Summary
Этот протокол описывает метод изоляции глазного яблока мыши с веком, глазной поверхностью, передней и задней сегментами в относительно неповрежденном положении.
Abstract
Окулярная поверхность (ОС) состоит из эпителиального листа с тремя связанными частями: палпебраальной конъюнктивы, бульбарной конъюнктивы и роговицы эпителия. Нарушение ОС приведет к кератит, конъюнктивит или оба (кератоконъюнктивит). В экспериментальных моделях животных с определенными генетическими модификациями или искусственными операциями полезно параллельно изучить все части эпителиального листа ОС для оценки относительных патогенетических изменений каждой части. Тем не менее, вскрытие ткани ОС в целом без искажений или повреждений было сложным, в первую очередь из-за мягкости и худобы ОС, прикрепленных к физически отдельным, но подвижным векам и глазным яблокам. Кроме того, глубокая глазная розетка, образованная твердым черепом/орбитальными костями, полностью занята глазным яблоком, оставляя ограниченное пространство для операционных вскрытий. В результате, прямое вскрытие глазного яблока с сопутствует ткани ОС со стороны лица часто приводит к повреждению тканей, особенно пальпебраальной и бульбарки конъюнктивы. В этом протоколе мы описали метод удаления черепа и орбитальных костей последовательно из двухсекционной головы мыши, оставляя веки, глазную поверхность, линзы и сетчатку в целом в один кусок. Целостность листа ОС хорошо сохранилась и может быть рассмотрена гистологией или иммунодефицитом в одном разделе.
Introduction
Глазная поверхность состоит из непрерывного листа регионального эпителия, включая палпебрелкную конъюнктиву, бульбарную конъюнктиву и роговицу1. Многие железистые структуры связаны с глазной поверхности эпителия и вместе генерировать слой слезной пленки защиты поверхности роговицы от сушки и экологических вторжений2. Нарушение ОС приведет к кератит, конъюнктивит или оба (кератоконъюнктивит). Как генетические факторы, так и экологические раздражители или их взаимодействие способствуют патологическим изменениям ОС3,4. Соответственно, для изучения процессов заболеваний ОС человека использовались различные генетически-инженерные и физически или химически индуцированные модели животных.
Структура и функция мыши Нойс во многих отношениях аналогична структуре и функции мышиной ОС. Компоненты слезной пленки, выделяемые глазными железами, также похожи между мышами и людьми. Обширные исследования были проведены с использованием моделей мыши для выяснения механизмов заболеваний ОС человека5,6,7. Во многих случаях, очень важно анализировать глобальные, а не локальные молекулярные изменения ОС, чтобы получить всеобъемлющую информацию в рамках той же экспериментальной обработки. Поэтому для одновременного анализа каждой части ОС необходима подготовка образца с хорошей целостностью.
Мышь OS плотно ассоциируется с глазным яблоком, которое было встроено в глазницу/орбиту (костлявая чашка из нескольких различных костей черепа) и соединяется с ним через тонкие соединительные ткани. Существуют огромные проблемы для вскрытия всей глазной поверхности, не повреждая палпебрал или bulbar conjunctiva. Эти проблемы сходящие с: i) ОС мягкая и тонкая и прикреплена к физически отдельным, но подвижным векам и глазным яблокам, поэтому уязвимыми для искажения и повреждения; и ii) ограниченное пространство между орбитальными костями и глазным яблоком ограничивает операции по вскрытию. Проблемы гораздо больше для взрослых мыши. В эмбриональной мыши, окостенение орбитальной кости не является полным и окружающие ткани относительносвободные 8. Голова может быть удалена и разделена, а затем непосредственно подвергается параформальдегида (PFA) фиксации и встраивания9. В отличие от этого, послеродовые и взрослые мыши орбитальных костей полностью окостенели с толстыми окружающими тканями, что делает проникновение фиксаторов менее эффективным. Кроме того, орбитальные / череп кости твердые и хрупкие, легко сломаны при разделении их в мягких встраивающих соединений, таких как парафин. Сломанные части костей будут единогласно разорвать близлежащие ткани в результате уступает морфологии тканей.
Многие опубликованные исследования часто показали частичную глазную поверхность, которая может быть достаточной для их конкретных целей исследования10,11. Грубое изучение литературы обнаружили лишь несколько исследований, показывающих всю неповрежденную глазную поверхность, демонстрируемую без подробного описания протоколов вскрытия12,13. В этом протоколе мы подробно описали метод вскрытия для получения интегральной послеродовой глазной поверхности, при которой орбитальные и черепные кости были упорядоченно удалены, оставляя нетронутую глазную поверхность вместе с глазным яблоком и веками, снижая физические повреждения. Мы дополнительно изучили гистологию ОС и провели иммуногистохимию с использованием тканевых секций, подготовленных с помощью этого протокола.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, связанные с использованием мышей, были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных, Офтальмологическим центром Чжуншань, и придерживались заявления ARVO об использовании животных в офтальмологических исследованиях и исследованиях зрения.
1. Рассечение глазного яблока с неповрежденной глазной поверхностью и веками
- Вскрыть голову.
- Эвтаназия послеродового дня 10 (P10) и P28 мышей (см. таблицу материалов для мыши штаммов) путем вывиха шейки матки, отрезать голову от шеи парой острых ножниц.
- Бисект голову с парой прямых ножниц вдоль сагиттальной средней линии, начиная с межпариетальной кости rostrally к носовой(Рисунок 1A,B).
ПРИМЕЧАНИЕ: кость черепа затвердевает со старением мыши, будьте осторожны, чтобы держать ножницы резки вдоль средней линии как можно больше. - Поместите каждую половину раздвоенной головы в чистую чашку Петри, отрежьте челюсть и язык сначала с помощью острых ножниц. Освободите зрительный нерв, отрезав его от мозга до расположения оптической хиазмы, и удалить все ткани мозга, включая обонятельную луковицу, прикрепленную к стенке черепа.
- Теперь оставшиеся ткани должны иметь все череп / орбитальные кости, связанные с глазным яблоком(Рисунок 1C,D). Вымойте оставшуюся часть с PBS для очистки крови и волос мусора.
- Ткани префикса с 4% параформальдегидом (PFA, в фосфатно-буферизированном солей, рН 7.4) в конической трубке 50 мл при комнатной температуре (RT) с вращением. Приблизительное время фиксации: 10 мин для P0 до P7; 20 мин для P8 до P28; и 30 мин для P29 и старше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Префикс предлагает жесткость тканей, что облегчает вскрытие. Кроме того, префикс позволяет избежать оставить свежие ткани незафиксированными слишком долго, прежде чем вскрытие будет завершено.
ВНИМАНИЕ: PFA является опасным и должны быть обработаны с осторожностью.
- Удалить череп / орбитальные кости.
- После префикса, быстро мыть расчлененные головы в PBS три раза для дальнейшего устранения сломанных волос книжки и фиксаторы для того, чтобы приступить к дальнейшему вскрытию.
ВНИМАНИЕ: Воздействие на фиксаторы во время вскрытия может быть вредным для здоровья. - Поместите ткань в 10 см Чашка Петри, разрезать череп на три части вдоль плоскостей, указанные в рисунке 1D, E. Глазное яблоко в розетке скрыто в средней части черепа под этмоидными, лобными и челюстными костями(рисунок 1D,E).
- Используйте две пары No 4 прямых щипц для снимают этидальную кость, чтобы полностью разоблачить лобные и челюстно-лицевой кости(рисунок 1F).
- Географически разделить поверхность черепа (в том числе верхнечелюстной и лобной кости) на 4 области(рисунок 1F). Вставьте кончик изогнутых щипцы горизонтально в каждой области, чтобы удалить верхнечелюстные и лобные кости последовательно(рисунок 1F).
ПРИМЕЧАНИЕ: Челюстные кости не могут быть удалены одновременно. Терпеливо вскрыть их по частям. Лобная кость непосредственно связана с глазным яблоком через мягкие соединительные ткани. Будьте осторожны при удалении его из глазного яблока, чтобы предотвратить растяжение глазного яблока и повреждения конъюнктивы. - После удаления частичной верхнечелюстной кости и всех лобных костей, основные lacrimal и когал кости будут подвергаться(Рисунок 1G). Удалите две кости и связанные с ними подкожные мышцы и жиры, окружающие глазное яблоко, обрезать глазное яблоко с прикрепленными веками и кожей в небольшой квадратной формы блока, чтобы уменьшить объем ткани и облегчить ориентацию ткани при встраивании (Рисунок 1 H).
- Поместите глазное яблоко и связанные с ними ткани обратно в 4% PFA и продолжать фиксировать ночь на 4 градусов по Цельсию. Фиксированная ткань может быть сохранена в течение по крайней мере одного месяца при 4 градусах По Цельсия в PBS с добавлением 0,02% NaN3. Кроме того, немедленно приступайке к гистологическому анализу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань должна храниться в течение более длительных периодов времени, она может быть легко храниться в 70% этанола.
- После префикса, быстро мыть расчлененные головы в PBS три раза для дальнейшего устранения сломанных волос книжки и фиксаторы для того, чтобы приступить к дальнейшему вскрытию.
2. Гистологический анализ
- Параффин раздел а гематоксилин и эозин (H и E) окрашивание
- Следуйте стандартному протоколу, описанному в другом месте9 для выполнения встраивания парафина и секции.
- Иммуногистохимия (IHC)
- Dewax парафиновые секции с ксиленом и регидратировать разделы через алкоголь серии (100%, 95%, 80%) в дистиллированную воду (dH2O).
- Выполните поиск антигена путем микроволновой обработки тканей слайдов в 0,01 М лимонной кислоты буфера (3 г тринатрия цитрат, 0,4 г лимонной кислоты на 1 л двойной дистиллированной H2O) в стеклянной горке банку с низкой мощностью (120 Вт). Энергия должна периодически доставляться в течение 5-10 мин с каждым интервалом продолжительностью около 2 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высокомощные микроволновые печи или последовательное нагревание приведет к отслоению секций тканей от слайда. - Выберите слайды из стеклянной банки, тщательно стереть остаточной жидкости, окружающие каждый раздел с помощью тканей лица и поместить их на слайд стойку в гистологии окно. Нарисуйте квадрат вокруг каждой секции водонепроницаемой гистологической ручкой. Поместите 100 зл блокирующего буфера (0,1% тритона X-100 и 10% сыворотки осла в 1x PBS) на каждый квадрат, и инкубировать в течение 30 минут на RT.
- Тщательно удалите блокирующий раствор с вакуумом, добавьте первичное антитело (см. таблицу материалов)с желаемым разбавлением в блокирующем буфере, и продолжайте инкубировать слайды при 4 градусах По Цельсию в течение 24 ч или дольше.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация для каждого первичного антитела, используемого для IHC варьируется, и должна быть проверена в экспериментальных экспериментах. - Вымойте ткани слайды с PBST (0,1% Тритон в PBS) в три раза, по 10 минут каждый. Повторите шаг 2.2.4 с использованием вторичного антитела (см. Таблица материалов)вместе с 4',6-diamidino-2-penylindole (DAPI) заменяя блокирующий буфер. Продолжайте инкубировать не менее 4 ч или дольше при комнатной температуре (RT).
- Удалить вторичное антитела, мыть ткани с решением PBST три раза, в течение 10 минут каждый, затем мыть с чистой PBS еще 5 мин.
- Протрите остаточные PBS окружающих секций ткани, монтировать крышки на секциях с монтажом среды. Выполните флуоресцентную микроскопию для получения изображений (см. таблицу материалов).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Основные кости черепа, рассматриваемые с разных точек зрения, были проиллюстрированы на рисунке 1A-E,с цветами, обозначающими различные кости. Мы использовали четырехнедельное животное для демонстрации процессов вскрытия. После вскрытия шагов 1.1.1-1.3 и короткой префиксации (шаг 1.1.4), глазное яблоко со связанными костями лица продемонстрировано на рисунке 1E. Дальнейшая обрезка для удаления передней (носовой и премакиллной) и задней (например, теменной), а также этидальных костей генерируемых тканей блок с главным образом верхнечелюстных и лобных костей на вершине глазного яблока (Рисунок 1F). Последовательное удаление этих костей в соответствии с назначенными областями на рисунке 1F подвергаются лежащим лязгским и когаловым костям, а также гланд-железе Хардергина(рисунок 1G). Гланд Harderin прикрепленный к глазному яблоку служил ориентиром(Рисунок 1G),и должен быть сдержан в месте все время. Изоляция глазного яблока была завершена путем удаления всех костей и окружающих жиров и мышечных тканей(рисунок 1H).
После встраивания парафина, глазное яблоко было разделено и Н И E-окрашенных. Репрезентативные изображения отображаются на рисунке 2. Относительное нетронутые положения век, роговицы и конъюнктивальной поверхности были визуализированы в одном разделе(рисунок 2A), части которого были увеличены на рисунке 2B,C. Морфология хрусталика трудна для поддержания(Рисунок 2A)из-за своей жесткости и хрупкости. Мы применили этот метод вскрытия для других послеродовых возрастов и показал пример Н И E гистологии P10 глазного яблока разделе(Рисунок 3). В общем, чем моложе мышь, тем лучше сохраняется морфология глазного яблока. Иммуноокрашенные парафиновые секции от серийного послеродового возраста показаны на рисунке 4, с кератином 12 (K12)(Рисунок 4A-F) и кератин 14 (K14) (Рисунок 4G-L) окрашивание роговицы и всего эпителия ОС, Соответственно.
Рисунок 1: Иллюстрация вскрытия глазного яблока у 4-недельной взрослой мыши. (A-D) Схематическая диаграмма композиции черепа рассматривается сверху (A), снизу (B), боковой (C) и средней плоскости (D), соответственно. Dashed линии в (A) и (B) указывают на раздвоенные плоскости. (E) Bisected-половина черепа на 4-недельный старый возраст, который точно соответствует (D). (F)Медиаль-плоскости зрения расчлененных тканей между двумя поперечными плоскостями в (D) и (E). Глазное яблоко (разбитый круг) было в основном встроено под лобной (Фрон) и верхнечелюсти (Макс). Цветные пунктирные линии географически делят раздвоенный план на 4 области, в которых кости были примерно удалены в порядке или номерах. Обратите внимание, что этмоидная (эт) кость была удалена. (G) После удаления лобной кости и частичной челюстно-лицевой кости, Хардергин железы (Хар) и джугал (джуг) и lacrimal (La) кости были выставлены. Круг пунктиры линии указывают на положение глазного яблока. (H) Изолированное глазное яблоко рассматривается изнутри после вскрытия завершена. Стрелка указывает на зрительный нерв (На). E - Глаз, Най Носаль, Премаксилья, Макс и Максиллари, Ла-Лакрималь, Фрон - Фронтальный, Али -Алисфеноид, Кувшин и Джугал, Пал а палатин, Птери - Птергойд, Сквосаль, Пар - Париетал, Этмойд. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Г И Е гистологии глазной поверхности ткани в послеродовой 4-недельный. (A) Век, конъюнктива и роговица визуализированы в одном разделе ткани. Коробок области "b" и "c" были увеличены в (B) и (C), соответственно. (B) Эпителий роговицы, стромы и эндотелия. (C) Конъюнктива с клетками кубок. ce й эпителий роговицы, ст. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: Г И Е гистологии глазной поверхности ткани в послеродовой день 10. (A) Intact глазное яблоко на P10. Коробок области "b" и "c" были увеличены в (B) и (C), соответственно. (B) Роговица. (C) Конъюнктива. Ce й роговица эпителия, ст й строма, эд эндотелий, cj конъюнктивы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Иммуностоинесивая поверхность глаз от P5 до P15. Квадратная площадь в каждой панели была увеличена в их праве. (A-F) Кератин 12 был специально выражен в эпителии роговицы (стрелки). (G-L) Кератин 14, выраженный в глазной поверхности. ac - передняя камера, пк и бледно-брюдная конъюнктива. Эта цифра была изменена из предыдущей публикации Guo et al.14. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Одним из важнейших напоминания для подготовки нетронутыми глазного яблока является то, что все орбитальные кости должны быть удалены полностью, особенно juga и lacrimal кости, которые являются небольшими и расположены в нижней части глазницы. Любые оставшиеся кости могут осложнить последующую гистологию. В случае, если крошечный кусок кости не был полностью удален из вскрытия случайно, он может быть выбран из встраивания парафиновый блок с помощью пары sharptweezers. Отверстие, оставленное после этой операции, должно быть заполнено расплавленным парафином.
Дополнительная осторожность следует проявлять при обращении с объективом. Сломанные части объектива обычно разбросаны по всему разделу. Это значительно повлияет на изучение микроскопии и анализ изображений. Попытки удалить линзы повредят либо глазную поверхность (если операция была проведена со стороны лица), либо сетчатку (если операция была проведена со стороны оптического диска сетчатки). Альтернативный способ уменьшить негативное влияние присутствия ткани хрусталика без вскрытия заключается в изменении направлений секции. Например, для сохранения морфологии глазной поверхности, секция парафиновой блока должна выполняться от передней части глазного яблока к задней, в противном случае, с противоположного направления.
Полезное примечание, чтобы сделать для PFA фиксированной парафин овой части является то, что антиген поиска, как правило, необходимо для иммуносохранения, таких как использование K12 и K14 антител. Тем не менее, Есть много исключений, что антиген поиска будет генерировать неспецифические сигналы увеличения фонового окрашивания. Таким образом, следует быть осторожным при использовании антигена технологии поиска, и должны проверить антитела в экспериментальных экспериментах, если это возможно, заранее.
В целом существуют два способа изоляции глазного яблока от черепа/орбитальных костей: i) непосредственно вскрыть глазное яблоко со стороны лица; и ii) удалить внутренний череп / орбитальные кости, чтобы освободить глазное яблоко. Задача первого метода заключается в том, что глазное яблоко погружается глубоко в орбитальную розетку с узким пространством между ними для вскрытия. Кроме того, подвижное глазное яблоко будет растягивать конъюнктива эпителия в любой момент, когда вскрытие инструменты коснуться его, создавая непреднамеренные повреждения. В отличие от этого, второй метод начинается с вскрытия черепа / орбитальных костей, которые находятся дальше от глазного яблока и связанных с ними глазной поверхностной ткани, тем самым снижая риск повреждения конъюнктивы. Кроме того, нет пространственных сужений для выполнения вскрытий. Даже если первый метод может работать, если большие предостережения были приняты, второй, безусловно, легче и лучше.
Таким образом, мы описали метод изоляции глазного яблока мыши с нетронутыми веком и связанной с ними глазной поверхности от послеродовых мышей. Описанный протокол подходит для изоляции глазного яблока нетронутым и связаннымс глазными тканями у послеродовых мышей. Протокол особенно полезен, когда требуется целостность ОС или целых глазных тканей. Мы использовали этот метод для подготовки образцов тканей для изучения кератина маркеров в ОС в нормальных и патологических условиях. Мы приходим к выводу, что глазные ткани от таких препаратов особенно полезны для просмотра дифференциальных правил белка в разных частях ОС на одном разделе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы благодарят профессора Ронг Цзю за критическое прочтение рукописи, а также всех сотрудников лаборатории за техническую помощь. Эта работа была поддержана грантами Национального фонда естественных наук Китая (NSFC: 31571077; Пекин, Китай), Гуанчжоу город наук и технологий Инновационный проект (2017070200009; Гуанчжоу, провинция Гуандун, Китай), "100 человек план" из Университета Сунь Ятсена (8300-1821104; Гуанчжоу, провинция Гуандун, Китай), и финансирование исследований из Государственной ключевой лаборатории офтальмологии в Чжуншань офтальмологического центра (303060202400339; Гуанчжоу, провинция Гуандун, Китай).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
- Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).
- Knop, E., Knop, N. Anatomy and immunology of the ocular surface. Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).
- Mizoguchi, S., et al. Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice. The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).
- Gipson, I. K. Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).
- Nowell, C. S., et al. Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction. Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).
- Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo. Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).
- Zhang, L., et al. A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure. The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).
- Sharov, A. A., et al. Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation. The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).
- Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP). The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).
- Zhang, Y., et al. Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity. Development. 140 (3), 594-605 (2013).
- McCauley, H. A., et al. TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium. Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).
