Summary
移植与宿主疾病是异体骨髓移植后的主要并发症。树突状细胞在移植与宿主疾病的发病机制中起着关键作用。本文介绍了一种新型的骨髓移植平台，用于研究树突状细胞在移植与宿主疾病发展中的作用以及移植对白血病的影响。
Abstract
异体骨髓移植（BMT）是治疗血液恶性肿瘤的有效疗法，由于移植对白血病（GVL）的作用来根除肿瘤。然而，其应用受到移植与宿主疾病（GVHD）的发展的限制，这是BMT的主要并发症。当供体移植物中的T细胞识别受体细胞表达的抗核抗原并对受体健康组织进行不需要的免疫攻击时，GVHD被唤起。因此，传统疗法旨在抑制供体T细胞同位活性。然而，这些方法大大削弱了GVL效应，使接受者的生存得不到改善。因此，了解治疗方法对BMT、GVL和GVHD的影响至关重要。由于抗原呈现和细胞因子分泌能力刺激供体T细胞，受体树突状细胞（DC）在GVHD的诱导中起着重要作用。因此，针对收件人 DC 成为控制 GVHD 的潜在方法。本工作描述了一个新的BMT平台，用于研究宿主DC如何调节移植后的GVH和GVL反应。介绍了一种有效的BMT模型，用于研究移植后GVHD和GVL的生物学。
Introduction
异体造血干细胞移植（BMT）是治疗血液恶性肿瘤的有效疗法1、22通过移植对白血病（GVL）效应3。然而，供体淋巴细胞总是对受体组织进行不需要的免疫攻击，这个过程称为移植与宿主疾病（GVHD）4。4
GVHD的毛利模型是研究GVHD生物学和GVL反应5的有效工具。老鼠是一种具有成本效益的研究动物模型。它们很小，在发育的早期阶段就有效地与分子和生物制剂结合。老鼠是基因操作研究的理想研究动物，因为它们在基因上定义得很好，非常适合研究生物途径和机制。几种小鼠主要组织相容性复合（MHC）MHC不匹配的GVHD模型已经建立，如C57BL/6（H2b）到BALB/c（H2d）和FVB（H2q）_C57BL/6（H2qbb）5，7。,7这些是确定单个细胞类型、基因和影响GVHD的因素的作用的特别重要的模型。从C57/BL/6（H2b）父母捐赠者移植到MHC I（B6.C-H2bm1）和/或MHC II（B6.C-H2bm12）突变的接受者，表明MHC I类和II类的不匹配是急性GVHD发展的重要要求。这表明CD4+和CD8+T细胞都是疾病发展所需的7，8。8GVHD还参与了被称为"亲炎细胞因子风暴"的炎症级联。在鼠模型中最常见的调理方法是 X 射线或137C 的总身体辐照 （TBI）。这导致接受者的骨髓消融，从而允许供体干细胞移植，并防止移植的排斥。这是通过限制受体T细胞的增殖来响应供体细胞来实现的。此外，遗传差异在疾病诱导中起着重要作用，这也取决于轻微的MHC不匹配10。因此，骨髓照射剂量在不同的小鼠菌株中有所不同（例如，BALB/c=C57BL/6）。
宿主抗原呈现细胞（APC）激活供体T细胞对GVHD发育至关重要。在APC中，树突状细胞（DC）是最有效的。它们具有遗传性诱导GVHD的能力，因为它们具有优越的抗原摄入、T细胞共刺激分子的表达以及产生使T细胞极化成致病子集的亲炎细胞因子。接受性D对促进移植后,T细胞充注和GVHD诱导至关重要。因此，在治疗GVHD12时，DC已成为有趣的目标。
需要TBI来增强供体细胞的移植。由于TBI效应，接受者DC在移植12后被激活并存活一小段时间。尽管在使用生物发光或荧光方面取得了重大进步，但建立一个有效的模型来研究受体D在GVHD中的作用仍然具有挑战性。
由于供体T细胞是GVL活动的驱动力，使用免疫抑制药物如类固醇抑制T细胞过敏反应的治疗策略往往导致肿瘤复发或感染13。因此，针对受体 DC 可以提供治疗 GVHD 的替代方法，同时保持 GVL 效果并避免感染。
简而言之，目前的研究提供了一个平台，以了解接收D中不同类型的信令如何调节GVHD的发展和BMT后GVL效应。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
实验程序得到了中佛罗里达大学机构动物护理和使用委员会的批准。
1. GVHD 感应
注：异体骨髓（BM）细胞移植（步骤1.2）在辐照后24小时内进行。下面描述的所有程序都在无菌环境中执行。在组织培养罩中执行该过程，并使用过滤试剂。
- 第 0 天：准备接收鼠标。
- 在 BALB/c 背景 （CD45.2+ H2kd+）上使用雌性野生类型 （WT） 小鼠，10~12 周大作为接受者。
- 在 TBI 之前标记和称重收件人。然后，将多达11只小鼠放入辐照室，并将其保存在辐照器中。在 700 cGy 的单剂量下照射 10~15 分钟。
- 在移植前，将辐照动物送回笼子，并把它们安置在无病原体的设施中。
注：受试者的最小体重应在20克左右。用这个重量作为计算实验期间体重损失的参考。
- 第1天：从供体小鼠中制备T细胞耗尽的骨髓（TCD-BM）。
- 通过 CO2窒息对 CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 小鼠进行安乐死，等待 2-3 分钟，直到它们失去知觉。如有必要，将宫颈脱位作为继发性安乐死。
- 将鼠标放在干净的工作板上。用70%异丙醇对毛皮和皮肤进行消毒。
- 用钳子和剪刀从双腿收集头骨和股骨。将它们放入冰冷RPMI中，含有1%FCS和100 U/mL青霉素/链霉素和2 mM L-谷氨酰胺（1%RPMI），在50 mL锥形管中。使用钳子和剪刀去除所有肌肉组织，彻底清洁股骨和头骨。将股骨和头骨从50mL锥形管转移到直径为92毫米的培养皿中，含有1%的RPMI。
- 使用剪刀，切割股骨或头骨的末端。用 25 mL 1% RPMI 1640 中等填充 50 mL 管。使用此功能将 3 mL 注射器填充到 26 G 针上，3 mL 的 1% RPMI。将此注射器插入骨骼，然后推柱塞将骨髓 （BM） 从腔中取出，以 1% RPMI （±3 mL/骨）冲洗出腔内。
- 对于来自其他供体小鼠的所有剩余头骨和股骨，重复步骤 1.2.4。将所有收集管放在冰上。
- 通过 75 μm 网状细胞滤网冲洗骨髓片，使单个细胞悬浮。在 50 mL 管中收集单细胞悬架。
- 在 800 x g下，在 4 °C 下，离心管 5 分钟。吸气并丢弃上清液。在20 x 106细胞/mL下，在含有0.5%牛血清白蛋白（BSA）的PBS缓冲液中重新悬浮颗粒。保存 2 x 106个细胞的等号，以便进行纯度染色。
- 在0.05 μg/106细胞14处加入Thy 1抗体，在4°C下孵育30分钟。用25 mL冷PBS洗涤一次。在 0.5% BSA/10% 幼兔补/2% DNase（无菌 H2O 中 10，000 U/mL）重新悬浮。6在37°C下孵育45分钟，洗涤2倍。
注：T细胞使用针对Thy1的mAb耗尽，这是一种由所有T细胞表达的蛋白质，而不是其他白细胞。 - 在含有0.5%BSA的PBS缓冲液的20 mL中重新悬浮细胞。使用血细胞计将骨髓细胞以1%的醋酸计数。保持 2 x 106细胞的等位，在细胞纯化后通过流细胞测定进行纯度检查。
注：一只供体小鼠通常产生约25 x 106 TCD-BM。 - 使用流细胞测定仪确认成功的T细胞耗尽。染色 1 x 106细胞，从步骤 1.2.7（T 细胞耗尽之前）和 1.2.9（T 细胞耗尽后的 TCD-BM）保留，具有以下抗体：β-CD3 （17A2）、β-CD4 （GK1.5） 和 β-CD8+（53-6.7）。
- 第1天：从供体小鼠中制备T细胞
- 使用 CD45.2+ H2kb+ C57BL/6 野生类型 （WT） 小鼠作为 T 细胞的捐赠者。
- 按二氧化碳（CO2）窒息对C57BL/6小鼠进行安乐死，如1.2.1所述。
- 用70%乙醇彻底清洁小鼠的毛皮和皮肤。使用注射器柱塞和40μm网状滤网器，切除脾脏和淋巴结，并将其分离成单细胞悬浮物的单细胞悬浮液。用 1% RPMI（1% FBS 包含 RPMI 介质）清洗滤网和注射器柱塞，以收集所有减员。
- 在 4 °C 下将电池悬浮液在 800 x g下离心 5 分钟。丢弃上清液后加入 5 mL 的 ACK 压合缓冲液（1 mM Na2EDTA，10 mM KHCO3、144 mM NH4Cl、pH 7.2）。在室温下孵育细胞悬浮液5分钟。
注：ACK 压网液用于压网红血球。 - 添加 5 mL 的 1% RPMI 以阻止套回。在 800 x g下离心 5 分钟，在 4 °C 下。丢弃上清剂。
- 制备冰冷的磁活细胞分拣（MACS）缓冲液（0.5%BSA，PBS中的2 mM EDTA，pH 7.2）。使用前对缓冲液进行气。在 MACS 缓冲液的 5 mL 中重新悬浮细胞颗粒。
- 使用血细胞计和 1% 锥形蓝色，对全细胞进行计数并检查活细胞和死细胞。保存 2 x 106个细胞的等位，通过流细胞测定分析评估纯化产量。
- 在 MACS 缓冲液中浓度为 200 x 106/mL 时重新悬浮脂质细胞。加入0.03μL的生物素抗鼠-Ter-119，0.03μL的生物素抗小鼠CD11b，0.03μL的生物素抗小鼠CD45R，和0.03μL的生物素抗鼠-DX5每106细胞。在4°C下孵育15分钟。
注：生物素抗小鼠-Ter-119、生物素抗小鼠-CD11b、生物素抗小鼠-CD45R和生物素抗小鼠DX5分别用于与红细胞、颗粒细胞、B细胞和NK细胞发生反应。因此，这些细胞子集在步骤15中耗尽。 - 将 10 mL 的冷式 MACS 缓冲液添加到电池悬浮液中。在 800 x g下离心 5 分钟，在 4 °C 下。丢弃上清剂。
- 以 100 x 106/mL 的浓度重新悬浮 MACS 缓冲液中的细胞颗粒。在增生细胞悬浮液中加入抗生物青星（0.22 μL/106细胞）。混合好，在4°C下孵育15分钟。使用 10 mL 的冷式 MACS 缓冲液清洗电池悬浮液一次。在 800 x g下离心 5 分钟，在 4 °C 下丢弃上清液。
- 在磁场中放置一个磁分离柱。用 3 mL 的 MACS 缓冲液冲洗列。将细胞悬架拖放到列上。在一个新的15 mL锥形管中收集由未绑定、浓缩T细胞组成的流通。使用 3 mL 的冷式 MACS 缓冲液清洗 MS 柱。
注： 在执行洗涤步骤之前，请确保列为空。 - 在 4 °C 下将电池悬浮液在 800 x g下离心 5 分钟。将细胞颗粒重新悬浮在 5 mL 的 MACS 缓冲液中。
- 使用血细胞计以 1% 锥蓝色计数细胞。保存 2 x 106个细胞的等位，以便通过流式细胞测定进行纯度检查。
注：此方法分离的全性 T 细胞的平均产量为每只小鼠 +20×25 x 106细胞。 - 通过流细胞测定确认T细胞富集的收率。染色 1 x 106细胞，从步骤 1.3.7（T 细胞耗尽之前）和 1.3.13（T 细胞耗尽后的 TCD-BM）保存，具有以下抗体：β-CD3 （17A2）、β-CD4 （GK1.5） 和 β-CD8+（53-6.7）。
- 第1天：用供体T细胞和TCD-BM注射辐照小鼠。
- 用 PBS 清洗 TCD-BM 和 T 电池 2 倍（在 4 °C 下为 800 x g 5 分钟）。重新悬浮冰冷PBS中的细胞进行注射。将 TCD BM 的细胞浓度调整为 20 x 106/mL，将 T 细胞的电池浓度调整为 4 x 106/mL。
- 使用加热灯加热动物，以提高双尾静脉的可见度。如有必要，将鼠标放在约束器中。
- 使用 70% 异丙醇清洁尾部表面。使用或不使用 T 细胞（0.75 x 106个单元/鼠标）注射 TCD-BM（5 x 106个单元/鼠标）。小心不要将任何空气引入注射器。
- 取出针头，将防腐拭子直接涂抹到注射部位 5~10 s 以停止任何出血。
- 在 2-80 天评估 GVHD。
- 跟踪动物的生存情况。监测GVHD的临床体征，适应库克等人16先前建立的评分系统，以及受体小鼠每周2倍的体重。使用 TBI 之前确定的体重来计算体重损失。
- 单独称重每只鼠标。对减肥评分如下：0级=小于10%;等级 1 = 10%~20%;等级 2 = 超过 20%。
- 评分收件人的姿势标志：0 级 = 无预感;0.5级 = 轻微的驼背，但行走时拉直;1年级 = 动物行走时保持驼背;等级1.5 = 动物不矫正;等级 2.0 = 动物站在后脚趾上。
- 对收件人的移动性标志进行评分：0 级 = 非常活跃;0.5级 = 比幼鼠慢;等级 1.0 = 仅在戳上时移动;等级 1.5 = 戳时稍微移动;等级 2.0 = 戳时不移动。
- 评分接受者的皮肤：0级 = 无擦伤、病变或缩放;0.5级 = 一个特定区域的发红;1级 = 一个区域的磨损或两个区域的轻度磨损;1.5级 = 两个或两个以上地区的严重擦伤;等级 2.0 = 严重擦伤、皮肤开裂、血液干燥。
- 对获奖者的毛皮打分：0级 =无异常迹象;0.5级 = 在颈部腹部或尿布的侧面，1.0 级 = 穿过或穿过腹部和颈部的侧;1.5级 = 松哑的磨砂和褶皱毛皮;等级 2.0 = 腹部和背部的毛皮严重磨砂。
- 评分的接受者腹泻：0级 = 无腹泻;0.5级 = 轻微和柔软的凳子;1.0级 = 轻度（黄色凳子）;1.5年级 = 中等（黄色大便，有一点血）;等级 2 = 严重（浅黄色和血腥的凳子，"干蛋糕凳子"出现在肛门区域）。
2. 共移植模型
- 生成骨髓衍生的树突状细胞（BM-DC）。
- 将骨髓从WT或因子B（fB）的股骨和骨子偏）中分离出，如步骤1.2.3_1.2.4所述。以 800 x g旋转细胞 5 分钟。
- 在5 mL的ACK压水液缓冲液中重新悬浮颗粒，用于红血球压网。在冰上孵育细胞悬浮液5分钟。在电池悬浮液中加入 10 mL 的 1% RPMI，在 4 °C 下以 800 x g停止套系统并离心 5 分钟。丢弃上清剂。
- 在10 mL培养介质中重新悬浮细胞颗粒（RPMI 1460含有10%FBS、100 U/mL青霉素/链霉素、2 mM l-谷氨酰胺和50 mMβ-汞氨基乙醇），并调整体积以满足2 x 106细胞/mL的最终浓度。
- 在细胞悬浮液中加入20纳克/mL粒细胞-巨噬细胞-刺激因子（GM-CSF）。在37°C下在5%CO2中培养骨髓细胞在100 x 15 mm培养皿中6天。
- 在第 3 天用含有 40 ng/mL GM-CSF 的新鲜介质替换一半的当前文化介质（约 5 mL）。
- 在 37 °C 的水浴中预热培养介质。从骨髓培养皿中收集大约5 mL的介质。在 800 x g下离心 5 分钟，在 4 °C 下。丢弃上清剂。在含有40纳克/mL GM-CSF的5 mL培养介质中重新悬浮细胞颗粒。
- 在培养物的第6天，将25μg/mL脂多糖（LPS）添加到介质中，使BM-DC成熟。保存2×106个细胞的分配额，通过流细胞测定确定直流分化效果。
- 收集成熟的 BM-DC：使用细胞升降机从培养皿中轻柔地刮取 DC。收集 50 mL 锥形管中的所有细胞悬浮液。在 800 x g下离心，在 4 °C 下 5 分钟。丢弃上清剂。用 50 mL 的冷 PBS 清洗 3 倍的细胞颗粒。节省约 2 x 106 BM-DC，通过流细胞测定进行免疫表型分析。
- 执行BMT（DC-协移植BMT）的树突细胞共移植。
注：使用FVB（H2kq）小鼠作为T细胞和BM细胞的捐赠者。以1，100 cGy（2剂，3小时间隔）的剂量照射B6 Ly5.1受体小鼠。请参阅步骤 1.1 中的详细信息。- 将BM与FVB供体小鼠的股骨和铁骨分离。请参阅步骤 1.2.3_1.2.10 的详细信息。
注：在此模型中使用完全分离的骨髓而不是 TCD-BM。 - 从FVB供体小鼠的脾脏和淋巴结中净化T细胞。请参阅步骤 1.3.1-1.3.13 的详细信息。
- 在实验课程的第 0 天用 BM-DC（2 x 106/鼠标）注射 BM（5 x 106/鼠标）、T 细胞（0.5 x 106/鼠标）。
- 在移植后的第3天，通过流动细胞测定检查供体DC重组。
- 从接受者的眼睛里收集血液。
- 用3%的西露酶吸入麻醉CD45.1/Ly5.1 B6小鼠。检查因对脚趾捏缺乏反应而麻醉的深度。
- 将无菌玻璃移液管放在眼睛的中段，以从鼻子平面的 30×45° 角度定向。轻轻旋转管时施加压力。
- 将血液放入含有10μL肝素的无菌1.5mL微离心管中。将50μL的血液输送到5 mL玻璃流管中。
- 添加 2 mL 的 ACK 帧缓冲液。在水浴中孵育37°C45分钟。加入2 mL的FACS染色缓冲液。在 800 x g下离心 5 分钟，在 4 °C 下。丢弃上清剂。
- 用含有适当流动染色抗体（活/死亡黄色、β-H-2K b、β-CD45.1、β-CD45.2、β-CD11c和β-MHCII）的200μL的FACS缓冲液重新悬浮细胞颗粒。b在黑暗中4°C孵育15分钟。使用 1 mL FACS 缓冲液洗涤 2 倍。在FACS缓冲液的200μL中重新悬浮细胞颗粒，并通过流细胞测定进行分析。
- 将BM与FVB供体小鼠的股骨和铁骨分离。请参阅步骤 1.2.3_1.2.10 的详细信息。
3. BMT 的 GVHD/GVL 型号
- 执行 GVHD/GVL 感应。
- 在RPMI培养介质中培养透明酶转导A20 B细胞淋巴瘤。
- 在 700 cGy（单剂量）下照射 BALB/c 背景 WT 或 Ly5.1 受体。请参阅步骤 1.1 中的详细信息。
- 将 TCD-BM 与 B6 的股骨和肋骨分离。莱5.1供体小鼠。请参阅步骤 1.2.1_1.2.10 的详细信息。
- 从C57BL/6供体小鼠的脾脏和淋巴结中纯化T细胞。请参阅步骤 1.3.1_1.3.15 的详细信息。
- 用 25 mL 的 PBS 清洗 A20 淋巴瘤 2 倍。在10mL的冰冷PBS中重新悬浮细胞颗粒。取细胞悬浮脂肪（10 μL），并使用1%的锥蓝色和血细胞计对细胞进行计数。将细胞浓度调整到 20，000 细胞/mL。
- 注射TCD-BM（5 x 106/鼠标），带或不带T细胞（0.75 x 106/鼠标）和A20淋巴瘤（5，000个细胞/鼠标）。
- 在实验过程中跟踪接受者生存、GVHD临床体征和体重损失。请参阅步骤 1.5 中的详细信息。
- 进行生物发光成像。
- 通过向受体小鼠注射4毫克D-Luciferin来监测移植受体的肿瘤生长。孵育5分钟，以确保透明明与透明酶发生反应。
- 在生物发光成像仪的腔室中使用3%的isoflurane对小鼠进行麻醉，并在D场对受体进行5分钟的成像，曝光时间为1分钟。
- 使用图像分析软件分析数据。更改伪彩色图像的比例以获得最佳效果。
注：所有图片必须在实验中处于相同的比例。 - 使用图像分析软件通过计算从每个感兴趣区域发射的通量（光子/s）来确定感兴趣的区域并量化信号密度。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
主要的MHC不匹配的B6（H2k b）-BALB/C（H2kd）模型与移植后GVHD的发展密切相关（图2）。b库克等人16日建立的所有6个GVHD临床体征均发生在使用WT-B6 T细胞移植的接受者中，但不包括单独移植BM的接受者（步骤1.5），后者代表GVHD阴性组。此模型中 GVHD 开发有两个阶段。首先，严重程度的峰值在移植后大约11天，随后临床评分下降，体重恢复长达16天。在这个阶段，一些机制，如辐照引起的炎症和移植综合征驱动疾病致病性和GVHD。接受者在移植后约30-40天内均匀地屈服于GVHD。
至少85%的BM分化成DC（图3A）。有趣的是，用fB-/--D进行移植提高了接受者的存活率和GVHD临床评分（图3B，C）。鉴于fB-/-DCs的抗原呈现能力较低，MHCII表达较低，共刺激受体表达17减少，共同移植协议可能足以检查BMT后GVHD开发中接收D中的各种信号或靶点。
浓缩后T细胞纯度为90%（图4A）。路西线酶转导的A20 B细胞淋巴瘤允许监测活体动物的肿瘤生长（图4B）。在这个模型中，如果接受者死亡没有任何信号和高GVHD临床评分，则得出结论，他们死于GVHD。所有仅接受BM加A20的WT BALB/c接受者都死于肿瘤复发（图3B）。相比之下，如果动物死于更高的信号密度，则断定它们死于肿瘤复发。如图3 Figure 3B所示，从ACC1fl/fl B6供体（ACC1+/+T细胞fl/fl）移植的BM和T细胞的WT+/+ BALB/c受体死于GVHD。如果动物死于疾病信号，则断定它们死于GVHD和肿瘤复发。接受ACC1fl/fl x CD4克里B6供体（ACC1-/---T-/-细胞）BM和T细胞的动物死于GVHD和肿瘤复发（图3B）。动物可以放回笼子里，在以后的时间点进行成像，或安乐死，以便进行前活体成像。使用该软件，动物中的肿瘤质量也可以单独分析（图3B）。
图 1：BMT 过程的原理图表示形式。（A） MHC 不匹配的 B6_BALB/c BMT 模型的方案。（B） 直流共移植FVB+B6模型方案。（C） B6_BALB/c GVHD/GVL 型号的方案。请点击此处查看此图形的较大版本。
图 2：主要 MHC 不匹配的 B6_BALB/c GVHD 型号。BALB/c小鼠单独用5 x 106 BM或0.75 x 106 T细胞进行致命辐照和移植。（A） 生存数据， （B） 体重减轻， 和 （C） 临床评分数据 BM 的接受者单独或与 T 细胞.请点击此处查看此图形的较大版本。
图3：直流共移植HCT模型。BM从WT和fB-/-----B6小鼠中分离出来，并通过与GM-CSF进行培养，分化成DC。（A） 通过流细胞测定，用CD11c和MHCII染色，检查DC的纯度。致命的辐照B6受体移植与BM（3 x 106/鼠标）加上纯化T细胞（1 x 106/小鼠）从FVB捐赠者。接受者在移植当天还接受了2 x 106 WT或fB-/-----B6 BM-DC细胞。显示了存活率 （B） 和临床评分 （C） .请点击此处查看此图形的较大版本。
图 4：主要 MHC 不匹配的 B6_BALB/c GVHD/GVL 型号。WT BALB/c受体单独移植TCD-BM（5 x 106/小鼠），或与ACC1+/+T细胞或ACC1+/+T细胞（1 x 106/小鼠）从B6背景供体小鼠分离。此外，接受者在移植时接受了2 x 103 A20-luc。T细胞纯度通过流细胞测定通过活/死黄色、CD3、CD4和CD8流动抗体（A）染色进行检测。接受者被监测肿瘤生长由全身生物发光成像（BLI）（B）确定。请点击此处查看此图形的较大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
使用干细胞来适应特定个体是治疗晚期和抗药性癌症的有效方法。然而，小分子药物长期以来一直是个性化癌症治疗的主要焦点。另一方面，在细胞治疗中，供体和宿主之间的多种相互作用可以决定性地影响治疗结果，如BMT1后GVHD的发展。
BMT的主要MHC错配小鼠模型是了解GVHD生物学和测试药物治疗效果的宝贵工具。其中，C57BL/6（H2b）至BALB/c（H2d）和FVB（H2q）=C57BL/6（H2b）是公认的型号q5、7。75这些模型将骨髓辐射调理作为单剂量（BALB/c）或分馏剂量（C57BL/6），其中需要3-8小时间隔，以减少肠道毒性5。两种型号均依赖于 CD8+和 CD4+ T 单元。在这些模型中，GVHD 严重性和存活率是测量的主要结果，移植受体具有一致的快速动力学和 100% 的渗透率。为了监测T细胞的迁移和扩张，来自透明酶转导供体小鼠的T细胞应该用于体内生物发光成像19。然而，虽然90%的BMT执行是MHC匹配，B6-BALB/c模型不完全类似于临床情况。MHC和次要组织相容抗原（miHA）的发现大大有助于推进BMT10领域。小型MHC不匹配的GVHD小鼠模型更密切地模仿患者GVHD20。调节强度诱导供体细胞移植导致组织损伤，并可能影响GVHD结果21。在Minin模型中的调理方案通常涉及TBI，与临床环境中的化疗2222，23。23因此，免疫抑制化疗模型被用来模拟诊所中条件强度的降低。小鼠模型是C57BL/6（H2b）到BALB/c（H2d），移植接受者发展了临床和组织症状与GVHD24。
共同移植协议的潜在优点是测试受体DC的作用，而不具体取决于CD11c耗尽小鼠。由于BM-DC生成是除活体外进行的，因此只需修改培养条件，就可以应用此协议来测试其他细胞类型（如巨噬细胞或嗜中性粒细胞）在 GVHD 中的作用。使用CD45.1+ B6小鼠作为受体，研究人员可以通过流量分析区分BM-DC（CD45.2+ CD11c+）和受体DC（CD45.1+ CD11c+）。移植受体体内产生并采用的细胞的灵活数量是共同移植协议的另一个好处。此外，前活体培养允许我们筛选潜在的药物来控制GVHD。
跟踪体内肿瘤模式的能力是一个强大的工具，有可能测试药物是否会影响GVL活性。使用这种GVHD/GVL模型，肿瘤进展和转移可以在活体动物16中监测。此外，此设置可用于测试多癌症的 GVL 效应。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
提交人没有利益冲突。
Acknowledgments
这项研究由中佛罗里达大学医学院启动补助金（对HN）、匹兹堡大学医学中心希尔曼癌症中心启动补助金（至HL）、美国NIH赠款#1P20CA210300-01和越南卫生部赠款#4694/QD-BYT（至PTH）支持。我们感谢南卡罗来纳医科大学的余学忠博士为这项研究提供了材料。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5 M EDTA pH 8.0 100ML | Fisher Scientific | BP2482100 | MACS buffer |
| 10X PBS | Fisher Scientific | BP3994 | MACS buffer |
| A20 B-cell lymphoma | University of Central Florida | In house | GVL experiment |
| ACC1 fl/fl | Jackson Lab | 30954 | GVL experiment |
| ACC1 fl/fl CD4cre | University of Central Florida | GVL experiment | |
| Anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | T-cell enrichment |
| Anti-Human/Mouse CD45R (B220) | Thermo Fisher Scientific | 13-0452-85 | T-cell enrichment |
| Anti-mouse B220 FITC | Thermo Fisher Scientific | 10452-85 | Flow cytometry analysis |
| Anti-mouse CD11c- AF700 | Thermo Fisher Scientific | 117319 | Flow cytometry analysis |
| Anti-Mouse CD25 PE | Thermo Fisher Scientific | 12-0251-82 | Flow staining |
| Anti-Mouse CD4 Biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-0041-86 | T-cell enrichment |
| Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) | Thermo Fisher Scientific | 48-0042-82 | Flow staining |
| Anti-mouse CD45.1 PE | Thermo Fisher Scientific | 12-0900-83 | Flow cytometry analysis |
| Anti-Mouse CD8a APC | Thermo Fisher Scientific | 17-0081-83 | Flow cytometry analysis |
| Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 | Thermo Fisher Scientific | 46-5958-82 | Flow cytometry analysis |
| Anti-mouse MHC Class II-antibody APC | Thermo Fisher Scientific | 17-5320-82 | Flow cytometry analysis |
| Anti-Mouse TER-119 Biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-5921-85 | T-cell enrichment |
| Anti-Thy1.2 | Bio Excel | BE0066 | BM generation |
| B6 fB-/- mice | University of Central Florida | In house | Recipients |
| B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice | Charles River | 564 | Donors |
| BALB/c mice | Charles River | 028 | Transplant recipients |
| C57BL/6 mice | Charles River | 027 | Donors/Recipients |
| CD11b | Thermo Fisher Scientific | 13-0112-85 | T-cell enrichment |
| CD25-biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-0251-82 | T-cell enrichment |
| CD45R | Thermo Fisher Scientific | 13-0452-82 | T-cell enrichment |
| CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin | Thermo Fisher Scientific | 13-5971-82 | T-cell enrichment |
| Cell strainer 40 uM | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | Cell preparation |
| Cell strainer 70 uM | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | Cell preparation |
| D-Luciferin | Goldbio | LUCK-1G | Live animal imaging |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Bilogicals R&D system | D17051 | Cell Culture |
| Flow cytometry tubes | Fisher Scientific | 352008 | Flow cytometry analysis |
| FVB/NCrl | Charles River | 207 | Donors |
| Lipopolysacharide (LPS) | Millipore Sigma | L4391-1MG | DC mature |
| LS column | Mitenyi Biotec | 130-042-401 | Cell preparation |
| MidiMACS | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | T-cell enrichment |
| New Brunswick Galaxy 170R incubator | Eppendorf | Galaxy 170 R | Cell Culture |
| Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) | GIBCO | 15140 | Media |
| RPMI 1640 | Thermo Fisher Scienctific | 11875-093 | Media |
| TER119 | Thermo Fisher Scientific | 13-5921-82 | T-cell enrichment |
| Xenogen IVIS-200 | Perkin Elmer | Xenogen IVIS-200 | Live animal imaging |
| X-RAD 320 Biological Irradiator | Precision X-RAY | X-RAD 320 | Total Body Irradiation |
References
- Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
- Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
- Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
- Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
- Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
- Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006 (2018).
- Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
- Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
- Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
- Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
- Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
- Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
- Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
- Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
- Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
- Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
- McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417 (2013).
- Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
- Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
- Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
- Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
- Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
- Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).
