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Immunology and Infection

Plate-forme de transplantation de moelle osseuse pour étudier le rôle des cellules dendritiques dans la maladie de greffe-contre-hôte

Published: March 17, 2020 doi: 10.3791/60083
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

La maladie de greffe-contre-hôte est une complication principale après la transplantation allogeneic de moelle. Les cellules dendritiques jouent un rôle critique dans la pathogénie de la maladie de greffe-contre-hôte. L’article actuel décrit une nouvelle plate-forme de transplantation de moelle osseuse pour étudier le rôle des cellules dendritiques dans le développement de la maladie de greffe-contre-hôte et de l’effet de greffe-contre-leucémie.

Abstract

La transplantation allogeneic de moelle (BMT) est une thérapie efficace pour des malignités hématologiques due à l’effet de greffe-contre-leucémie (GVL) pour éradiquer des tumeurs. Cependant, son application est limitée par le développement de la maladie de greffe-contre-hôte (GVHD), une complication majeure de BMT. GVHD est évoqué quand les lymphocytes T dans les greffes de donneur reconnaissentalloantigen exprimées par les cellules de destinataire et montent des attaques immunologiques indésirables contre les tissus sains de destinataire. Ainsi, les thérapies traditionnelles sont conçues pour supprimer l’alloreactivité de T-cellule de donneur. Cependant, ces approches nuisent considérablement à l’effet GVL afin que la survie du receveur ne soit pas améliorée. Il est donc essentiel de comprendre les effets des approches thérapeutiques sur le BMT, le GVL et le GVHD. En raison des capacités de présentation et de sécrétion de cytokine de l’antigène pour stimuler les lymphocytes T donneurs, les cellules dendritiques du receveur jouent un rôle significatif dans l’induction de GVHD. Par conséquent, le ciblage des CD destinataire devient une approche potentielle pour contrôler GVHD. Ce travail fournit une description d’une nouvelle plate-forme BMT pour étudier comment les DCs hôtes régulent les réponses GVH et GVL après la transplantation. Un modèle BMT efficace pour étudier la biologie de la GVHD et du GVL après la transplantation est également présenté.

Introduction

La transplantation de cellules souches hématopoïétiques allogéniques (BMT) est une thérapie efficace pour traiter les malignités hématologiques1,2 par l’effet greffe-contre-leucémie (GVL)3. Cependant, les lymphocytes de donneur montent toujours des attaques immunologiques non désirées contre des tissus de destinataire, un processus appelé greffe-contre-hôte maladie (GVHD)4.

Les modèles murins de GVHD sont un outil efficace pour étudier la biologie de GVHD et la réponse GVL5. Les souris sont un modèle animal de recherche rentable. Ils sont petits et efficacement dosés avec des molécules et des produits biologiques aux premières phases du développement6. Les souris sont des animaux de recherche idéaux pour les études de manipulation génétique parce qu’ils sont génétiquement bien définis, ce qui est idéal pour étudier les voies biologiques et les mécanismes6. Plusieurs modèles de souris majeure histocompatibilité complexe (MHC) MHC-dépareillé modèles de GVHD ont été bien établis, tels que C57BL/6 (H2b) à BALB / c (H2d) et FVB (H2q) C57BL/6 (H2b)5,7. Ce sont des modèles particulièrement précieux pour déterminer le rôle des types de cellules, des gènes et des facteurs qui affectent la GVHD. La transplantation de C57/BL/6 (H2b) donneurs parentaux à des receveurs présentant des mutations dans le MHC I (B6.C-H2bm1) et/ou MHC II (B6.C-H2bm12) a révélé qu’un décalage dans la classe I et la classe II du MHC est une exigence importante pour le développement de GVHD aigus. Ceci suggère que les cellulesT de CD4et de CD8 sont exigées pour le développement de la maladie7,,8. GVHD est également impliqué dans une cascade inflammatoire connue sous le nom de «tempête de cytokine pro-inflammatoire»9. La méthode de conditionnement la plus courante dans les modèles murins est l’irradiation totale du corps (TBI) par rayon X ou 137Cs. Ceci mène à l’ablation de moelle d’os du destinataire, permettant ainsi l’engraftment de cellules souches de donneur et empêchant le rejet de la greffe. Ceci est fait en limitant la prolifération des lymphocytes T bénéficiaires en réponse aux cellules de donneur. En outre, les disparités génétiques jouent un rôle important dans l’induction de la maladie, qui dépend également de l’inadéquation mineure du MHC10. Par conséquent, la dose d’irradiation myéloablative varie selon différentes souches de souris (p. ex., BALB/c-C57BL/6).

L’activation des lymphocytes T donneurs par les cellules présentant des antigènes hôtes (APC) est essentielle pour le développement de la DGV. Parmi les APC, les cellules dendritiques (DCs) sont les plus puissantes. Ils sont héréditairement capables d’induire le GVHD en raison de leur absorption supérieure d’antigène, expression des molécules co-stimulatrices de lymphocytes T, et production de cytokines pro-inflammatoires qui polarisent les lymphocytes T en sous-ensembles pathogènes. Les CD bénéficiaires sont essentiels pour faciliter l’amorçage des lymphocytes T et l’induction de GVHD après la transplantation11,12. En conséquence, les CDC sont devenus des cibles intéressantes dans le traitement de GVHD12.

TBI est nécessaire pour améliorer l’engraftment cellulaire donneur. En raison de l’effet TBI, les CD destinataires sont activés et survivent pendant une courte période après la transplantation12. Malgré les progrès importants dans l’utilisation de la bioluminescence ou de la fluorescence, l’établissement d’un modèle efficace pour étudier le rôle des CD bénéficiaires dans le GVHD est toujours difficile.

Parce que les lymphocytes T donneurs sont la force motrice de l’activité GVL, les stratégies de traitement utilisant des médicaments immunosuppresseurs tels que les stéroïdes pour supprimer l’alloreactivité à cellule T causent souvent une rechute de tumeur ou une infection13. Par conséquent, le ciblage des CD destinataires peut fournir une approche alternative pour traiter le GVHD tout en préservant l’effet GVL et en évitant l’infection.

En bref, la présente étude fournit une plate-forme pour comprendre comment différents types de signalisation dans les CD destinataires régule le développement de GVHD et l’effet GVL après BMT.

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Protocol

Les procédures expérimentales ont été approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Floride centrale.

1. Induction GVHD

REMARQUE : La transplantation de cellules de moelle osseuse allogeneic (BM) (étape 1.2) est effectuée dans les 24 h après l’irradiation. Toutes les procédures décrites ci-dessous sont effectuées dans un environnement stérile. Effectuez la procédure dans un capot de culture tissulaire et utilisez des réactifs filtrés.

  1. Jour 0 : Préparer les souris receveures.
    1. Utilisez des souris femelles de type sauvage (WT) sur un fond BALB/c (CD45.2- H2kd '), 10-12 semaines en tant que receveurs.
    2. Ear-tag et peser les destinataires avant TBI. Ensuite, placez jusqu’à 11 souris dans la chambre d’irradiation et gardez-la dans l’irradiateur. Irradiate à une seule dose de 700 cGy pendant 10-15 min.
    3. Retournez les animaux irradiés dans les cages et logez-les dans des installations exemptes d’agents pathogènes avant la greffe.
      REMARQUE: Le poids corporel minimal des destinataires devrait être d’environ 20 g. Utilisez ce poids comme référence pour calculer la perte de poids du corps au cours de la période expérimentale.
  2. Jour 1 : Préparer la moelle osseuse appauvrie à cellule T (TCD-BM) des souris donneuses.
    1. Euthanasiez les souris CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 par asphyxie de CO2 et attendez 2 à 3 min jusqu’à ce qu’elles soient inconscientes. Effectuer la dislocation cervicale comme euthanasie secondaire si nécessaire.
    2. Placez chaque souris sur un tableau de travail propre. Désinfecter la fourrure et la peau avec 70% d’isopropanol.
    3. Recueillir le tibia et le fémur des deux jambes à l’aide de forceps et de ciseaux. Mettez-les dans un RPMI glacé contenant 1% de FCS et 100 U/mL pénicilline/streptomycine et 2 mM L-glutamine (1% RPMI) dans des tubes coniques de 50 ml. Nettoyez le fémur et les os du tibia à fond en enlevant tous les tissus musculaires à l’aide de forceps et de ciseaux. Transférer le fémur et le tibia des tubes coniques de 50 ml à un plat Petri de 92 mm de diamètre contenant 1% de RPMI.
    4. À l’aide de ciseaux, couper les extrémités du fémur ou du tibia. Remplir un tube de 50 ml avec 25 ml de 1% RPMI 1640 moyen. Utilisez-le pour remplir une seringue de 3 ml attachée à une aiguille de 26 G avec 3 ml de RPMI de 1 %. Insérez cette seringue dans l’os et poussez le piston à rincer la moelle osseuse (BM) de la cavité dans le tube de collecte avec 1% de RPMI (3 ml/os).
    5. Répéter l’étape 1.2.4 pour tous les os restants de tibia et de fémur d’autres souris de donneur. Gardez tous les tubes de collecte sur la glace.
    6. Faire la suspension à cellule unique en rinçant les morceaux de moelle osseuse à travers une passoire à cellules en maille de 75 m. Recueillir la suspension à cellule unique dans un tube de 50 ml.
    7. Tubes de centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min à 4 oC. Aspirer et jeter le supernatant. Réutilisez la granule dans le tampon PBS contenant 0,5% d’albumine de sérum bovin (BSA) à 20 x 106 cellules/mL. Enregistrer un aliquote de 2 x 106 cellules pour la coloration de pureté.
    8. Ajouter Thy 1 anticorps à 0,05 g/106 cellules14 et incuber pendant 30 min à 4 oC. Laver une fois avec 25 ml de PBS glacé. Résuspendez à 20 x 106/mL dans 0,5% BSA/10% jeune lapin complément/2% DNase (10.000 U/mL en sterile H2O). Incuber pendant 45 min à 37 oC et laver 2x comme avant.
      REMARQUE : Les lymphocytes T sont épuisés à l’aide d’un mAb spécifique pour Thy1, une protéine exprimée par toutes les lymphocytes T, mais pas d’autres leucocytes.
    9. Résuspendez les cellules dans 20 ml de tampon PBS contenant 0,5% BSA. Comptez les cellules de moelle osseuse dans 1% d’acide acétique à l’aide d’un hémocytomètre. Conserver un aliquote de 2 x 106 cellules pour un contrôle de pureté par cytométrie d’écoulement après la purification cellulaire.
      REMARQUE : Une souris de donneur génère normalement environ 25 x 106 TCD-BM.
    10. Utilisez la cytométrie d’écoulement pour confirmer un appauvrissement réussi de cellule T. Tache 1 x 106 cellules, conservées à partir des étapes 1.2.7 (avant l’épuisement des lymphocytes T) et 1.2.9 (TCD-BM après l’épuisement des lymphocytes T) avec les anticorps suivants : 'CD3 (17A2), 'CD4 (GK1.5), et '-CD8 ' (53-6.7).
  3. Jour 1 : Préparer les lymphocytes T des souris donneurs
    1. Utilisez des souris de+ type T (WT) de CD45.2 et H2kb' C57BL/6 comme donneurs de lymphocytes T.
    2. Euthanasier les souris C57BL/6 par le dioxyde de carbone (CO2) l’asphyxie telle que décrite dans 1.2.1.
    3. Nettoyer la fourrure et la peau de la souris à fond avec 70% d’éthanol. Accise les rates et les ganglions lymphatiques et les séparer en une seule suspension cellulaire de spénocytes à l’aide d’un piston de seringue et de passoires à mailles de 40 m. Laver la passoire et la seringue avec 1% de RPMI (1% FBS contenant des supports RPMI) pour collecter tous les ratenocytes.
    4. Centrifuge la suspension cellulaire à 800 x g pendant 5 min à 4 oC. Ajouter 5 mL de tampon de lysing ACK (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3, 144 mM NH4Cl, pH 7.2) après avoir jeté le supernatant. Incuber la suspension cellulaire pendant 5 minutes à température ambiante.
      REMARQUE : Le tampon de lyse ACK est utilisé pour lysing globules rouges.
    5. Ajouter 5 ml de RPMI à 1 % pour arrêter la lyse. Centrifugeuse à 800 x g pour 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
    6. Préparer le tampon de tri magnétique à froid glacé (MACS) tampon (0,5 % BSA, 2 mM EDTA dans PBS, pH 7.2). Dégazer le tampon avant l’utilisation. Réutilisez les granulés de cellules dans 5 ml de tampon MACS.
    7. Comptez les plénocytes et vérifiez les cellules vivantes et mortes à l’aide d’un hémocytomètre et de 1% de bleu trypan. Enregistrer un aliquote de 2 x 106 cellules pour évaluer le rendement de purification avec l’analyse de cytométrie de débit.
    8. Resuspendez les plénètes à la concentration de 200 x 106/mLdans le tampon MACS. Ajoutez 0,03 L de biotine anti-souris-Ter-119, 0,03 L de biotine anti-souris-CD11b, 0,03 L d’anti-souris-CD45R de biotine et 0,03 L d’anti-souris-DX5 biotin pour 106 cellules. Incuber pendant 15 min à 4 oC.
      REMARQUE : Biotin anti-mouse-Ter-119, biotin anti-mouse-CD11b, biotin anti-mouse-CD45R, et biotin anti-mouse-DX5 ont été employés pour réagir avec des cellules érythroides, granulocytes, B-cells, et NK respectivement. Par conséquent, ces sous-ensembles cellulaires sont épuisés dans la foulée de l’étape15.
    9. Ajouter 10 ml de tampon MACS glacé à la suspension cellulaire. Centrifugeuse à 800 x g pour 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
    10. Réutilisez les granulés cellulaires dans le tampon MACS à une concentration de 100 x 106/mL. Ajouter les microbilles antibiotines (0,22 l/106 cellules) à la suspension de la rate. Bien mélanger et incuber pendant 15 minutes supplémentaires à 4 oC. Laver la suspension cellulaire une fois avec 10 ml de tampon MACS glacé. Centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min à 4 oC et jeter le supernatant.
    11. Placez une colonne de séparation magnétique dans le champ magnétique. Rincer la colonne avec 3 ml de tampon MACS. Déposez la suspension de la cellule sur la colonne. Recueillir le flux-through composé de non liés, enrichis lymphocytes T, dans un nouveau tube conique de 15 mL. Laver la colonne MS avec 3 ml de tampon MACS glacé.
      REMARQUE : Assurez-vous que la colonne est vide avant d’effectuer les étapes de lavage.
    12. Centrifuge la suspension cellulaire à 800 x g pendant 5 min à 4 oC. Réutilisez la pastille cellulaire dans 5 ml de tampon MACS.
    13. Comptez les cellules en bleu trypan de 1 % à l’aide d’un hémocytomètre. Enregistrer un aliquote de 2 x 106 cellules pour un contrôle de pureté par cytométrie d’écoulement.
      REMARQUE : Le rendement moyen des lymphocytes T spléniques isolés par cette méthode est de 20 à 25 x 106 cellules par souris.
    14. Confirmer le rendement de l’enrichissement des lymphocytes T par cytométrie d’écoulement. Tache 1 x 106 cellules, conservées à partir des étapes 1.3.7 (avant l’épuisement des lymphocytes T) et 1.3.13 (TCD-BM après l’épuisement des lymphocytes T), avec les anticorps suivants: 'CD3 (17A2), 'CD4 (GK1.5), et '-CD8 ' (53-6.7).
  4. Jour 1 : Injectez des souris irradiées avec des lymphocytes T donneurs et TCD-BM.
    1. Laver le TCD-BM et les lymphocytes T 2x avec PBS (800 x g pendant 5 min à 4 oC). Réutilisez les cellules dans PBS glacé pour l’injection. Ajuster la concentration cellulaire à 20 x 106/mL pour TCD BM et 4 x 106/mL pour les lymphocytes T.
    2. Chauffer l’animal à l’aide d’une lampe chauffante pour augmenter la visibilité des veines de queue bilatérales. Si nécessaire, placez la souris dans une retenue.
    3. Nettoyez la surface de la queue à l’aide de 70% d’isopropanol. Injecter TCD-BM (5 x 106 cellules/souris) avec ou sans lymphocytes T (0,75 x 106 cellules/souris). Veillez à ne pas introduire d’air dans la seringue.
    4. Retirez l’aiguille et appliquez un écouvillon antiseptique directement au site d’injection 5 à 10 s pour arrêter tout saignement.
  5. Évaluer le GVHD les jours 2-80.
    1. Gardez une trace de la survie de l’animal. Surveillez les signes cliniques de GVHD adaptés du système de notation établi précédemment par Cook et al.16 et le poids corporel des souris receveures 2x par semaine. Utilisez le poids corporel déterminé avant l’ITT pour calculer la perte de poids corporelle.
    2. Peser chaque souris individuellement. Marquez la perte de poids comme suit : grade 0 - moins de 10%; grade 1 - 10%-20%; grade 2 - plus de 20%.
    3. Marquez le signe de posture des receveurs : grade 0 , pas d’intuition; grade 0.5 - légère intuition, mais se redresse lors de la marche; grade 1 - l’animal reste voûté lors de la marche; grade 1.5 - l’animal ne se redresse pas; grade 2.0 - stand animal sur les pattes arrière.
    4. Marquez le signe de mobilité des bénéficiaires : 0e année et très actif; grade 0.5 - plus lent que les souris naïves; grade 1.0 - se déplace seulement lorsqu’il est piqué; grade 1.5 - se déplace légèrement lorsqu’il est piqué; grade 2.0 - ne bouge pas lorsqu’il est piqué.
    5. Score de la peau des receveurs: grade 0 - pas d’abrasions, lésions ou mise à l’échelle; grade 0.5 - rougeur dans un domaine spécifique; grade 1 - abrasion dans une zone ou abrasion douce dans deux secteurs ; grade 1.5 - abrasions graves dans deux zones ou plus; grade 2.0 - abrasions sévères, peau craquante, sang séché.
    6. Notons la fourrure des receveurs : grade 0, aucun signe anormal; grade 0.5 - débarrassant sur le côté du ventre ou de la nuque, grade 1.0 - se débarrassant à travers ou sur le côté du ventre et du cou; grade 1.5 - fourrure emmêlée et ébouriffée; grade 2.0 - fourrure mal emmêlée sur le ventre et le dos.
    7. Notons la diarrhée des receveurs : grade 0, pas de diarrhée; grade 0.5 - selles légères et molles; grade 1.0 - doux (selles jaunes); grade 1.5 - modéré (selles jaunes avec un peu de sang); grade 2 - sévère (jaune clair et selles sanglantes, « tabourets à gâteau séchés » apparaissent à la zone anale).

2. Modèle de cotransplantation

  1. Générer des cellules dendritiques dérivées de la moelle osseuse (BM-DCs).
    1. Isoler la moelle osseuse des fémurs et des tibias de WT ou du facteur B (fB)-/- souris sur le fond B6 comme décrit dans les étapes 1.2.3-1.2.4. Tourner les cellules à 800 x g pendant 5 min.
    2. Résuspendez la pastille dans 5 ml de tampon de lysage ACK pour la lyse des globules rouges. Incuber la suspension cellulaire pendant 5 min sur la glace. Ajouter 10 ml de RPMI à la suspension cellulaire pour arrêter la lyse et la centrifugeuse à 800 x g pendant 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
    3. Ressuspendez les granulés de cellules dans 10 ml de supports culturels (RPMI 1460 contenant 10% FBS, 100 U/mL de pénicilline/streptomycine, 2 mM l-glutamine, et 50 mM -mercaptoethanol) et ajuster le volume pour répondre à la concentration finale de 2 x 106/mL cellules.
    4. Ajoutez 20 ng/mL granulocyte-macrophage facteur de stimulation de la colonie (GM-CSF) à la suspension cellulaire. Culture les cellules de moelle osseuse dans des plats Petri de 100 x 15 mm à 37 oC en 5 % de CO2 pendant 6 jours.
    5. Remplacez la moitié des supports culturels en cours (environ 5 ml) par des supports frais contenant 40 ng/mL GM-CSF le jour 3.
    6. Avant la guerre, les médias culturels dans un bain d’eau à 37 oC. Recueillir environ 5 ml de médias à partir des plats de culture de la moelle osseuse. Centrifugeuse à 800 x g pour 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant. Réutilisez la pastille cellulaire dans un support culturel de 5 ml contenant 40 ng/mL GM-CSF.
    7. Ajouter 25 g/mL lipopolysaccharide (LPS) aux médias le jour 6 de la culture pour mûrir les BM-DCs. Enregistrer un aliquot de 2 x 106 cellules pour déterminer l’efficacité de différenciation DC par cytométrie d’écoulement.
    8. Recueillir des BM-DCs matures : Utilisez des élévateurs cellulaires pour gratter doucement les DC des plats Petri. Recueillir toutes les suspensions cellulaires dans des tubes coniques de 50 ml. Centrifugeuse à 800 x g,pour 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant. Laver les granulés de cellules 3x avec 50 ml de PBS glacé. Économisez environ 2 x 106 BM-DCs pour l’analyse immunologique du phénotype par cytométrie d’écoulement.
  2. Effectuez la co-transplantation de cellules dendritiques de BMT (DC-cotransplanting BMT).
    REMARQUE : Utilisez des souris FVB (H2kq)comme donneurs pour les lymphocytes T et les cellules BM. Irradiate B6 Ly5.1 souris receveures à une dose de 1 100 cGy (2 doses, 3 h d’intervalle). Voir les détails à l’étape 1.1.
    1. Isoler BM des fémurs et des tibias des souris donneuses de FVB. Voir les détails dans les étapes 1.2.3-1.2.10.
      REMARQUE : Utilisez la moelle osseuse isolée totale au lieu de TCD-BM dans ce modèle.
    2. Purifier les lymphocytes T des rates et des ganglions lymphatiques des souris donneurs de FVB. Voir les détails dans les étapes 1.3.1-1.3.13.
    3. Injecter BM (5 x 106/souris), T-cells (0.5 x 106/mouse) avec BM-DCs (2 x 106/mouse) le jour 0 du cours expérimental.
    4. Le jour 3 après la transplantation, examinez la reconstitution de DC de donneur par cytométrie d’écoulement.
      1. Recueillir le sang des yeux des receveurs.
      2. Anesthésiez les souris CD45.1/Ly5.1 B6 par 3% d’inhalation d’isoflurane. Vérifiez la profondeur de l’anesthésie par l’absence de réponse à un pincement d’un toe.
      3. Placez un tube de pipette en verre stérile dans le canthus médial de l’œil dirigé caudally à un angle de 30 à 45 degrés du plan du nez. Appliquer une pression tout en faisant pivoter doucement le tube.
      4. Déposer le sang dans un tube stérile de microcentrifuge stérile de 1,5 mL contenant de l’héparine. Transférer 50 L de sang dans des tubes de flux de verre de 5 ml.
      5. Ajouter 2 ml de tampon de lysage ACK. Incuber à 37 oC dans un bain d’eau pendant 45 min. Ajouter 2 ml de tampon de colorant FACS. Centrifugeuse à 800 x g pour 5 min à 4 oC. Jetez le supernatant.
      6. Resuspendez les granulés de cellules avec 200 l de tampon FACS contenant des anticorps appropriés de coloration de débit (jaune vivant/mort, '-H-2Kb, '-CD45.1, '-CD45.2, 'CD11c, et '-MHCII). Incuber pendant 15 min à 4 oC dans l’obscurité. Laver 2x avec 1 mL tampon FACS. Réutilisez les granulés de cellules dans 200 L de tampon FACS et effectuez l’analyse par cytométrie d’écoulement.

3. Modèles GVHD/GVL de BMT

  1. Effectuez l’induction GVHD/GVL.
    1. Culture la luciferase transduite au lymphome de cellules A20 B dans les médias de culture RPMI.
    2. Irradiate BALB/c fond WT ou Ly5.1 receveur à 700 cGy (dose unique). Voir les détails à l’étape 1.1.
    3. Isoler TCD-BM des fémurs et des tibias de B6. Ly5.1 souris donneuses. Voir les détails dans les étapes 1.2.1-1.2.10.
    4. Purifier les lymphocytes T des rates et des ganglions lymphatiques des souris donneurs C57BL/6. Voir les détails dans les étapes 1.3.1-1.3.15.
    5. Laver le lymphome A20 2x avec 25 ml de PBS. Réutilisez les granulés de cellules dans 10 ml de PBS glacé. Prenez un aliquot de suspension cellulaire (10 l) et comptez les cellules à l’aide de 1% de bleu trypan et d’un hémocytomètre. Ajuster la concentration cellulaire à 20 000 cellules/mL.
    6. Injecter TCD-BM (5 x 106/souris)avec ou sans lymphocytes T (0,75 x 106/souris)et lymphome A20 (5 000 cellules/souris).
    7. Suivi de la survie du destinataire, des signes cliniques GVHD, et de la perte de poids corporelle pendant le cours expérimental. Voir les détails à l’étape 1.5.
  2. Effectuez l’imagerie bioluminescente.
    1. Surveiller la croissance tumorale dans le receveur transplanté en injectant aux souris receveures 4 mg de D-luciferine. Incuber pendant 5 min pour s’assurer que la luciferine réagit avec la luciferase.
    2. Anesthésiez la souris à l’aide de 3% d’isoflurane dans la chambre d’un imageur de bioluminescence et imagez les destinataires pendant 5 min dans le champ D et le temps d’exposition de 1 min.
    3. Analyser les données à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images. Modifier l’échelle des images pseudo couleur pour de meilleurs résultats.
      REMARQUE: Toutes les images doivent être à la même échelle à travers les expériences.
    4. Utilisez le logiciel d’analyse d’images pour déterminer les régions d’intérêt et quantifier la densité du signal en calculant le flux (photons/s) émis par chaque région d’intérêt.

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Representative Results

Le modèle B6 majeur dépareillé MHC (H2kb)-BALB/C (H2kd)correspondait étroitement au développement du GVHD après la transplantation(figure 2). Les six signes cliniques de GVHD établis précédemment par Cooke et coll.16 se sont produits dans les destinataires transplantés avec des lymphocytes T WT-B6 mais pas dans les destinataires transplantés avec BM seul (étape 1.5), qui représentaient le groupe GVHD-négatif. Il y a deux phases dans le développement de GVHD dans ce modèle. Tout d’abord, le pic de gravité est d’environ 11 jours après la transplantation, suivie d’une réduction des scores cliniques et de la récupération du poids corporel jusqu’à 16 jours. Dans cette phase, plusieurs mécanismes tels que l’inflammation et le syndrome d’engraftment induits par l’irradiation conduisent la pathogène de la maladie et le GVHD. Les receveurs succombent uniformément au GVHD environ 30 à 40 jours après la transplantation.

Au moins 85 % de la BM se différencie en CD(figure 3A). Fait intéressant, la transplantation avec fB-/- DCs a amélioré la survie du receveur et le score clinique GVHD(figure 3B,C). Étant donné que le fB-/- les DCs ont moins de capacité de présentation d’antigène démontrée par une expression plus faible de MHCII et une expression réduite des récepteurs co-stimulants17, le protocole de co-transplantation peut être suffisant pour examiner divers signalements ou cibles dans les CD destinataires dans le développement de GVHD après BMT.

La pureté des lymphocytes T était de 90 % après l’enrichissement(figure 4A). Le lymphome cellulaire A20 B transducté par Luciferase permet de surveiller la croissance tumorale chez les animaux vivants(figure 4B). Dans ce modèle, si les destinataires sont morts sans aucun signal et un score clinique élevé de GVHD, il a été conclu qu’ils sont morts de GVHD. Tous les receveurs balB/c WT qui ont reçu BM seul plus A20 est mort de rechute tumorale (Figure 3B). En revanche, si l’animal est mort d’une densité de signal plus élevée, il a été conclu qu’ils sont morts de rechute de tumeur. Comme le démontre la figure 3B, les receveurs WT BALB/c transplantés avec des cellules BM et T du donneur ACC1fl/fl B6 (ACC1/MD T-cells) sont morts de GVHD. Si les animaux sont morts avec des signaux de la maladie, il a été conclu qu’ils sont morts de GVHD et de rechute de tumeur. Les animaux qui ont reçu des cellules BM et T de l’ACC1fl/fl x CD4 cre B6 donneur (ACC1-/- lymphocytes T) sont morts de la GVHD et de la rechute tumorale(figure 3B). Les animaux peuvent être placés dans la cage pour être photographiés à un moment ultérieur ou euthanasiés pour l’imagerie ex vivo. À l’aide du logiciel, la masse tumorale de l’animal peut également être analysée individuellement(figure 3B).

Figure 1
Figure 1 : Représentation schématique de la procédure BMT. (A) Scheme for MHC-mismatched B6-BALB/c BMT model. (B) Scheme for DC co-transplanting FVB-B6 model. (C) Schéma pour le modèle B6-BALB/c GVHD/GVL. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2
Figure 2 : Modèle B6-BALB/c GVHD dépareillé par le MHC majeur. Les souris BALB/c ont été mortellement irradiées et transplantées avec 5 x 106 BM seule ou avec 0,75 x 106 lymphocytes T. (A) Données de survie, (B) perte de poids corporel, et (C) données de score clinique des destinataires de BM seul ou avec des lymphocytes T. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3
Figure 3 : Modèle de co-transplantation de HCT de DC. BM a été isolé des souris WT et FB-/- B6 et différencié en DCs en se culturant avec GM-CSF. (A) La pureté des DC a été examinée par cytométrie d’écoulement par coloration avec CD11c et MHCII. Les receveurs B6 mortellement irradiés ont été transplantés avec BM (3 x 106/souris) plus les lymphocytes T purifiés (1 x 106/souris) des donneurs de FVB. Les receveurs ont également reçu 2 x 106 cellules WT ou fB-/- B6 BM-DCs le jour de la transplantation. La survie (B) et le score clinique (C) sont montrés. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4
Figure 4 : Modèle B6-BALB/c GVHD/GVL dépareillé de Major-MHC. Les receveurs de WT BALB/c ont été transplantés avec TCD-BM (5 x 106/souris)seuls ou avec ACC1- T-cells ou ACC1' / T-cellules (1 x 106/souris) isolées des souris de donneur de fond B6. De plus, les receveurs ont reçu 2 x 103 A20-luc au moment de la greffe. La pureté des lymphocytes T a été examinée par cytométrie d’écoulement par la coloration avec des anticorps vivants/mortels de flux de CD8 (A). Les destinataires ont été surveillés pour la croissance de tumeur déterminée par l’imagerie de bioluminescence de corps entier (BLI) (B). S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Discussion

L’utilisation de cellules souches pour convenir à une personne particulière est une approche efficace pour traiter les cancers avancés et résistants18. Les produits pharmaceutiques à petites molécules, cependant, sont longtemps restés un foyer principal de la thérapie personnalisée de cancer. D’autre part, dans la thérapie cellulaire une multitude d’interactions entre le donneur et l’hôte peut influencer de façon décisive les résultats du traitement, tels que le développement de GVHD après BMT1.

Les principaux modèles de souris dépareillés de BMT sont un outil précieux pour comprendre la biologie du GVHD et tester l’efficacité des médicaments dans son traitement. Parmi eux, C57BL/6 (H2b) à BALB/c (H2d) et FVB (H2q) C57BL/6 (H2b) sont des modèles bien établis5,7. Ces modèles intègrent soit le conditionnement de rayonnement myéloablatif comme une dose simple (BALB/c) ou une dose fractionnée (C57BL/6) dans laquelle des intervalles de 3 à 8 heures sont exigés pour diminuer la toxicité intestinale5. Les deux modèles dépendent à la fois deslymphocytes T CD8 et CD4. Dans ces modèles, la sévérité et la survie de GVHD sont les principaux résultats mesurés, et le destinataire transplanté a la cinétique rapide cohérente et la pénététique 100%. Afin de surveiller la migration et l’expansion des lymphocytes T, les lymphocytes T des souris donneuses transduites par luciferase devraient être utilisées pour l’imagerie in vivobioluminescence19. Cependant, alors que 90 % du BMT effectué est jumelé au MHC, le modèle B6-BALB/c ne ressemble pas parfaitement à la situation clinique. La découverte des antigènes mHC et de l’histocompatibilité mineure (miHAs) a contribué de manière significative à faire progresser le domaine du BMT10. Les modèles mineurs de souris GVHD dépareillés de MHC imitent plus étroitement le patient GVHD20. L’intensité de conditionnement pour induire l’engraftment de cellules de distributeur cause des dommages de tissu et peut affecter le résultatGVHD 21. Les schémas de conditionnement dans les modèles murins impliquent souvent TBI contrairement à la chimiothérapie dans les milieux cliniques22,23. Par conséquent, un modèle de chimiothérapie immunosuppressive a été utilisé pour imiter une intensité conditionnelle réduite dans les cliniques. Le modèle de souris était C57BL/6 (H2b) à BALB/c (H2d) et les destinataires transplantés ont développé des symptômes cliniques et histologiques liés au GVHD24.

L’avantage potentiel du protocole co-transplanté est de tester le rôle des CD receveurs sans dépendre spécifiquement des souris appauvries CD11c. Puisque la génération BM-DC a été exécutée ex vivo, ce protocole peut également être appliqué pour tester le rôle d’autres types de cellules tels que les macrophages ou les neutrophiles dans GVHD simplement en modifiant les conditions de culture. L’utilisation de souris CD45.1et B6 comme receveurs permet aux chercheurs de distinguer les BM-DCs (CD45.2et CD11c) des CD bénéficiaires (CD45.1et CD11c)par analyse de flux.+ Le nombre flexible de cellules générées ex vivo et adoptedinto les receveurs transplantés est un autre avantage du protocole de co-transplantation. En outre, la culture ex vivo nous permet de filtrer les médicaments potentiels pour contrôler GVHD.

La capacité de suivre les modèles tumoraux in vivo est un outil puissant qui a le potentiel de tester si un médicament peut affecter l’activité GVL. À l’aide de ce modèle GVHD/GVL, la progression tumorale et la métastase peuvent être surveillées chez les animaux vivants16. En outre, ce paramètre peut être utilisé pour tester l’effet GVL dans plusieurs cancers.

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Disclosures

Les auteurs n’ont pas de conflits d’intérêts.

Acknowledgments

Cette étude est soutenue par l’Université de Central Florida College of Medicine subvention de démarrage (à HN), l’Université de Pittsburgh Medical Center Hillman Cancer Center start-up subvention (à HL), les États-Unis NIH Grant #1P20CA210300-01 et le ministère vietnamien de la Santé Grant #4694/QD-BYT (à PTH). Nous remercions le Dr Xue-zhong Yu de l’Université médicale de Caroline du Sud d’avoir fourni du matériel pour l’étude.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA pH 8.0 100ML Fisher Scientific BP2482100 MACS buffer
10X PBS Fisher Scientific BP3994 MACS buffer
A20 B-cell lymphoma University of Central Florida In house GVL experiment
ACC1 fl/fl Jackson Lab 30954 GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4cre University of Central Florida GVL experiment
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485 T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220) Thermo Fisher Scientific 13-0452-85 T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITC Thermo Fisher Scientific 10452-85 Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700 Thermo Fisher Scientific 117319 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PE Thermo Fisher Scientific 12-0251-82 Flow staining
Anti-Mouse CD4 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-0041-86 T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) Thermo Fisher Scientific 48-0042-82 Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PE Thermo Fisher Scientific 12-0900-83 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APC Thermo Fisher Scientific 17-0081-83 Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-5958-82 Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APC Thermo Fisher Scientific 17-5320-82 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-5921-85 T-cell enrichment
Anti-Thy1.2 Bio Excel BE0066 BM generation
B6 fB-/- mice University of Central Florida In house Recipients
B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice Charles River 564 Donors
BALB/c mice Charles River 028 Transplant recipients
C57BL/6 mice Charles River 027 Donors/Recipients
CD11b Thermo Fisher Scientific 13-0112-85 T-cell enrichment
CD25-biotin Thermo Fisher Scientific 13-0251-82 T-cell enrichment
CD45R Thermo Fisher Scientific 13-0452-82 T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin Thermo Fisher Scientific 13-5971-82 T-cell enrichment
Cell strainer 40 uM Thermo Fisher Scientific 22363547 Cell preparation
Cell strainer 70 uM Thermo Fisher Scientific 22363548 Cell preparation
D-Luciferin Goldbio LUCK-1G Live animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Bilogicals R&D system D17051 Cell Culture
Flow cytometry tubes Fisher Scientific 352008 Flow cytometry analysis
FVB/NCrl Charles River 207 Donors
Lipopolysacharide (LPS) Millipore Sigma L4391-1MG DC mature
LS column Mitenyi Biotec 130-042-401 Cell preparation
MidiMACS Miltenyi Biotec 130-042-302 T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubator Eppendorf Galaxy 170 R Cell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140 Media
RPMI 1640 Thermo Fisher Scienctific 11875-093 Media
TER119 Thermo Fisher Scientific 13-5921-82 T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200 Perkin Elmer Xenogen IVIS-200 Live animal imaging
X-RAD 320 Biological Irradiator Precision X-RAY X-RAD 320 Total Body Irradiation

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References

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Immunologie et infection numéro 157 transplantation hématopoïétique de cellules souches greffe de moelle osseuse maladie de greffe contre hôte greffe contre leucémie cellules dendritiques co-transplantation de cellules dendritiques
Plate-forme de transplantation de moelle osseuse pour étudier le rôle des cellules dendritiques dans la maladie de greffe-contre-hôte
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Nguyen, H. D., Huong, P. T., Hossack, K., Gurshaney, S., Ezhakunnel, K., Huynh, T. H., Alvarez, A. M., Le, N. T., Luu, H. N. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. (157), e60083, doi:10.3791/60083 (2020).

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