Summary
Detta protokoll beskriver en metod för isolering av mus ögongloben med ögonlock, okulär yta, främre och bakre segment i relativt intakt läge.
Abstract
Okulär yta (OS) består av en epitelial ark med tre anslutna delar: palpebrala konjunktiva, bulbar konjunktiva och korneal epitel. Störningar av OS skulle leda till keratit, konjunktivit eller båda (keratokonjunktivit). I experimentella djurmodeller med vissa genetiska modifieringar eller konstgjorda operationer, är det lämpligt att undersöka alla delar av OS epitelial blad för att utvärdera relativa patogenetiska förändringar av varje del parallellt. Emellertid, dissektion av OS vävnad som helhet utan distorsion eller skada har varit utmanande, främst på grund av mjukhet och tunnhet av OS anbringas på fysiskt separata men rörliga ögonlock och ögongloben. Dessutom är den djupa ögon uttaget som bildas av den hårda skull/orbital ben fullt upptagen av ögongloben lämnar begränsat utrymme för att driva dissektioner. Som ett resultat, direkt dissektion av ögongloben med tillhörande OS vävnader från ansikts sidan skulle ofta leda till vävnadsskador, särskilt palpebrala och bulbar konjunktiva. I detta protokoll, vi beskrev en metod för att ta bort skalle och orbital ben sekventiellt från en bisekcted mus huvud, lämnar ögonlock, okulär yta, lins och näthinnan helt i ett stycke. Integriteten i OS-arket var väl bevarad och kunde undersökas med histologi eller immunofärgning i en enda sektion.
Introduction
Den okulära ytan består av en kontinuerlig ark av regionaliserade epitel inklusive palpebrala konjunktiva, bulbar konjunktiva och hornhinnan1. Många körtelstrukturer är förknippade med den okulära ytan epitel och tillsammans generera ett skikt av tår film skydda hornhinnan ytan från torkning och miljö invasioner2. Störningar av OS skulle leda till keratit, konjunktivit eller båda (keratokonjunktivit). Både genetiska faktorer och miljömässiga irriterande eller deras interaktioner bidra till patologiska förändringar av OS3,4. Följaktligen har en mängd genetiskt modifierade och fysiskt eller kemiskt inducerad djurmodeller använts för att studera sjukdomsprocesser i det mänskliga operativsystemet.
Den struktur och funktion av mus OS är liknande den hos människor på många sätt. Tår film komponenter utsöndras av okulära körtlar är också liknande mellan möss och människor. En mängd studier har utförts med hjälp av musmodeller för att belysa mekanismerna för mänskliga OS-sjukdomar5,6,7. I många fall är det viktigt att analysera globala i stället för lokala molekylära förändringar av operativsystemet för att få omfattande information under samma experimentella behandling. Därför behövs provberedning med god integritet för att säkerställa att varje del av operativsystemet analyseras samtidigt.
Musen OS tätt Associates med ögongloben som var inbäddad i ögat socket/omloppsbana (en benig kopp av flera olika skallben) och ansluter till den genom tunna bindväv. Det finns enorma utmaningar för dissekera hela ögats yta utan att skada palpebrala eller bulbar konjunktiva. Dessa utmaningar härstammar från: (i) OS är mjukt och tunt och anbringas på fysiskt åtskilda men rörliga ögonlock och ögongloben, därför sårbara för distorsion och skador; och (II) det begränsade utrymmet mellan orbital ben och ögongloben begränsa dissektion operationer. Utmaningarna är mycket större för den vuxna musen. I den embryonala musen, är orbital ben förbening inte fullständig och omgivande vävnader är relativa lös8. Huvudet kan avlägsnas och bisekeras, och sedan direkt utsätts för PARAFORMALDEHYD (PFA) fixering och inbäddning9. Däremot är de postnatal och vuxna mus orbital ben helt förbenad med tjocka omgivande vävnader, vilket gör penetrationen av fixeringsmedel mindre effektiva. Dessutom, orbital/skalle benen är hårda och sköra, lätt bryts när snittning dem i mjuk inbäddning föreningar såsom paraffin. Den brutna bitar av ben kommer enhälligt riva den närliggande vävnader resulterar i sämre vävnadmorfologi.
Många publicerade studier visade ofta partiell okulär yta, vilket kan vara tillräckligt för deras särskilda forskningsändamål10,11. En grov undersökning av litteraturer fann endast få studier som visar hela intakt okulär yta som demonstreras utan detaljerad beskrivning av dissektion protokoll12,13. I detta protokoll, vi detaljerade en dissektion metod för att få integrerad postnatal okulär yta, där orbital och skallben var ordnad bort, lämnar orörd okulär yta tillsammans med ögongloben och ögonlocken, minimera de fysiska skadorna. Vi undersökte vidare OS-histologin och utförde immunohistokemi med hjälp av de vävnads sektioner som utarbetats med detta protokoll.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla förfaranden som inbegriper användning av möss godkändes av djuromsorg och användning kommittén, Zhongshan ophthalmic Center, och anslutit sig till ARVO uttalande för användning av djur i oftalmologiska och vision forskning.
1. dissektion av ögongloben med intakt okulär yta och ögonlock
- Dissekera huvudet.
- Euthanize postnatal dag 10 (P10) och P28 möss (se tabellen av material för mus stammar) genom cervikal dislokation, klippa huvudet av halsen med ett par vassa saxar.
- Bisect huvudet med ett par raka sax längs sagittal mittlinjen början vid interparietala benet rostrally till näsan (figur 1a, B).
Obs: skallbenet hårdnar med mus åldrande, var noga med att hålla saxen skära längs mittlinjen så mycket som möjligt. - Placera varje halva av det bisekerade huvudet i en ren petriskål, klipp av käken och tungan först med vassa saxar. Frigör synnerven genom att skära bort den från hjärnan innan den optiska chiasm plats, och ta bort alla hjärnvävnader inklusive lukt glödlampa bifogas skalle väggen.
- Nu resterande vävnader skall ha alla skalle/orbital ben i samband med ögongloben (figur 1C, D). Tvätta resterande del med PBS för att rengöra blod och håravfall.
- Prefix vävnader med 4% PARAFORMALDEHYD (PFA, i fosfatbuffrad saltlösning [PBS], pH 7,4) i en 50 mL koniskt rör i rumstemperatur (RT) med rotation. Ungefärlig bindningstid är följande: ~ 10 min för P0 till P7; ~ 20 min för P8 till P28; och ~ 30 min för P29 och äldre.
Obs: prefixeringen ger vävnads styvhet som gör den efterföljande dissektion lättare. Dessutom undviker prefixering lämnar färsk vävnad ofixerad för länge innan dissektion är klar.
FÖRSIKTIGHET: PFA är farligt och måste hanteras varsamt.
- Ta bort skalle/orbital ben.
- Efter prefixeringen, snabbt tvätta dissekerade huvudet i PBS tre gånger för att ytterligare eliminera de trasiga hårstrån och fixeringsmedel för att fortsätta med ytterligare dissektion.
Varning: exponering för fixeringsmedel under dissektion kan vara skadlig för hälsan. - Placera vävnaden i 10 cm petriskål, skär skallen i tre delar längs de plan som anges i figur 1D, E. Ögongloben i uttaget är gömd i den mellersta delen av skallen under ethmoid, frontal-och maxillary ben (figur 1D, E).
- Använd två par av No. 4 raka pinpett att skala bort ethmoid benet att fullt ut exponera den främre och maxillary ben (figur 1F).
- Geografiskt dela skallytan (inklusive maxillary och pannbenet) i 4 områden (figur 1F). Sätt spetsen på böjda tång horisontellt i varje område för att ta bort maxillary och frontal benen sekventiellt (figur 1F).
Obs: maxillary ben kan inte alla tas bort på en gång. Tålmodigt dissekera dem bit för bit. Pannbenet är direkt ansluten till ögongloben genom mjuka bindväv. Ta försiktighet när du tar bort den från ögongloben för att förhindra stretching ögongloben och skadar bindhinnan. - Efter avlägsnande av partiell maxillary ben och alla frontal ben, de underliggande lacrimal och okbenet ben skulle exponeras (figur 1G). Ta bort de två benen och associerade subkutana muskler och fetter som omger ögongloben, trimma ögongloben med bifogade ögonlock och hud i en liten fyrkantig form block för att minska vävnadsvolym och underlätta orientering vävnaden vid inbäddning (figur 1 H).
- Placera ögongloben och associerade vävnader tillbaka i 4% PFA och fortsätt att fixa över natten vid 4 ° c. Den fasta vävnaden kan bevaras i minst en månad vid 4 ° c i PBS med tillägg av 0,02% NaN3. Alternativt, gå vidare till histologisk analys omedelbart.
Obs: om vävnaden behöver lagras under längre perioder, det kan lätt lagras i 70% etanol.
- Efter prefixeringen, snabbt tvätta dissekerade huvudet i PBS tre gånger för att ytterligare eliminera de trasiga hårstrån och fixeringsmedel för att fortsätta med ytterligare dissektion.
2. histologisk analys
- Paraffin avsnitt och hematoxylin och eosin (H & E) färgning
- Följ standardprotokoll som beskrivs på annan plats9 för att utföra paraffin inbäddning och snittning.
- Immunohistokemi (IHC)
- Devax paraffin avsnitten med xylen och rehydrera sektionerna genom alkohol serien (100%, 95%, 80%) destillerat vatten (dH2O).
- Utför antigen hämtning genom mikrovågs behandling av vävnads glasen i 0,01 M citronsyra buffert (3 g Trinatriumcitrat, 0,4 g citronsyra per 1 L dubbeldestillerat H2O) i en glasburk med låg effekt (120 W). Energi bör levereras periodvis för totalt 5-10 min med varje intervall som varar ca 2 min.
Obs: hög effekt mikrovågsugn eller konsekvent uppvärmning skulle leda till avlossning av vävnad sektioner från bilden. - Plocka ut bilderna från glasburk, torka försiktigt bort kvarvarande vätska som omger varje sektion med hjälp av ansikts vävnader och placera dem på glid stället i en histologisk ruta. Rita en kvadrat runt varje sektion med en vattentät histologisk penna. Placera 100 μL blockerande buffert (0,1% Triton X-100 och 10% Donkey serum i 1x PBS) på varje kvadrat, och inkubera i 30 minuter vid RT.
- Ta försiktigt bort den blockerande lösningen med vakuum, tillsätt den primära antikroppen (se tabellen med material) med önskad utspädning i blockeringsbuffert, och fortsätt att Inkubera bilderna vid 4 ° c i 24 h eller längre.
Obs: koncentrationen för varje primär antikropp som används för IHC varierar och måste testas i pilotexperiment. - Tvätta vävnad diabilder med PBST (0,1% Triton i PBS) tre gånger, för 10 min vardera. Upprepa steg 2.2.4 med den sekundära antikroppen (se tabell över material) tillsammans med 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) som ersätter blockeringsbufferten. Fortsätt att Inkubera i minst 4 h eller längre vid rumstemperatur (RT).
- Ta bort den sekundära antikroppen, tvätta vävnad sektioner med PBST lösning tre gånger, för 10 min vardera, tvätta sedan med ren PBS för ytterligare 5 min.
- Torka av resterande PBS omgivande vävnad sektioner, montera täckglas på sektioner med monteringsmedel. Utför fluorescerande mikroskopi för att få bilder (se tabell över material).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De stora Skallbenen sedd ur olika perspektiv illustrerades i figur 1A-E, med färger som betecknar olika ben. Vi använde fyra veckor gammalt djur för demonstration av dissekeringsprocesserna. Efter dissekeringssteg 1.1.1-1.1.3 och en kort prefixering (steg 1.1.4) visas ögongloben med tillhörande ansiktsben i figur 1E. Ytterligare trimning för att ta bort främre (nasal och premaxillary) och posterior (t. ex., parietal) samt ethmoid ben genererade vävnad block med främst maxillary och frontal ben ovanpå ögongloben (figur 1F). Sekventiell borttagning av dessa ben enligt utsedda områden i figur 1F exponerade underliggande lacrimal-och okbenet-ben samt harderin körtel (figur 1G). Den Harderin körtel fäst på ögongloben fungerade som ett landmärke (figur 1G), och bör hållas på plats hela tiden. Isolering av ögongloben slutfördes genom avlägsnande av alla ben och omgivande fetter och muskelvävnad (figur 1H).
Efter paraffin inbäddning, var ögongloben sektionerad och H & E-färgade. Representativa bilder visas i figur 2. De relativa intakt positionerna av ögonlocken, hornhinnan och konjunktival yta visualiserades i ett avsnitt (figur 2a), varav delar var förstorade i figur 2B, C. Objektivets morfologi är svår att underhålla (figur 2a) på grund av dess styvhet och instabilitet. Vi tillämpade denna dissekeringsmetod på andra postnatala åldrar och visade ett exempel på H & E histologi av P10 ögongloben section (figur 3). I allmänhet, den yngre musen är, desto bättre ögongloben morfologi bevaras. Immunfärgade paraffin sektioner från seriella postnatal åldrar visas i figur 4, med keratin 12 (K12) (figur 4A-F) och keratin 14 (k14) (figur 4G-L) färgning av hornhinnan och hela OS-epitel, Respektive.
Figur 1: illustration av ögongloben dissektion i 4-veckors gammal vuxen mus. (a-D) Det schematiska diagrammet över skallsammansättningen sedd uppifrån (A), nedtill (B), lateralt (C) och mittplan (D), respektive. Streckade linjer i (A) och (B) indikerar de tvåsekrade planen. E) halv skalle vid 4 veckors ålder som exakt matchar (D). Fmedial-Plane syn på dissekerade vävnader mellan de två tvärgående planen i D och e. Ögongloben (streckad cirkel) var huvudsakligen inbäddad under frontala (Fron) och maxillary (max). Färgade streckade linjer delar geografiskt upp det tvåsekerade planet i fyra områden, där benen ungefär togs bort enligt ordningen eller numren. Observera att ethmoid (ETH) ben har tagits bort. (G) efter avlägsnande av pannben och partiell maxillary, harderin körtel (har) och okbenet (tillbringare) och lacrimal (La) ben exponerades. Cirkel streckade linjer indikerar ögongloben position. (H) isolerad ögongloben Sedd inifrån efter dissektion avslutad. Pilen pekar på optisk nerv (på). E = öga, na = nasal, pre = Premaxilla, Max = maxillary, La = lacrimal, Fron = frontal, Ali = Alisphenoid, tillbringare = Jugal, PAL = Palatine, Ptery = pterygoid, squ = squamosal, par = parietal, ETH = ethmoid. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: H &Amp; E histologi av den okulära ytvävnaden vid postnatal 4-veckors gammal. (A) ögonlocket, konjunktiva och hornhinnan visualiseras i en vävnads sektion. Boxed områden av "b" och "c" var förstorad i (B) och (C), respektive. (B) hornhinnan epitel, stroma och endotelet. C) bindhinnan med bägaren celler. CE = hornhinnan epitel, St = stroma, Ed = endotelet, GC = bägaren cell. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: H &Amp; E histologi av den okulära ytvävnaden vid postnatal dag 10. (A) intakt ögongloben vid P10. Boxed områden av "b" och "c" var förstorad i (B) och (C), respektive. B) hornhinnan. C) bindhinnan. CE = hornhinnan epitel, St = stroma, Ed = endotelet, CJ = konjunktiva. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: immunofärgning av ögats yta från P5 till p15. Kvadrat-boxed område i varje panel var förstorad i sin rätt. (a-F) Keratin 12 uttrycktes särskilt i hornhinnan epitel (pilar). (G-L) Keratin 14 uttryckt i den okulära ytan. AC = främre kammare, PC = palpebrala konjunktiva. Denna siffra ändrades från en tidigare publikation Guo et al.14. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En kritisk påminnelse för beredning av intakt ögongloben är att alla orbital ben måste avlägsnas helt, särskilt Juga och lacrimal ben, som är små och ligger nära botten av ögat socket. Eventuella överfall ben kan komplicera den efterföljande histologin. Om en liten bit av ben inte var helt bort från dissektion av misstag, kan det plockas ut från inbäddning paraffin blocket med ett par sharptweezers. Hålet som lämnas kvar ska fyllas med smält paraffin efter denna operation.
Ytterligare försiktighet bör iakttas vid hantering av linsen. De trasiga bitar av linsen är oftast utspridda genom hela sektionen. Detta kommer att avsevärt påverka mikroskopi undersökning och bildanalys. Försök att ta bort linsen skulle skada antingen den okulära ytan (om operationen utfördes från ansiktet sida) eller näthinnan (om operationen var från den optiska skivan sidan av näthinnan). Ett alternativt sätt att minska den negativa effekten av närvaron av lins vävnad utan dissektion är att ändra snittning riktningar. Till exempel, för att spara den okulära ytan morfologi, snittning av paraffin blocket bör utföras från främre ögongloben till den bakre, annars, från motsatt riktning.
En användbar anmärkning att göra för PFA-fast paraffin avsnitt är att antigen hämtning är vanligtvis nödvändigt för immunofärgning som använder K12 och k14 antikroppar. Det finns dock många undantag att antigen hämtning skulle generera icke-specifika signaler öka bakgrunds färgning. Därför bör man vara försiktig när man använder antigen Hämta teknik, och bör testa antikroppar i pilotexperiment om möjligt, i förväg.
I allmänhet finns det två metoder för isolering av ögongloben från skallen/orbital ben: (i) direkt dissekera ögongloben från ansiktet sida; och (II) ta bort insidan skalle/orbital ben för att frigöra ögongloben. Utmaningen för den första metoden är att ögongloben sjunker djupt in i orbital uttaget med ett smalt utrymme däremellan för dissektion. Dessutom skulle den rörliga ögongloben sträcka bindhinnan epitel vid varje given punkt när dissektion verktyg röra den, skapa oavsiktliga skador. Däremot, den andra metoden börjar med dissektion av skalle/orbital ben, som är längre från ögongloben och tillhörande okulär ytvävnad, vilket minskar risken för att skada bindhinnan. Dessutom finns det inga rumsliga sammandragningar för att utföra dissektioner. Även om den första metoden kan fungera om stora försiktighetsåtgärder vidtogs, den andra är definitivt lättare och bättre.
Sammanfattnings, vi har beskrivit en metod för isolering av mus ögongloben med intakt ögonlocket och tillhörande ögats yta från postnatal möss. Det beskrivna protokollet lämpar sig för isolering av ögongloben med intakt ögonlock och tillhörande ögon vävnader hos postnatal möss. Protokollet är särskilt användbart när integriteten av OS eller hela okulär vävnad krävs. Vi har använt denna metod för att förbereda vävnadsprover för undersökning av keratin markörer i OS under normala och patologiska förhållanden. Vi drar slutsatsen att de okulära vävnaderna från sådana preparat är särskilt användbara för att titta på differential reglering av ett protein i olika delar av operativsystemet på en enda sektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Författarna tackar prof. Rong ju för kritisk läsning av manuskriptet, och alla Lab medlemmar för teknisk assistans. Detta arbete stöddes av bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (NSFC: 31571077; Peking, Kina), Guangzhou City Sciences och teknik innovation Project (201707020009; Guangzhou, Guangdongprovinsen, Kina), "100 People plan" från Sun Yat-sen University (8300-18821104; Guangzhou, Guangdongprovinsen, Kina), och forskningsfinansiering från State Key Laboratory oftalmologi vid Zhongshan ophthalmic Center (303060202400339; Guangzhou, Guangdongprovinsen, Kina).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
- Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
- Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).
- Knop, E., Knop, N. Anatomy and immunology of the ocular surface. Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).
- Mizoguchi, S., et al. Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice. The Ocular Surface. 15 (4), 713-722 (2017).
- Gipson, I. K. Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).
- Nowell, C. S., et al. Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction. Nature Cell Biology. 18 (2), 168-180 (2016).
- Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo. Archives of Histology and Cytology. 54 (3), 267-278 (1991).
- Zhang, L., et al. A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure. The Embo Journal. 22 (17), 4443-4454 (2003).
- Sharov, A. A., et al. Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation. The Embo Journal. 22 (12), 2992-3003 (2003).
- Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP). The American Journal of Pathology. 178 (5), 2058-2065 (2011).
- Zhang, Y., et al. Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity. Development. 140 (3), 594-605 (2013).
- McCauley, H. A., et al. TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium. Development. 141 (23), 4628-4639 (2014).
- Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).
