Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Isolierung des Mausauges mit Augenlid-, Augenoberfläche-, vorderen und hinteren Segmenten in relativ intakter Position.
Abstract
Die Augenoberfläche (OS) besteht aus einem Epithelblatt mit drei verbundenen Teilen: palpebrale Bindehaut, Bulbarkonjunktiviva und Hornhautepithel. Störung des OS würde zu Keratitis, Konjunktivitis oder beidem führen (Keratokonjunktivitis). In experimentellen Tiermodellen mit bestimmten genetischen Modifikationen oder künstlichen Operationen ist es sinnvoll, alle Teile des OS-Epithelblatts zu untersuchen, um relative pathogenetische Veränderungen jedes Teils parallel zu bewerten. Die Zerlegung des OS-Gewebes als Ganzes ohne Verzerrung oder Beschädigung war jedoch eine Herausforderung, vor allem aufgrund der Weichheit und Dünnheit des Os, das an physisch getrennten, aber beweglichen Augenlidern und Augäpfeln befestigt ist. Darüber hinaus ist die tiefe Augenhöhle, die durch die harten Schädel/Orbitalknochen gebildet wird, durch den Augapfel voll belegt, so dass nur begrenzter Platz für die Bedienung von Sezierungen bleibt. Als Ergebnis würde eine direkte Zerlegung des Augapfels mit zugehörigem OS-Gewebe von der Gesichtsseite oft zu Gewebeschäden führen, insbesondere der palpebralen und bulbaren Bindehaut. In diesem Protokoll beschrieben wir eine Methode, um den Schädel und die Orbitalknochen sequenziell von einem zerkularten Mauskopf zu entfernen, wobei Augenlider, Augenoberfläche, Linse und Netzhaut in einem Stück zusammengelassen werden. Die Integrität des OS-Blattes war gut erhalten und konnte durch Histologie oder Immunostainierung in einem einzigen Abschnitt untersucht werden.
Introduction
Die Augenoberfläche besteht aus einem kontinuierlichen Blatt regionalisiertes Epithel einschließlich palpebrale Bindehaut, Bulbar-Konjunktiva und Hornhaut1. Viele Drüsenstrukturen sind mit dem Augenoberflächenepithel assoziiert und erzeugen zusammen eine Schicht Tränenfolie, die die Hornhautoberfläche vor Trocknung und Umweltinvasionen schützt2. Störung des OS würde zu Keratitis, Konjunktivitis oder beidem führen (Keratokonjunktivitis). Sowohl genetische Faktoren als auch Umweltreizstoffe oder ihre Wechselwirkungen tragen zu pathologischen Veränderungen des OS3,4bei. Dementsprechend wurden eine Vielzahl von gentechnisch veränderten und physikalisch oder chemisch induzierten Tiermodellen zur Untersuchung von Krankheitsprozessen des menschlichen Betriebssystems verwendet.
Die Struktur und Funktion des Maus-OS ist ähnlich wie die des Menschen in vielerlei Hinsicht. Die von den Augendrüsen sezernierten Tränenfilmkomponenten ähneln auch bei Mäusen und Menschen. Eine Fülle von Studien wurde mit Mausmodellen zur Aufklärung von Mechanismen menschlicher OS-Erkrankungen5,6,7durchgeführt. In vielen Fällen ist es wichtig, globale statt lokale molekulare Veränderungen des Betriebssystems zu analysieren, um umfassende Informationen unter der gleichen experimentellen Behandlung zu erhalten. Daher ist eine Probenvorbereitung mit guter Integrität erforderlich, um sicherzustellen, dass jeder Teil des Betriebssystems gleichzeitig analysiert wird.
Das Mausbetriebssystem verbindet sich eng mit dem Augapfel, der in die Augenhöhle/Orbit eingebettet war (eine knöcherne Tasse aus mehreren verschiedenen Schädelknochen) und verbindet sich mit ihm durch dünnes Bindegewebe. Es gibt enorme Herausforderungen für die Sezieren der gesamten Augenoberfläche, ohne die palpebrale oder bulbar Konjunktiva zu beschädigen. Diese Herausforderungen gehen von: (i) das Betriebssystem ist weich und dünn und befestigt an physisch getrennten, aber beweglichen Augenlidern und Augäpfeln, daher anfällig für Verzerrungen und Beschädigungen; und (ii) der begrenzte Abstand zwischen den Orbitalknochen und dem Augapfel die Seziervorgänge einschränken. Die Herausforderungen sind viel größer für die erwachsene Maus. In der embryonalen Maus ist die Orbitalknochenverknösung nicht vollständig und das umgebende Gewebe ist relativ locker8. Der Kopf kann entfernt und zerlegt werden und dann direkt paraformaldehyd (PFA) Fixierung und Einbettungausgesetzt 9. Im Gegensatz dazu sind die postnatalen und erwachsenen Maus-Orbitalknochen vollständig mit dicken umgebenden Geweben verknözt, was das Eindringen von Fixativen weniger effizient macht. Darüber hinaus sind die Orbital-/Schädelknochen hart und spröde, leicht gebrochen, wenn sie in die weichen Einbettverbindungen wie Paraffin geschnitten werden. Die gebrochenen Knochenstücke reißen einstimmig die nahegelegenen Gewebe, was zu einer minderwertigen Gewebemorphologie führt.
Viele veröffentlichte Studien zeigten oft partielle Augenoberfläche, die für ihre speziellen Forschungszwecke ausreichen kann10,11. Eine grobe Untersuchung der Literatur ergab nur wenige Studien, die zeigten, dass die gesamte intakte Augenoberfläche ohne detaillierte Beschreibung der Sezierprotokolle12,13nachgewiesen wurde. In diesem Protokoll haben wir eine Seziermethode beschrieben, um eine integrierte postnatale Augenoberfläche zu erhalten, bei der Orbital- und Schädelknochen geordnet entfernt wurden, wobei die unberührte Augenoberfläche zusammen mit dem Augapfel und den Augenlidern zurückbleibt, wodurch die körperlichen Schäden minimiert werden. Wir untersuchten die OS-Histologie und führten die Immunhistochemie mit den mit diesem Protokoll hergestellten Gewebeabschnitten durch.
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Protocol
Alle Verfahren zur Verwendung von Mäusen wurden vom Animal Care and Use Committee, Zhongshan Ophthalmic Center, genehmigt und befolgten die ARVO-Erklärung für den Einsatz von Tieren in der Augen- und Sehforschung.
1. Zerlegung des Augapfels mit intakter Augenoberfläche und Augenlidern
- Sezieren Sie den Kopf.
- Euthanisieren Sie postnatale Tag 10 (P10) und P28 Mäuse (siehe Tabelle der Materialien für Mausstämme) durch Zervixdislokation, schneiden Sie den Kopf vom Hals durch eine scharfe Schere.
- Bisect Kopf mit einem Paar gerade Schere entlang der sagittalen Mittellinie beginnend an der interparietalen Knochen rostral zur Nasal (Abbildung 1A,B).
HINWEIS: Der Schädelknochen härtet mit der Alterung der Maus aus, achten Sie darauf, dass die Schere so weit wie möglich entlang der Mittellinie schneidet. - Legen Sie jede Hälfte des geteilten Kopfes in eine saubere Petrischale, schneiden Sie den Kiefer und die Zunge zuerst mit einer scharfen Schere ab. Befreien Sie den Sehnerv, indem Sie ihn vor der optischen Chiasm-Position aus dem Gehirn schneiden, und entfernen Sie alle Hirngewebe, einschließlich der Olfaktor-Lampe, die an der Schädelwand befestigt ist.
- Nun sollen die restlichen Gewebe alle Schädel-Orbital-Knochen haben, die mit dem Augapfel verbunden sind (Abbildung 1C,D). Waschen Sie den restlichen Teil mit PBS, um Blut und Haarreste zu reinigen.
- Präfixgewebe mit 4% Paraformaldehyd (PFA, in phosphatgepufferter Saline [PBS], pH 7,4) in einem 50 ml konischen Rohr bei Raumtemperatur (RT) mit Rotation. Die ungefähre Fixierungszeit ist wie folgt: 10 min für P0 bis P7; 20 min für P8 bis P28; und 30 min für P29 und älter.
HINWEIS: Die Präfixierung bietet Gewebesteifigkeit, die die anschließende Zerlegung erleichtert. Darüber hinaus vermeidet die Präfixierung, dass frisches Gewebe zu lange vor der Zerlegung unfixiert bleibt.
VORSICHT: PFA ist gefährlich und muss mit Vorsicht behandelt werden.
- Entfernen Sie Schädel-Orbitalknochen.
- Nach der Präfixierung den sezierten Kopf in PBS dreimal schnell waschen, um die gebrochenen Haare und Fixativen weiter zu beseitigen, um mit der weiteren Zerlegung fortzufahren.
VORSICHT: Die Exposition gegenüber Fixativen während der Zerlegung kann gesundheitsschädlich sein. - Legen Sie das Gewebe in 10 cm Petrischale, schneiden Sie den Schädel in drei Teile entlang der in Abbildung 1D,Eangegebenen Ebenen. Der Augapfel in der Steckdose ist im mittleren Teil des Schädels unter ethmoiden, frontalen und kieferllbeinen Knochen versteckt (Abbildung 1D,E).
- Verwenden Sie zwei Paare von No. 4 geradeZange, um den ethmoiden Knochen abzuschälen, um die Frontal- und Kieferknochen vollständig freizulegen (Abbildung 1F).
- Teilen Sie die Schädeloberfläche (einschließlich Der Oberkiefer und der Frontalknochen) geographisch in 4 Bereiche (Abbildung 1F). Setzen Sie die Spitze der gekrümmten Zangen horizontal in jeden Bereich ein, um die Oberkiefer- und Frontalknochen sequenziell zu entfernen (Abbildung 1F).
HINWEIS: Die Kieferknochen können nicht alle gleichzeitig entfernt werden. Geduldig sezieren sie Stück für Stück. Der Frontalknochen ist durch weiches Bindegewebe direkt mit dem Augapfel verbunden. Seien Sie vorsichtig, wenn Sie ihn aus dem Augapfel entfernen, um zu verhindern, dass sich der Augapfel dehnt und die Bindehaut beschädigt wird. - Nach der Entfernung des partiellen Kieferknochens und aller Frontalknochen würden die darunter liegenden Tränen- und Jugalknochen freigelegt (Abbildung 1G). Entfernen Sie die beiden Knochen und die damit verbundenen subkutanen Muskeln und Fette, die den Augapfel umgeben, schneiden Sie den Augapfel mit angeschlossenen Augenlidern und Haut in einen kleinen quadratischen Block, um das Gewebevolumen zu reduzieren und die Orientierung des Gewebes beim Einbetten zu erleichtern(Abbildung 1 H).
- Den Augapfel und das zugehörige Gewebe wieder in 4% PFA geben und über Nacht bei 4 °C fixieren. Das feste Gewebe kann mindestens einen Monat lang bei 4 °C in PBS mit einem Zusatz von 0,02% NaN3konserviert werden. Alternativ können Sie sofort mit der histologischen Analyse fortfahren.
HINWEIS: Wenn das Gewebe länger gelagert werden muss, kann es leicht in 70% Ethanol gelagert werden.
- Nach der Präfixierung den sezierten Kopf in PBS dreimal schnell waschen, um die gebrochenen Haare und Fixativen weiter zu beseitigen, um mit der weiteren Zerlegung fortzufahren.
2. Histologische Analyse
- Paraffin-Sektion und Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H&E)
- Befolgen Sie das an anderer Stelle beschriebene Standardprotokoll9, um Paraffineinbettungen und -schnitte durchzuführen.
- Immunhistochemie (IHC)
- Paraffinabschnitte mit Xylol ableiten und die Abschnitte durch Alkoholreihen (100%, 95%, 80%) rehydrieren in destilliertes Wasser (dH2O).
- Antigenabruf durch Mikrowellenbehandlung der Geweberutschen im 0,01 M Zitronensäurepuffer (3 g Trinatriumcitrat, 0,4 g Zitronensäure pro 1 L doppelt destilliertemH2O) in einem Glasschieber glas mit geringer Leistung (120 W). Die Energie sollte zeitweise für insgesamt 5-10 min mit jedem Intervall von etwa 2 min geliefert werden.
HINWEIS: Hochleistungs-Mikrowelle oder gleichmäßige Erwärmung würde zur Ablösung von Gewebeabschnitten von der Rutsche führen. - Wählen Sie die Dias aus dem Glas, wischen Sie die Restflüssigkeit, die jeden Abschnitt umgibt, vorsichtig mit Gesichtsgewebeabsaugen ab und legen Sie sie in einer Histologiebox auf das Diaregal. Zeichnen Sie ein Quadrat um jeden Abschnitt mit einem wasserdichten histologischen Stift. Legen Sie 100 l Blockierpuffer (0,1% Triton X-100 und 10% Eselserum in 1x PBS) auf jedes Quadrat und brüten 30 min bei RT.
- Entfernen Sie die Blockierlösung vorsichtig mit Vakuum, fügen Sie den primären Antikörper (siehe Materialtabelle) mit der gewünschten Verdünnung im Sperrpuffer hinzu und inkubieren Sie die Dias 24 h oder länger bei 4 °C.
HINWEIS: Die Konzentration für jeden primären Antikörper, der für IHC verwendet wird, variiert und muss in Pilotversuchen getestet werden. - Waschen Sie Gewebeschlitten mit PBST (0,1% Triton in PBS) dreimal, für jeweils 10 min. Wiederholen Sie Schritt 2.2.4 mit dem sekundären Antikörper (siehe Materialtabelle) zusammen mit 4',6-Diamidino-2-phenylindole (DAPI), der den Sperrpuffer ersetzt. Bei Raumtemperatur (RT) mindestens 4 h oder länger weiter inkubieren.
- Entfernen Sie den sekundären Antikörper, waschen Gewebeabschnitte mit PBST-Lösung dreimal, für jeweils 10 min, dann mit sauberen PBS für weitere 5 min waschen.
- Wischen Sie die verbleibenden PBS-Umhänge ab, montieren Sie Abdeckungen auf Abschnitten mit Montagemedium. Führen Sie eine fluoreszierende Mikroskopie durch, um Bilder zu erhalten (siehe Tabelle der Materialien).
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Representative Results
Die wichtigsten Schädelknochen aus verschiedenen Perspektiven wurden in Abbildung 1A-Edargestellt, mit Farben, die verschiedene Knochen bezeichnen. Wir benutzten vier Wochen altes Tier, um die Sezierprozesse zu demonstrieren. Nach den Sezierschritten 1.1.1-1.1.3 und einer kurzen Präfixierung (Schritt 1.1.4) wird der Augapfel mit den zugehörigen Gesichtsknochen in Abbildung 1Egezeigt. Weitere Trimmungen zur Entfernung von vorderen (nasalen und prämaxillären) und hinteren (z.B. parietal) sowie ethmoiden Knochen erzeugten Gewebeblock mit hauptsächlich kiefer- und frontalen Knochen auf dem Augapfel (Abbildung 1F). Sequenzielle Entfernung dieser Knochen gemäß den ausgewiesenen Bereichen in Abbildung 1F belichtete zugrunde liegende Tränen- und Jugalknochen sowie Harderindrüse (Abbildung 1G). Die am Augapfel befestigte Harderin-Drüse diente als Wahrzeichen (Abbildung 1G) und sollte jederzeit an Ort und Stelle gehalten werden. Die Isolierung des Augapfels wurde durch die Entfernung aller Knochen und umgebenden Fette und Muskelgewebe abgeschlossen (Abbildung 1H).
Nach der Paraffineinbettung wurde der Augapfel geschnitten und H&E-befleckt. Repräsentative Bilder sind in Abbildung 2dargestellt. Die relativ intakten Positionen der Augenlider, der Hornhaut und der Bindehautoberfläche wurden in einem Abschnitt visualisiert (Abbildung 2A), von denen Teile in Abbildung 2B,Cvergrößert wurden. Die Linsenmorphologie ist aufgrund ihrer Steifigkeit und Fragilität schwer zu pflegen (Abbildung 2A). Wir wandten diese Seziermethode auf andere postnatale Altersgruppen an und zeigten ein Beispiel für H&E-Histologie des P10-Augenballabschnitts (Abbildung 3). Im Allgemeinen gilt: Je jünger die Maus ist, desto besser bleibt die Augapfelmorphologie erhalten. Immunostainierte Paraffinabschnitte aus dem seriellen postnatalen Alter sind in Abbildung 4dargestellt, mit Keratin 12 (K12) (Abbildung 4A-F) und Keratin 14 (K14) (Abbildung 4G-L), die die Hornhaut und das gesamte OS-Epithel färben, in dieser reihenfolge.
Abbildung 1: Abbildung der Augapfelsektion in einer 4 Wochen alten Erwachsenenmaus. (A-D) Das schematische Diagramm der Schädelzusammensetzung von oben (A), unten (B), seitlich (C) bzw. mittlerer Ebene (D). Gestrichelte Linien in (A) und (B) zeigen biszierte Ebenen an. (E) Bisected-Halbschädel im Alter von 4 Wochen, der genau mit (D) übereinstimmt. (F) Medialebene des sezierten Gewebes zwischen den beiden Querebenen in (D) und (E). Der Augapfel (gestrichelter Kreis) war hauptsächlich unter der Front (Fron) und Der Kiefer (Max) eingebettet. Farbige gestrichelte Linien teilen die geteilte Ebene geografisch in 4 Bereiche, in denen Knochen in etwa nach der Reihenfolge oder den Zahlen entfernt wurden. Beachten Sie, dass der Ethmoid-Knochen (Eth) entfernt wurde. (G) Nach der Entfernung von Frontalknochen und partiellen Kieferhöhlen wurden Harderindrüse (Har) und Jugalknochen (Jug) und Tränenknochen (La) freigelegt. Gekreiste gestrichelte Linien zeigen die Augapfelposition an. (H) Isolierter Augapfel von innen betrachtet nach der Zerlegung abgeschlossen. Pfeil zeigt auf Sehnerv (Ein). E = Auge, Na = Nasal, Pre = Premaxilla, Max = Maxillary, La = Lacrimal, Fron = Frontal, Ali = Alisphenoid, Jug = Jugal, Pal = Palatine, Ptery = Pterygoid, Squ = Squamosal, Par = Parietal, Eth = Ethmoid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: H&E-Histologie des okulären Oberflächengewebes im postnatalen 4 Wochen alter Zeit. (A) Augenlid, Bindehaut und Hornhaut werden in einem Gewebeabschnitt visualisiert. Die Boxbereiche von "b" und "c" wurden in (B) bzw. (C) vergrößert. (B) Das Hornhautepithel, Stroma und Endothel. (C) Die Bindehaut mit Kelchenzellen. ce = Hornhautepithel, st = stroma, ed = endothelium, gc = Goblet-Zelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: H&E-Histologie des okulären Oberflächengewebes am postnatalen Tag 10. (A) Intakter Augapfel bei P10. Die Boxbereiche von "b" und "c" wurden in (B) bzw. (C) vergrößert. (B) Die Hornhaut. (C) Die Bindehaut. Ce = Hornhautepithel, st = stroma, ed = endothelium, cj = bindehaut. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Immunostainierung der Augenoberfläche von P5 bis P15. Quadratischer Bereich in jeder Platte wurde in ihrem Recht vergrößert. (A-F) Keratin 12 wurde speziell im Hornhautepithel (Pfeile) exprimiert. (G-L) Das Keratin 14 exprimiert in der Augenoberfläche. ac = Vorderkammer, pc = palpebrale Bindehaut. Diese Zahl wurde aus einer früheren Veröffentlichung Guo et al.14geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
Eine wichtige Erinnerung für die Vorbereitung des intakten Augapfels ist, dass alle Orbitalknochen vollständig entfernt werden müssen, insbesondere die Juga- und Tränenknochen, die klein sind und sich in der Nähe der Unterseite der Augenhöhle befinden. Alle übrig gebliebenen Knochen können die anschließende Histologie erschweren. Falls ein winziges Stück Knochen nicht versehentlich vollständig aus der Zerlegung entfernt wurde, kann es aus dem Einbettungsparaffinblock mit einem Paar Scharfmacher herausgenommen werden. Das zurückgelassene Loch sollte nach dieser Operation mit geschmolzenem Paraffin gefüllt werden.
Beim Umgang mit der Linse ist zusätzliche Vorsicht geboten. Die zerbrochenen Linsenstücke sind in der Regel über den gesamten Abschnitt verstreut. Dies wird sich erheblich auf die Mikroskopieuntersuchung und die Bildanalyse auswirken. Versuche, die Linse zu entfernen, würden entweder die Augenoberfläche (wenn die Operation von der Gesichtsseite durchgeführt wurde) oder die Netzhaut beschädigen (wenn die Operation von der optischen Bandseite der Netzhaut stammt). Eine alternative Möglichkeit, die negativen Auswirkungen des Vorhandenseins von Linsengewebe ohne Sezierung zu reduzieren, besteht darin, Schnittrichtungen zu ändern. Um beispielsweise die Morphologie der Augenoberfläche zu retten, sollte die Schnittung des Paraffinblocks vom vorderen Ende des Augapfels bis zum Hinterteil, ansonsten aus der entgegengesetzten Richtung durchgeführt werden.
Eine nützliche Anmerkung für den PFA-festen Paraffin-Abschnitt ist, dass Antigen-Retrieval in der Regel für die Immunfärbung notwendig ist, wie z. B. mit K12- und K14-Antikörpern. Es gibt jedoch viele Ausnahmen, dass Antigen-Retrieval unspezifische Signale erzeugen würde, die die Hintergrundfärbung erhöhen. Daher sollte man bei der Verwendung der Antigen-Retrieval-Technologie vorsichtig sein und Antikörper möglichst vorher in Pilotversuchen testen.
Im Allgemeinen gibt es zwei Methoden zur Isolierung des Augapfels von den Schädel-Orbitalknochen: (i) den Augapfel direkt von der Gesichtsseite sezieren; und (ii) entfernen Sie die inneren Schädel-Orbitalknochen, um den Augapfel zu befreien. Die Herausforderung für die erste Methode besteht darin, dass der Augapfel tief in den Orbitalsockel sinkt, mit einem schmalen Raum dazwischen für die Zerlegung. Darüber hinaus würde der bewegliche Augapfel das Bindehautepithel an einem bestimmten Punkt dehnen, wenn die Sezierwerkzeuge es berühren, was unbeabsichtigte Schäden verursacht. Im Gegensatz dazu beginnt die zweite Methode mit der Zerlegung von Schädel-Orbitalknochen, die weiter vom Augapfel und dem zugehörigen okulären Oberflächengewebe entfernt sind, wodurch das Risiko einer Beschädigung der Bindehaut verringert wird. Darüber hinaus gibt es keine räumlichen Engstellen für die Durchführung von Sezierungen. Auch wenn die erste Methode funktionieren kann, wenn große Vorsichtsmaßnahmen getroffen wurden, ist die zweite definitiv einfacher und besser.
Zusammenfassend haben wir eine Methode zur Isolierung von Mausaugder n. Chr. mit intaktem Augenlid und zugehöriger Augenoberfläche von den postnatalen Mäusen beschrieben. Das beschriebene Protokoll eignet sich zur Isolierung des Augapfels mit intaktem Augenlid und zugehörigem Augengewebe bei postnatalen Mäusen. Das Protokoll ist besonders nützlich, wenn die Integrität des Betriebssystems oder des gesamten Augengewebes erforderlich ist. Wir haben diese Methode verwendet, um Gewebeproben für die Untersuchung von Keratinmarkern im Os unter normalen und pathologischen Bedingungen vorzubereiten. Wir kommen zu dem Schluss, dass das Augengewebe solcher Präparate besonders hilfreich ist, um die Differentialregulationen eines Proteins in verschiedenen Teilen des Betriebssystems auf einem einzigen Abschnitt zu betrachten.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Prof. Rong Ju für die kritische Lektüre des Manuskripts und allen Labormitgliedern für die technische Unterstützung. Diese Arbeit wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (NSFC: 31571077; Beijing, China), das Guangzhou City Sciences and Technologies Innovation Project (201707020009; Guangzhou, Provinz Guangdong, China), "100 People Plan" von der Sun Yat-sen University (8300-18821104; Guangzhou, Provinz Guangdong, China) und Forschungsgelder vom State Key Laboratory of Ophthalmology am Zhongshan Ophthalmic Center (303060202400339; Guangzhou, Provinz Guangdong, China).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1× Phosphate buffered saline (PBS) | Transgen Biotech | FG701-01 | |
| 50ml centrifuge tube | Corning | 430829 | |
| Adhesive microscope slides | Various | ||
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Alexa Fluor 568 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12380 | Suggested concentration 1:500 - 1,000 |
| Anti-K12 antibody | Abcam | ab124975 | Suggested concentration 1:1,000 |
| Anti-K14 antibody | Abcam | ab7800 | Suggested concentration 1:800 |
| Citric acid | Various | ||
| Cover slide | Various | ||
| Curved forceps | World Precision Instruments | 14127 | |
| Dissecting microscope. | Olmpus | SZ61 | |
| Ethyl alcohol | Various | ||
| Fluorescent Microscope | Zeiss | AxioImager.Z2 | |
| Fluoromount-G Mounting media | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Micro dissecting scissors-straight blade | World Precision Instruments | 503242 | |
| Microwave ovens | Galanz | P70D20TL-D4 | |
| Mouse strains | C57/BL6 and Sv129 mixed | ||
| No.4 straight forceps | World Precision Instruments | 501978-6 | |
| Normal Goat Serum | Various | ||
| Paraformaldehyde (PFA) | Various | Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane | |
| Tissue culture dish | Various | ||
| Trisodium citrate | Various | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | SLBW6818 |
References
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