ويتم ذلك عن طريق الحد من انتشار الخلايا التائية المتلقية استجابة للخلايا المانحة. بالإضافة إلى ذلك ، تلعب التفاوتات الوراثية دورًا مهمًا في تحريض المرض ، والذي يعتمد أيضًا على MHC-mismatch81. لذلك ، تختلف جرعة التشعيع النقوي في سلالات الفئران المختلفة (على سبيل المثال ، BALB /c→ C57BL/6).

تنشيط الخلايا التائية المانحة من قبل مستضد المضيف الخلايا تقديم (APCs) أمر ضروري لتطوير GVHD. من بين APCs، الخلايا التشجرات (DCs) هي الأقوى. فهي قادرة على إحداث GVHD بشكل موروث بسبب الإنتضاد الأعلى، والتعبير عن جزيئات T-cell المشتركة المحفزة، وإنتاج السيتوكينات المؤيدة للالتهابات التي تستقطب الخلايا التائية إلى مجموعات فرعية مسببة للأمراض. البلدان النامية المتلقية حاسمة لتسهيل فتيلة الخلايا T والتعريفي GVHD بعد زرع11،12. وبناء على ذلك، أصبحت البلدان النامية أهدافا مثيرة للاهتمام في علاج GVHD12.

مطلوب TBI لتعزيز الترقيع الخلية المانحة. بسبب تأثير TBI ، يتم تنشيط البلدان النامية المتلقية والبقاء على قيد الحياة لفترة قصيرة بعد زرع12. وعلى الرغم من التقدم الكبير في استخدام الإضاءة الحيوية أو الفلور، فإن إنشاء نموذج فعال لدراسة دور البلدان النامية المتلقية في الـ GVHD لا يزال يشكل تحدياً.

لأن الخلايا التائية المانحة هي القوة الدافعة لنشاط GVL ، فإن استراتيجيات العلاج باستخدام الأدوية المثبطة للمناعة مثل المنشطات لقمع الخلايا التائية غالبًا ما تسبب انتكاسة الورم أو العدوى13. ولذلك، فإن استهداف البلدان النامية المتلقية قد يوفر نهجاً بديلاً لعلاج الـ GVHD مع الحفاظ على تأثير GVL وتجنب العدوى.

باختصار، توفر الدراسة الحالية منصة لفهم كيفية تنظيم أنواع مختلفة من الإشارات في البلدان النامية المتلقية لتطوير GVHD وتأثير GVL بعد BMT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تمت الموافقة على الإجراءات التجريبية من قبل لجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية واستخدامها في جامعة وسط فلوريدا.

1. التعريفي GVHD

ملاحظة: يتم إجراء زرع الخلايا نخاع العظم الأوجيني (BM) (الخطوة 1.2) في غضون 24 ساعة بعد التشعيع. يتم تنفيذ جميع الإجراءات الموضحة أدناه في بيئة معقمة. تنفيذ الإجراء في غطاء زراعة الأنسجة واستخدام الكواشف المصفاة.

  1. اليوم 0: إعداد الفئران المتلقي.
    1. استخدم فئران الإناث البرية (WT) على خلفية BALB/c (CD45.2+ H2kd+) ، 10-12 أسبوعًا من العمر كمستلمين.
    2. الأذن الوسم ووزن المستلمين قبل TBI. ثم، وضع ما يصل إلى 11 الفئران في غرفة التشعيع والاحتفاظ بها في الرادياتير. يشع بجرعة واحدة من 700 cGy لمدة 10−15 دقيقة.
    3. إعادة الحيوانات المشععة إلى الأقفاص وإيوها في مرافق خالية من مسببات الأمراض قبل عملية الزرع.
      ملاحظة: يجب أن يكون الحد الأدنى لوزن الجسم للمستلمين حوالي 20 جم. استخدم هذا الوزن كمرجع لحساب فقدان وزن الجسم خلال الفترة التجريبية.
  2. اليوم الأول: إعداد نخاع العظم المستنفد للخلايا التّتية (TCD-BM) من الفئران المانحة.
    1. القتل الرحيم CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 الفئران عن طريق ثاني أكسيد الكربونالاختناق والانتظار لمدة 2-3 دقيقة حتى أنهم فاقدو الوعي. إجراء خلع عنق الرحم كجريمة القتل الرحيم الثانوية إذا لزم الأمر.
    2. وضع كل ماوس على لوحة عمل نظيفة. تعقيم الفراء والجلد مع 70٪ ايزوبروبانول.
    3. جمع الساق وعظم الفخذ من كلا الساقين باستخدام ملقط ومقص. وضعها في الجليد الباردة RPMI تحتوي على 1٪ FCS و 100 U/mL البنسلين / ستربتومايسين و 2 مل L-الجلوتامين (1٪ RPMI) في أنابيب مخروطية 50 مل. تنظيف عظم الفخذ وعظام الساق جيدا عن طريق إزالة جميع أنسجة العضلات باستخدام ملقط ومقص. نقل عظم الفخذ والساق من أنابيب مخروطية 50 مل إلى طبق بيتري قطر92 ملم التي تحتوي على 1٪ RPMI.
    4. باستخدام مقص، وقطع نهايات عظم الفخذ أو الساق. ملء أنبوب 50 مل مع 25 مل من 1٪ RPMI 1640 المتوسطة. استخدم هذا لملء حقنة 3 مل متصلة بإبرة 26 G مع 3 مل من 1٪ RPMI. أدخل هذه الحقنة في العظام وادفع المكبس لطرد نخاع العظم (BM) من التجويف إلى أنبوب المجموعة مع 1٪ RPMI (~ 3 مل / عظم).
    5. كرر الخطوة 1.2.4 لجميع عظام الساق وعظم الفخذ المتبقية من الفئران المانحة الأخرى. إبقاء جميع أنابيب جمع على الجليد.
    6. جعل تعليق خلية واحدة عن طريق مسح قطع نخاع العظام من خلال مصفاة خلية شبكة 75 ميكرون. جمع تعليق خلية واحدة في أنبوب 50 مل.
    7. أنابيب الطرد المركزي في 800 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجة مئوية. يستنشق ويتجاهل الـ(سوبرناتانت) إعادة تعليق بيليه في PBS العازلة التي تحتوي على 0.5٪ الزلال مصل البقر (BSA) في 20 × 106 خلايا / مل. حفظ aliquot من 2 × 106 خلايا لتلطيخ النقاء.
    8. أضف الأجسام المضادة 1 في 0.05 ميكروغرام/106 خلايا14 واحتضان لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية. يغسل مرة واحدة مع 25 مل الجليد الباردة PBS. إعادة تعليق في 20 × 106/ مل في 0.5٪ BSA/10٪ تكمل الأرنب الشباب / 2٪ DNase (10،000 U/mL في العقيمة H2O). احتضان لمدة 45 دقيقة في 37 درجة مئوية وغسل 2x كما كان من قبل.
      ملاحظة: يتم استنفاد الخلايا التائية باستخدام mAb محددة لThy1، وهو بروتين يعبر عنه جميع الخلايا التائية، ولكن ليس الكريات البيض الأخرى.
    9. إعادة تعليق الخلايا في 20 مل من المخزن المؤقت PBS التي تحتوي على 0.5٪ BSA. عد خلايا نخاع العظام في 1٪ حمض الخليك باستخدام مقياس الهيموكيتومتر. الحفاظ على aliquot من 2 × 106 خلايا للتحقق من النقاء عن طريق قياس التدفق الخلوي بعد تنقية الخلايا.
      ملاحظة: يولد ماوس متبرع واحد عادةً حوالي 25 × 106 TCD-BM.
    10. استخدم قياس التدفق الخلوي لتأكيد نجاح استنفاد الخلايا التّتية. وصمة عار 1 × 106 خلايا، محفوظة من الخطوات 1.2.7 (قبل استنفاد الخلايا التائية) و 1.2.9 (TCD-BM بعد استنفاد الخلايا التائية) مع الأجسام المضادة التالية: α-CD3 (17A2)، α-CD4 (GK1.5)، وα-CD8α (53-6.7).
  3. اليوم الأول: إعداد الخلايا التائية من الفئران المانحة
    1. استخدم CD45.2+ H2kb+ C57BL/6 فئران من النوع البري (WT) كمتبرعين للخلايا التائية.
    2. القتل الرحيم C57BL/6 الفئران عن طريق ثاني أكسيد الكربون (CO2)الاختناق كما هو موضح في 1.2.1.
    3. تنظيف الفراء والجلد من الماوس جيدا مع الإيثانول 70٪. الطحال المكوس والغدد الليمفاوية وفصلها إلى تعليق خلية واحدة من الطحال باستخدام المحقنة المكبس و40 ميكرومتر مكروبين الشبكة. غسل مصفاة وحقنة المكبس مع 1٪ RPMI (1٪ FBS التي تحتوي على وسائل الإعلام RPMI) لجمع جميع الطحال.
    4. الطرد المركزي تعليق الخلية في 800 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية. إضافة 5 مل من ACK العازلة التخلص (1 mM Na2EDTA، 10 mM KHCO3،144 mM NH4Cl، درجة الحموضة 7.2) بعد التخلص من supernatant. احتضان تعليق الخلية لمدة 5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: يتم استخدام المخزن المؤقت ACK الانزلاً لخلايا الدم الحمراء.
    5. إضافة 5 مل من 1٪ RPMI لوقف الانضاق. جهاز طرد مركزي عند 800 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تجاهل السوبرناستانت.
    6. إعداد الجليد الباردة المغناطيسي تنشيط خلية الفرز (MACS) عازلة (0.5٪ BSA، 2 MM EDTA في PBS، درجة الحموضة 7.2). إزالة الغاز المخزن المؤقت قبل الاستخدام. إعادة تعليق الكريات الخلية في 5 مل من العازلة MACS.
    7. عد الطحال وتحقق من الخلايا الحية والميتة باستخدام مقياس الهيموكيتومتر و 1٪ trypan الأزرق. حفظ aliquot من 2 × 106 خلايا لتقييم العائد تنقية مع تحليل التدفق الخلوي.
    8. إعادة تعليق الطحال عند تركيز 200 × 106/ مل في العازلة MACS. إضافة 0.03 ميكرولتر من البيوتين المضادة للفأرة-تير-119، 0.03 ميكرولتر من البيوتين المضادة للفأرة CD11b، 0.03 ميكرولتر من البيوتين المضادة للفأرة-CD45R، و 0.03 ميكرولتر من البيوتين المضادة للفأرة-DX5 لكل 106 خلايا. احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.
      ملاحظة: تم استخدام البيوتين المضادة للفأرة-تير-119، البيوتين المضادة للفأرة-CD11b، البيوتين المضادة للفأرة-CD45R، والبيوتين المضادة للفأرة-DX5 للتفاعل مع الكريات الحمراء، المحببة، B-الخلايا، وخلايا NK على التوالي. لذلك، يتم استنفاد هذه المجموعات الفرعية الخلية في الخطوةالتالية 15.
    9. إضافة 10 مل من الجليد الباردة MACS العازلة إلى تعليق الخلية. جهاز طرد مركزي عند 800 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تجاهل السوبرناستانت.
    10. إعادة تعليق الكريات الخلية في المخزن المؤقت MACS بتركيز 100 × 106/ مل. أضف الميكروبات المضادة للبيوتين (0.22 ميكرولتر/106 خلايا) إلى تعليق الطحال. مزيج جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة إضافية في 4 درجة مئوية. غسل تعليق الخلية مرة واحدة مع 10 مل من الجليد الباردة MACS العازلة. الطرد المركزي في 800 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية والتخلص من supernatant.
    11. ضع عمود فصل مغناطيسي في المجال المغناطيسي. شطف العمود مع 3 مل من العازلة MACS. إسقاط تعليق الخلية على العمود. جمع تدفق من خلال تتكون من غير منضم، إثراء الخلايا التائية، في أنبوب مخروطي جديد 15 مل. اغسل عمود MS بـ 3 مل من مخزن MACS البارد.
      ملاحظة: تأكد من أن العمود فارغ قبل تنفيذ خطوات الغسيل.
    12. الطرد المركزي تعليق الخلية في 800 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية. إعادة تعليق بيليه الخلية في 5 مل من العازلة MACS.
    13. عد الخلايا في 1٪ trypan الأزرق باستخدام مقياس الهيموكيتومتر. حفظ aliquot من 2 × 106 خلايا للتحقق من النقاء عن طريق قياس التدفق الخلوي.
      ملاحظة: متوسط عائد الخلايا التائية الطحال معزولة بواسطة هذا الأسلوب ~ 20-25 × 106 خلايا لكل فأرة.
    14. تأكيد العائد من تخصيب الخلية التّتيّة بواسطة قياس التدفق الخلوي. وصمة عار 1 × 106 خلايا، محفوظة من الخطوات 1.3.7 (قبل استنفاد الخلايا التائية) و 1.3.13 (TCD-BM بعد استنفاد الخلايا التائية)، مع الأجسام المضادة التالية: α-CD3 (17A2)، α-CD4 (GK1.5)، وα-CD8α (53-6.7).
  4. اليوم الأول: حقن الفئران المشععة مع الخلايا التائية المانحة وTCD-BM.
    1. غسل TCD-BM وT-الخلايا 2x مع PBS (800 × ز لمدة 5 دقيقة في 4 درجة مئوية). إعادة تعليق الخلايا في PBS الجليد الباردة للحقن. ضبط تركيز الخلية إلى 20 × 106/ مل لTCD BM و 4 × 106/ مل للخلايا التائية.
    2. سخني الحيوان باستخدام مصباح تدفئة لزيادة وضوح عروق الذيل الثنائية. إذا لزم الأمر، ضع الماوس في الكبح.
    3. تنظيف سطح الذيل باستخدام 70٪ ايزوبروبانول. حقن TCD-BM (5 × 106 خلايا / فأرة) مع أو بدون خلايا T (0.75 × 106 خلايا / فأرة). يجب الحرص على عدم إدخال أي هواء في الحقنة.
    4. أزل الإبرة واضع مسحة مطهرة مباشرة على موقع الحقن 5-10 ق لوقف أي نزيف.
  5. تقييم GVHD في الأيام 2-80.
    1. تتبع بقاء الحيوان. رصد العلامات السريرية للGVHD المقتبسة من نظام التهديف الذي أنشأه كوك وآخرون16 ووزن جسم الفئران المتلقية 2x في الأسبوع. استخدام وزن الجسم المحدد قبل TBI لحساب فقدان وزن الجسم.
    2. وزن كل ماوس على حدة. تسجيل فقدان الوزن على النحو التالي: الصف 0 = أقل من 10٪؛ الصف 1 = 10% -20%؛ الصف 2 = أكثر من 20٪.
    3. تسجيل علامة الموقف من المستلمين: الصف 0 = لا حدس; الصف 0.5 = حدس طفيف ولكن يستقيم عند المشي؛ الصف 1 = يبقى الحيوان حدب عند المشي؛ الصف 1.5 = الحيوان لا تصويب; الصف 2.0 = موقف الحيوان على اللّزبالخلفي.
    4. تسجيل علامة التنقل للمستلمين: الصف 0 = نشط للغاية؛ الصف 0.5 = أبطأ من الفئران الساذجة؛ الصف 1.0 = يتحرك فقط عندما مطعون؛ الصف 1.5 = يتحرك قليلا عندما مطعون؛ الصف 2.0 = لا يتحرك عندما مطعون.
    5. تسجيل جلد المستلمين: الصف 0 = لا سحجات أو آفات أو تحجيم؛ الصف 0.5 = احمرار في منطقة واحدة محددة؛ الصف 1 = الكشط في منطقة واحدة أو كشط خفيف في منطقتين؛ الصف 1.5 = سحجات خطيرة في منطقتين أو أكثر؛ الصف 2.0 = سحجات شديدة، تكسير الجلد، والدم المجفف.
    6. تسجيل الفراء من المستلمين: الصف 0 = لا علامات غير طبيعية; الصف 0.5 = التخلص على جانب البطن أو مؤخر الرقبة ، الصف 1.0 = التخلص عبر أو جانب البطن والرقبة ؛ الصف 1.5 = غير مهذب والفراء ruffed؛ الصف 2.0 = الفراء مطفأ بشكل سيئ على البطن والظهر.
    7. تسجيل الإسهال من المتلقين: الصف 0 = لا الإسهال; الصف 0.5 = البراز طفيف ولينة؛ الصف 1.0 = معتدل (البراز الأصفر)؛ الصف 1.5 = معتدل (البراز الأصفر مع القليل من الدم)؛ الصف 2 = شديدة (أصفر فاتح والبراز الدموي، "براز الكعكة المجففة" تظهر في منطقة الكل).

2. نموذج الزرع المشترك

  1. توليد خلايا التشجرات المستمدة من نخاع العظم (BM-DCs).
    1. عزل نخاع العظم من عظم الفخذ والطيبي من WT أو العامل B (fB)-/- الفئران على خلفية B6 كما هو موضح في الخطوات 1.2.3−1.2.4. تدور الخلايا في 800 × ز لمدة 5 دقيقة.
    2. إعادة تعليق بيليه في 5 مل من ACK العازلة التليس لخلايا الدم الحمراء. احتضان تعليق الخلية لمدة 5 دقيقة على الجليد. أضف 10 مل من 1٪ RPMI إلى تعليق الخلية لوقف الانفصال والطرد المركزي في 800 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجة مئوية. تجاهل السوبرناستانت.
    3. إعادة تعليق الكريات الخلية في 10 مل من وسائل الإعلام الثقافة (RPMI 1460 التي تحتوي على 10٪ FBS، 100 U/mL من البنسلين / streptomycin، 2 mM l-الجلوتامين، و 50 mM α-mercaptoethanol) وضبط حجم لتلبية التركيز النهائي من 2 × 106 خلايا / مل.
    4. أضف 20 نانوغرام/مل عامل تحفيز للمستعمرة الحبيبية/مل (GM-CSF) إلى تعليق الخلايا. ثقافة خلايا نخاع العظام في 100 × 15 ملم أطباق بيتري في 37 درجة مئوية في 5٪ CO2 لمدة 6 أيام.
    5. استبدال نصف الوسائط الثقافية الجارية (حوالي 5 مل) بوسائط جديدة تحتوي على 40 نانوغرام/مل من GM-CSF في اليوم الثالث.
    6. Prewarm وسائل الإعلام الثقافة في حمام مائي في 37 درجة مئوية. جمع حوالي 5 مل من وسائل الإعلام من أطباق ثقافة نخاع العظم. جهاز طرد مركزي عند 800 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تجاهل السوبرناستانت. إعادة تعليق بيليه الخلية في 5 مل وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على 40 نانوغرام / مل GM-CSF.
    7. إضافة 25 ميكروغرام / مل lipopolysaccharide (LPS) إلى وسائل الإعلام في اليوم 6 من الثقافة لتنضج BM-DCs. حفظ aliquot من 2 × 106 خلايا لتحديد فعالية التمايز DC عن طريق قياس التدفق الخلوي.
    8. جمع نضجت BM-DCs: استخدام رافعي الخلايا لكشط بهدوء DCs من أطباق بيتري. جمع كل تعليق الخلية في أنابيب مخروطية 50 مل. الطرد المركزي في 800 × ز، لمدة 5 دقيقة عند 4 درجة مئوية. تجاهل السوبرناستانت. غسل الكريات الخلية 3x مع 50 مل من الجليد الباردة PBS. حفظ حوالي 2 × 106 BM-DCs لتحليل النمط الظاهري المناعي عن طريق قياس التدفق الخلوي.
  2. إجراء زرع مشترك للخلايا التشجرات من BMT (DC-cotransplanting BMT).
    ملاحظة: استخدم FVB (H2kq)الفئران كمتبرعين للخلايا التائية وخلايا BM. تشعيع B6 Ly5.1 الفئران المتلقيب بجرعة 1100 cGy (جرعتين، 3 ساعة الفاصل الزمني). انظر التفاصيل في الخطوة 1.1.
    1. عزل BM من الفخذ والطيبي من الفئران المانحة FVB. راجع التفاصيل في الخطوات 1.2.3−1.2.10.
      ملاحظة: استخدام إجمالي نخاع العظم المعزول بدلاً من TCD-BM في هذا النموذج.
    2. تنقية الخلايا التائية من الطحال والغدد الليمفاوية للفئران المانحة FVB. انظر التفاصيل في الخطوات 1.3.1-1.3.13.
    3. حقن BM (5 × 106/ الماوس) ، والخلايا التائية (0.5 × 106/ الماوس) مع BM -DCs (2 × 106/ الماوس) في اليوم 0 من الدورة التجريبية.
    4. في اليوم 3 بعد زرع, فحص إعادة تشكيل DC المانحة عن طريق تدفق الخلايا.
      1. جمع الدم من عيون المتلقين.
      2. تطفل CD45.1/Ly5.1 B6 الفئران بنسبة 3٪ استنشاق الإيأوفلوران. تحقق من عمق التخدير بسبب عدم الاستجابة لقرصة إصبع القدم.
      3. ضع أنبوب ماصة زجاجي معقم في العلبة المنسّمة للعين الموجهة بزاوية 30-45 درجة من مستوى الأنف. تطبيق الضغط أثناء تدوير الأنبوب بلطف.
      4. إسقاط الدم في 10 ميكرولتر الهيبارين التي تحتوي على أنابيب مركزية دقيقة 1.5 مل. نقل 50 ميكرولتر من الدم إلى 5 أنابيب تدفق الزجاج مل.
      5. إضافة 2 مل من المخزن المؤقت ACK التليس. احتضان في 37 درجة مئوية في حمام مائي لمدة 45 دقيقة. إضافة 2 مل من FACS تلطيخ العازلة. جهاز طرد مركزي عند 800 × ز لمدة 5 دقيقة عند 4 درجات مئوية. تجاهل السوبرناستانت.
      6. إعادة تعليق كريات الخلية مع 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS التي تحتوي على الأجسام المضادة تلطيخ التدفق المناسب (العيش / الموت الأصفر، α-H-2Kب،α-CD45.1، α-CD45.2، α-CD11c، وα-MHCII). احتضان لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية في الظلام. غسل 2x مع 1 مل FACS المخزن المؤقت. إعادة تعليق الكريات الخلية في 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت FACS وإجراء التحليل عن طريق قياس التدفق الخلوي.

3. نماذج GVHD / GVL من BMT

  1. أداء التعريفي GVHD / GVL.
    1. ثقافة لوسيفيراز نقل A20 B سرطان الغدد الليمفاوية الخلية في وسائل الإعلام ثقافة RPMI.
    2. تشعيع BALB / ج في الخلفية WT أو Ly5.1 المتلقي في 700 cGy (جرعة واحدة). انظر التفاصيل في الخطوة 1.1.
    3. عزل TCD-BM من عظم الفخذ والطيبي من B6. Ly5.1 الفئران المانحة. راجع التفاصيل في الخطوات 1.2.1−1.2.10.
    4. تنقية الخلايا التائية من الطحال والغدد الليمفاوية من الفئران المانحة C57BL/6. راجع التفاصيل في الخطوات 1.3.1−1.3.15.
    5. غسل A20 الليمفاوية 2x مع 25 مل من برنامج تلفزيوني. إعادة تعليق الكريات الخلية في 10 مل من الجليد الباردة PBS. اتخاذ aliquot تعليق الخلية (10 ميكرولتر) وحساب الخلايا باستخدام 1٪ trypan الأزرق ومقياس الهيوكتومتر. ضبط تركيز الخلية إلى 20،000 خلية / مل.
    6. حقن TCD-BM (5 × 106/ الماوس) مع أو بدون الخلايا التائية (0.75 × 106/ الماوس) وسرطان الغدد الليمفاوية A20 (5000 خلية / فأرة).
    7. متابعة بقاء المتلقي، والعلامات السريرية GVHD، وفقدان وزن الجسم خلال الدورة التجريبية. انظر التفاصيل في الخطوة 1.5.
  2. إجراء التصوير الحيوي.
    1. مراقبة نمو الورم في المتلقي المزروعة عن طريق حقن الفئران المتلقي مع 4 ملغ من D-لوسيفيرين. احتضان لمدة 5 دقيقة لضمان يتفاعل لوسيفيرين مع لوسيفيراز.
    2. قم بتنويم الفأرة باستخدام 3٪ من الإيزوفلوران في غرفة صور الإضاءة الحيوية وصورة المستلمين لمدة 5 دقيقة في الحقل D ووقت التعرض لمدة 1 دقيقة.
    3. تحليل البيانات باستخدام برنامج تحليل الصور. تغيير مقياس الصور الملونة الزائفة للحصول على أفضل النتائج.
      ملاحظة: يجب أن تكون كافة الصور على نفس المقياس عبر التجارب.
    4. استخدم برنامج تحليل الصور لتحديد المناطق ذات الأهمية وتحديد كثافة الإشارة عن طريق حساب التدفق (الفوتوات/الفوتوات) المنبعثة من كل منطقة من المناطق ذات الاهتمام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نموذج MHC غير المتطابقة الرئيسية B6 (H2k b)-BALB/C (H2kd)يتوافق بشكل وثيق مع تطور GVHD بعد الزرعb(الشكل 2). حدثت جميع العلامات السريرية الست GVHD التي وضعها كوك وآخرون16 في المتلقين المزروعين بخلايا WT-B6 T ولكن ليس في المستلمين المزروعين بـ BM وحده (الخطوة 1.5) ، والتي مثلت المجموعة السلبية GVHD. هناك مرحلتين في تطوير GVHD في هذا النموذج. أولاً، ذروة الشدة هي حوالي 11 يوماً بعد الزرع، يليها انخفاض في الدرجات السريرية واستعادة وزن الجسم حتى 16 يوماً. في هذه المرحلة ، تدفع العديد من الآليات مثل الالتهاب الناجم عن الإشعاع ومتلازمة الترقيع إلى الإمراضية المرض وGVHD. ويستسلم المستفيدون بشكل موحد للـ GVHD بعد حوالي 30-40 يوماً من عملية الزرع.

ما لا يقل عن 85٪ من BM متمايزة في البلدان النامية(الشكل 3A). ومن المثير للاهتمام، زرع مع fB-/- DCs تحسين بقاء المتلقي والنتيجة السريرية GVHD(الشكل 3B، C). وبالنظر إلى أن fB-/- DCs لديها قدرة عرض مستضدية أقل يظهرها تعبير MHCII أقل وتعبير مستقبلات محفز ة مشاركة أقل17، قد يكون بروتوكول الزرع المشترك كافيًا لفحص الإشارات أو الأهداف المختلفة في البلدان النامية المتلقية في تطوير GVHD بعد BMT.

كان نقاء الخلايا التاء 90٪ بعد الإثراء(الشكل 4A). لوسيفيراز محولة A20 B سرطان الغدد الليمفاوية الخلية يسمح رصد نمو الورم في الحيوانات الحية(الشكل 4B). في هذا النموذج، إذا توفي المتلقين دون أي إشارة ودرجة سريرية عالية GVHD، وخلص إلى أنهم ماتوا من GVHD. جميع المتلقين BALB / ج WT التي تلقت BM وحدها بالإضافة إلى A20 توفي من انتكاس الورم(الشكل 3B). على النقيض من ذلك ، إذا توفي الحيوان من كثافة إشارة أعلى ، وخلص إلى أنهم ماتوا من انتكاس الورم. كما هو موضح في الشكل 3B، WT BALB / c المستلمين زرعها مع BM والخلايا التائية من ACC1fl/fl B6 المانحة (ACC1+ / + الخلايا التائية) توفي من GVHD. إذا ماتت الحيوانات مع إشارات المرض ، وخلص إلى أنها ماتت من GVHD والانتكاس الورم. الحيوانات التي تلقت BM وT-الخلايا من ACC1fl/fl x CD4 cre B6 المانحة (ACC1-/- T-الخلايا) توفي من كل GVHD والانتكاس الورم(الشكل 3B). يمكن وضع الحيوانات مرة أخرى في القفص ليتم تصويرها في وقت لاحق نقطة أو القتل الرحيم للتصوير الجسم الحي السابقين. باستخدام البرنامج ، يمكن أيضًا تحليل كتلة الورم في الحيوان بشكل فردي(الشكل 3B).

Figure 1
الشكل 1: التمثيل التخطيطي لإجراء BMT. (A)مخطط لنموذج B6→BALB/c BMT غير المتطابقة MHC. (B)مخطط لDC المشاركة في زرع FVB → B6 نموذج. (C)مخطط لنموذج B6→BALB/c GVHD/GVL. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: الرئيسية MHC غير متطابقة B6→ BALB / ج GVHD نموذج. تم تشعيع فئران BALB/c بشكل قاتل وزرعها بـ 5 × 106 BM وحدها أو مع 0.75 × 106 خلايا تي. (أ)بيانات البقاء على قيد الحياة،(B)فقدان وزن الجسم، و(C)بيانات النتيجة السريرية للمستلمين من BM وحدها أو مع الخلايا التائية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: DC المشاركة في زرع نموذج HCT. تم عزل BM من WT و fB-/- B6 الفئران ومتباينة في DCs عن طريق الاستزراع مع GM-CSF. (أ)تم فحص نقاء DCs عن طريق قياس التدفق الخلوي عن طريق تلطيخ مع CD11c و MHCII. تم زرع متلقي B6 المشعع بشكل قاتل مع BM (3 × 106/ الماوس) بالإضافة إلى الخلايا التائية النقية (1 × 106/ الماوس) من المتبرعين FVB. كما تلقى المستلمون 2 × 106 WT أو fB-/- B6 BM-DCs الخلايا في يوم زرع. يتم عرض البقاء على قيد الحياة(B)والنتيجة السريرية(C). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: نموذج Major-MHC غير متطابق B6→BALB/c GVHD/GVL. تم زرع WT BALB/c المتلقين مع TCD-BM (5 × 106/ الماوس) وحدها أو مع ACC1+/+ الخلايا التائية أو ACC1+/+ T-cells (1 × 106/mouse) معزولة عن الفئران المانحة الخلفية B6. بالإضافة إلى ذلك ، تلقى المستلمون 2 × 103 A20-luc في وقت زرع. تم فحص نقاء الخلايا التتي عن طريق قياس الخلايا من خلال تلطيخ مع الأجسام المضادة الحية / الموت الأصفر ، CD3 ، CD4 ، وCD8 تدفق الأجسام المضادة(A). تم رصد المتلقين لنمو الورم الذي يحدده تصوير الإضاءة الحيوية للجسم كله (BLI)(B). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

استخدام الخلايا الجذعية لتناسب فرد معين هو نهج فعال لعلاج السرطانات المتقدمة والمقاومة18. المستحضرات الصيدلانية جزيء صغير، ومع ذلك، ظلت لفترة طويلة التركيز الرئيسي لعلاج السرطان شخصية. من ناحية أخرى ، في العلاج الخلوي يمكن أن تؤثر العديد من التفاعلات بين المانح والمضيف بشكل حاسم على نتائج العلاج ، مثل تطوير GVHD بعد BMT1.

نماذج الماوس MHC غير متطابقة الرئيسية من BMT هي أداة قيمة في فهم بيولوجيا GVHD واختبار فعالية الأدوية في علاجها. من بينها، C57BL/6 (H2ب)إلى BALB/c (H2d)وFVB (H2 q)→C57BL/6 (H2ب)هي نماذج راسخةq5،,7. تتضمن هذه النماذج إما تكييف الإشعاع النقوي كجرعة واحدة (BALB/c) أو جرعة مجزأة (C57BL/6) حيث يلزم فترات 3-8 ساعات لتقليل سمية الأمعاء5. كلا النموذجين تعتمد على كل من CD8+ وCD4+ الخلايا التائية. في هذه النماذج، GVHD شدة والبقاء على قيد الحياة هي النتائج الرئيسية التي تم قياسها، والمتلقي المزروعة لديها حركية سريعة متسقة و100٪ penetrance. من أجل مراقبة هجرة الخلايا التائية والتوسع ، يجب استخدام الخلايا التائية من الفئران المانحة المنقولة من لوسيفراز في التصوير vivobioluminescence19. ومع ذلك ، في حين أن 90 ٪ من BMT التي أجريت هي MHC المتطابقة ، فإن نموذج B6-BALB / c لا يشبه تمامًا الوضع السريري. وقد ساهم اكتشاف MHC ومستضدات التوافق الأنسجة الثانوية (miHAs) بشكل كبير في النهوض بمجال BMT10. نماذج الماوس GVHD MHC غير متطابقة طفيفة أكثر عن كثب تحاكي المريض GVHD20. كثافة تكييف للحث على تطعيم الخلايا المانحة يسبب تلف الأنسجة ويمكن أن تؤثر على نتيجة GVHD21. نظم تكييف في نماذج المورين غالبا ما ينطوي TBI على النقيض من العلاج الكيميائي في البيئات السريرية22،23. لذلك ، تم استخدام نموذج العلاج الكيميائي المثبط للمناعة لتقليد انخفاض الكثافة الشرطية في العيادات. كان نموذج الماوس C57BL/6 (H2ب)إلى BALB/c (H2d)والمتلقين المزروعة وضعت الأعراض السريرية والالنسيجية المرتبطة GVHD24.

الميزة المحتملة للبروتوكول المزروع ة المشتركة هي اختبار دور البلدان النامية المتلقية دون الاعتماد على وجه التحديد على الفئران المستنفدة CD11c. لأن تم تنفيذ الجيل BM-DC السابقين vivo، يمكن أيضا ً تطبيق هذا البروتوكول لاختبار دور أنواع الخلايا الأخرى مثل الضامة أو العدلات في GVHD ببساطة عن طريق تعديل شروط الثقافة. باستخدام CD45.1+ B6 الفئران كمستلمين يسمح للباحثين بالتمييز بين BM-DCs (CD45.2+ CD11c+) من DCs المتلقي (CD45.1+ CD11c+) عن طريق تحليل التدفق. عدد مرن من الخلايا ولدت الجسم الحي السابق واعتمدت في المتلقين زرع فائدة أخرى من بروتوكول زرع المشتركة. وعلاوة على ذلك، فإن ثقافة الجسم الحي تسمح لنا بفحص الأدوية المحتملة للسيطرة على GVHD.

القدرة على تتبع أنماط الورم في الجسم الحي هو أداة قوية لديها القدرة على اختبار ما إذا كان الدواء يمكن أن تؤثر على نشاط GVL. باستخدام هذا النموذج GVHD / GVL ، يمكن رصد تطور الورم والانبثاث في الحيوانات الحية16. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا الإعداد لاختبار تأثير GVL في سرطانات متعددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

ويدعم هذه الدراسة من جامعة وسط فلوريدا كلية الطب بدء المنحة (لHN), جامعة بيتسبرغ المركز الطبي هيلمان مركز السرطان بدء منحة (إلى HL), الولايات المتحدة المعاهد القومية للصحة منحة #1P20CA210300-01 ووزارة الصحة الفيتنامية منحة #4694/ QD-BYT (إلى PTH). نشكر الدكتور شيوي تشونغ يو في جامعة كارولينا الجنوبية الطبية لتوفير المواد اللازمة للدراسة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA pH 8.0 100ML Fisher Scientific BP2482100 MACS buffer
10X PBS Fisher Scientific BP3994 MACS buffer
A20 B-cell lymphoma University of Central Florida In house GVL experiment
ACC1 fl/fl Jackson Lab 30954 GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4cre University of Central Florida GVL experiment
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485 T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220) Thermo Fisher Scientific 13-0452-85 T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITC Thermo Fisher Scientific 10452-85 Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700 Thermo Fisher Scientific 117319 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PE Thermo Fisher Scientific 12-0251-82 Flow staining
Anti-Mouse CD4 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-0041-86 T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) Thermo Fisher Scientific 48-0042-82 Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PE Thermo Fisher Scientific 12-0900-83 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APC Thermo Fisher Scientific 17-0081-83 Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-5958-82 Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APC Thermo Fisher Scientific 17-5320-82 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-5921-85 T-cell enrichment
Anti-Thy1.2 Bio Excel BE0066 BM generation
B6 fB-/- mice University of Central Florida In house Recipients
B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice Charles River 564 Donors
BALB/c mice Charles River 028 Transplant recipients
C57BL/6 mice Charles River 027 Donors/Recipients
CD11b Thermo Fisher Scientific 13-0112-85 T-cell enrichment
CD25-biotin Thermo Fisher Scientific 13-0251-82 T-cell enrichment
CD45R Thermo Fisher Scientific 13-0452-82 T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin Thermo Fisher Scientific 13-5971-82 T-cell enrichment
Cell strainer 40 uM Thermo Fisher Scientific 22363547 Cell preparation
Cell strainer 70 uM Thermo Fisher Scientific 22363548 Cell preparation
D-Luciferin Goldbio LUCK-1G Live animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Bilogicals R&D system D17051 Cell Culture
Flow cytometry tubes Fisher Scientific 352008 Flow cytometry analysis
FVB/NCrl Charles River 207 Donors
Lipopolysacharide (LPS) Millipore Sigma L4391-1MG DC mature
LS column Mitenyi Biotec 130-042-401 Cell preparation
MidiMACS Miltenyi Biotec 130-042-302 T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubator Eppendorf Galaxy 170 R Cell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140 Media
RPMI 1640 Thermo Fisher Scienctific 11875-093 Media
TER119 Thermo Fisher Scientific 13-5921-82 T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200 Perkin Elmer Xenogen IVIS-200 Live animal imaging
X-RAD 320 Biological Irradiator Precision X-RAY X-RAD 320 Total Body Irradiation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
  2. Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
  3. Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
  4. Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
  5. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
  6. Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006 (2018).
  7. Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
  8. Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
  9. Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
  10. Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
  11. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  12. Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
  13. Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
  14. Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  15. Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
  16. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  17. Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
  18. McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417 (2013).
  19. Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
  20. Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
  21. Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
  22. Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
  23. Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
  24. Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 157، زرع الخلايا الجذعية الدموية، زرع نخاع العظم، مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف، الكسب غير المشروع مقابل سرطان الدم، الخلايا التشجرات، زرع الخلايا التشجرات
منصة زرع نخاع العظم للتحقيق في دور الخلايا التطبيب في مرض الكسب غير المشروع مقابل المضيف
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nguyen, H. D., Huong, P. T.,… More

Nguyen, H. D., Huong, P. T., Hossack, K., Gurshaney, S., Ezhakunnel, K., Huynh, T. H., Alvarez, A. M., Le, N. T., Luu, H. N. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. (157), e60083, doi:10.3791/60083 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter