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Immunology and Infection

बोन मैरो प्रत्यारोपण मंच भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग में Dendritic कोशिकाओं की भूमिका की जांच करने के लिए

Published: March 17, 2020 doi: 10.3791/60083
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

एलोजेनिक बोन मैरो प्रत्यारोपण के बाद भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग एक बड़ी जटिलता है । डेंग्ड्रिटिक कोशिकाएं भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग के रोगजनकता में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। वर्तमान लेख भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग और भ्रष्टाचार बनाम ल्यूकेमिया प्रभाव के विकास में डेंड्रिटिक कोशिकाओं की भूमिका की जांच करने के लिए एक उपन्यास अस्थि मज्जा प्रत्यारोपण मंच का वर्णन करता है ।

Abstract

ट्यूमर को समाप्त करने के लिए भ्रष्टाचार बनाम ल्यूकेमिया (जीवीएल) प्रभाव के कारण एलोजेनिक बोन मैरो प्रत्यारोपण (बीएमटी) हेमेटोलॉजिकल घातक के लिए एक प्रभावी चिकित्सा है। हालांकि, इसका आवेदन भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग (GVHD), बीएमटी की एक बड़ी जटिलता के विकास से सीमित है । GVHD पैदा किया जाता है जब दाता ग्राफ्ट में टी कोशिकाओं प्राप्तकर्ता कोशिकाओं द्वारा व्यक्त allalloantigen पहचान और प्राप्तकर्ता स्वस्थ ऊतकों के खिलाफ अवांछित प्रतिरक्षा हमलों माउंट । इस प्रकार, पारंपरिक चिकित्सा दाता टी सेल alloreactivity को दबाने के लिए डिज़ाइन कर रहे हैं । हालांकि, ये दृष्टिकोण जीवीएल प्रभाव को काफी हद तक ख़राब करते हैं ताकि प्राप्तकर्ता के अस्तित्व में सुधार न हो। बीएमटी, जीवीएल और जीवीएचडी पर चिकित्सीय दृष्टिकोणों के प्रभावों को समझना, इस प्रकार आवश्यक है। दाता टी-कोशिकाओं को प्रोत्साहित करने के लिए एंटीजन-पेश करने और साइटोकिन-स्राव क्षमताओं के कारण, प्राप्तकर्ता डेंड्रिटिक कोशिकाएं (डीसी) जीवीएचडी को शामिल करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। इसलिए, प्राप्तकर्ता डीसी को लक्षित करना जीवीएचडी को नियंत्रित करने के लिए एक संभावित दृष्टिकोण बन जाता है। यह काम एक उपन्यास बीएमटी मंच का वर्णन प्रदान करता है ताकि यह जांच की जा सके कि प्रत्यारोपण के बाद मेजबान डीसी जीवीएच और जीवीएल प्रतिक्रियाओं को कैसे विनियमित करते हैं। इसके अलावा प्रस्तुत प्रत्यारोपण के बाद जीवीएचडी और जीवीएल के जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी बीएमटी मॉडल है।

Introduction

एलोजेनिक हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल प्रत्यारोपण (बीएमटी) भ्रष्टाचार बनाम ल्यूकेमिया (जीवल) प्रभाव3के माध्यम से हेमेटोलॉजिकल घातक1,,2 के इलाज के लिए एक प्रभावी चिकित्सा है। हालांकि, दाता लिम्फोसाइट्स हमेशा प्राप्तकर्ता ऊतकों के खिलाफ अवांछित प्रतिरक्षा हमलों को माउंट करते हैं, एक प्रक्रिया जिसे भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग (GVHD)4कहा जाता है।

जीवीएचडी के Murine मॉडल जीवीएचडी के जीव विज्ञान और जीवीएल प्रतिक्रिया5का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी उपकरण हैं। चूहे एक लागत प्रभावी अनुसंधान पशु मॉडल हैं। वे विकासकेशुरुआती चरणों में अणुओं और जीवविज्ञान ों के साथ छोटे और कुशलता से खुराक लेते हैं । चूहे आनुवंशिक हेरफेर अध्ययन के लिए आदर्श शोध जानवर हैं क्योंकि वे आनुवंशिक रूप से अच्छी तरह से परिभाषित हैं, जो जैविक रास्तों और तंत्र6का अध्ययन करने के लिए आदर्श है। कई माउस प्रमुख हिस्टोकॉम्पिटीबिलिटी कॉम्प्लेक्स (एमएचसी) एमवीएचडी के एमएचसी-बेमेल मॉडल अच्छी तरह से स्थापित किए गए हैं, जैसे C57BL/6 (H2b)से बाल्बी/सी (H2d)और एफवीबी (H2q)→ C57BL/6 (H2b)5,,7। ये विशेष रूप से मूल्यवान मॉडल हैं जो जीवीएचडी को प्रभावित करने वाले व्यक्तिगत कोशिका प्रकारों, जीन और कारकों की भूमिका निर्धारित करने के लिए हैं। C57/BL/6 (H2b)से प्रत्यारोपण MHC I (B6.C-H2bm1)और/या MHC द्वितीय (B6.C-H2bm12)में उत्परिवर्तन के साथ प्राप्तकर्ताओं के लिए माता पिता के दाताओं से पता चला है कि दोनों MHC वर्ग मैं और वर्ग द्वितीय में एक बेमेल तीव्र GVHD के विकास के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है । इससे पता चलता है कि रोग विकास7,8के लिए सीडी 4+ और सीडी 8+ टी-कोशिकाओं दोनों की आवश्यकता होती है । जीवीएचडी एक भड़काऊ झरना में भी शामिल है जिसे 'प्रो-भड़काऊ साइटोकिन स्टॉर्म'9के नाम से जाना जाता है। मूत्र मॉडल में सबसे आम कंडीशनिंग विधि एक्स-रे या 137सीएस द्वारा कुल शरीर विकिरण (टीबीआई) है। यह प्राप्तकर्ता के अस्थि मज्जा एब्लेशन की ओर जाता है, जिससे दाता स्टेम सेल एनग्राफमेंट की अनुमति देता है और भ्रष्टाचार की अस्वीकृति को रोकता है। यह दाता कोशिकाओं के जवाब में प्राप्तकर्ता टी-कोशिकाओं के प्रसार को सीमित करके किया जाता है। इसके अतिरिक्त, आनुवंशिक असमानताएं रोग प्रेरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं, जो मामूली एमएचसी-बेमेल10पर भी निर्भर करती है । इसलिए, माइलोएबलेटिव विकिरण खुराक विभिन्न माउस उपभेदों (जैसे, बाल्बी/सी →C57BL/6) में भिन्न होती है।

मेजबान एंटीजन पेश कोशिकाओं (APCs) द्वारा दाता टी कोशिकाओं की सक्रियण GVHD विकास के लिए आवश्यक है । एपीसी में, डेंड्रिटिक कोशिकाएं (डीसी) सबसे शक्तिशाली हैं। वे अपने बेहतर एंटीजन तेज, टी-सेल सह-उत्तेजक अणुओं की अभिव्यक्ति और प्रो-भड़काऊ साइटोकिन्स के उत्पादन के कारण जीवीएचडी को प्रेरित करने में सक्षम हैं जो टी-कोशिकाओं को रोगजनक सबसेट में ध्रुवित करते हैं। प्राप्तकर्ता डीसी11,12प्रत्यारोपण के बाद टी-सेल प्राइमिंग और जीवीएचडी इंडक्शन की सुविधा के लिए महत्वपूर्ण हैं । तदनुसार, डीसी GVHD12के उपचार में दिलचस्प लक्ष्य बन गए हैं ।

डोनर सेल एनग्राफमेंट को बढ़ाने के लिए टीबीआई की जरूरत होती है। टीबीआई प्रभाव के कारण, प्राप्तकर्ता डीसी सक्रिय होते हैं और प्रत्यारोपण12के बाद थोड़े समय के लिए जीवित रहते हैं। बायोल्यूमिनेसेंस या फ्लोरेसेंस के उपयोग में प्रमुख प्रगति के बावजूद, जीवीएचडी में प्राप्तकर्ता डीसी की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक प्रभावी मॉडल की स्थापना अभी भी चुनौतीपूर्ण है।

क्योंकि दाता टी कोशिकाओं GVL गतिविधि के लिए प्रेरक शक्ति हैं, उपचार ऐसे स्टेरॉयड के रूप में इम्यूनोसप्रेसिव दवाओं का उपयोग करने के लिए टी सेल alloreactivity दबाने रणनीतियों अक्सर ट्यूमर पतन या संक्रमण13का कारण । इसलिए, प्राप्तकर्ता डीसी को लक्षित करने से जीवीएल प्रभाव को संरक्षित करते हुए और संक्रमण से बचने के लिए जीवीएचडी के इलाज के लिए एक वैकल्पिक दृष्टिकोण प्रदान किया जा सकता है।

संक्षेप में, वर्तमान अध्ययन यह समझने के लिए एक मंच प्रदान करता है कि प्राप्तकर्ता डीसी में विभिन्न प्रकार के सिग्नलिंग बीएमटी के बाद जीवीएचडी विकास और जीवीएल प्रभाव को कैसे नियंत्रित करता है।

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Protocol

प्रायोगिक प्रक्रियाओं को सेंट्रल फ्लोरिडा विश्वविद्यालय की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था ।

1. जीवीएचडी इंडक्शन

नोट: एलोजेनिक बोन मैरो (बीएम) सेल प्रत्यारोपण (चरण 1.2) विकिरण के बाद 24 घंटे के भीतर किया जाता है। नीचे वर्णित सभी प्रक्रियाओं को बाँझ वातावरण में किया जाता है। एक ऊतक संस्कृति हुड में प्रक्रिया प्रदर्शन और फ़िल्टर किए गए अभिकर्मकों का उपयोग करें।

  1. 0 दिन: प्राप्तकर्ता चूहों को तैयार करें।
    1. एक BALB/c पृष्ठभूमि (CD45.2+ H2kd+),प्राप्तकर्ताओं के रूप में 10−12 सप्ताह पुराने पर महिला जंगली प्रकार (WT) चूहों का प्रयोग करें ।
    2. कान टैग और टीबीआई से पहले प्राप्तकर्ताओं वजन । इसके बाद 11 चूहों को विकिरण कक्ष में रखकर डिरेडिएटर में रख दें। 10−15 वर्ष के लिए 700 सीजीकी की एक खुराक पर विकिरणित।
    3. विकिरणित जानवरों को पिंजरों में लौटाएं और प्रत्यारोपण से पहले उन्हें रोगजनक मुक्त सुविधाओं में घर दें।
      नोट: प्राप्तकर्ताओं के शरीर का न्यूनतम वजन लगभग 20 ग्राम होना चाहिए। प्रयोगात्मक अवधि के दौरान शरीर के वजन घटाने की गणना करने के संदर्भ के रूप में इस वजन का उपयोग करें।
  2. 1 दिन: दाता चूहों से टी-सेल समाप्त बोन मैरो (टीसीडी-बीएम) तैयार करें।
    1. EU2 asphyxiation द्वारा CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 चूहों इच्छामृत्यु और 2−3 मिन के लिए प्रतीक्षा करें जब तक वे बेहोश हैं । यदि आवश्यक हो तो एक माध्यमिक इच्छामृत्यु के रूप में गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था प्रदर्शन करें।
    2. प्रत्येक माउस को एक साफ काम करने वाले बोर्ड पर रखें। 70% आइसोप्रोपेनॉल के साथ फर और त्वचा को साफ करें।
    3. संदंश और कैंची का उपयोग करके दोनों पैरों से टिबिया और फीमर ले लीजिए। उन्हें बर्फ-ठंड े आरपीएमआई में रखें जिसमें 50 मीटर शंकुई ट्यूबों में 1% एफसीएस और 100 यू/एमएल पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन और 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन (1% आरपीएमआई) शामिल हैं। संदंश और कैंची का उपयोग करके सभी मांसपेशियों के ऊतकों को हटाकर फीमर और टिबिया हड्डियों को अच्छी तरह से साफ करें। फीमर और टिबिया को 50 मिलीएल शंकुट्यूब से 1% आरपीएमआई वाले 92 मिमी व्यास पेट्री डिश में स्थानांतरित करें।
    4. कैंची का उपयोग करके, फीमर या टिबिया के सिरों को काट लें। 1% आरपीएमआई 1640 मीडियम के 25 mL के साथ 50 एमएएल ट्यूब भरें। 1% आरपीएमआई के 3 मिलील के साथ 26 जी सुई से जुड़ी 3 मिलीग्राम सिरिंज को भरने के लिए इसका उपयोग करें। हड्डी में इस सिरिंज डालें और 1% RPMI (~ 3 mL/bone) के साथ संग्रह ट्यूब में गुहा से बाहर अस्थि मज्जा (बीएम) फ्लश करने के लिए प्लंजर धक्का ।
    5. अन्य दाता चूहों से शेष टिबिया और फीमर हड्डियों के लिए चरण 1.2.4 दोहराएं। बर्फ पर सभी संग्रह ट्यूब रखें।
    6. 75 माइक्रोन मेश सेल छलनी के माध्यम से बोन मैरो के टुकड़ों को फ्लश करके सिंगल सेल सस्पेंशन करें। एक 50 mL ट्यूब में एकल सेल निलंबन ले लीजिए।
    7. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज ट्यूब। एस्पिरेट और अतिशयोक्ति को त्यागदें। पीबीएस बफर में गोली को 20 x 106 कोशिकाओं/mL पर ०.५% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) युक्त फिर से निलंबित करें । शुद्धता धुंधला के लिए 2 x 106 कोशिकाओं का एक aliquot सहेजें।
    8. 0.05 μg/106 कोशिकाओं पर तेरा 1 एंटीबॉडी जोड़ें14 और 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मेंस के लिए इनक्यूबेट। 25 मिलीआर बर्फ-ठंडा पीबीएस के साथ एक बार धो लें। 0.5% बीएसए/10% युवा खरगोश पूरक/2% DNase (बाँझ एच2ओ में 10,000 यू/एमएल) में 20 x 106/mLपर पुनर्निलंबन। 37 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिन के लिए इनक्यूबेट और पहले की तरह 2x धोएं।
      नोट: टी कोशिकाओं Thy1, एक प्रोटीन सभी टी कोशिकाओं द्वारा व्यक्त के लिए विशिष्ट mAb का उपयोग कर समाप्त हो रहे हैं, लेकिन नहीं अंय ल्यूकोसाइट्स ।
    9. 0.5% बीएसए वाले पीबीएस बफर के 20 एमएल में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके बोन मैरो कोशिकाओं को 1% एसिटिक एसिड में गिनें। सेल शुद्धि के बाद प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा शुद्धता जांच के लिए 2 x 106 कोशिकाओं का एक विवरणी रखें।
      नोट: एक दाता माउस आम तौर पर लगभग 25 x 106 टीसीडी-बीएम उत्पन्न करता है।
    10. एक सफल टी-सेल कमी की पुष्टि करने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करें। दाग 1 x 106 कोशिकाओं, कदम से संरक्षित 1.2.7 (टी सेल की कमी से पहले) और 1.2.9 (टी सेल कमी के बाद TCD-बीएम) निम्नलिखित एंटीबॉडी के साथ: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5), और α-CD8α (53-6.7) ।
  3. 1 दिन: दाता चूहों से टी कोशिकाओं को तैयार
    1. टी कोशिकाओं के लिए दाताओं के रूप में CD45.2+ H2kबी + C57BL/6 जंगली प्रकार (WT) चूहों का प्रयोग करें ।
    2. 1.2.1 में वर्णित कार्बन डाइऑक्साइड (सीओ2)एस्फिक्सिएशन द्वारा C57BL/6 चूहों को इच्छामृत्यु दें।
    3. माउस के फर और त्वचा को 70% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से साफ करें। उत्पाद शुल्क तिल्ली और लिम्फ नोड्स और उन्हें सिरिंज प्लंजर और 40 माइक्रोन मेश छलनी का उपयोग करके स्पेलिंसाइट्स के एक सेल निलंबन में अलग करें। सभी प्लंनोसाइट्स को इकट्ठा करने के लिए 1% आरपीएमआई (आरपीएमआई मीडिया युक्त 1% एफबीएस) के साथ छलनी और सिरिंज प्लंजर धोएं।
    4. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रलाइज किया। सुपरनेटेंट को त्यागने के बाद एके लीजिंग बफर (1 एमएम एनए2ईटीए, 10 एमएम केको3,144 एमएम एनएच4सीएल, पीएच 7.2) के 5 मिलील जोड़ें। कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए सेल निलंबन को इनक्यूबेट करें।
      नोट: ACK lysis बफर लाल रक्त कोशिकाओं lysing के लिए प्रयोग किया जाता है।
    5. लिसिस रोकने के लिए 1% आरपीएमआई का 5 mL जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। अधिस्थान त्यागें।
    6. बर्फ-ठंडा चुंबकीय सक्रिय सेल छंटाई (एमएबीएस) बफर (0.5% बीएसए, पीबीएस में 2 एम एम ईटीए, पीएच 7.2) तैयार करें। उपयोग से पहले बफर को डेगास करें। एमएएस बफर के 5 mL में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें।
    7. प्लंफोनसाइट्स की गणना करें और हीमोसाइटोमीटर और 1% ट्राइपैन ब्लू का उपयोग करके लाइव और मृत कोशिकाओं की जांच करें। प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के साथ शुद्धिकरण उपज का मूल्यांकन करने के लिए 2 x 106 कोशिकाओं का एक एलिकोट सहेजें।
    8. एमएएस बफर में 200 x 106/mLकी एकाग्रता पर प्लंनोसाइट्स को फिर से निलंबित करें। बायोटिन एंटी-माउस-टेर-119 के 0.03 माइक्रोन जोड़ें, बायोटिन एंटी-माउस-सीडी11बी के 0.03 माइक्रोन, बायोटिन एंटी-माउस-सीडी45आर के 0.03 माइक्रोन, और बायोटिन एंटी-माउस-डीएक्स5 प्रति 106 कोशिकाओं के 0.03 माइक्रोन जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए इनक्यूबेट।
      नोट: बायोटिन एंटी-माउस-टेर-119, बायोटिन एंटी-माउस-सीडी11बी, बायोटिन एंटी-माउस-सीडी45आर, और बायोटिन एंटी-माउस-डीएक्स5 का उपयोग क्रमशः एरिथ्रोइड, ग्रैनुलोसाइट्स, बी-कोशिकाओं और एनके कोशिकाओं के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए किया गया था। इसलिए, ये सेल सबसेट निम्नलिखित चरण15में समाप्त हो जाते हैं।
    9. सेल निलंबन के लिए बर्फ ठंडा एमएएस बफर के 10 mL जोड़ें । 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। अधिस्थान त्यागें।
    10. 100 x 10 6/mL की एकाग्रता पर6एमएएस बफर में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें। प्लीनोसाइट निलंबन में एंटी-बायोटिन माइक्रोमोतियां (0.22 माइक्रोल/106 कोशिकाएं) जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर अतिरिक्त 15 मिन के लिए अच्छी तरह से मिलाएं और इनक्यूबेट करें। बर्फ-ठंडा एमएएस बफर के 10 मिलील के साथ एक बार सेल निलंबन धो लें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र और अतिशयोक्ति त्यागें।
    11. चुंबकीय क्षेत्र में चुंबकीय अलग कॉलम रखो। एमएएस बफर के 3 mL के साथ कॉलम कुल्ला। कॉलम पर सेल निलंबन छोड़ दें। एक नए 15 mL शंकुट्यूब में अनबाउंड, समृद्ध टी-कोशिकाओं से मिलकर प्रवाह-थ्रू एकत्र करें। एमएस कॉलम को आइस-कोल्ड एमएएस बफर के 3 मिलील से धोएं।
      नोट: सुनिश्चित करें कि कॉलम धोने के कदम प्रदर्शन से पहले खाली है ।
    12. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर सेल निलंबन को सेंट्रलाइज किया। एमएएस बफर के 5 mL में सेल पैलेट को फिर से निलंबित करें।
    13. हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं को 1% ट्राइपैन ब्लू में गिनें। प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा शुद्धता जांच के लिए 2 x 106 कोशिकाओं का एक एलिकोट सहेजें।
      नोट: इस विधि से अलग प्लीनिक टी-कोशिकाओं की औसत उपज ~ 20−25 x 106 कोशिकाएं प्रति माउस है।
    14. फ्लो साइटोमेट्री द्वारा टी-सेल संवर्धन की उपज की पुष्टि करें। दाग 1 x 106 कोशिकाओं, चरण 1.3.7 से संरक्षित (टी सेल की कमी से पहले) और 1.3.13 (टी सेल की कमी के बाद TCD-बीएम), निम्नलिखित एंटीबॉडी के साथ: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5), और α-CD8α (53-6.7) ।
  4. 1 दिन: दाता टी कोशिकाओं और TCD-बीएम के साथ किरणित चूहों सुई ।
    1. टीसीडी-बीएम और टी-सेल 2x को पीबीएस (5 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस) के साथ धोएं। इंजेक्शन के लिए बर्फ-ठंडा पीबीएस में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें। टीसीडी बीएम के लिए 20 x 106/mLऔर टी-कोशिकाओं के लिए 4 x 106/mLके लिए सेल एकाग्रता समायोजित करें ।
    2. द्विपक्षीय पूंछ नसों की दृश्यता बढ़ाने के लिए एक हीटिंग लैंप का उपयोग कर जानवर गर्म करें। यदि आवश्यक हो, तो माउस को एक निरोधक में रखें।
    3. 70% आइसोप्रोपेनॉल का उपयोग करके पूंछ की सतह को साफ करें। टी-कोशिकाओं (०.७५ x १०६ कोशिकाओं/माउस) के साथ या बिना टीसीडी-बीएम (5 x १०६ कोशिकाओं/माउस) इंजेक्ट करें । सावधान रहें कि सिरिंज में किसी भी हवा को पेश न करें।
    4. सुई निकालें और किसी भी रक्तस्राव को रोकने के लिए इंजेक्शन साइट 5−10 एस पर सीधे एंटीसेप्टिक झाड़ू लगाएं।
  5. 2−80 दिनों पर जीवीएचडी का आकलन करें।
    1. पशु अस्तित्व का ट्रैक रखें। कुक एट अल16 द्वारा पहले स्थापित स्कोरिंग सिस्टम से अनुकूलित GVHD के नैदानिक संकेतों और प्राप्तकर्ता चूहों के शरीर के वजन प्रति सप्ताह 2x की निगरानी करें । शरीर के वजन घटाने की गणना करने के लिए टीबीआई से पहले निर्धारित शरीर के वजन का उपयोग करें।
    2. प्रत्येक माउस को व्यक्तिगत रूप से तौलें। इस प्रकार वजन घटाने का स्कोर करें: ग्रेड 0 = 10% से कम; ग्रेड 1 = 10%−20%; ग्रेड 2 = 20% से अधिक।
    3. प्राप्तकर्ताओं के आसन हस्ताक्षर स्कोर: ग्रेड 0 = कोई कूबड़; ग्रेड 0.5 = मामूली कूबड़ लेकिन चलने पर सीधा; ग्रेड 1 = पशु चलने पर कूबड़ रहता है; ग्रेड 1.5 = जानवर सीधा नहीं करता है; ग्रेड 2.0 = पशु रियर टोज़ पर खड़े हैं।
    4. प्राप्तकर्ताओं की गतिशीलता पर हस्ताक्षर स्कोर करें: ग्रेड 0 = बहुत सक्रिय; ग्रेड 0.5 = भोले चूहों की तुलना में धीमी; ग्रेड 1.0 = केवल जब poked चालें; ग्रेड 1.5 = प्रहार करते समय थोड़ा चलता है; ग्रेड 2.0 = जब poked कदम नहीं है।
    5. प्राप्तकर्ताओं की त्वचा स्कोर करें: ग्रेड 0 = कोई घर्षण, घाव, या स्केलिंग; ग्रेड 0.5 = एक विशिष्ट क्षेत्र में लालिमा; ग्रेड 1 = एक क्षेत्र में घर्षण या दो क्षेत्रों में हल्के घर्षण; ग्रेड 1.5 = दो या अधिक क्षेत्रों में गंभीर घर्षण; ग्रेड 2.0 = गंभीर घर्षण, त्वचा को क्रैक करना, सूखा रक्त।
    6. प्राप्तकर्ताओं के फर स्कोर: ग्रेड 0 = कोई असामान्य संकेत; ग्रेड 0.5 = पेट या गर्दन के नैप के किनारे पर छुटकारा, ग्रेड 1.0 = भर में या पेट और गर्दन के किनारे ridging; ग्रेड 1.5 = अनकेम्प्ट मैट और रफ्ड फर; ग्रेड 2.0 = पेट और पीठ पर बुरी तरह से मटमैले फर।
    7. प्राप्तकर्ताओं के दस्त स्कोर: ग्रेड 0 = कोई दस्त; ग्रेड 0.5 = मामूली और नरम मल; ग्रेड 1.0 = हल्के (पीला मल); ग्रेड 1.5 = मध्यम (थोड़ा रक्त के साथ पीला मल); ग्रेड 2 = गंभीर (हल्का पीला और खूनी मल, "सूखे केक मल" गुदा क्षेत्र में दिखाई देते हैं)।

2. सहप्रत्यारोपण मॉडल

  1. बोन मैरो-व्युत्पन्न डेंड्रिटिक कोशिकाएं (बीएम-डीसी) उत्पन्न करें।
    1. बी 6 पृष्ठभूमि पर डब्ल्यूटी या फैक्टर बी (एफबी) के फीमर और टिबियस से बोन मैरो को अलगकरें-/-चरण 1.2.3−1.2.4 में वर्णित चूहों । कोशिकाओं को 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर स्पिन करें।
    2. लाल रक्त कोशिका लिसिस के लिए ACK lysing बफर के 5 mL में गोली को फिर से निलंबित करें। बर्फ पर 5 मिन के लिए सेल निलंबन इनक्यूबेट। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर लाइसिस और सेंट्रलाइज को रोकने के लिए सेल सस्पेंशन में 1% आरपीएमआई का 10 एमएल जोड़ें। अधिस्थान त्यागें।
    3. संस्कृति मीडिया के 10 mL में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें (RPMI १४६० जिसमें 10% एफबीएस, पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन का १०० यू/एमएल, 2 एमएम एल-ग्लूटामाइन, और ५० एमएम-मर्काप्टोथेनॉल) शामिल हैं और 2 x 106 कोशिकाओं/mL की अंतिम एकाग्रता को पूरा करने के लिए मात्रा को समायोजित करें ।
    4. सेल निलंबन में 20 एनजी/एमएल ग्रैनुलोसाइट-मैक्रोफेज कॉलोनी-उत्तेजक कारक (जीएम-सीएसएफ) जोड़ें । कल्चर 100 x 15 एमएम पेट्री डिश में बोन मैरो सेल्स 5% सीओ2 में 6 दिन तक 37 डिग्री सेल्सियस पर।
    5. 3 दिन ४० एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ युक्त ताजा मीडिया के साथ चल रहे संस्कृति मीडिया (लगभग 5 mL) के आधे की जगह ।
    6. 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में संस्कृति मीडिया को प्रीवार्म करें। अस्थि मज्जा संस्कृति व्यंजनों से मीडिया के बारे में 5 मिलील ले लीजिए। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। अधिस्थान त्यागें। 40 एनजी/एमएल जीएम-सीएसएफ वाले 5 एमएल कल्चर मीडिया में सेल पैलेट को फिर से सस्पेंड करें।
    7. बीएम-डीसी को परिपक्व करने के लिए संस्कृति के 6 दिन मीडिया में 25 μg/mL लिपोपोलिसाइड (एलपीएस) जोड़ें । फ्लो साइटोमेट्री द्वारा डीसी विभेदन प्रभावकारिता निर्धारित करने के लिए 2 x 106 कोशिकाओं का एक बहाना सहेजें ।
    8. परिपक्व बीएम-डीसी एकत्र करें: पेट्री व्यंजनों से धीरे-धीरे डीसी को कुरेदने के लिए सेल लिफ्टर्स का उपयोग करें। 50 mL शंकुट्यूब में सभी सेल निलंबन ले लीजिए। 800 x ग्रामपर अपकेंद्रित्र, 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए। अधिस्थान त्यागें। बर्फ-ठंडा पीबीएस के 50 मिलील के साथ सेल छर्रों 3x धोलें। फ्लो साइटोमेट्री द्वारा इम्यूनोलॉजिकल फेनोटाइप विश्लेषण के लिए लगभग 2 x 106 बीएम-डीसी बचाएं।
  2. बीएमटी (डीसी-कोट्रांसप्लांट बीएमटी) के डेंड्रिटिक सेल सह प्रत्यारोपण का प्रदर्शन करें।
    नोट: टी कोशिकाओं और बीएम कोशिकाओं के लिए दाताओं के रूप में FVB (H2kक्यू)चूहों का उपयोग करें । 1,100 cGy (2 खुराक, 3 h अंतराल) की खुराक पर किरणित B6 Ly5.1 प्राप्तकर्ता चूहों। चरण 1.1 में विवरण देखें।
    1. एफवीबी दाता चूहों के फीमर और टिबियस से बीएम को अलग करें। चरणों में विवरण देखें 1.2.3−1.2.10।
      नोट: इस मॉडल में टीसीडी-बीएम के बजाय कुल अलग-थलग बोन मैरो का उपयोग करें।
    2. एफवीबी दाता चूहों की तिल्ली और लिम्फ नोड्स से टी-कोशिकाओं को शुद्ध करें। चरण1.3.1-1.3.13 में विवरण देखें।
    3. प्रायोगिक पाठ्यक्रम के 0 दिन बीएम (2 x 10 6/माउस) के साथ बीएम (5 x6106/माउस),टी-कोशिकाओं (०.५ x 106/माउस)इंजेक्ट करें ।
    4. प्रत्यारोपण के बाद 3 दिन, रक्तदाता डीसी पुनर्गठन प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा जांच करें ।
      1. प्राप्तकर्ताओं की आंखों से रक्त एकत्र करें।
      2. एनेस्थेटाइज CD45.1/Ly5.1 B6 चूहों द्वारा 3% isoflurane साँस लेना । एक अंगूठे चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी से संज्ञाहरण की गहराई के लिए जांच करें ।
      3. नाक के विमान से 30−45 डिग्री कोण पर निर्देशित आंख के मध्यस्थ कैंटस में एक बाँझ ग्लास पिपेट ट्यूब रखें। ट्यूब को धीरे-धीरे घुमाते समय दबाव लगाएं।
      4. रक्त को 10 माइक्रोन हेपरिन युक्त बाँझ 1.5 मीटर माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब में छोड़ दें। 5 0 माइक्रोन रक्त को 5 0 एल ग्लास प्रवाह ट्यूबमें स्थानांतरित करें।
      5. ACK lysing बफर के 2 mL जोड़ें । 45 मिन के लिए पानी के स्नान में 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट। 2 एमसी के एफएसीएस धुंधला बफर जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिन के लिए 800 x ग्राम पर सेंट्रलाइज। अधिस्थान त्यागें।
      6. FACS बफर के २०० μL के साथ सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें जिसमें उचित प्रवाह धुंधला एंटीबॉडी (लाइव/डेथ येलो, α-H-2Kb,α-CD45.1, α-CD45.2, α-CD11c, और α-MHCII) शामिल है । अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर 15 मिन के लिए इनक्यूबेट। 1 mL FACS बफर के साथ 2x धोएं। एफएसीएस बफर के 200 माइक्रोन में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें और प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा विश्लेषण करें।

3. बीएमटी के GVHD/GVL मॉडल

  1. जीवीएचडी/जीवीएल इंडक्शन करें ।
    1. संस्कृति लुसिफ़ेरेज़ ने आरपीएमआई कल्चर मीडिया में A20 बी सेल लिंफोमा को स्थानांतरित कर दिया।
    2. ७०० cGy (एकल खुराक) पर किरणमय BALB/c पृष्ठभूमि WT या Ly5.1 प्राप्तकर्ता । चरण 1.1 में विवरण देखें।
    3. B6 के फीमर और टिबियस से टीसीडी-बीएम को अलग करें। Ly5.1 दाता चूहों। चरणों में विवरण देखें 1.2.1−1.2.10।
    4. C57BL/6 दाता चूहों के तिल्ली और लिम्फ नोड्स से टी-कोशिकाओं को शुद्ध करें। चरणों में विवरण देखें 1.3.1−1.3.15।
    5. ए20 लिंफोमा 2x को पीबीएस के 25 मीटर के साथ धोलें। बर्फ-ठंडा पीबीएस के 10 मिलील में सेल छर्रों को फिर से निलंबित करें। एक सेल सस्पेंशन एलिकोट (10 माइक्रोन) लें और 1% ट्राइपैन ब्लू और हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। सेल एकाग्रता को 20,000 कोशिकाओं/mL में समायोजित करें।
    6. टी-कोशिकाओं (०.७५ x १०६/माउस)और A20 लिंफोमा (५,००० कोशिकाओं/माउस) के साथ या बिना TCD-बीएम (5 x १०६/माउस)इंजेक्ट करें ।
    7. प्रायोगिक पाठ्यक्रम के दौरान प्राप्तकर्ता अस्तित्व, जीवीएचडी नैदानिक संकेत, और शरीर के वजन घटाने पर अनुवर्ती कार्रवाई करें। चरण 1.5 में विवरण देखें।
  2. बायोल्यूमिनेसेंट इमेजिंग करें।
    1. 4 मिलीग्राम डी-लूसिफ़ेरिन के साथ प्राप्तकर्ता चूहों को इंजेक्शन देकर प्रत्यारोपित प्राप्तकर्ता में ट्यूमर के विकास की निगरानी करें। लूसिफ़ेरिन को लूसिफ़ेराज़ के साथ प्रतिक्रिया सुनिश्चित करने के लिए 5 मिन के लिए इनक्यूबेट।
    2. एनेस्थेटाइज माउस को बायोल्यूमिनेसेंस इमेजर के कक्ष में 3% आइसोफ्लोरीन का उपयोग करके और फील्ड डी में 5 मिन के लिए प्राप्तकर्ताओं को छवि और 1 मिन के एक्सपोजर समय।
    3. छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग कर डेटा का विश्लेषण करें। सबसे अच्छा परिणाम के लिए छद्म रंग छवियों के पैमाने को बदलें।
      नोट: सभी चित्र प्रयोगों में एक ही पैमाने पर होना चाहिए ।
    4. ब्याज के क्षेत्रों को निर्धारित करने और ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र से उत्सर्जित किए जा रहे प्रवाह (फोटॉन/एस) की गणना करके सिग्नल घनत्व की मात्रा निर्धारित करने के लिए छवि-विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करें ।

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Representative Results

प्रमुख एमएचसी-बेमेल बी 6 (H2k बी)-BALB/C (H2kडी)मॉडल बारीकी से प्रत्यारोपण के बाद GVHD विकास के अनुरूप(चित्रा 2)।b सभी छह GVHD नैदानिक कुक एट अल द्वारा पहले स्थापित संकेत16 WT-B6 टी कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित प्राप्तकर्ताओं में हुई, लेकिन अकेले बीएम (कदम १.५), जो GVHD नकारात्मक समूह का प्रतिनिधित्व के साथ प्रत्यारोपित प्राप्तकर्ताओं में नहीं । इस मॉडल में जीवीएचडी विकास में दो चरण हैं। सबसे पहले, गंभीरता का शिखर प्रत्यारोपण के लगभग 11 दिनों बाद है, जिसके बाद नैदानिक स्कोर और शरीर के वजन में 16 दिनों तक कमी आती है। इस चरण में, विकिरण-प्रेरित सूजन और एनग्राफमेंट सिंड्रोम जैसे कई तंत्र रोग रोगजनकता और जीवीएचडी को चलाते हैं। प्राप्तकर्ता समान रूप से प्रत्यारोपण के बाद लगभग 30−40 दिनों के बारे में GVHD का शिकार होते हैं।

बीएम का कम से कम 85% डीसी(चित्रा 3ए)में अंतर किया गया। दिलचस्प बात यह है किएफबी-/-डीसी के साथ प्रत्यारोपण से प्राप्तकर्ता जीवित रहने और जीवीएचडी नैदानिक स्कोर(चित्रा 3बी, सी)में सुधार हुआ । यह देखते हुए किएफबी-/-डीसी कम MHCII अभिव्यक्ति और कम सह उत्तेजक रिसेप्टर अभिव्यक्ति17द्वारा प्रदर्शित क्षमता पेश कम एंटीजन है, सह प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल BMT के बाद GVHD विकास में प्राप्तकर्ता डीसी में विभिन्न संकेत या लक्ष्यों की जांच के लिए पर्याप्त हो सकता है ।

टी सेल शुद्धता संवर्धन के बाद ९०% था(चित्र4ए)। लूसिफ़ेरेज़-ट्रांसड्यूड A20 बी सेल लिंफोमा जीवित जानवरों में ट्यूमर के विकास की निगरानी की अनुमति देता है(चित्रा 4बी)। इस मॉडल में, यदि प्राप्तकर्ताओं की मृत्यु बिना किसी संकेत और उच्च जीवीएचडी नैदानिक स्कोर के बिना हुई है, तो यह निष्कर्ष निकाला गया कि उनकी मृत्यु जीवीएचडी से हुई है। सभी WT BALB/c प्राप्तकर्ताओं कि अकेले बीएम प्राप्त प्लस A20 ट्यूमर पतन(चित्रा 3बी)की मृत्यु हो गई । इसके विपरीत, यदि जानवर की मृत्यु उच्च सिग्नल घनत्व से हुई, तो यह निष्कर्ष निकाला गया कि उनकी मृत्यु ट्यूमर पतन से हुई है। जैसा कि चित्रा 3बीमें प्रदर्शित किया गया है, डब्ल्यूटी बीएएलएलबी/सी प्राप्तकर्ताओं ने बीसीओ 1fl/fl B6 दाता (ACC1+/+ टी-कोशिकाओं) से बीएम और टी-कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया, जीवीएचडी से मृत्यु हो गई । यदि जानवरों की बीमारी के संकेतों से मृत्यु हो जाती है, तो यह निष्कर्ष निकाला गया कि वे जीवीएचडी और ट्यूमर पतन से मर गए। जानवरों कि ACC1fl/fl x CD4 cre B6 दाता (ACC1-/-टी कोशिकाओं) से बीएम और टी कोशिकाओं प्राप्त दोनों GVHD और ट्यूमर पतन-/- (चित्रा 3बी)से मर गया । जानवरों को पिंजरे में वापस रखा जा सकता है एक बाद के समय बिंदु पर छवि या पूर्व वीवो इमेजिंग के लिए इच्छामृत्यु । सॉफ्टवेयर का उपयोग करना, जानवर में ट्यूमर द्रव्यमान भी व्यक्तिगत रूप से विश्लेषण कर सकता है(चित्रा 3बी)।

Figure 1
चित्रा 1: बीएमटी प्रक्रिया का योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व। (A)एमएचसी-बेमेल B6 → BALB/c BMT मॉडल के लिए योजना । (ख)एफवीबी → बी 6 मॉडल को सह-प्रत्यारोपित करने के लिए डीसी के लिए योजना। (C)B6→ BALB/c GVHD/GVL मॉडल के लिए योजना । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: मेजर एमएचसी-बेमेल B6 → BALB/c GVHD मॉडल । बाल्ब/सी चूहों को घातक रूप से विकिरणित किया गया था और अकेले 5 x 106 बीएम के साथ या ०.७५ x १०६ टी-कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया गया था । (A)सर्वाइवल डेटा,(बी)शरीर के वजन में कमी, और(C)अकेले बीएम के प्राप्तकर्ताओं के नैदानिक स्कोर डेटा या टी कोशिकाओं के साथ । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: डीसी सह प्रत्यारोपण एचसीटी मॉडल । बीएम को डब्ल्यूटी औरएफबी-/बी 6 चूहों से अलग किया गया और जीएम-सीएसएफ के साथ मिलकर डीसी में अंतर किया गया । }डीसीकी शुद्धता की जांच फ्लो साइटोमेट्री द्वारा सीडी11सी और एमएचसीआईआई से धुंधला करके की गई। घातक विकिरणित B6 प्राप्तकर्ताओं बीएम (3 x १०6६/माउस) प्लस एफवीबी दाताओं से शुद्ध टी कोशिकाओं (1 x १०६/माउस)के साथ प्रत्यारोपित किया गया । प्राप्तकर्ताओं को प्रत्यारोपण के दिन 2 x 106 डब्ल्यूटी याएफबी-/-बी6 बीएम-डीसी कोशिकाएं भी मिलीं । बिका(बी)और क्लीनिकल स्कोर(सी)दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: मेजर-एमएचसी बेमेल B6 → BALB/c GVHD/GVL मॉडल । WT BALB/c प्राप्तकर्ताओं को अकेले या ACC1+/+ टी-कोशिकाओं या ACC1+/+ टी-कोशिकाओं (1 x 106/माउस)B6 पृष्ठभूमि दाता चूहों से अलग के साथ टीसीडी-बीएम (5 x १०६/माउस)के साथ प्रत्यारोपित किया गया । इसके अलावा, प्राप्तकर्ताओं प्रत्यारोपण के समय 2 x 103 A20-ल्यूक प्राप्त किया । टी सेल शुद्धता लाइव/मौत पीले, सीडी 3, सीडी 4, और CD8 प्रवाह एंटीबॉडी(ए)के साथ धुंधला के माध्यम से प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा जांच की गई थी । प्राप्तकर्ताओं को पूरे शरीर बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (BLI)(बी)द्वारा निर्धारित ट्यूमर विकास के लिए निगरानी की गई थी । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

किसी विशेष व्यक्ति के अनुरूप स्टेम सेल का प्रयोग उन्नत और प्रतिरोधी कैंसर18के इलाज के लिए एक प्रभावी दृष्टिकोण है . छोटे अणु फार्मास्यूटिकल्स, हालांकि, लंबे समय से व्यक्तिगत कैंसर चिकित्सा का प्राथमिक ध्यान केंद्रित रहे हैं । दूसरी ओर, सेलुलर थेरेपी में दाता और मेजबान के बीच बातचीत की एक भीड़ बीएमटी1के बाद GVHD के विकास जैसे उपचार परिणामों को निर्णायक रूप से प्रभावित कर सकती है।

बीएमटी के प्रमुख एमएचसी-बेमेल माउस मॉडल जीवीएचडी के जीव विज्ञान को समझने और इसके उपचार में दवाओं की प्रभावकारिता का परीक्षण करने में एक मूल्यवान उपकरण हैं। उनमें से, C57BL/6 (H2बी)से BALB/c (H2d)और FVB (H2q)→ C57BL/6 (H2b)अच्छी तरह से स्थापित मॉडल5,,7हैं । इन मॉडलों में या तो एक खुराक (BALB/c) या एक आंशिक खुराक (C57BL/6) के रूप में myeloablative विकिरण कंडीशनिंग शामिल है जिसमें 3-8 घंटे के अंतराल आंत विषाक्तता5कम करने के लिए आवश्यक हैं । दोनों मॉडल सीडी8+ और सीडी 4+ टी-सेल दोनों पर निर्भर हैं। इन मॉडलों में, जीवीएचडी गंभीरता और अस्तित्व मुख्य परिणाम मापा जाता है, और प्रत्यारोपित प्राप्तकर्ता में लगातार तेजी से गतिज और 100% तपस्या होती है। टी-सेल माइग्रेशन और विस्तार की निगरानी के लिए, ल्यूसिफ़ेरे-ट्रांसड्यूड दाता चूहों से टी-कोशिकाओं का उपयोग विवोबायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग19में किया जाना चाहिए। हालांकि, जबकि बीएमटी के ९०% प्रदर्शन MHC मिलान कर रहे हैं, B6-BALB/c मॉडल पूरी तरह से नैदानिक स्थिति के समान नहीं है । एमएचसी और माइनर हिस्टोकॉम्पिटीएंटिवएंटीजन (एमआईएचए) की खोज ने बीएमटी10के क्षेत्र को आगे बढ़ाने में महत्वपूर्ण योगदान दिया है। माइनर एमएचसी-बेमेल GVHD माउस मॉडल अधिक बारीकी से रोगी GVHD20की नकल । डोनर सेल एनग्राफमेंट को प्रेरित करने के लिए कंडीशनिंग तीव्रता ऊतक क्षति का कारण बनती है और जीवीएचडी परिणाम21को प्रभावित कर सकती है । मूत्र मॉडल ों में कंडीशनिंग रेजिस्टेंस में अक्सर टीबीआई शामिल होता है , जो क्लीनिकल सेटिंग्स22,23में कीमोथेरेपी के विपरीत होता है । इसलिए, क्लीनिक में कम सशर्त तीव्रता की नकल करने के लिए इम्यूनोसप्रेसिव कीमोथेरेपी मॉडल का उपयोग किया गया है। माउस मॉडल C57BL/6 (H2b)को BALB/c (H2d)और प्रत्यारोपित प्राप्तकर्ताओं ने GVHD24से जुड़े नैदानिक और हिस्टोलॉजिकल लक्षण विकसित किए ।

सह-प्रत्यारोपित प्रोटोकॉल का संभावित लाभ विशेष रूप से CD11c समाप्त चूहों के आधार पर बिना प्राप्तकर्ता डीसी की भूमिका का परीक्षण करना है। क्योंकि बीएम-डीसी पीढ़ी को पूर्व वीवो किया गया था, इसलिए इस प्रोटोकॉल को संस्कृति की स्थिति को संशोधित करके जीवीएचडी में मैक्रोफेज या न्यूट्रोफिल जैसे अन्य सेल प्रकारों की भूमिका का परीक्षण करने के लिए भी लागू किया जा सकता है। प्राप्तकर्ताओं के रूप में CD45.1+ B6 चूहों का उपयोग करने से शोधकर्ताओं को फ्लो विश्लेषण द्वारा प्राप्तकर्ता डीसी (CD45.1+ CD11c+)से बीएम-डीसी (CD45.2+ CD11c+)को अलग करने की अनुमति मिलती है। पूर्व वीवो उत्पन्न कोशिकाओं की लचीली संख्या और प्रत्यारोपित प्राप्तकर्ताओं में अपनाई गई सह-प्रत्यारोपण प्रोटोकॉल का एक और लाभ है। इसके अलावा, पूर्व वीवो संस्कृति हमें GVHD को नियंत्रित करने के लिए संभावित दवाओं को स्क्रीन करने की अनुमति देती है।

वीवो में ट्यूमर पैटर्न को ट्रैक करने की क्षमता एक शक्तिशाली उपकरण है जिसमें यह परीक्षण करने की क्षमता है कि क्या कोई दवा जीवीएल गतिविधि को प्रभावित कर सकती है। इस GVHD/GVL मॉडल का उपयोग करना, ट्यूमर प्रगति और मेटास्टेसिस जीवित जानवरों में निगरानी की जा सकती है16। इसके अलावा, इस सेटिंग का उपयोग कई कैंसर में जीवीएल प्रभाव के परीक्षण के लिए किया जा सकता है।

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Disclosures

लेखकों के हितों का कोई टकराव नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन के सेंट्रल फ्लोरिडा कॉलेज ऑफ मेडिसिन स्टार्ट-अप अनुदान (एचएन के लिए), पिट्सबर्ग मेडिकल सेंटर हिलमैन कैंसर सेंटर स्टार्ट-अप अनुदान (एचएल के लिए), संयुक्त राज्य अमेरिका NIH अनुदान #1P20CA210300-01 और वियतनामी स्वास्थ्य अनुदान #4694/QD-BYT (PTH के लिए) मंत्रालय द्वारा समर्थित है । हम अध्ययन के लिए सामग्री प्रदान करने के लिए दक्षिण कैरोलिना के मेडिकल विश्वविद्यालय में डॉ Xue-zhong यू शुक्रिया अदा करते हैं ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA pH 8.0 100ML Fisher Scientific BP2482100 MACS buffer
10X PBS Fisher Scientific BP3994 MACS buffer
A20 B-cell lymphoma University of Central Florida In house GVL experiment
ACC1 fl/fl Jackson Lab 30954 GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4cre University of Central Florida GVL experiment
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485 T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220) Thermo Fisher Scientific 13-0452-85 T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITC Thermo Fisher Scientific 10452-85 Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700 Thermo Fisher Scientific 117319 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PE Thermo Fisher Scientific 12-0251-82 Flow staining
Anti-Mouse CD4 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-0041-86 T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) Thermo Fisher Scientific 48-0042-82 Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PE Thermo Fisher Scientific 12-0900-83 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APC Thermo Fisher Scientific 17-0081-83 Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-5958-82 Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APC Thermo Fisher Scientific 17-5320-82 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-5921-85 T-cell enrichment
Anti-Thy1.2 Bio Excel BE0066 BM generation
B6 fB-/- mice University of Central Florida In house Recipients
B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice Charles River 564 Donors
BALB/c mice Charles River 028 Transplant recipients
C57BL/6 mice Charles River 027 Donors/Recipients
CD11b Thermo Fisher Scientific 13-0112-85 T-cell enrichment
CD25-biotin Thermo Fisher Scientific 13-0251-82 T-cell enrichment
CD45R Thermo Fisher Scientific 13-0452-82 T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin Thermo Fisher Scientific 13-5971-82 T-cell enrichment
Cell strainer 40 uM Thermo Fisher Scientific 22363547 Cell preparation
Cell strainer 70 uM Thermo Fisher Scientific 22363548 Cell preparation
D-Luciferin Goldbio LUCK-1G Live animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Bilogicals R&D system D17051 Cell Culture
Flow cytometry tubes Fisher Scientific 352008 Flow cytometry analysis
FVB/NCrl Charles River 207 Donors
Lipopolysacharide (LPS) Millipore Sigma L4391-1MG DC mature
LS column Mitenyi Biotec 130-042-401 Cell preparation
MidiMACS Miltenyi Biotec 130-042-302 T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubator Eppendorf Galaxy 170 R Cell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140 Media
RPMI 1640 Thermo Fisher Scienctific 11875-093 Media
TER119 Thermo Fisher Scientific 13-5921-82 T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200 Perkin Elmer Xenogen IVIS-200 Live animal imaging
X-RAD 320 Biological Irradiator Precision X-RAY X-RAD 320 Total Body Irradiation

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इम्यूनोलॉजी एंड इंफेक्शन इश्यू 157 हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल ट्रांसप्लांटेशन बोन मैरो ट्रांसप्लांटेशन ग्राफ्ट बनाम होस्ट डिजीज भ्रष्टाचार बनाम ल्यूकेमिया डेंड्रिटिक सेल्स डेंड्रिटिक सेल सह-प्रत्यारोपण
बोन मैरो प्रत्यारोपण मंच भ्रष्टाचार बनाम मेजबान रोग में Dendritic कोशिकाओं की भूमिका की जांच करने के लिए
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Nguyen, H. D., Huong, P. T.,… More

Nguyen, H. D., Huong, P. T., Hossack, K., Gurshaney, S., Ezhakunnel, K., Huynh, T. H., Alvarez, A. M., Le, N. T., Luu, H. N. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. (157), e60083, doi:10.3791/60083 (2020).

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