Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bone Marrow Transplantation Plattform för att undersöka rollen av dendritiska celler i Graft-versus-Host Disease

Published: March 17, 2020 doi: 10.3791/60083
Automatic Translation
*1, *2, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 4,5
1Cancer Division, Burnett School of Biomedical Sciences, University of Central Florida, 2Department of Biochemistry, Hanoi University of Pharmacy, 3Center for Cardiovascular Regeneration, Department of Cardiovascular Sciences, Houston Methodist Research Institute, 4Department of Epidemiology, University of Pittsburgh Graduate School of Public Health, 5Division of Cancer Control and Population Sciences, University of Pittsburgh Medical Center, Hillman Cancer Center
* These authors contributed equally

Summary

Graft-versus-host sjukdom är en stor komplikation efter allogena benmärg transplantation. Dendritiska celler spelar en avgörande roll i patogenesen vid graft-versus-host sjukdom. Den aktuella artikeln beskriver en ny benmärg transplantation plattform för att undersöka dendritiska cellers roll i utvecklingen av graft-versus-host sjukdom och graft-versus-leukemi effekt.

Abstract

Allogen benmärgtransplantation (BMT) är en effektiv terapi för hematologiska maligniteter på grund av graft-versus-leukemi (GVL) effekt för att utrota tumörer. Emellertid, dess tillämpning begränsas av utvecklingen av graft-versus-host sjukdom (GVHD), en stor komplikation av BMT. GVHD framkallas när T-celler i givaren ympkvistar känner igenalloantigen uttryckt av mottagarceller och montera oönskade immunologiska attacker mot mottagaren friska vävnader. Således är traditionella terapier utformade för att undertrycka givaren T-cells alloreactivity. Dessa metoder försämrar dock avsevärt GVL-effekten så att mottagarens överlevnad inte förbättras. Att förstå effekterna av terapeutiska metoder på BMT, GVL och GVHD är därför viktigt. På grund av antigen-presentera och cytokin-utsöndrar kapacitet för att stimulera givaren T-celler, mottagare dendritiska celler (DCs) spelar en viktig roll i induktion av GVHD. Därför blir inriktning på mottagar-DCs en potentiell metod för att kontrollera GVHD. Detta arbete ger en beskrivning av en ny BMT plattform för att undersöka hur värd DCs reglera GVH och GVL svar efter transplantation. Presenteras också är en effektiv BMT modell för att studera biologi GVHD och GVL efter transplantation.

Introduction

Allogena hematopoietic stamceller transplantation (BMT) är en effektiv terapi för att behandla hematologiska maligniteter1,2 genom graft-versus-leukemi (GVL) effekt3. Emellertid, givare lymfocyter alltid montera oönskade immunologiska attacker mot mottagaren vävnader, en process som kallas graft-versus-host sjukdom (GVHD)4.

Murine modeller av GVHD är ett effektivt verktyg för att studera biologi GVHD och GVL svar5. Möss är en kostnadseffektiv forskningsdjursmodell. De är små och effektivt dosed med molekyler och biologiska läkemedel i tidiga faser av utveckling6. Möss är idealiska forskningsdjur för genetisk manipulation studier eftersom de är genetiskt väl definierade, vilket är idealiskt för att studera biologiska vägar och mekanismer6. Flera mus stora histocompatibility komplexa (MHC) MHC-inkompatibla modeller av GVHD har varit väl etablerade, såsom C57BL/6 (H2b) till BALB / c (H2d) och FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)5,7. Dessa är särskilt värdefulla modeller för att bestämma rollen för enskilda celltyper, gener och faktorer som påverkar GVHD. Transplantation från C57/BL/6 (H2b)föräldradonatorer till mottagare med mutationer i MHC I (B6.C-H2bm1)och/eller MHC II (B6.C-H2bm12) visade att en obalans i både MHC klass I och klass II är ett viktigt krav för utvecklingen av akut GVHD. Detta tyder på att både CD4+ och CD8+ T-celler krävs för sjukdomsutveckling7,8. GVHD är också involverad i en inflammatorisk kaskad som kallas den "proinflammatoriska cytokinstormen"9. Den vanligaste konditioneringsmetoden i murinemodeller är total kroppsbestrålning (TBI) med röntgen eller 137Cs. Detta leder till mottagarens benmärgablation, vilket gör det möjligt för givaren stamcellsengraftment och förhindra nde av transplantatet. Detta görs genom att begränsa spridningen av mottagare T-celler som svar på donatorceller. Dessutom spelar genetiska skillnader en viktig roll i sjukdomsinduktion, som också beror på mindre MHC-obalans10. Därför varierar myeloablativ bestrålningsdos i olika musstammar (t.ex. BALB/c→C57BL/6).

Aktivering av givare T-celler av värd antigen presentera celler (APC) är viktigt för GVHD utveckling. Bland De apc:er är de dritiska cellerna (DCs) de mest potenta. De är ärftligt kapabla att inducera GVHD på grund av deras överlägsna antigenupptag, uttryck för T-cells co-stimulatory molekyler, och produktion av proinflammatoriska cytokiner som polariserar T-celler i patogena undergrupper. Mottagare DCs är avgörande för att underlätta T-cells priming och GVHD induktion efter transplantation11,12. Följaktligen har DCs blivit intressanta mål vid behandling av GVHD12.

TBI krävs för att förbättra givaren cellengraftment. På grund av TBI-effekten aktiveras mottagar-DCs och överlever under en kort tid efter transplantationen12. Trots stora framsteg i användningen av bioluminescens eller fluorescens, etablera en effektiv modell för att studera rollen som mottagare DC i GVHD är fortfarande utmanande.

Eftersom givaren T-celler är den drivande kraften för GVL aktivitet, behandlingsstrategier med immunsuppressiva läkemedel såsom steroider för att undertrycka T-cells alloreactivity orsakar ofta tumör återfall eller infektion13. Därför kan inriktning en mottagare DCs ge en alternativ metod för att behandla GVHD samtidigt som GVL-effekten och undvika infektion.

I korthet ger den aktuella studien en plattform för att förstå hur olika typer av signalering i mottagare DCs reglerar GVHD utveckling och GVL effekt efter BMT.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

De experimentella förfarandena godkändes av institutionella Djur vård och användning kommittén vid University of Central Florida.

1. GVHD Induktion

OBS: Allogen benmärg (BM) celltransplantation (steg 1.2) utförs inom 24 timmar efter bestrålning. Alla procedurer som beskrivs nedan utförs i en steril miljö. Utför proceduren i en vävnadskulturhuva och använd filtrerade reagenser.

  1. Dag 0: Förbered mottagarmössen.
    1. Använd möss av kvinnlig vild typ (WT) på balb/c-bakgrund (CD45.2+ H2kd+), 10−12 veckor gamla som mottagare.
    2. Öronmärka och väg mottagarna före TBI. Placera sedan upp till 11 möss i bestrålningskammaren och förvara den i irradiatorn. Bestråla vid en engångsdos på 700 cGy i 10−15 min.
    3. Återgå bestrålade djur till burarna och hus dem i patogenfria anläggningar före transplantationen.
      OBS: Den minimala kroppsvikten hos mottagarna bör vara cirka 20 g. Använd denna vikt som referens för att beräkna viktminskningunder försöksperioden.
  2. Dag 1: Förbered T-cells utarmade benmärg (TCD-BM) från donatormössen.
    1. Avliva CD45.1/Ly5.1 C57BL/6 möss av CO2 kvävning och vänta i 2−3 min tills de är medvetslösa. Utför cervikal störning som en sekundär dödshjälp om det behövs.
    2. Sätt varje mus på en ren arbetsbräda. Sanitisera pälsen och huden med 70% isopropanol.
    3. Samla skenbenet och lårbenet från båda benen med hjälp av pincett och sax. Lägg dem i iskallt RPMI som innehåller 1% FCS och 100 U/mL penicillin/streptomycin och 2 mM L-glutamin (1% RPMI) i 50 ml koniska rör. Rengör lårbenet och skenbenet ben noggrant genom att ta bort alla muskelvävnader med hjälp av pincett och sax. Överför lårbenet och skenbenet från de 50 mL koniska rören till en 92 mm petriskål med en petriskål med en diameter på 92 mm som innehåller 1% RPMI.
    4. Med sax, skär ändarna på lårbenet eller skenbenet. Fyll ett 50 ml rör med 25 ml 1% RPMI 1640 medium. Använd detta för att fylla en 3 ml spruta fäst vid en 26 G nål med 3 ml 1% RPMI. Sätt in sprutan i benet och tryck kolven för att spola benmärgen (BM) ut ur kaviteten i uppsamlingsröret med 1% RPMI (~3 ml/ben).
    5. Upprepa steg 1.2.4 för alla återstående skenben och lårben från andra donatormöss. Håll alla uppsamlingsrör på is.
    6. Gör encellen suspension genom att spola benmärgsdelarna genom en 75 μm mesh cell sil. Samla encellfjädring i ett 50 ml rör.
    7. Centrifugrör vid 800 x g i 5 min vid 4 °C. Aspirera och kasta supernatanten. Återupphäng pelleten i PBS buffert som innehåller 0,5% bovint serum albumin (BSA) på 20 x 106 celler/ml. Spara en alikvot på 2 x 106 celler för renhet färgning.
    8. Tillsätt din 1 antikropp vid 0,05 μg/106 celler14 och inkubera i 30 min vid 4 °C. Tvätta en gång med 25 ml iskall PBS. Återhäng vid 20 x 106/ml i 0,5% BSA/10% ung kanin komplement/2% DNase (10.000 U /ml i steril H2O). Inkubera i 45 min vid 37 °C och tvätta 2x som tidigare.
      OBS: T-celler är uttömda med hjälp av en mAb specifik för Thy1, ett protein uttryckt av alla T-celler, men inte andra leukocyter.
    9. Återupphäng cellerna i 20 ml PBS-buffert som innehåller 0,5 % BSA. Räkna benmärgscellerna i 1% ättiksyra med hjälp av en hemocytometer. Håll en alikvot på 2 x 106 celler för en renhetskontroll genom flödecytometri efter cellrening.
      OBS: En givare mus normalt genererar ca 25 x 106 TCD-BM.
    10. Använd flödescytometri för att bekräfta en lyckad Utarmning av T-celler. Fläck 1 x 106 celler, konserverade från steg 1.2.7 (före t-cellsutarmning) och 1.2.9 (TCD-BM efter t-cellsutarmning) med följande antikroppar: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) och α-CD8α (53-6.7).
  3. Dag 1: Förbered T-celler från donatormössen
    1. Använd CD45.2+ H2kb+ C57BL/6 wild type (WT) möss som givare för T-celler.
    2. Avliva C57BL/6 möss med koldioxid (CO2)kvävning enligt beskrivningen i 1.2.1.
    3. Rengör musens päls och hud noggrant med 70% etanol. Punktskatter och lymfkörtlar och separera dem i en encells suspension av mjäcyter med hjälp av en spruta kolv och 40 μm mesh silar. Tvätta sil- och sprutkolven med 1% RPMI (1% FBS som innehåller RPMI-media) för att samla in alla mjältor.
    4. Centrifugera cellsuspensionen vid 800 x g i 5 min vid 4 °C. Lägg till 5 ml ACK lysing buffert (1 mM Na2EDTA, 10 mM KHCO3, 144 mM NH4Cl, pH 7.2) efter att ha kastat supernatant. Inkubera cellfjädringen i 5 min vid rumstemperatur.
      OBS: ACK lysbuffert används för att lyssa röda blodkroppar.
    5. Lägg till 5 ml 1% RPMI för att stoppa lys. Centrifugera vid 800 x g i 5 min vid 4 °C. Kasta supernatanten.
    6. Förbered iskalla magnetisk-aktiverad cellsortering (MACS) buffert (0,5% BSA, 2 mM EDTA i PBS, pH 7.2). Avgasa bufferten före användning. Återupphäng cellpellets en 5 ml MACS-buffert.
    7. Räkna splenocytes och kontrollera för levande och döda celler med hjälp av en hemocytometer och 1% trypan blå. Spara en alikvot på 2 x 106 celler för att utvärdera reningsutbytet med flödecytometrianalys.
    8. Återupphäng splenocytes vid koncentrationen av 200 x 106/ml i MACS buffert. Tillsätt 0,03 μL biotin anti-mouse-Ter-119, 0,03 μL biotin anti-mouse-CD11b, 0,03 μL biotin anti-mouse-CD45R och 0,03 μL biotin anti-mouse-DX5 per 106 celler. Inkubera i 15 min vid 4 °C.
      OBS: Biotin anti-mouse-Ter-119, biotin anti-mouse-CD11b, biotin anti-mouse-CD45R och biotin anti-mouse-DX5 användes för att reagera med erytroid, granulocyter, B-celler respektive NK-celler. Därför är dessa celldelmängder uttömda i följande steg15.
    9. Lägg till 10 ml iskall MACS-buffert till cellfjädringen. Centrifugera vid 800 x g i 5 min vid 4 °C. Kasta supernatanten.
    10. Återupphäng cellpelletsen i MACS-bufferten vid en koncentration på 100 x 106/ml. Tillsätt antibiotinmikropärlor (0,22 μL/106 celler) till splenocytesuspensionen. Blanda väl och inkubera i ytterligare 15 min vid 4 °C. Tvätta cellsuspensionen en gång med 10 ml iskallt MACS-buffert. Centrifugera vid 800 x g i 5 min vid 4 °C och kassera supernatanten.
    11. Placera en magnetisk separerakolonn i magnetfältet. Skölj kolonnen med 3 ml MACS-buffert. Släpp cellsuspensionen till kolumnen. Samla genomflödet bestående av obundna, berikade T-celler, i ett nytt 15 mL koniskt rör. Tvätta MS-kolonnen med 3 ml iskall MACS-buffert.
      OBS: Se till att kolumnen är tom innan tvättstegen utförs.
    12. Centrifugera cellsuspensionen vid 800 x g i 5 min vid 4 °C. Återupphäng cellkulanten i 5 ml MACS-buffert.
    13. Räkna cellerna i 1% trypan blå med hjälp av en hemocytometer. Spara en alikvot på 2 x 106 celler för en renhetskontroll genom flödecytometri.
      OBS: Den genomsnittliga avkastningen av splenic T-celler isolerade med denna metod är ~ 20−25 x 106 celler per mus.
    14. Bekräfta avkastningen av T-cells anrikning genom flödecytometri. Fläck 1 x 106 celler, konserverade från steg 1.3.7 (före t-cellsutarmning) och 1.3.13 (TCD-BM efter t-cellsutarmning), med följande antikroppar: α-CD3 (17A2), α-CD4 (GK1.5) och α-CD8α (53-6.7).
  4. Dag 1: Injicera bestrålade möss med givaren T-celler och TCD-BM.
    1. Tvätta TCD-BM och T-celler 2x med PBS (800 x g i 5 min vid 4 °C). Återupphäng cellerna i iskalla PBS för injektion. Justera cellkoncentrationen till 20 x 106/mL för TCD BM och 4 x 106/ml för T-celler.
    2. Värm djuret med hjälp av en värmelampa för att öka sikten hos de bilaterala stjärtvenerna. Om det behövs placerar du musen i en restrainer.
    3. Rengör ytan på svansen med 70% isopropanol. Injicera TCD-BM (5 x 106 celler/mus) med eller utan T-celler (0,75 x 106 celler/mus). Var försiktig så att du inte för in någon luft i sprutan.
    4. Ta bort nålen och applicera en antiseptisk svabb direkt på injektionsstället 5−10 s för att stoppa blödning.
  5. Utvärdera GVHD på dag 2−80.
    1. Håll koll på djurets överlevnad. Övervaka de kliniska tecknen på GVHD anpassade från det poängsystem som tidigare fastställts av Cook et al.16 och kroppsvikten hos mottagarmössen 2x per vecka. Använd den kroppsvikt som fastställts före TBI för att beräkna viktminskningen.
    2. Väg varje mus individuellt. Betyg viktminskning enligt följande: grad 0 = mindre än 10%; klass 1 = 10%−20%; grad 2 = mer än 20%.
    3. Betyg hållning tecken på mottagarna: grad 0 = ingen föraning; grad 0,5 = lätt föraning men rätar ut när man går; klass 1 = djuret förblir böjdnär man går; Grad 1.5 = djuret rätas inte ut. grad 2.0 = djurstativ på bakre tår.
    4. Betyg på mottagarnas mobilitetstecken: grad 0 = mycket aktiv; grad 0,5 = långsammare än naiva möss; grad 1.0 = rör sig endast när de petas; grad 1,5 = rör sig något när petas; 2.0 = rör sig inte när petade.
    5. Betyg huden på mottagarna: grad 0 = inga skrubbsår, lesioner eller skalning; Grad 0.5 = rodnad i ett visst område; Grad 1 = nötning i ett område eller mild nötning i två områden; Grad 1.5 = allvarliga skrubbsår i två eller flera områden. grad 2.0 = svåra skrubbsår, sprickbildning hud, torkat blod.
    6. Betyg pälsen av mottagarna: grad 0 = inga onormala tecken; grad 0,5 = befria på sidan av magen eller nacken, grad 1.0 = befria över eller sidan av mage och hals; grad 1,5 = ovårdad matt och ruffed päls; grad 2.0 = dåligt matt päls på mage och rygg.
    7. Betyg diarré av mottagarna: grad 0 = ingen diarré; grad 0,5 = liten och mjuk avföring; grad 1.0 = mild (gul avföring); grad 1,5 = måttlig (gul avföring med lite blod); grad 2 = svår (ljusgul och blodig avföring, "torkad kaka avföring" visas på analområdet).

2. Cotransplantation Modell

  1. Generera benmärgshärledda dendritiska celler (BM-DCs).
    1. Isolera benmärgen från lårbenoch tibias av WT eller faktor B (fB)-/- möss på B6-bakgrunden enligt beskrivningen i steg 1.2.3−1.2.4. Snurra cellerna med 800 x g i 5 min.
    2. Återupphäng av pelleten i 5 ml ACK lysing buffert för röda blodkroppar lysis. Inkubera cellsuspensionen i 5 min på is. Tillsätt 10 ml 1% RPMI till cellfjädringen för att stoppa lysoch centrifug vid 800 x g i 5 min vid 4 °C. Kasta supernatanten.
    3. Återupphäng cellpellets i 10 ml odlingsmedia (RPMI 1460 innehållande 10% FBS, 100 U/ml penicillin/streptomycin, 2 mM l-glutamin och 50 mM β-mercaptoetanol) och justera volymen för att möta den slutliga koncentrationen på 2 x 106 celler/ml.
    4. Lägg till 20 ng/mL granulocyte-macrophage kolonistimulerande faktor (GM-CSF) till cellsuspensionen. Odla benmärgscellerna i 100 x 15 mm Petri-rätter vid 37 °C i 5% CO2 i 6 dagar.
    5. Byt ut hälften av de pågående kulturmedierna (ca 5 ml) med färska medier som innehåller 40 ng/mL GM-CSF dag 3.
    6. Förvärm odlingsmedia i ett vattenbad vid 37 °C. Samla ca 5 ml av media från benmärgkulturrätter. Centrifugera vid 800 x g i 5 min vid 4 °C. Kasta supernatanten. Återupphäng cellkulanten i 5 ml odlingsmedia som innehåller 40 ng/mL GM-CSF.
    7. Tillsätt 25 μg/mL lipopolysackarider (LPS) i media dag 6 av kulturen för att mogna BM-DCs. Spara en alikvot på 2 x 106 celler för att bestämma DC-differentieringseffekten genom flödecytometri.
    8. Samla mogna BM-DCs: Använd celllyftare för att mjukt skrapa DCs från Petri rätter. Samla alla cellsuspensioner i 50 mL koniska rör. Centrifugera vid 800 x g, i 5 min vid 4 °C. Kasta supernatanten. Tvätta cellpellets 3x med 50 ml iskall PBS. Spara ca 2 x 106 BM-DCs för immunologisk fenotyp analys av flöde cytometri.
  2. Utför dendritisk cell co-transplantation av BMT (DC-cotransplanting BMT).
    OBS: Använd FVB (H2kq)möss som givare för T-celler och BM-celler. Bestråla B6 Ly5.1 mottagarmöss med en dos av 1 100 cGy (2 doser, 3 h intervall). Se detaljer i steg 1.1.
    1. Isolera BM från lårben och tibias av FVB givaren möss. Se mer information i steg 1.2.3−1.2.10.
      OBS: Använd total isolerad benmärg i stället för TCD-BM i den här modellen.
    2. Rena T-celler från mjälten och lymfkörtlar av FVB givaren möss. Se mer information i steg 1.3.1-1.3.13.
    3. Injicera BM (5 x 106/mus), T-celler (0,5 x 106/mus) med BM-DCs (2 x 106/mus) på dag 0 av den experimentella kursen.
    4. På dag 3 efter transplantationen, undersöka givaren DC reconstitution genom flöde cytometri.
      1. Samla blod från mottagarnas ögon.
      2. Anestesi dränger cd45.1/Ly5.1 B6 möss av 3% isoflurane inandning. Kontrollera om anestesins djup inte kan svara på en tånypa.
      3. Placera ett sterilt glaspipettrör i det mediala canthus i ögat riktad caudally i en 30−45° vinkel från nosplanet. Tryck medan du försiktigt roterar röret.
      4. Släpp blodet i en 10 μL heparin-innehållande sterila 1,5 ml mikrocentrifugrör. Överför 50 μL blod till 5 ml glasflödesrör.
      5. Lägg till 2 ml ACK lysing buffert. Inkubera vid 37 °C i vattenbad i 45 min. Tillsätt 2 ml FACS färgningsbuffert. Centrifugera vid 800 x g i 5 min vid 4 °C. Kasta supernatanten.
      6. Återupphäng cellpellets med 200 μL FACS-buffert som innehåller lämpliga flödesfärgningsantikroppar (levande/dödgula, α-H-2Kb, α-CD45.1, α-CD45.2, α-CD11c och α-MHCII). Inkubera i 15 min vid 4 °C i mörkret. Tvätta 2x med 1 ml FACS buffert. Återupphäng cellpelletsen i 200 μL FACS-buffert och utföra analysen genom flödecytometri.

3. GVHD/GVL Modeller av BMT

  1. Utför GVHD/GVL-induktion.
    1. Kultur luciferase transduced A20 B cell lymfom i RPMI kultur media.
    2. Bestråla BALB/c bakgrund WT eller Ly5.1 mottagare vid 700 cGy (engångsdos). Se detaljer i steg 1.1.
    3. Isolera TCD-BM från lårben och tibias av B6. Ly5.1 donatormöss. Se mer information i steg 1.2.1−1.2.10.
    4. Rena T-celler från mjälte och lymfkörtlar av C57BL/6 givare möss. Se mer information i steg 1.3.1−1.3.15.
    5. Tvätta A20 lymfom 2x med 25 ml PBS. Återupphäng cellpellets i 10 ml iskall PBS. Ta en cellsuspension alikvot (10 μL) och räkna cellerna med 1% trypan blå och en hemocytometer. Justera cellkoncentrationen till 20 000 celler/ml.
    6. Injicera TCD-BM (5 x 106/mus) med eller utan T-celler (0,75 x 106/mus) och A20-lymfom (5 000 celler/mus).
    7. Följ upp mottagarens överlevnad, GVHD kliniska tecken och viktminskning under den experimentella kursen. Se detaljer i steg 1.5.
  2. Utför bioluminescerande avbildning.
    1. Övervaka tumörtillväxten i den transplanterade mottagaren genom att injicera mottagarmössen med 4 mg D-luciferin. Inkubera i 5 min för att säkerställa luciferin reagerar med luciferase.
    2. Anestesi mus med 3% isoflurane i kammaren av en bioluminescens imager och bild mottagarna för 5 min i fält D och exponeringstiden på 1 min.
    3. Analysera data med hjälp av bildanalysprogram. Ändra skalan på pseudofärgbilderna för bästa resultat.
      Alla bilder måste vara i samma skala över experiment.
    4. Använd bildanalysprogrammet för att bestämma vilka områden som är av intresse och kvantifiera signaltätheten genom att beräkna det flöde (fotoner/s) som släpps ut från varje intresseområde.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Den stora MHC-felmatchade B6-modellen (H2k b)-BALB/C (H2kd)motsvarade gvhd-utvecklingen efter transplantationen (figur 2).b Alla sex Kliniska GVHD-tecken som tidigare fastställts av Cooke et al.16 inträffade hos mottagarna som transplanterats med WT-B6 T-celler men inte i mottagarna som transplanterats enbart med BM (steg 1.5), som representerade gvhd-negativa gruppen. Det finns två faser i GVHD utveckling i denna modell. Först är toppen av svårighetsgrad cirka 11 dagar efter transplantationen, följt av en minskning av de kliniska poängen och kroppsvikt återhämtning upp till 16 dagar. I denna fas driver flera mekanismer såsom bestrålningsinducerad inflammation och engraftmentsyndrom sjukdomenpatogenicitet och GVHD. Mottagarna dukar jämnt för GVHD ca 30−40 dagar efter transplantationen.

Minst 85 % av bm-länderna differentierades till dc(figur 3A). Intressant, transplantation med fB-/- Dc förbättrade mottagarens överlevnad och GVHD kliniska poäng(figur 3B,C). Med tanke på att fB-/- DCs har mindre antigen presentera kapacitet visat genom lägre MHCII uttryck och minskad co-stimulatory receptor uttryck17,co-transplantation protokollet kan vara tillräckligt för att undersöka olika signalering eller mål i mottagaren DC i GVHD utveckling efter BMT.

T-cellsrenhet var 90% efter anrikning (figur 4A). Luciferase-transduced A20 B cell lymfom möjliggör övervakning tumörtillväxt hos levande djur(figur 4B). I denna modell, om mottagarna dog utan någon signal och en hög GVHD klinisk poäng, drogs slutsatsen att de dog av GVHD. Alla WT BALB / c mottagare som fick BM ensam plus A20 dog av tumör återfall(figur 3B). Däremot, om djuret dog av högre signaltäthet, drogs slutsatsen att de dog av tumör återfall. Som framgår av figur 3Bdog WT BALB/c-mottagare som transplanterats med BM- och T-celler från ACC1fl/fl B6-donator (ACC1+/+ T-celler) av GVHD. Om djur dog med signaler av sjukdom, drogs slutsatsen att de dog av GVHD och tumör återfall. De djur som fick BM- och T-celler från ACC1fl/fl x CD4 cre B6-givaren (ACC1-/- T-celler) dog av både GVHD och tumöråterfall (figur 3B). Djur kan placeras tillbaka i buren för att avbildas vid en senare tidpunkt eller avlivas för ex vivo-avbildning. Med hjälp av programvaran kan tumörmassan i djuret också analyseras individuellt (figur 3B).

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av BMT-förfarandet. a)System för MHC-inkompatibla B6→BALB/c BMT-modell. (B)System för DC-co-transplantering av FVB→B6-modellen. c)System för B6→BALB/c GVHD/GVL-modell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Major MHC-inkompatibla B6→BALB/c GVHD-modell. BALB/c möss bestrålades dödligt och transplanterades med 5 x 106 BM ensamma eller med 0,75 x 106 T-celler. A)Överlevnadsdata,(B)viktminskning och(C)uppgifter om kliniska poäng för mottagarna av BM ensam eller med T-celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: DC co-transplantera HCT modell. BM isolerades från WT och fB-/- B6 möss och differentierades till DC genom odling med GM-CSF. (A)Renheten hos DCs undersöktes genom flödecytometri genom färgning med CD11c och MHCII. Dödligt bestrålade B6 mottagare transplanterades med BM (3 x 106/ mus) plus renade T-celler (1 x 106/ mus) från FVB givare. Mottagarna fick också 2 x 106 WT eller fB-/- B6 BM-DCs celler på transplantationsdagen. Överlevnaden (B) och kliniska poäng (C) visas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Major-MHC stämmer inte överens B6→BALB/c GVHD/GVL-modellen. WT BALB/c-mottagare transplanterades med TCD-BM (5 x 106/mouse) ensamma eller med ACC1+/+ T-celler eller ACC1+/+ T-celler (1 x 106/mus) isolerade från B6-bakgrundsgivarmöss. Dessutom fick mottagarna 2 x 103 A20-luc vid tidpunkten för transplantation. T-cells renhet undersöktes genom flödecytometri genom färgning med levande / död gul, CD3, CD4 och CD8 flöde antikroppar(A). Mottagarna övervakades för tumörtillväxt bestäms av hela kroppen bioluminescens imaging (BLI) (B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Användningen av stamceller för att passa en viss individ är ett effektivt tillvägagångssätt för att behandla avancerade och resistenta cancer18. Små molekylläkemedel har dock länge varit ett primärt fokus på personlig cancerbehandling. Å andra sidan, i cellulär terapi en mängd interaktioner mellan givare och värd kan beslutsamt påverka behandlingsresultaten, såsom utvecklingen av GVHD efter BMT1.

Major MHC-inkompatibla musmodeller av BMT är ett värdefullt verktyg för att förstå biologi GVHD och testa effekten av läkemedel i sin behandling. Bland dem är C57BL/6 (H2b) till BALB/c (H2d)och FVB (H2q)→C57BL/6 (H2b)väletablerade modeller5,7. Dessa modeller innehåller antingen myeloablativ strålning konditionering som en engångsdos (BALB / c) eller en fraktionerad dos (C57BL/6) där 3-8 timmars intervall krävs för att minska tarmtoxicitet5. Båda modellerna är beroende av både CD8+ och CD4+ T-celler. I dessa modeller, GVHD svårighetsgrad och överlevnad är de viktigaste resultaten mätt, och den transplanterade mottagaren har konsekvent snabb kinetik och 100% penetrance. För att övervaka T-cells migration och expansion bör T-celler från luciferase-transduced donatormöss användas för in vivobioluminescence imaging19. Medan 90% av bmt-resultatet är MHC-matchade, liknar b6-BALB/c-modellen inte helt den kliniska situationen. Upptäckten av MHC och mindre histokompatibilitet antigener (miHAs) har avsevärt bidragit till att främja området BMT10. Mindre MHC-inkompatibla GVHD mus modeller närmare efterlikna patienten GVHD20. Konditioneringsintensitet för att inducera givaren cell engraftment orsakar vävnadsskador och kan påverka GVHD resultatet21. Konditionering regimer i murine modeller innebär ofta TBI i motsats till kemoterapi i kliniska inställningar22,23. Därför har en immunsuppressiv kemoterapi modell använts för att efterlikna en minskad villkorlig intensitet i kliniker. Musmodellen var C57BL/6 (H2b) till BALB/c (H2d)och transplanterade mottagare utvecklade kliniska och histologiska symtom i samband med GVHD24.

Den potentiella fördelen med det samtransplanterade protokollet är att testa rollen för mottagar-DCs utan att specifikt beroende på CD11c utarmat möss. Eftersom BM-DC-generationen utfördes ex vivo, kan detta protokoll också tillämpas för att testa rollen för andra celltyper såsom makrofager eller neutrofiler i GVHD helt enkelt genom att ändra kulturvillkoren. Med hjälp av CD45.1+ B6 möss som mottagare gör det möjligt för forskare att skilja BM-DCs (CD45.2+ CD11c+) från mottagare DCs (CD45.1+ CD11c+) genom flödeanalys. Det flexibla antalet celler som genereras ex vivo och antas in i de transplanterade mottagarna är en annan fördel med medtransplantationsprotokollet. Dessutom, ex vivo kultur tillåter oss att skärmen de potentiella droger för att kontrollera GVHD.

Förmågan att spåra tumörmönster in vivo är ett kraftfullt verktyg som har potential att testa om ett läkemedel kan påverka GVL aktivitet. Med hjälp av denna GVHD/GVL-modell kan tumörprogression och metastasering övervakas hos levande djur16. Dessutom kan denna inställning användas för att testa GVL-effekten i flera cancerformer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga intressekonflikter.

Acknowledgments

Denna studie stöds av University of Central Florida College of Medicine start-up bidrag (till HN), University of Pittsburgh Medical Center Hillman Cancer Center start-up bidrag (till HL), USA NIH Grant #1P20CA210300-01 och vietnamesiska hälsoministeriet Grant #4694 / QD-BYT (till PTH). Vi tackar Dr Xue-zhong Yu vid Medical University of South Carolina för att tillhandahålla material för studien.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.5 M EDTA pH 8.0 100ML Fisher Scientific BP2482100 MACS buffer
10X PBS Fisher Scientific BP3994 MACS buffer
A20 B-cell lymphoma University of Central Florida In house GVL experiment
ACC1 fl/fl Jackson Lab 30954 GVL experiment
ACC1 fl/fl CD4cre University of Central Florida GVL experiment
Anti-Biotin MicroBeads Miltenyi Biotec 130-090-485 T-cell enrichment
Anti-Human/Mouse CD45R (B220) Thermo Fisher Scientific 13-0452-85 T-cell enrichment
Anti-mouse B220 FITC Thermo Fisher Scientific 10452-85 Flow cytometry analysis
Anti-mouse CD11c- AF700 Thermo Fisher Scientific 117319 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD25 PE Thermo Fisher Scientific 12-0251-82 Flow staining
Anti-Mouse CD4 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-0041-86 T-cell enrichment
Anti-Mouse CD4 eFluor® 450 (Pacific Blue® replacement) Thermo Fisher Scientific 48-0042-82 Flow staining
Anti-mouse CD45.1 PE Thermo Fisher Scientific 12-0900-83 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse CD8a APC Thermo Fisher Scientific 17-0081-83 Flow cytometry analysis
Anti-mouse H-2Kb PerCP-Fluor 710 Thermo Fisher Scientific 46-5958-82 Flow cytometry analysis
Anti-mouse MHC Class II-antibody APC Thermo Fisher Scientific 17-5320-82 Flow cytometry analysis
Anti-Mouse TER-119 Biotin Thermo Fisher Scientific 13-5921-85 T-cell enrichment
Anti-Thy1.2 Bio Excel BE0066 BM generation
B6 fB-/- mice University of Central Florida In house Recipients
B6.Ly5.1 (CD45.1+) mice Charles River 564 Donors
BALB/c mice Charles River 028 Transplant recipients
C57BL/6 mice Charles River 027 Donors/Recipients
CD11b Thermo Fisher Scientific 13-0112-85 T-cell enrichment
CD25-biotin Thermo Fisher Scientific 13-0251-82 T-cell enrichment
CD45R Thermo Fisher Scientific 13-0452-82 T-cell enrichment
CD49b Monoclonal Antibody (DX5)-biotin Thermo Fisher Scientific 13-5971-82 T-cell enrichment
Cell strainer 40 uM Thermo Fisher Scientific 22363547 Cell preparation
Cell strainer 70 uM Thermo Fisher Scientific 22363548 Cell preparation
D-Luciferin Goldbio LUCK-1G Live animal imaging
Fetal Bovine Serum (FBS) Atlanta Bilogicals R&D system D17051 Cell Culture
Flow cytometry tubes Fisher Scientific 352008 Flow cytometry analysis
FVB/NCrl Charles River 207 Donors
Lipopolysacharide (LPS) Millipore Sigma L4391-1MG DC mature
LS column Mitenyi Biotec 130-042-401 Cell preparation
MidiMACS Miltenyi Biotec 130-042-302 T-cell enrichment
New Brunswick Galaxy 170R incubator Eppendorf Galaxy 170 R Cell Culture
Penicilin+streptomycinPenicillin/Streptomycin (10,000 units penicillin / 10,000 mg/ml strep) GIBCO 15140 Media
RPMI 1640 Thermo Fisher Scienctific 11875-093 Media
TER119 Thermo Fisher Scientific 13-5921-82 T-cell enrichment
Xenogen IVIS-200 Perkin Elmer Xenogen IVIS-200 Live animal imaging
X-RAD 320 Biological Irradiator Precision X-RAY X-RAD 320 Total Body Irradiation

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shlomchik, W. D. Graft-versus-host disease. Nature Reviews Immunology. 7, 340-352 (2007).
  2. Appelbaum, F. R. Haematopoietic cell transplantation as immunotherapy. Nature. 411, 385-389 (2001).
  3. Blazar, B. R., Murphy, W. J., Abedi, M. Advances in graft-versus-host disease biology and therapy. Nature Reviews Immunology. 12, 443-458 (2012).
  4. Pasquini, M. C., Wang, Z., Horowitz, M. M., Gale, R. P. 2010 report from the Center for International Blood and Marrow Transplant Research (CIBMTR): current uses and outcomes of hematopoietic cell transplants for blood and bone marrow disorders. Clinical Transplantation. , 87-105 (2010).
  5. Schroeder, M. A., DiPersio, J. F. Mouse models of graft-versus-host disease: advances and limitations. Disease Model & Mechanism. 4, 318-333 (2011).
  6. Graves, S. S., Parker, M. H., Storb, R. Animal Models for Preclinical Development of Allogeneic Hematopoietic Cell Transplantation. ILAR Journal. , ily006 (2018).
  7. Sprent, J., Schaefer, M., Korngold, R. Role of T cell subsets in lethal graft-versus-host disease (GVHD) directed to class I versus class II H-2 differences. II. Protective effects of L3T4+ cells in anti-class II GVHD. Journal of Immunology. 144, 2946-2954 (1990).
  8. Rolink, A. G., Radaszkiewicz, T., Pals, S. T., van der Meer, W. G., Gleichmann, E. Allosuppressor and allohelper T cells in acute and chronic graft-vs-host disease. I. Alloreactive suppressor cells rather than killer T cells appear to be the decisive effector cells in lethal graft-vs.-host disease. The Journal of Experimental Medicine. 155, 1501-1522 (1982).
  9. Lu, Y., Waller, E. K. Dichotomous role of interferon-gamma in allogeneic bone marrow transplant. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15, 1347-1353 (2009).
  10. Abdollahi, A., et al. Inhibition of platelet-derived growth factor signaling attenuates pulmonary fibrosis. The Journal of Experimental Medicine. 201, 925-935 (2005).
  11. Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control of immunity. Nature. 392, 245-252 (1998).
  12. Stenger, E. O., Turnquist, H. R., Mapara, M. Y., Thomson, A. W. Dendritic cells and regulation of graft-versus-host disease and graft-versus-leukemia. Blood. 119, 5088-5103 (2012).
  13. Ullmann, A. J., et al. Posaconazole or fluconazole for prophylaxis in severe graft-versus-host disease. New England Journal of Medicine. 356, 335-347 (2007).
  14. Dittel, B. N. Depletion of specific cell populations by complement depletion. Journal of Visualized Experiments. , (2010).
  15. Nguyen, H. D., et al. Metabolic reprogramming of alloantigen-activated T cells after hematopoietic cell transplantation. Journal of Clinical Investigation. 126, 1337-1352 (2016).
  16. Cooke, K. R., et al. An experimental model of idiopathic pneumonia syndrome after bone marrow transplantation: I. The roles of minor H antigens and endotoxin. Blood. 88, 3230-3239 (1996).
  17. Nguyen, H., et al. Complement C3a and C5a receptors promote GVHD by suppressing mitophagy in recipient dendritic cells. Journal of Clinical Investigation Insight. 3, (2018).
  18. McNutt, M. Cancer immunotherapy. Science. 342, 1417 (2013).
  19. Negrin, R. S., Contag, C. H. In vivo imaging using bioluminescence: a tool for probing graft-versus-host disease. Nature Reviews in Immunology. 6, 484-490 (2006).
  20. Roy, D. C., Perreault, C. Major vs minor histocompatibility antigens. Blood. 129, 664-666 (2017).
  21. Gendelman, M., et al. Host conditioning is a primary determinant in modulating the effect of IL-7 on murine graft-versus-host disease. Journal of Immunology. 172, 3328-3336 (2004).
  22. Li, J., et al. HY-Specific Induced Regulatory T Cells Display High Specificity and Efficacy in the Prevention of Acute Graft-versus-Host Disease. Journal of Immunology. 195, 717-725 (2015).
  23. Zeiser, R., et al. Early CD30 signaling is critical for adoptively transferred CD4+CD25+ regulatory T cells in prevention of acute graft-versus-host disease. Blood. 109, 2225-2233 (2007).
  24. Sadeghi, B., et al. GVHD after chemotherapy conditioning in allogeneic transplanted mice. Bone Marrow Transplant. 42, 807-818 (2008).

Tags

Immunologi och infektion hematopoietic stamcellstransplantation benmärgtransplantation graft-versus-host sjukdom graft-versus-leukemi dendritiska celler dendritiska cellen co-transplantation
Bone Marrow Transplantation Plattform för att undersöka rollen av dendritiska celler i Graft-versus-Host Disease
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nguyen, H. D., Huong, P. T.,… More

Nguyen, H. D., Huong, P. T., Hossack, K., Gurshaney, S., Ezhakunnel, K., Huynh, T. H., Alvarez, A. M., Le, N. T., Luu, H. N. Bone Marrow Transplantation Platform to Investigate the Role of Dendritic Cells in Graft-versus-Host Disease. J. Vis. Exp. (157), e60083, doi:10.3791/60083 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter