Summary
该协议描述了一种在相对完整位置分离眼睑、眼表面、前段和后段的小鼠眼球的方法。
Abstract
眼部表面 （OS） 由上皮片组成，其三个连接部分：胸膜结膜、胸膜结膜和角膜上皮。操作系统中断会导致角膜炎、结膜炎或两者（角膜结膜炎）。在具有某些基因修饰或人工操作的实验动物模型中，检查 OS 上皮表的所有部分以并行评估每个部分的相对病理遗传变化非常有用。然而，对操作系统组织整体进行解剖，没有变形或损伤一直具有挑战性，这主要是因为附在物理上分离但可移动的眼睑和眼球的操作系统柔软和薄薄。此外，硬头骨/轨道骨骼形成的深眼窝被眼球完全占据，留下有限的空间进行解剖。因此，从面部侧直接切除眼球与相关的OS组织往往会导致组织损伤，特别是胸膜和胸膜结膜。在这个协议中，我们描述了一种从分离的小鼠头部依次取出头骨和轨道骨骼的方法，将眼睑、眼表面、透镜和视网膜完全分离在一块。OS 表的完整性得到了很好的保存，可以通过组织学或免疫染色在单个部分进行检查。
Introduction
眼部表面由连续的局部上皮片组成，包括胸膜结膜、胸膜结膜和角膜1。许多腺体结构与眼表面上皮相关，并共同产生一层撕裂膜，保护角膜表面免受干燥和环境入侵2。操作系统中断会导致角膜炎、结膜炎或两者（角膜结膜炎）。遗传因素和环境刺激物或其相互作用都促成了OS3，4的病理改变。因此，各种基因工程和物理或化学诱导的动物模型被用于研究人类操作系统的疾病过程。
鼠标操作系统的结构和功能在许多方面与人类相似。眼腺分泌的泪膜成分在小鼠和人类之间也相似。利用小鼠模型阐明人类OS疾病5、6、7的机制进行了大量研究。在许多情况下，分析操作系统的全局性而不是局部分子变化，以获得相同实验处理下的全面信息至关重要。因此，需要具有良好完整性的样品制备，以确保同时分析操作系统的每个部分。
鼠标操作系统与嵌入在眼窝/轨道中的眼球（由几个不同头骨制成的骨杯）紧密相连，并通过薄连接组织连接到它。在不破坏眼皮或胸膜结膜的情况下解剖整个眼部表面存在巨大的挑战。这些挑战来自：（i） 操作系统柔软而薄薄，并贴在物理上分离但可移动的眼睑和眼球上，因此容易受到变形和损坏;（ii）轨道骨骼和眼球之间的有限空间限制了解剖操作。对于成年小鼠来说，挑战要大得多。在胚胎小鼠中，轨道骨的骨化不完备，周围组织相对松散8。头部可以去除和分一半，然后直接进行甲醛（PFA）固定和嵌入9。相比之下，产后和成年小鼠轨道骨骼完全被厚厚的周围组织所渗透，使得固定剂的渗透效率降低。此外，轨道/头骨是硬和脆的，很容易打破时，切片他们在软嵌入化合物，如石蜡。破碎的骨头会一致撕裂附近的组织，导致劣质组织形态。
许多已发表的研究往往显示部分眼表面，这可能足以为他们的特定研究目的10，11。对文献的一次总检查发现，只有很少的研究显示整个完整的眼表面被证明没有详细的解剖协议12，13。在此协议中，我们详细介绍了一种解剖方法，以获得完整的产后眼部表面，其中轨道和头骨被有序地去除，留下未接触的眼表面以及眼球和眼睑，最大限度地减少了物理损伤。我们进一步检查了OS组织学，并使用使用该协议准备的组织部分进行免疫组织化学。
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Protocol
所有涉及使用小鼠的程序均获得中山眼科中心动物护理和使用委员会的批准，并遵守《关于在眼科和视觉研究中使用动物的ARVO声明》。
1. 眼睑表面和眼睑完整可分光的眼球
- 切除头部。
- 通过宫颈脱位，将产后第10天（P10）和P28小鼠（见小鼠菌株材料表）用一把锋利的剪刀砍下颈部。
- 沿着下垂中线沿下垂中线将头分叉到鼻腔（图1A，B）。
注意：头骨骨骼随着鼠标老化而变硬，请尽量保持剪刀沿中线切割。 - 将两半头放在干净的培养皿中，先用锋利的剪刀切断下巴和舌头。在视光位置之前切断大脑，释放视神经，并去除所有脑组织，包括附着在头骨壁上的嗅球。
- 现在，剩余的组织应具有与眼球相关的所有头骨/轨道骨骼（图1C，D）。用 PBS 清洗剩余部分，以清洁血液和头发碎片。
- 在室温（RT）下，在室温（RT）下，在50mL锥形管中，在50mL锥形管中，在50mL锥形管中，在50mL锥形管中，在50mL锥形管中，在50mL锥形管中旋转，使用PFA，在磷酸盐缓冲盐水[PBS]中，pH 7.4） 的前缀组织。大致固定时间如下：P0 至 P7 的固定时间为 ±10 分钟;P8 至 P28 约 20 分钟;P29 及更岁及以上的分钟和 ±30 分钟。
注： 前缀提供组织刚度，使随后的解剖更容易。此外，前缀避免在解剖完成之前使新鲜组织长时间未固定。
注意：PFA 是危险的，必须小心处理。
- 取出头骨/轨道骨骼。
- 前缀后，快速在PBS中清洗解剖头三次，以进一步消除破毛和固定剂，以便进行进一步的解剖。
注意：在解剖过程中接触固定剂会损害健康。 - 将组织放入10厘米培养皿中，沿着图1D，E所示的平面将头骨切成三部分。插座中的眼球隐藏在头骨的中间部分，下有前骨骨和上颌骨（图1D，E）。
- 使用两对4号直钳剥离乙型骨，以完全暴露正面和上颌骨（图1F）。
- 从地理上将头骨表面（包括上颌骨和前骨）划分为 4 个区域（图1F）。将弯曲的钳尖水平插入每个区域，以按顺序去除上颌骨和前骨骼（图1F）。
注： 上颌骨骼不能同时全部切除。耐心地逐一解剖它们。前骨通过软结缔组织直接连接到眼球。从眼球中取出时要小心，以防止眼球拉伸和损伤结膜。 - 切除部分上颌骨和所有正面骨后，底层的乳突骨和颈骨将暴露（图1G）。去除眼球周围的两块骨骼和相关皮下肌肉和脂肪，将眼睑和皮肤修剪成小方形方块，以减少组织体积，便于嵌入时组织定向（图1） H）
- 将眼球和相关组织放回4%PFA中，并在4°C继续固定过夜。固定组织可在PBS4°C下保存至少一个月，并添加0.02%NaN3。或者，立即进行组织学分析。
注：如果组织需要储存更长时间，它可以很容易地储存在70%乙醇中。
- 前缀后，快速在PBS中清洗解剖头三次，以进一步消除破毛和固定剂，以便进行进一步的解剖。
2. 组织学分析
- 石蜡部分和血氧林和欧辛（H&E）染色
- 按照其他位置9中描述的标准协议执行石蜡嵌入和切片。
- 免疫组织化学（IHC）
- 用二甲苯对石蜡部分进行脱蜡，并通过酒精系列（100%、95%、80%）对石蜡部分进行再水化。入蒸馏水（dH2O）。
- 通过微波处理0.01 M柠檬酸缓冲液（3克柠檬酸三钠，每1升双蒸馏H2O0.4克柠檬酸）中的低功率（120 W）中的组织滑片进行抗原回收。能量应间歇性地输送，共 5-10 分钟，每个间隔持续约 2 分钟。
注：大功率微波或一致加热将导致组织部分从幻灯片分离。 - 从玻璃罐中挑选出幻灯片，使用面部组织仔细擦拭每个部分周围的残留液体，并将其放在组织学盒中的滑架上。用防水组织学笔在每个部分周围画一个正方形。将100 μL的阻塞缓冲液（0.1%三吨X-100和10%驴血清在1xPBS）放在每个方块上，并在RT孵育30分钟。
- 小心地用真空去除阻滞溶液，加入原抗体（见材料表），在阻滞缓冲液中进行所需的稀释，并继续在4°C下孵育滑片24小时或更长时间。
注：用于IHC的每个主要抗体的浓度各不相同，需要在试验实验中进行测试。 - 用PBST（PBS中0.1%Triton）清洗组织幻灯片三次，每次10分钟。使用二级抗体（见材料表）与4'，6-二酰胺-2-苯丙烯（DAPI）一起重复步骤2.2.4，以取代阻塞缓冲液。在室温 （RT） 下继续孵育至少 4 小时或更长时间。
- 取出二级抗体，用PBST溶液清洗组织部分三次，每次10分钟，然后用干净的PBS再洗5分钟。
- 擦去残留的PBS周围组织部分，将盖玻片安装在带有安装介质的截面上。执行荧光显微镜以获得图像（参见材料表）。
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Representative Results
从不同角度看的主要头骨骨骼如图1A-E所示，颜色表示不同的骨骼。我们使用四周大的动物来演示解剖过程。在解剖步骤 1.1.1-1.1.3 和短前缀（步骤 1.1.4）之后，图 1E中演示了具有相关面部骨骼的眼球。进一步修剪，以去除前（鼻和上半身）和后部（例如，前体）以及食性骨骼产生的组织块，主要是眼球上的上颌骨和前骨（图1F）。根据图1F中的指定区域，按顺序去除这些骨骼，暴露底层的乳突骨和巨体骨骼以及哈丁腺（图1G）。附在眼球上的哈丁腺作为一个里程碑（图1G），应始终保持在原位。眼球的分离是通过去除所有骨骼和周围的脂肪和肌肉组织完成（图1H）。
石蜡嵌入后，眼球被分割和H&E染色。具有代表性的图像如图2所示。眼睑、角膜和结膜表面的相对完整位置在一个部分（图2A）中可视化，其中部分在图2B，C中放大。透镜形态由于刚度和脆弱性，难以保持（图2A）。我们将这种解剖方法应用于其他产后年龄，并举例说，P10眼球部分的H&E组织学（图3）。一般来说，老鼠越年轻，眼球形态保存越好。图4显示了连续产后的免疫染色石蜡部分，角蛋白12（K12）（图4A-F）和角蛋白14（K14）（图4G-L）染色角膜和整个OS上皮，分别。
图1：4周大成年小鼠眼球解剖图。（A-D）分别从顶部 （A）、底部 （B）、横向 （C） 和中间平面 （D） 查看的头骨组成原理图。（A） 和 （B） 中的虚线表示两面。（E） 4周大时半头骨，正好与 （D） 匹配。（F） 在 （D） 和 （E） 中两个横平面之间的解剖组织中， 中平面视图.眼球（圆环）主要嵌入正面（Fron）和上颌（最大值）下方。彩色虚线在地理上将两面分割的平面划分为 4 个区域，其中骨骼大致按照顺序或数字移除。请注意，活动（Eth）骨骼已移除。（G） 去除前骨和部分上颌骨后，接触了硬质腺（哈）和朱格（Jug）和乳酸（拉）骨。圆虚线表示眼球位置。（H） 解剖完成后从内部观察的孤立的眼球。箭头指向视神经（打开）。E = 眼睛、娜 = 鼻腔、前 = 前最大值、最大值 、 La = 拉克里马尔、弗龙 = 正面、阿里 • 阿利斯芬诺、朱格 • 朱加尔、帕尔 • 帕拉蒂尼、Ptery = Pterygoid、Squ = 夸莫萨尔、帕尔 • 帕里塔尔、Eth = Ethmoid。请点击此处查看此图的较大版本。
图2：产后4周表层组织的H&E组织学。（A） 眼睑、 结膜和角膜在一个组织部分可视化."b"和"c"的盒装区域分别在（B）和（C）中被放大。（B） 角膜上皮、频闪和内皮。（C） 与果子细胞的结膜。ce = 角膜上皮， st = 频闪， ed = 内皮， gc = 球体细胞.请点击此处查看此图的较大版本。
图3：产后第10天眼表面组织的H&E组织学。（A） P10 的眼珠。"b"和"c"的盒装区域分别在（B）和（C）中被放大。（B） 角膜.（C） 结膜.Ce = 角膜上皮， st = 频闪， ed = 内皮， cj = 结膜.请点击此处查看此图的较大版本。
图4：从P5到P15的眼表面免疫染色。每个面板中的方形框区域在其右侧被放大。（A-F）角蛋白12是专门表达在角膜上皮（箭头）。（G-L）角蛋白14在眼表面表示。ac = 前室，pc = 苍白结膜。这个数字是从郭等人14日以前的出版物中修改的。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
准备完整眼球的一个关键提醒是，所有轨道骨骼必须完全去除，尤其是小而靠近眼窝底部的朱加骨和乳状骨骼。任何遗留的骨头都可能使随后的骨骼学复杂化。如果一小块骨头没有被意外从解剖中完全去除，则可以使用一对尖锐的钳子从嵌入的石蜡块中挑选出来。此操作后，留下的孔应填充熔化的石蜡。
处理镜头时应格外小心。破碎的镜头通常分散在整个部分。这将极大地影响显微镜检查和图像分析。尝试取出镜头会损坏眼表面（如果手术是从面部进行）或视网膜（如果手术来自视网膜的视盘侧）。减少镜头组织存在的负面影响而不进行解剖的另一种方法是改变切片方向。例如，为了保存眼表面形态，石蜡块的切片应从眼球前到后，否则，从相反的方向进行。
PFA 固定石蜡部分的一个有用说明是，抗原检索通常是免疫染色所必需的，例如使用 K12 和 K14 抗体。然而，有许多例外，抗原检索将产生非特异性信号，增加背景染色。因此，在使用抗原检索技术时应谨慎，如有可能，应事先在试验实验中测试抗体。
一般来说，有两种方法将眼球从头骨/轨道骨骼中分离出来：（i） 直接从面部解剖眼球;（二） 从面部直接解剖眼球;和（ii）取出头骨内部/轨道骨骼以释放眼球。第一种方法的挑战是眼球深沉入轨道插座，中间有一个狭窄的空间进行解剖。此外，当解剖工具触摸到结膜上皮时，可移动的眼球会拉伸结膜上皮，造成无意的损害。相比之下，第二种方法从解剖头骨/轨道骨骼开始，这些骨骼离眼球和相关眼部组织较远，从而降低了损伤结膜的风险。此外，没有空间收缩进行解剖。即使第一种方法可以工作，如果采取很大的谨慎，第二个肯定更容易和更好。
总之，我们描述了一种从产后小鼠身上分离具有完整眼睑和相关眼表面的小鼠眼球的方法。所述方案适用于分离眼球与完整的眼睑和相关眼组织在产后小鼠。当需要操作系统或整个眼组织的完整性时，该协议特别有用。我们使用这种方法制备组织样本，用于在正常和病理条件下检查OS中的角蛋白标记物。我们得出结论，这种制剂的眼组织对于在单个部分查看操作系统不同部分蛋白质的差异规律特别有用。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
作者感谢荣居教授对手稿的批判性阅读，并感谢所有实验室成员提供技术支持。这项工作得到了国家自然科学基金（国家自然科学基金委员会：31571077）的资助;中国北京），广州市科技创新项目（201707020009）;中国广东省广州市"百人计划"来自中山大学（8300-18821104）;中国广东省广州市，中山眼科中心眼科国家重点实验室（303060202400339）;中国广东省广州市）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
- Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).
- Knop, E., Knop, N. Anatomy and immunology of the ocular surface. Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).
- Mizoguchi, S., et al. Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice. The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).
- Gipson, I. K. Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).
- Nowell, C. S., et al. Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction. Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).
- Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo. Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).
- Zhang, L., et al. A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure. The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).
- Sharov, A. A., et al. Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation. The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).
- Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP). The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).
- Zhang, Y., et al. Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity. Development. 140 (3), 594-605 (2013).
- McCauley, H. A., et al. TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium. Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).
