Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Benmargstransplantasjonsplattform for å undersøke rollen til dendrittiske celler i graft-versus vertssykdom

Published: March 17, 2020 doi: 10.3791/60083
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Graft-versus-host sykdom er en stor komplikasjon etter allogen benmargstransplantasjon. Dendrittiske celler spiller en kritisk rolle i patogenesen av graft-versus-host sykdom. Den nåværende artikkelen beskriver en ny benmargstransplantasjonsplattform for å undersøke rollen som dendrittiske celler i utviklingen av graft-versus-host sykdom og graft-versus-leukemi effekt.

Abstract

Allogene benmargstransplantasjon (BMT) er en effektiv terapi for hematologiske maligniteter på grunn av graft-versus-leukemi (GVL) effekt for å utrydde svulster. Imidlertid er søknaden begrenset av utviklingen av graft-versus-host sykdom (GVHD), en stor komplikasjon av BMT. GVHD fremkalles når T-celler i donortransplantatene gjenkjenner alloantigen uttrykt av mottakerceller og monterer uønskede immunologiske angrep mot mottakerens friske vev. Dermed er tradisjonelle terapier designet for å undertrykke donor T-celle alloreactivity. Disse tilnærmingene svekker imidlertid GVL-effekten vesentlig slik at mottakerens overlevelse ikke forbedres. Å forstå effekten av terapeutiske tilnærminger på BMT, GVL og GVHD, er dermed viktig. På grunn av antigen-presentere og cytokin-utskillekapasitet for å stimulere donor T-celler, mottaker dendrittiske celler (DCs) spille en betydelig rolle i induksjon av GVHD. Målretting mottaker DCs blir derfor en potensiell tilnærming for å kontrollere GVHD. Dette arbeidet gir en beskrivelse av en ny BMT-plattform for å undersøke hvordan verts-DCer regulerer GVH- og GVL-svar etter transplantasjon. Også presentert er en effektiv BMT modell for å studere biologien til GVHD og GVL etter transplantasjon.

Introduction

Allogene hematopoietiske stamcelletransplantasjon (BMT) er en effektiv terapi for å behandle hematologiske maligniteter1,2 gjennom graft-versus-leukemi (GVL) effekt3. Donorlymfocytter monterer imidlertid alltid uønskede immunologiske angrep mot mottakervev, en prosess som kalles graft-versus-host sykdom (GVHD)4.

Murine modeller av GVHD er et effektivt verktøy for å studere biologien til GVHD og GVL respons5. Mus er en kostnadseffektiv forskningsdyrmodell. De er små og effektivt dosert med molekyler og biologer i tidlige faser av utvikling6. Mus er ideelle forskningsdyr for genetiske manipulasjonsstudier fordi de er genetisk godt definert, noe som er ideelt for å studere biologiske veier og mekanismer6. Flere mus store histokompatibilitet kompleks (MHC) MHC-mismatchet modeller av GVHD har blitt godt etablert, for eksempel C57BL/6 (H2b) til BALB/c (H2d) og FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,7. Dette er spesielt verdifulle modeller for å bestemme rollen til individuelle celletyper, gener og faktorer som påvirker GVHD. Transplantasjon fra C57/BL/6 (H2b) foreldregivere til mottakere med mutasjoner i MHC I (B6.C-H2bm1) og/eller MHC II (B6.C-H2bm12) viste at en mismatch i både MHC klasse I og klasse II er et viktig krav for utvikling av akutt GVHD. Dette tyder på at både CD4+ og CD8+ T-celler er nødvendig for sykdomsutvikling7,8. GVHD er også involvert i en inflammatorisk kaskade kjent som den "proinflammatoriske cytokinstormen"9. Den vanligste kondisjoneringsmetoden i murine-modeller er total kroppsbestråling (TBI) av røntgen eller 137Cs. Dette fører til mottakerens benmargsablasjon, og dermed tillater donor stamcelleengraftment og forhindrer avvisning av transplantatet. Dette gjøres ved å begrense spredningen av mottaker T-celler som svar på donorceller. I tillegg spiller genetiske forskjeller en viktig rolle i sykdomsinduksjon, som også avhenger av mindre MHC-mismatch10. Myeloablatisk bestrålingsdose varierer derfor i forskjellige musestammer (f.eks. BALB/c→C57BL/6).

Aktivering av donor T-celler ved vert antigen presentere celler (APCer) er avgjørende for GVHD utvikling. Blant APCene er dendrittceller (DCer) de mest potente. De er arvelig i stand til å indusere GVHD på grunn av deres overlegne antigenopptak, uttrykk for T-celle co-stimulerende molekyler, og produksjon av proinflammatoriske cytokiner som polariserer T-celler i patogene undergrupper. Mottaker DCer er avgjørende for å legge til rette for T-celle priming og GVHD induksjon etter transplantasjon11,12. Følgelig har DCs blitt interessante mål i behandlingen av GVHD12.

TBI er nødvendig for å forbedre donorcelleinnpode. På grunn av TBI-effekten aktiveres mottaker-DCer og overlever i kort tid etter transplantasjonen12. Til tross for store fremskritt i bruk av bioluminescens eller fluorescens, etablere en effektiv modell for å studere rollen som mottaker DCs i GVHD er fortsatt utfordrende.

Fordi donor T-celler er drivkraften for GVL aktivitet, behandling strategier ved hjelp av immunsuppressive legemidler som steroider for å undertrykke T-celle alloreaktivitet ofte føre til tumor tilbakefall eller infeksjon13. Målretting mottaker DCs kan derfor gi en alternativ tilnærming til å behandle GVHD samtidig bevare GVL-effekten og unngå infeksjon.

Kort sagt, den nåværende studien gir en plattform for å forstå hvordan ulike typer signalering i mottaker-DCer regulerer GVHD-utvikling og GVL-effekten etter BMT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De eksperimentelle prosedyrene ble godkjent av Institutional Animal Care and Use Committee of University of Central Florida.

1. GVHD Induksjon

MERK: Allogene benmarg (BM) celletransplantasjon (trinn 1.2) utføres innen 24 timer etter bestråling. Alle prosedyrer beskrevet nedenfor utføres i et sterilt miljø. Utfør prosedyren i en vevskulturhette og bruk filtrerte reagenser.

  1. Dag 0: Forbered mottakermusene.
    1. Bruk kvinnelige villtypemus (WT) på en BALB/c-bakgrunn (CD45.2+ H2kd+), 10–12 uker gammel som mottakere.
    2. Øre-tag og veie mottakerne før TBI. Deretter plasserer du opptil 11 mus i bestrålingskammeret og holder det i irradiatoren. Bestråle i en enkeltdose på 700 cGy i 10–15 min.
    3. Returner bestrålte dyr til burene og hus dem i patogenfrie fasiliteter før transplantasjonen.
      MERK: Den minimale kroppsvekten til mottakerne bør være rundt 20 g. Bruk denne vekten som referanse for å beregne vekttapet i den eksperimentelle perioden.
  2. Dag 1: Forbered T-celleutarmet benmarg (TCD-BM) fra donormusene.
    1. Eutaniser CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 mus av CO2 kvelning og vent i 2-3 min til de er bevisstløse. Utfør cervical dislokasjon som sekundær eutanasi om nødvendig.
    2. Sett hver mus på et rent arbeidsbrett. Sanitiser pelsen og huden med 70% isopropanol.
    3. Samle tibia og lårben fra begge beina ved hjelp av tang og saks. Sett dem i iskald RPMI som inneholder 1% FCS og 100 U / ml penicillin / streptomycin og 2 mM L-glutamin (1% RPMI) i 50 ml koniske rør. Rengjør lårbenet og tibiabeinene grundig ved å fjerne alle muskelvevet ved hjelp av tang og saks. Overfør lårbenet og tibia fra 50 ml koniske rør til en 92 mm diameter Petriskål som inneholder 1% RPMI.
    4. Bruk saks, kutt endene av lårbenet eller tibia. Fyll et 50 ml rør med 25 ml 1 % RPMI 1640 medium. Bruk denne til å fylle en 3 ml sprøyte festet til en 26 G kanyle med 3 ml 1% RPMI. Sett denne sprøyten inn i beinet og skyv stempelet for å skylle benmargen (BM) ut av hulrommet i oppsamlingsrøret med 1 % RPMI (~3 ml/bein).
    5. Gjenta trinn 1.2.4 for alle gjenværende tibia og lårben fra andre donormus. Oppbevar alle oppsamlingsrørene på isen.
    6. Lag encellede suspensjon ved å skylle benmargsbitene gjennom en 75 μm mesh cellesil. Samle encellede suspensjon i et 50 ml rør.
    7. Sentrifugerør ved 800 x g i 5 min ved 4 °C. Aspirer og kast supernatanten. Resuspender pelleten i PBS-bufferen som inneholder 0,5 % storfeserumalbumin (BSA) ved 20 x 106 celler/ml. Lagre en aliquot på 2 x 106 celler for renhet farging.
    8. Tilsett Thy 1 antistoff ved 0,05 μg/106 celler14 og inkuber i 30 min ved 4 °C. Vask en gang med 25 ml iskald PBS. Resuspendpå ved 20 x 106/ml i 0,5% BSA/10% ung kanin komplement/2% DNase (10.000 E/ml i sterilH2O). Inkuber i 45 min ved 37 °C og vask 2x som før.
      MERK: T-celler er utarmet ved hjelp av en mAb spesifikk for Thy1, et protein uttrykt av alle T-celler, men ikke andre leukocytter.
    9. Resuspender cellene i 20 ml PBS-buffer som inneholder 0,5 % BSA. Tell benmargscellene i 1% eddiksyre ved hjelp av et hemocytometer. Hold en aliquot på 2 x 106 celler for en renhet kontroll ved flyt cytometri etter celle rensing.
      MERK: En donormus genererer vanligvis ca. 25 x 106 TCD-BM.
    10. Bruk flow cytometri for å bekrefte en vellykket T-celle uttømming. Beis 1 x 106 celler, bevart fra trinn 1.2.7 (før T-celleuttømming) og 1,2,9 (TCD-BM etter T-celleuttømming) med følgende antistoffer: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) og α-CD8α (53-6.7).
  3. Dag 1: Forbered T-celler fra donormusene
    1. Bruk CD45.2+ H2kb+ C57BL/6 wild type (WT) mus som donorer for T-celler.
    2. Eutaniser C57BL/6 mus ved karbondioksid (CO2) kvelning som beskrevet i 1.2.1.
    3. Rengjør musens pels og hud grundig med 70% etanol. Utvanne milter og lymfeknuter og skill dem inn i en enkelt celle suspensjon av splenocytter ved hjelp av en sprøyte stempel og 40 μm mesh siler. Vask silen og sprøytestempelet med 1 % RPMI (1 % FBS som inneholder RPMI-medier) for å samle alle splenocytter.
    4. Sentrifugercellesuspensjonen ved 800 x g i 5 min ved 4 °C. Tilsett 5 ml ACK lysing buffer (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3,144 mM NH4Cl, pH 7.2) etter å ha kassert supernatanten. Inkuber cellesuspensjonen i 5 min ved romtemperatur.
      MERK: ACK lysis buffer brukes til å lysing røde blodlegemer.
    5. Tilsett 5 ml 1% RPMI for å stoppe lysis. Sentrifuge ved 800 x g i 5 min ved 4 °C. Kast supernatanten.
    6. Forbered iskald magnetisk aktivert cellesorteringsbuffer (MACS) (0,5 % BSA, 2 mM EDTA i PBS, pH 7.2). Duas bufferen før bruk. Resuspender cellepellets i 5 ml MACS-buffer.
    7. Tell splenocytter og se etter levende og døde celler ved hjelp av et hemocytometer og 1% trypan blå. Lagre en aliquot på 2 x 106 celler for å evaluere renseutbyttet med flow cytometrianalyse.
    8. Resuspender lysplenocytter ved konsentrasjonen av 200 x 106/ml i MACS-bufferen. Tilsett 0,03 μL biotin anti-mouse-Ter-119, 0,03 μL biotin anti-mouse-CD11b, 0,03 μL biotin anti-mouse-CD45R og 0,03 μL biotin anti-mouse-DX5 per 106 celler. Inkuber i 15 min ved 4 °C.
      MERK: Biotin anti-mus-Ter-119, biotin anti-mus-CD11b, biotin anti-mus-CD45R og biotin anti-mus-DX5 ble brukt til å reagere med erytroid, granulocytter, B-celler og NK celler henholdsvis. Disse celleundersettene er derfor tømt i følgende trinn15.
    9. Tilsett 10 ml iskald MACS-buffer i cellefjæringen. Sentrifuge ved 800 x g i 5 min ved 4 °C. Kast supernatanten.
    10. Resuspender cellepellets i MACS-bufferen ved en konsentrasjon på 100 x 106/ml. Tilsett mikroperler av antibiotin (0,22 μL/106 celler) i lysplenocyttersuspensjonen. Bland godt og inkuber i ytterligere 15 min ved 4 °C. Vask cellesuspensjonen én gang med 10 ml iskald MACS-buffer. Sentrifuge ved 800 x g i 5 min ved 4 °C og kast supernatanten.
    11. Sett en magnetisk skillekolonne i magnetfeltet. Skyll kolonnen med 3 ml MACS-buffer. Slipp cellesuspensjonen på kolonnen. Samle gjennomstrømningen bestående av ubundne, berikede T-celler, i et nytt 15 ml konisk rør. Vask MS-kolonnen med 3 ml iskald MACS-buffer.
      MERK: Kontroller at kolonnen er tom før du utfører vasketrinnene.
    12. Sentrifugercellesuspensjonen ved 800 x g i 5 min ved 4 °C. Resuspender cellepelleten i 5 ml MACS-buffer.
    13. Tell cellene i 1% trypan blå ved hjelp av et hemocytometer. Lagre en aliquot på 2 x 106 celler for en renhet sjekk ved flyt cytometri.
      MERK: Gjennomsnittlig utbytte av milt-T-celler isolert av denne metoden er ~20−25 x 106 celler per mus.
    14. Bekreft utbyttet av T-celleberikelse ved flytcytometri. Beis 1 x 106 celler, bevart fra trinn 1.3.7 (før T-celleuttømming) og 1,3,13 (TCD-BM etter T-celleuttømming), med følgende antistoffer: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) og α-CD8α (53-6.7).
  4. Dag 1: Injiser bestrålte mus med donor-T-celler og TCD-BM.
    1. Vask TCD-BM og T-celler 2x med PBS (800 x g i 5 min ved 4 °C). Resuspendcellene i iskald PBS til injeksjon. Juster cellekonsentrasjonen til 20 x 106/ml for TCD BM og 4 x 106/ml for T-celler.
    2. Varm opp dyret ved hjelp av en varmelampe for å øke synligheten av de bilaterale halevenene. Om nødvendig, plasser musen i et beherskelse.
    3. Rengjør overflaten av halen ved hjelp av 70% isopropanol. Injiser TCD-BM (5 x 106 celler/mus) med eller uten T-celler (0,75 x 106 celler/mus). Vær forsiktig så du ikke introduserer luft i sprøyten.
    4. Fjern nålen og påfør en antiseptisk vattpinne direkte på injeksjonsstedet 5-10 s for å stoppe blødninger.
  5. Vurder GVHD på dag 2−80.
    1. Hold styr på dyrets overlevelse. Overvåk de kliniske tegnene på GVHD tilpasset fra poengsystemet som tidligere ble etablert av Cook et al.16 og kroppsvekten til mottakermusene 2x per uke. Bruk kroppsvekten som bestemmes før TBI for å beregne vekttapet.
    2. Vei hver mus individuelt. Score vekttap som følger: klasse 0 = mindre enn 10%; klasse 1 = 10%−20%; klasse 2 = mer enn 20 %.
    3. Score holdning tegn på mottakerne: klasse 0 = ingen anelse; klasse 0,5 = liten anelse, men retter seg når du går; klasse 1 = dyret forblir pukkel når du går; klasse 1.5 = dyret retter seg ikke ut; klasse 2.0 = dyrestativ på bakre tær.
    4. Score mobilitettegn av mottakerne: klasse 0 = veldig aktiv; klasse 0,5 = langsommere enn naive mus; klasse 1.0 = beveger seg bare når poked; klasse 1.5 = beveger seg litt når poked; klasse 2.0 = beveger seg ikke når den er stukket.
    5. Score huden på mottakerne: klasse 0 = ingen slitasje, lesjoner, eller skalering; klasse 0,5 = rødhet i ett bestemt område; klasse 1 = slitasje i ett område eller mild slitasje i to områder; klasse 1.5 = alvorlige slitasje på to eller flere områder; klasse 2.0 = alvorlige slitasje, sprekker huden, tørket blod.
    6. Score pelsen av mottakerne: klasse 0 = ingen unormale tegn; klasse 0,5 = ridging på siden av magen eller nakken, klasse 1.0 = ridging over eller siden av mage og nakke; klasse 1.5 = uflidd formatert og ruffed pels; klasse 2.0 = dårlig formatert pels på mage og rygg.
    7. Score diaré av mottakerne: klasse 0 = ingen diaré; klasse 0,5 = liten og myk avføring; klasse 1.0 = mild (gul avføring); klasse 1.5 = moderat (gul avføring med litt blod); klasse 2 = alvorlig (lys gul og blodig avføring, "tørket kake avføring" vises på analområdet).

2. Cotransplantasjon Modell

  1. Generer benmargsavledede dendrittiske celler (BM-DCer).
    1. Isoler benmargen fra lårbenet og tibias av WT eller faktor B (fB)-/- mus på B6-bakgrunnen som beskrevet i trinn 1.2.3−1.2.4. Snurrcellene på 800 x g i 5 min.
    2. Resuspender pelleten i 5 ml ACK lysing buffer for røde blodlegemer lysis. Inkuber cellesuspensjonen i 5 min på is. Tilsett 10 ml 1% RPMI til cellesuspensjonen for å stoppe lysen og sentrifugen ved 800 x g i 5 min ved 4 °C. Kast supernatanten.
    3. Resuspender cellepellets i 10 ml kulturmedier (RPMI 1460 som inneholder 10% FBS, 100 U/ml penicillin/streptomycin, 2 mM l-glutamin og 50 mM β-mercaptoetanol) og juster volumet for å møte den endelige konsentrasjonen på 2 x 106 celler/ml.
    4. Legg til 20 ng/ml granulocytter-makrofag kolonistimulerende faktor (GM-CSF) i cellesuspensjonen. Kultur benmargscellene i 100 x 15 mm Petri retter ved 37 °C i 5% CO2 i 6 dager.
    5. Erstatt halvparten av de pågående kulturmediene (ca. 5 ml) med friske medier som inneholder 40 ng/ml GM-CSF på dag 3.
    6. Forvarm kulturmediene i et vannbad ved 37 °C. Samle ca 5 ml av media fra benmargskulturretter. Sentrifuge ved 800 x g i 5 min ved 4 °C. Kast supernatanten. Resuspender cellepelleten i 5 ml kulturmedier som inneholder 40 ng/ml GM-CSF.
    7. Legg til 25 μg/ml lipopolysakkarid (LPS) i media på dag 6 av kulturen for å modne BM-DCs. Lagre en aliquot på 2 x 106 celler for å bestemme DC differensiering effekt ved flyt cytometri.
    8. Samle modne BM-DCs: Bruk celleløftere til mykt skrape DCer fra Petri-rettene. Samle alle cellesuspensjoner i 50 ml koniske rør. Sentrifuge ved 800 x g, i 5 min ved 4 °C. Kast supernatanten. Vask cellepellets 3x med 50 ml iskald PBS. Spar ca 2 x 106 BM-DCs for immunologisk fenotype analyse ved flyt cytometri.
  2. Utfør dendrittisk cellekotransplantasjon av BMT (DC-cotransplanting BMT).
    MERK: Bruk FVB (H2kq) mus som donorer for T-celler og BM-celler. Bestråle B6 Ly5.1 mottaker mus i en dose på 1100 cGy (2 doser, 3 t intervall). Se detaljer i trinn 1.1.
    1. Isoler BM fra lårbensog tibias av FVB donormus. Se detaljer i trinn 1.2.3−1.2.10.
      MERK: Bruk totalt isolert benmarg i stedet for TCD-BM i denne modellen.
    2. Rense T-celler fra miltene og lymfeknuter av FVB donor mus. Se detaljer i trinn 1.3.1-1.3.13.
    3. Injiser BM (5 x 106/mus), T-celler (0,5 x 106/mus) med BM-DCer (2 x 106/mus) på dag 0 av det eksperimentelle kurset.
    4. På dag 3 etter transplantasjonen, undersøke donor DC rekonstituering ved flyt cytometri.
      1. Samle blod fra øynene til mottakerne.
      2. Bedøvelse av CD45.1/Ly5.1 B6 mus med 3% isofluran inhalasjon. Se etter dybden av anestesi ved mangel på respons på en tåklemme.
      3. Plasser et sterilt glasspipetterør i øyets mediale kantier rettet ut i en 30-45° vinkel fra neseplanet. Påfør trykket mens du forsiktig roterer røret.
      4. Slipp blodet i et 10 μL heparinholdige sterile 1,5 ml mikrosentrifugerør. Overfør 50 μL blod til 5 ml glassstrømningsrør.
      5. Tilsett 2 ml ACK-lysingbuffer. Inkuber ved 37 °C i vannbad i 45 min. Tilsett 2 ml FACS-fargebuffer. Sentrifuge ved 800 x g i 5 min ved 4 °C. Kast supernatanten.
      6. Resuspender cellepellets med 200 μL FACS buffer som inneholder passende strømningsflekker antistoffer (live/death gul, α-H-2Kb, α-CD45.1, α-CD45.2, α-CD11c og α-MHCII). Inkuber i 15 min ved 4 °C i mørket. Vask 2x med 1 ml FACS-buffer. Resuspender cellepellets i 200 μL av FACS buffer og utfør analysen ved flyt cytometri.

3. GVHD/GVL Modeller av BMT

  1. Utfør GVHD/GVL induksjon.
    1. Kultur luciferase transduced A20 B celle lymfom i RPMI kultur medier.
    2. Irradiate BALB/c bakgrunn WT eller Ly5.1 mottaker ved 700 cGy (enkeltdose). Se detaljer i trinn 1.1.
    3. Isoler TCD-BM fra lårbenet og tibias av B6. Ly5.1 donormus. Se detaljer i trinn 1.2.1−1.2.10.
    4. Rense T-celler fra milter og lymfeknuter i C57BL/6 donormus. Se detaljer i trinn 1.3.1−1.3.15.
    5. Vask A20 lymfom 2x med 25 ml PBS. Resuspender cellepellets i 10 ml iskald PBS. Ta en celle suspensjon aliquot (10 μL) og telle cellene ved hjelp av 1% trypan blå og et hemocytometer. Juster cellekonsentrasjonen til 20 000 celler/ml.
    6. Injiser TCD-BM (5 x 106/mouse) med eller uten T-celler (0,75 x 106/mus) og A20 lymfom (5000 celler/mus).
    7. Oppfølging av mottakerens overlevelse, GVHD kliniske tegn og vekttap i løpet av det eksperimentelle kurset. Se detaljer i trinn 1.5.
  2. Utfør bioluminescerende bildebehandling.
    1. Overvåk tumorveksten hos den transplanterte mottakeren ved å injisere mottakermusene med 4 mg D-luciferin. Inkuber i 5 min for å sikre at luciferin reagerer med luciferase.
    2. Bedøve musen ved hjelp av 3% isofluran i kammeret av en bioluminescence imager og bilde mottakerne for 5 min i felt D og eksponeringstiden på 1 min.
    3. Analyser data ved hjelp av bildeanalyseprogramvare. Endre omfanget av pseudo fargebilder for best resultat.
      MERK: Alle bildene må være i samme skala på tvers av eksperimenter.
    4. Bruk bildeanalyserende programvare til å bestemme interesseområdene og kvantifisere signaltettheten ved å beregne at fluksen (fotonene/s) slippes ut fra hver interesseregion.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den store MHC-mismatched B6 (H2kb)-BALB/C (H2kd) modellen nært korresponderte med GVHD utvikling etter transplantasjon (Figur 2). Alle seks GVHD kliniske tegn etablert tidligere av Cooke et al.16 forekom hos mottakerne transplantert med WT-B6 T-celler, men ikke hos mottakerne transplantert med BM alene (trinn 1.5), som representerte GVHD-negativ gruppe. Det er to faser i GVHD utvikling i denne modellen. For det første er alvorlighetsgradens topp ca. 11 dager etter transplantasjonen, etterfulgt av en reduksjon i kliniskscore og kroppsvektgjenoppretting opptil 16 dager. I denne fasen driver flere mekanismer som bestrålingsindusert betennelse og engraftmentsyndrom sykdommen patogeneog GVHD. Mottakerne gir en en en sentil etter for GVHD om 30–40 dager etter transplantasjonen.

Minst 85 % av BM differensieres til DCer (figur 3A). Interessant, transplantasjon med fB-/- DCs forbedret mottakerenoverlevelse og GVHD klinisk score (figur 3B, C). Gitt at fB-/- DCer har mindre antigen presentere kapasitet demonstrert av lavere MHCII uttrykk og redusert co-stimulerende reseptor uttrykk17, co-transplantasjon protokollen kan være tilstrekkelig for å undersøke ulike signalering eller mål i mottaker DCs i GVHD utvikling etter BMT.

T-cellerenheten var 90 % etter berikelse (figur 4A). Luciferase-transduced A20 B celle lymfom gjør overvåking tumorvekst i levende dyr (Figur 4B). I denne modellen, hvis mottakerne døde uten signal og en høy GVHD klinisk score, ble det konkludert med at de døde av GVHD. Alle WT BALB/c-mottakerne som fikk BM alene pluss A20 døde av tumortilbakefall (figur 3B). Derimot, hvis dyret døde av høyere signaltetthet, ble det konkludert med at de døde av tumortilbakefall. Som demonstrert i figur 3Bdøde WT BALB/c-mottakere transplantert med BM- og T-celler fra ACC1fl/fl B6 donor (ACC1+/+ T-celler) av GVHD. Hvis dyr døde med sykdomssignaler, ble det konkludert med at de døde av GVHD og tumortilbakefall. Dyrene som fikk BM- og T-celler fra ACC1fl/fl x CD4 cre B6 donor (ACC1-/- T-celler) døde av både GVHD og tumortilbakefall (figur 3B). Dyr kan plasseres tilbake i buret for å bli avbildet på et senere tidspunkt eller euthanized for ex vivo imaging. Ved hjelp av programvaren kan tumormassen i dyret også analyseres individuelt (figur 3B).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk representasjon av BMT-prosedyren. (A) Ordning for MHC-mismatchb6→BALB/c BMT-modell. (B) Ordning for DC co-transplantasjon FVB→B6 modell. (C) Ordning for B6→BALB/c GVHD/GVL-modell. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Major MHC-mismatchb6→BALB/c GVHD-modell. BALB/c mus ble lethally bestrålt og transplantert med 5 x 106 BM alene eller med 0,75 x 106 T-celler. (A) Overlevelsesdata, (B) vekttap, og (C) kliniskscore data av mottakerne av BM alene eller med T-celler. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: DC co-transplantering HCT modell. BM ble isolert fra WT og fB-/- B6 mus og differensiert til DCer ved å kulurmed GM-CSF. (A) Renheten av DCer ble undersøkt ved strømning cytometri ved farging med CD11c og MHCII. Lethally bestrålt B6 mottakere ble transplantert med BM (3 x 106/ mus) pluss renset T-celler (1 x 106/ mus) fra FVB donorer. Mottakerne fikk også 2 x 106 WT eller fB-/- B6 BM-DCs celler på transplantasjonsdagen. Overlevelsen (B) og klinisk score (C) vises. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Major-MHC mismatchet B6→BALB/c GVHD/GVL-modell. WT BALB/c-mottakere ble transplantert med TCD-BM (5 x 106 /mus)alene eller med ACC1+/+ T-celler eller ACC1+/+ T-celler (1 x 106/mus) isolert fra B6-bakgrunnsdonormus. I tillegg fikk mottakerne 2 x 103 A20-luc på transplantasjonstidspunktet. T-cellerenheten ble undersøkt av flow cytometri gjennom farging med live/death gul, CD3, CD4 og CD8 flow antistoffer (A). Mottakerne ble overvåket for tumorvekst bestemt av bioluminescencebilde (BLI) (B)i hele kroppen). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bruken av stamceller som passer til en bestemt person er en effektiv tilnærming til å behandle avanserte og resistente kreftformer18. Små molekyllegemidler har imidlertid lenge vært et hovedfokus for personlig kreftbehandling. På den annen side, i cellulær terapi kan en rekke interaksjoner mellom donor og vert avgjørende påvirke behandlingsresultatene, for eksempel utviklingen av GVHD etter BMT1.

Store MHC-mismatched musemodeller av BMT er et verdifullt verktøy for å forstå biologien til GVHD og teste effekten av legemidler i behandlingen. Blant dem er C57BL/6 (H2b) til BALB/c (H2d) og FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b) veletablerte modeller5,7. Disse modellene omfatter enten myeloablaativ strålingskondisjonering som en enkeltdose (BALB/c) eller en fraksjonert dose (C57BL/6) der 3–8 timers intervaller er nødvendig for å redusere tarmtoksisitet5. Begge modellene er avhengige av både CD8+ og CD4+ T-celler. I disse modellene er GVHD-alvorlighetsgrad og overlevelse de viktigste resultatene målt, og den transplanterte mottakeren har konsistentrask kinetikk og 100% penetrance. For å overvåke T-cellemigrasjon og ekspansjon, bør T-celler fra luciferase-transduced donormus brukes til in vivobioluminescence imaging19. Men mens 90% av BMT-utført er MHC-matchet, ligner B6-BALB /c-modellen ikke perfekt den kliniske situasjonen. Oppdagelsen av MHC og mindre histokompatibilitetsantigener (miHAer) har betydelig bidratt til å fremme feltet BMT10. Mindre MHC-mismatchet GVHD-musemodeller etterligner ytterligere pasientens GVHD20. Kondisjoneringsintensitet for å indusere donorcelleengraftment forårsaker vevsskade og kan påvirke GVHD-utfallet21. Kondisjoneringsregimer i murinemodeller innebærer ofte TBI i motsetning til kjemoterapi i kliniske innstillinger22,23. Derfor har en immunsuppressiv kjemoterapimodell blitt brukt til å etterligne en redusert betinget intensitet i klinikker. Musemodellen var C57BL/6 (H2b) til BALB/c (H2d)og transplanterte mottakere utviklet kliniske og histologiske symptomer forbundet med GVHD24.

Den potensielle fordelen med den co-transplanterte protokollen er å teste rollen som mottaker DCer uten å være avhengig av CD11c utarmet mus. Fordi BM-DC-generasjonen ble utført ex vivo, kan denne protokollen også brukes til å teste rollen til andre celletyper som makrofager eller nøytrofiler i GVHD bare ved å endre kulturforholdene. Ved hjelp av CD45.1+ B6 mus som mottakere gjør det mulig for forskere å skille BM-DC (CD45.2+ CD11c+) fra mottaker DCer (CD45.1+ CD11c+) ved strømningsanalyse. Det fleksible antallet celler generert ex vivo og vedtatt i transplanterte mottakere er en annen fordel med co-transplantasjon protokollen. Videre, ex vivo kultur tillater oss å screene potensielle stoffer for å kontrollere GVHD.

Evnen til å spore tumormønstre in vivo er et kraftig verktøy som har potensial til å teste om et stoff kan påvirke GVL-aktivitet. Ved hjelp av denne GVHD/GVL-modellen kan tumorprogresjon og metastase overvåkes hos levende dyr16. Videre kan denne innstillingen brukes til å teste GVL-effekten i flere kreftformer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter.

Acknowledgments

Denne studien støttes av University of Central Florida College of Medicine oppstartsstipend (til HN), University of Pittsburgh Medical Center Hillman Cancer Center oppstartsstipend (til HL), USA NIH Grant #1P20CA210300-01 og vietnamesiskhelsedepartementet Grant #4694 / QD-BYT (til PTH). Vi takker Dr. Xue-zhong Yu ved Medical University of South Carolina for å gi materialer til studien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA pH 8.0 100ML Fisher Scientific BP2482100 MACS buffer
10X PBS Fisher Scientific BP3994 MACS buffer
A20 B-cell lymphoma University of Central Florida In house GVL experiment
ACC1 fl/fl Jackson Lab 30954 GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4cre University of Central Florida GVL experiment
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485 T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220) Thermo Fisher Scientific 13-0452-85 T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITC Thermo Fisher Scientific 10452-85 Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700 Thermo Fisher Scientific 117319 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PE Thermo Fisher Scientific 12-0251-82 Flow staining
Anti-Mouse CD4 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-0041-86 T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) Thermo Fisher Scientific 48-0042-82 Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PE Thermo Fisher Scientific 12-0900-83 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APC Thermo Fisher Scientific 17-0081-83 Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-5958-82 Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APC Thermo Fisher Scientific 17-5320-82 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-5921-85 T-cell enrichment
Anti-Thy1.2 Bio Excel BE0066 BM generation
B6 fB-/- mice University of Central Florida In house Recipients
B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice Charles River 564 Donors
BALB/c mice Charles River 028 Transplant recipients
C57BL/6 mice Charles River 027 Donors/Recipients
CD11b Thermo Fisher Scientific 13-0112-85 T-cell enrichment
CD25-biotin Thermo Fisher Scientific 13-0251-82 T-cell enrichment
CD45R Thermo Fisher Scientific 13-0452-82 T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin Thermo Fisher Scientific 13-5971-82 T-cell enrichment
Cell strainer 40 uM Thermo Fisher Scientific 22363547 Cell preparation
Cell strainer 70 uM Thermo Fisher Scientific 22363548 Cell preparation
D-Luciferin Goldbio LUCK-1G Live animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Bilogicals R&D system D17051 Cell Culture
Flow cytometry tubes Fisher Scientific 352008 Flow cytometry analysis
FVB/NCrl Charles River 207 Donors
Lipopolysacharide (LPS) Millipore Sigma L4391-1MG DC mature
LS column Mitenyi Biotec 130-042-401 Cell preparation
MidiMACS Miltenyi Biotec 130-042-302 T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubator Eppendorf Galaxy 170 R Cell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140 Media
RPMI 1640 Thermo Fisher Scienctific 11875-093 Media
TER119 Thermo Fisher Scientific 13-5921-82 T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200 Perkin Elmer Xenogen IVIS-200 Live animal imaging
X-RAD 320 Biological Irradiator Precision X-RAY X-RAD 320 Total Body Irradiation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
  2. Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
  3. Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
  4. Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
  5. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
  6. Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006 (2018).
  7. Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
  8. Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
  9. Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
  10. Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
  11. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  12. Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
  13. Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
  14. Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  15. Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
  16. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  17. Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
  18. McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417 (2013).
  19. Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
  20. Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
  21. Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
  22. Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
  23. Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
  24. Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).

Tags

Immunologi og infeksjon Utgave 157 hematopoetisk stamcelletransplantasjon benmargstransplantasjon graft-versus-host sykdom graft-versus-leukemi dendrittiske celler dendrittisk cellekotransplantasjon
Benmargstransplantasjonsplattform for å undersøke rollen til dendrittiske celler i graft-versus vertssykdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nguyen, H. D., Huong, P. T.,… More

Nguyen, H. D., Huong, P. T., Hossack, K., Gurshaney, S., Ezhakunnel, K., Huynh, T. H., Alvarez, A. M., Le, N. T., Luu, H. N. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. (157), e60083, doi:10.3791/60083 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter