Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

عزل مقلة العين السليمة للحصول علي الانسجه السطحية البصرية المتكاملة للفحص النسيجي والمناعي

doi: 10.3791/60086 Published: October 20, 2019

Summary

هذا البروتوكول يصف طريقه لعزل مقلة العين الماوس مع جفن, سطح العينين, الأجزاء الاماميه والخلفية في موقف سليمه نسبيا.

Abstract

سطح العين (نظام التشغيل) يتكون من ورقه الظهاريه مع ثلاثه أجزاء متصلة: الملتحمة جفني ، بولبار الملتحمة وظهاره القرنية. قد يؤدي تعطيل نظام التشغيل إلى قرنيه أو التهاب الملتحمة أو كليهما (قرنيه). في النماذج الحيوانية التجريبية مع بعض التعديلات الوراثية أو العمليات الاصطناعية ، فمن المفيد لفحص جميع أجزاء من ورقه الظهاريه OS لتقييم التغيرات المرضية النسبية لكل جزء في نفس الوقت. ومع ذلك ، فقد كان تشريح انسجه نظام التشغيل ككل دون تشويه أو ضرر تحديا ، ويرجع ذلك في المقام الأول إلى نعومه ونحافة نظام التشغيل المثبت علي الجفون المنقولة جسديا ومقلة العين. بالاضافه إلى ذلك ، فان ماخذ العين العميقة التي شكلتها الجمجمة الصلبة/العظام المدارية مشغولة تماما من قبل المقلة تاركه مساحة محدوده لتشغيل الأجزاء المتقطعة. ونتيجة لذلك ، فان التشريح المباشر لمقلة العين مع انسجه نظام التشغيل المرتبطة من جانب الوجه غالبا ما يؤدي إلى تلف الانسجه ، وخاصه الملتحمة الشاحبة والبولبار. في هذا البروتوكول ، وصفنا طريقه لأزاله الجمجمة والعظام المدارية بالتتابع من راس الماوس المقطوع ، تاركا الجفون وسطح العين والعدسة والشبكية تماما في قطعه واحده. تم الحفاظ علي سلامه ورقه نظام التشغيل بشكل جيد ويمكن فحصها من قبل الانسجه أو المناعة في قسم واحد.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

يتكون سطح العين من ورقه مستمرة من ظهاره الاقليميه بما في ذلك الملتحمة جفني ، والملتحمة بولبار والقرنية1. ترتبط العديد من الهياكل الغديه مع ظهاره سطح العين وتولد معا طبقه من فيلم المسيل للدموع حماية سطح القرنية من التجفيف والغزوات البيئية2. قد يؤدي تعطيل نظام التشغيل إلى قرنيه أو التهاب الملتحمة أو كليهما (قرنيه). كل من العوامل الوراثية والمهيجات البيئية أو تفاعلاتها تسهم في التعديلات المرضية من OS3,4. وتبعا لذلك ، استخدمت مجموعه متنوعة من النماذج الحيوانية المهندسة وراثيا والمستحثة ماديا أو كيميائيا لدراسة عمليات الامراض في نظام التشغيل البشري.

هيكل ووظيفة الماوس OS مماثله لتلك التي من البشر في نواح كثيره. كما ان مكونات الفيلم المسيل للدموع التي تفرزها الغدد البصرية متشابهة أيضا بين الفئران والبشر. وقد أجريت ثروة من الدراسات باستخدام نماذج الماوس لليات التوضيح من امراض الإنسان OS5,6,7. في كثير من المناسبات ، من الضروري تحليل التغيرات العالمية بدلا من التغييرات الجزيئية المحلية لنظام التشغيل للحصول علي معلومات شامله تحت نفس العلاج التجريبي. ولذلك ، هناك حاجه إلى اعداد عينه مع سلامه جيده لضمان كل جزء من نظام التشغيل ليتم تحليلها في وقت واحد.

الماوس نظام التشغيل المرتبطة باحكام مقلة العين التي كانت جزءا لا يتجزا من التجويف/المدار (كوب عظمي مصنوعة من عده عظام الجمجمة المختلفة) ويتصل به من خلال الانسجه الضامة رقيقه. هناك تحديات هائله لتشريح سطح العين كله دون الاضرار بالملتحمة جفني أو بصلي. وهذه التحديات تنحدر من: ' 1 ' ان نظام التشغيل لين ورقيق ومثبت علي الجفون ومقلة العين المنقولين ماديا ، التالي فهو معرض للتشويه والتلف ؛ و ' 2 ' الحيز المحدود بين العظام المدارية ومقلة العين يقيد عمليات التشريح. التحديات هي أكبر بكثير بالنسبة للماوس الكبار. في الفاره الجنينية ، والتحجر العظام المدارية ليست كامله والانسجه المحيطة هي فضفاضة نسبي8. يمكن أزاله الراس وتقسيمها ، ومن ثم تعرض مباشره لتثبيت بارافورمالدهيد (PFA) وتضمين9. وعلي النقيض من ذلك ، فان العظام المدارية الفارهة بعد الولادة والبالغة هي متحجرة تماما مع الانسجه المحيطة السميكة ، مما يجعل تغلغل المثبتات اقل كفاءه. وعلاوة علي ذلك ، العظام المدارية/الجمجمة من الصعب وهشه ، وكسر بسهوله عند التماس لهم في المركبات التضمين لينه مثل البارافين. سوف تمزق القطع المكسورة من العظام بالإجماع الانسجه القريبة مما ادي إلى المورفولوجية الانسجه السفلي.

كثير نشر دراسات غالبا يبدي متحيزة عين سطح, اي يمكن كنت كاف ل هم خاصه بحث أغراض10,11. وقد وجدت دراسة إجماليه للآداب دراسات قليله فقط تبين السطح الكامل للعين السليمة دون وصف مفصل لبروتوكولات التشريح12،13. في هذا البروتوكول ، قمنا بتفصيل طريقه تشريح للحصول علي سطح العين المتكامل بعد الولادة ، والتي تم فيها أزاله العظام المدارية والجمجمة بشكل منظم ، تاركه سطح العين البكر مع مقلة العينين والجفون ، وتقليل الاضرار المادية. درسنا كذلك الانسجه نظام التشغيل وأداء مناعي باستخدام أقسام الانسجه التي أعدت مع هذا البروتوكول.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تمت الموافقة علي جميع الإجراءات التي تنطوي علي استخدام الفئران من قبل لجنه العناية بالماشية واستخدامها ، مركز تشونغشان للعيون ، وانضم إلى بيان ARVO لاستخدام الحيوانية في بحوث العيون والبصر.

1. تشريح مقلة العين مع سطح العينين سليمه والجفون

  1. تشريح الراس.
    1. موت ببطء اليوم التالي للولادة 10 (P10) و P28 الفئران (انظر جدول المواد لسلالات الماوس) عن طريق خلع عنق الرحم ، وقطع راس الرقبة من قبل زوج من مقص حاد.
    2. الراس bisect مع زوج من مقص مستقيم علي طول خط الوسط السهمي بداية في العظم الجدارية rostrally إلى الأنف (الشكل 1ا ، ب).
      ملاحظه: عظم الجمجمة يصلب مع الشيخوخة الماوس ، وتوخي الحذر للحفاظ علي مقص قطع علي طول خط الوسط قدر الإمكان.
    3. ضع كل نصف الراس المقطوع في طبق بيتري نظيف ، واقطع الفك واللسان أولا باستخدام مقص حاد. حرر العصب البصري عن طريق تقطيعه من الدماغ قبل الموقع التصالب البصرية ، وأزاله جميع انسجه المخ بما في ذلك لمبة حاسة الشم تعلق علي جدار الجمجمة.
    4. الآن الانسجه المتبقية يجب ان يكون كل العظام الجمجمة/المدارية المرتبطة مقلة العين (الشكل 1ج ، د). غسل الجزء المتبقي مع برامج تلفزيونيه لتنظيف الدم والحطام الشعر.
    5. الانسجه بادئه مع 4 ٪ بارافورمالدهيد (PFA ، في المحلول الملحي الفوسفات مخزنه [بالفيديو] ، pH 7.4) في أنبوب مخروطي 50 mL في درجه حرارة الغرفة (RT) مع التناوب. الوقت التقريبي للتثبيت علي النحو التالي: ~ 10 دقيقه ل P0 إلى P7; ~ 20 دقيقه ل P8 إلى P28; و ~ 30 دقيقه ل P29 وكبار السن.
      ملاحظه: يوفر التثبيت المسبق صلابة الانسجه مما يجعل التشريح الناتج أسهل. بالاضافه إلى ذلك ، يتجنب التثبيت المسبق ترك الانسجه الطازجة غير ثابته لفتره طويلة قبل اكتمال التشريح.
      تحذير: PFA خطره ويجب التعامل معها بعناية.
  2. أزاله الجمجمة/العظام المدارية.
    1. بعد التثبيت ، بسرعة غسل الراس تشريحها في الاذاعه التلفزيونية ثلاث مرات لمزيد من القضاء علي الشعر المكسور والمثبتات من أجل المضي قدما في تشريح مزيد من.
      تحذير: يمكن ان يكون التعرض للتثبيتات اثناء التشريح ضارا بالصحة.
    2. ضع النسيج في طبق بيتري 10 سم ، وقطع الجمجمة إلى ثلاثه أجزاء علي طول الطائرات المشار اليها في الشكل 1D ، E. يتم إخفاء مقلة العين في المقبس في الجزء الأوسط من الجمجمة تحت ethmoid ، والعظام الاماميه والفك العلوي (الشكل 1د ، ه).
    3. استخدم زوجين من الملقط المستقيم رقم 4 لتقشير العظم الغربالي للكشف عن العظام الاماميه والفك العلوي بشكل كامل (الشكل 1و).
    4. تقسيم سطح الجمجمة جغرافيا (بما في ذلك الفك العلوي والعظام الاماميه) إلى 4 مناطق (الشكل 1و). ادخل طرف الملقط المنحني أفقيا في كل منطقه لأزاله العظم الفكي والامامي بالتتابع (الشكل 1و).
      ملاحظه: لا يمكن أزاله العظام الفك العلوي في وقت واحد. تشريح بصبر لهم قطعه من قطعه. العظم الجبهي متصل مباشره بمقلة العين من خلال الانسجه الضامة اللينة. توخي الحذر عند ازالته من مقلة العين لمنع تمدد مقلة العين والاضرار الملتحمة.
    5. بعد أزاله العظم الفكي الجزئي وجميع العظام الاماميه ، ستتعرض العظام الدمعية الاساسيه وعظم الجوغال (الشكل 1G). أزاله العظام اثنين والعضلات تحت الجلد المرتبطة والدهون المحيطة مقلة العين ، وتقليم مقلة العين مع الجفون المرفقة والجلد في كتله صغيره الشكل مربع للحد من حجم الانسجه وتسهيل توجيه الانسجه عند تضمين (الشكل 1 ح).
    6. وضع مقلة العين والانسجه المرتبطة بها مره أخرى إلى 4% PFA والاستمرار في إصلاح بين عشيه وضحيها في 4 ° c. النسيج ثابته يستطيع كنت حافظت ل علي الأقل واحده شهر في 4 [ك] في [ببس] مع أضافه من 0.02% [نان]3. بدلا من ذلك ، انتقل إلى التحليل النسيجي علي الفور.
      ملاحظه: إذا كان النسيج يحتاج إلى تخزين لفترات أطول ، فانه يمكن تخزينها بسهوله في 70 ٪ الايثانول.

2. التحليل النسيجي

  1. البارافين القسم والدم والخلايا الدموية و يوزين (H & E) تلطيخ
    1. اتبع البروتوكول القياسي الموصوف في مكان آخر9 لاجراء تضمين البارافين والتقسيم.
  2. مناعي (IHC)
    1. ديواكس أقسام البارافين مع اكسيلين وأعاده ترطيب الأقسام من خلال سلسله الكحول (100 ٪ ، 95 ٪ ، 80 ٪) في الماء المقطر (dH2س).
    2. اجراء استرداد مستضد عن طريق المعالجة بالموجات الدقيقة من الشرائح الانسجه في 0.01 M العازلة حامض الستريك (3 غرام من سترات الصوديوم ، 0.4 غرام من حمض الستريك في 1 لتر المقطر المزدوج H2س) في جره الشريحة الزجاجية مع انخفاض الطاقة (120 W). وينبغي ان يتم تسليم الطاقة بشكل متقطع لمجموع 5-10 دقيقه مع كل فاصل زمني يدوم حوالي 2 دقيقه.
      ملاحظه: الميكروويف عاليه الطاقة أو التدفئة متسقة تؤدي إلى انفصال أقسام الانسجه من الشريحة.
    3. اقتطاف الشرائح من جره زجاجيه ، ويمسح بعناية قباله السائل المتبقية المحيطة كل قسم باستخدام انسجه الوجه ووضعها علي رف الشريحة في مربع الانسجه. رسم مربع حول كل قسم مع قلم النسيجية للماء. مكان 100 μL من حجب العازلة (0.1 ٪ تريتون X-100 و 10 ٪ حمار المصل في 1x تلفزيوني) علي كل مربع ، واحتضان لمده 30 دقيقه في RT.
    4. أزاله بعناية حل الحجب مع فراغ ، أضافه الأجسام المضادة الاساسيه (انظر جدول المواد) مع التخفيف المطلوب في حظر العازلة ، والاستمرار في احتضان الشرائح في 4 درجه مئوية لمده 24 ساعة أو أكثر.
      ملاحظه: يختلف تركيز كل الأجسام المضادة الاساسيه المستخدمة في IHC ، ويحتاج إلى اختبارها في التجارب التجريبية.
    5. يغسل الشرائح الانسجه مع PBST (0.1 ٪ تريتون في الاذاعه التلفزيونية) ثلاث مرات ، لمده 10 دقيقه لكل منهما. كرر الخطوة 4.2.2 باستخدام الأجسام المضادة الثانوية (انظر جدول المواد) مع 4 ' ، 6-diamidino-2-فينيلانديول (dapi) استبدال المخزن المؤقت الحظر. الاستمرار في احتضان لمده 4 ساعات علي الأقل أو أكثر في درجه حرارة الغرفة (RT).
    6. أزاله الأجسام المضادة الثانوية ، وغسل أقسام الانسجه مع محلول PBST ثلاث مرات ، لمده 10 دقيقه لكل منهما ، ثم يغسل مع برامج تلفزيونيه نظيفه لمده 5 دقائق أخرى.
    7. امسح الأجزاء المتبقية من الانسجه المحيطة بالمقاطع التلفزيونية ، وجبل الشفتين علي الأقسام ذات التركيب المتوسط. أداء المجهر الفلورسنت للحصول علي الصور (انظر جدول المواد).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تم توضيح عظام الجمجمة الرئيسية التي تم النظر اليها من وجات نظر مختلفه في الشكل 1ا-ه، مع ألوان التي تدل علي عظام مختلفه. استخدمنا أربعه أسابيع الحيوانية القديمة لإظهار عمليات تشريح. بعد التشريح الخطوات 1.1.1-1-1-3 والتثبيت المسبق قصيرة (الخطوة 1-1-4) ، وتظهر مقلة العين مع عظام الوجه المرتبطة بها في الشكل 1ه. مزيد من تقليم لأزاله الامامي (الأنف والفك العلوي) والخلفي (علي سبيل المثال ، الجدارية) ، فضلا عن العظام غربالي ولدت كتله الانسجه مع الفكين أساسا والعظام الاماميه فوق مقلة العين (الشكل 1و). أزاله متتابعة من هذه العظام وفقا للمناطق المحددة في الشكل 1F يتعرض الدمعية الاساسيه والعظام جوغال وكذلك الغدة harderin (الشكل 1ز). الغدة Harderin تعلق علي مقلة العين بمثابه معلم (الشكل 1ز) ، وينبغي ان تبقي في مكانها في جميع الأوقات. تم الانتهاء من عزل مقلة العين عن طريق أزاله جميع العظام والدهون المحيطة وانسجه العضلات (الشكل 1ح).

بعد تضمين البارافين ، تم تقسيم مقلة العين و H & الملطخة بالبريد. وترد الصور التمثيلية في الشكل 2. وقد تم تصور المواضع السليمة النسبية لجفون العينين والقرنية وسطح الملتحمة في قسم واحد (الشكل 2ا) ، وقد تم تضخيم أجزاء منها في الشكل 2ب ، ج. ومن الصعب الحفاظ علي تشكل العدسة (الشكل 2ا) بسبب جمودها وهشاشتها. قمنا بتطبيق طريقه التشريح هذه علي الاعمار الأخرى بعد الولادة وأظهرنا مثالا علي الانسجه H & E من القسم P10 مقلة العين (الشكل 3). بشكل عام ، والأصغر سنا هو الفار ، والحفاظ علي أفضل المورفولوجية مقلة العين. يتم عرض أقسام البارافين المناعية من الاعمار المتسلسلة بعد الولادة في الشكل 4، مع الكيراتين 12 (K12) (الشكل 4ا-و) و الكيراتين 14 (K14) (الشكل 4G-L) تلطيخ القرنية وظهاره نظام التشغيل كله ، التوالي.

Figure 1
الشكل 1: الرسم التوضيحي لتشريح مقلة العين في الفار البالغ من العمر 4 أسابيع. (الف-دال) الرسم التخطيطي لتكوين الجمجمة ينظر اليه من اعلي (A) ، أسفل (B) ، الجانبي (C) والمستوي الأوسط (D) ، علي التوالي. تشير الخطوط المتقطعة في (ا) و (ب) إلى الطائرات المقسمة. (ه) نصف جمجمة في عمر 4 أسابيع يطابق تماما (D). (و) رؤية المستوي الإنسي للانسجه التي تم تشريحها بين الطائرتين المستعرضتين في (د) و (ه). وكان جزءا لا يتجزا من مقلة العين (دائره متقطعه) تحت الجبهي (فرون) والفك العلوي (ماكس). تقسم الخطوط المتقطعة الملونة جغرافيا الطائرة المقسمة إلى 4 مناطق ، حيث تمت أزاله العظام تقريبا وفقا للترتيب أو الأرقام. لاحظ انه قد تمت أزاله عظم غربالي (Eth). (ز) وبعد أزاله العظم الجبهي والفك العلوي الجزئي ، تعرضت عظام الغدة الحرة (هار) والجوغال (الإبريق) والدمعية (لا). تشير الخطوط المتقطعة للدائرة إلى موضع مقلة العين. (ح) مقلة العين المعزولة التي ينظر اليها من الداخل بعد انتهاء التشريح. السهم يشير إلى العصب البصري (علي). E = العين ، Na = الأنف ، قبل = Premaxilla ، ماكس = الفك العلوي ، لا = الدمعية ، فرون = امامي ، علي = اليسفينويد ، إبريق = Jugal ، بال = بالاتيني ، باتري = [بتروقويد] ، سلطان قابوس = حرشفي ، Par = باريميتال ، Eth = Ethmoid. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: H &Amp; E الانسجه من نسيج سطح العين في فتره ما بعد الولادة 4-الأسبوع القديم. (ا) يتم تصور الجفن والملتحمة والقرنية في قسم نسيجي واحد. وتم تضخيم المناطق المحاصرة من "ب" و "ج" في (ب) و (ج) علي التوالي. (ب) ظهاره القرنية ، سدي والبطانة. (ج) الملتحمة مع الخلايا القدح. ce = ظهاره القرنية ، st = سدي ، اد = بطانة ، gc = الخلية القدح. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: H &Amp; E الانسجه من نسيج سطح العين في اليوم بعد الولادة 10. (ا) مقلة العين السليمة في الساعة P10. وتم تضخيم المناطق المحاصرة من "ب" و "ج" في (ب) و (ج) علي التوالي. (ب) القرنية. (ج) الملتحمة. Ce = ظهاره القرنية ، st = سدي ، اد = بطانة ، cj = الملتحمة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: تحصين سطح العين من 5 إلى P15. تم تضخيم المنطقة المربعة في كل لوحه في حقهم. (الف-واو) وأعرب علي وجه التحديد الكيراتين 12 في ظهاره القرنية (السهام). (خ م-ل) وأعرب عن الكيراتين 14 في سطح العين. ac = الغرفة الاماميه ، والكمبيوتر = الملتحمة جفني. وقد عدل هذا الرقم من منشور سابق هو قوه وآخرون14. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أحد التذكيرات الهامه لاعداد مقلة العين السليمة هو ان جميع العظام المدارية يجب ازالتها تماما ، وخاصه العظام الجوقة والدمعية ، والتي هي صغيره وتقع بالقرب من الجزء السفلي من تجويف العينين. اي عظام اليسار قد تعقد الانسجه التي تلت ذلك. في حاله عدم أزاله قطعه صغيره من العظم بالبالكامل من التشريح عن طريق الصدفة ، قد يتم انتقاؤها من كتله البارافين المضمنة باستخدام زوج من الشاربات. يجب ان تملا الحفرة التي خلفتها بالبارافين المذاب بعد هذه العملية.

وينبغي توخي الحذر الإضافي عند التعامل مع العدسة. القطع المكسورة من العدسة عاده ما تكون متناثرة من خلال القسم بأكمله. وهذا سيؤثر بشكل كبير علي فحص المجهر وتحليل الصور. محاولات أزاله العدسة من شانها ان تضر اما سطح العين (إذا كانت العملية قد أجريت من جانب الوجه) أو الشبكية (إذا كانت العملية من جانب القرص البصري من الشبكية). وهناك طريقه بديله للحد من التاثير السلبي لوجود انسجه العدسة دون تشريح لتغيير اتجاات التماس. علي سبيل المثال ، لحفظ الشكل السطحي للعين ، يجب اجراء عمليه التقطيع من كتله البارافين من الجانب الامامي من مقلة العين إلى الخلفي ، والا ، من الاتجاه المعاكس.

ملاحظه مفيده لجعل لقسم البارافين الثابتة PFA هو ان استرجاع مستضد عاده ما يكون ضروريا للمناعة مثل استخدام K12 و K14 الأجسام المضادة. ومع ذلك ، هناك العديد من الاستثناءات التي استخراج antigen توليد إشارات غير محدده زيادة تلطيخ الخلفية. التالي ، ينبغي ان يكون المرء حذرا عند استخدام تكنولوجيا استرجاع مستضد ، وينبغي اختبار الأجسام المضادة في التجارب التجريبية إذا كان ذلك ممكنا ، مسبقا.

بشكل عام ، هناك طريقتان لعزل مقلة العين من الجمجمة/العظام المدارية: ' 1 ' تشريح مقلة العين مباشره من جانب الوجه. و (2) أزاله الجمجمة الداخلية/العظام المدارية لتحرير مقلة العين. التحدي بالنسبة للأسلوب الأول هو ان مقلة العين تغرق عميقا في التجويف المداري مع مساحة ضيقه بين لتشريح. وعلاوة علي ذلك ، فان مقلة العين المنقولة تمتد ظهاره الملتحمة في اي نقطه معينه عندما أدوات تشريح تلمس عليه ، وخلق اضرار غير مقصوده. وعلي النقيض من ذلك ، تبدا الطريقة الثانية بتشريح الجمجمة/العظام المدارية ، والتي هي ابعد من مقلة العين والانسجه السطحية المرتبطة بها ، مما يقلل من خطر اتلاف الملتحمة. وعلاوة علي ذلك ، لا توجد تضييقات مكانيه لأداء الأجزاء المشوهة. علي الرغم من ان الطريقة الاولي يمكن ان تعمل إذا تم اتخاذ تحذيرات كبيره ، والثاني هو بالتاكيد أسهل وأفضل.

باختصار ، لقد وصفنا طريقه لعزل مقلة العين الماوس مع الجفن سليمه والمرتبطة سطح العينين من الفئران بعد الولادة. البروتوكول الموصوف هو مناسبه لعزل مقلة العين مع الجفن سليمه والانسجه العينية المرتبطة بها في الفئران بعد الولادة. البروتوكول مفيد بشكل خاص عند الحاجة إلى سلامه نظام التشغيل أو انسجه العين بأكملها. لقد استخدمنا هذه الطريقة لاعداد عينات الانسجه لفحص علامات الكيراتين في نظام التشغيل تحت الظروف العادية والمرضية. ونستنتج ان انسجه العين من هذه الاستعدادات مفيده بشكل خاص للنظر في اللوائح التفاضلية للبروتين في أجزاء مختلفه من نظام التشغيل علي قسم واحد.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgments

ويشكر المؤلفان البروفيسور رونغ جو علي القراءة الناقدة للمخطوطة ، وجميع أعضاء المختبر للحصول علي المساعدة التقنية. وقد دعم هذا العمل بمنح مقدمه من المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (NSFC: 31571077 ؛ بيجين ، الصين) ، مشروع مدينه قوانغتشو للابتكار في مجال العلوم والتكنولوجيات (201707020009 ؛ قوانغتشو ، مقاطعه قوانغدونغ ، الصين) ، "100 خطه الناس" من جامعه صن يات سين (8300-18821104 ؛ قوانغتشو ، مقاطعه قوانغدونغ ، الصين) ، والتمويل البحثي من مختبر الدولة مفتاح طب العيون في مركز تشونغشان للعيون (303060202400339 ؛ قوانغتشو ، مقاطعه قوانغدونغ ، الصين).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1× Phosphate buffered saline (PBS) Transgen Biotech FG701-01
50ml centrifuge tube Corning 430829
Adhesive microscope slides Various
Alexa Fluor 488 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12379 Suggested concentration 1:500 - 1,000
Alexa Fluor 568 Phalloidin Invitrogen/Life Technologies A12380 Suggested concentration 1:500 - 1,000
Anti-K12 antibody Abcam ab124975 Suggested concentration 1:1,000
Anti-K14 antibody Abcam ab7800 Suggested concentration 1:800
Citric acid Various
Cover slide Various
Curved forceps World Precision Instruments 14127
Dissecting microscope. Olmpus SZ61
Ethyl alcohol Various
Fluorescent Microscope Zeiss AxioImager.Z2
Fluoromount-G Mounting media SouthernBiotech 0100-01
Micro dissecting scissors-straight blade World Precision Instruments 503242
Microwave ovens Galanz P70D20TL-D4
Mouse strains C57/BL6 and Sv129 mixed
No.4 straight forceps World Precision Instruments 501978-6
Normal Goat Serum Various
Paraformaldehyde (PFA) Various Prepare a 4% solution in 1× PBS and filter with 0.45μm filter membrane
Tissue culture dish Various
Trisodium citrate Various
Triton X-100 Sigma-Aldrich SLBW6818

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Swamynathan, S. K. Ocular surface development and gene expression. Journal of Ophthalmology. 2013, (2013).
  2. Arita, R., Fukuoka, S., Morishige, N. Functional Morphology of the Lipid Layer of the Tear Film. Cornea. 36 Suppl 1, S60-S66 (2017).
  3. Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2018).
  4. Knop, E., Knop, N. Anatomy and immunology of the ocular surface. Chemical Immunology and Allergy. 92, 36-49 (2007).
  5. Mizoguchi, S., et al. Ocular surface alkali injury damages meibomian glands in mice. The Ocular Surface. 15, (4), 713-722 (2017).
  6. Gipson, I. K. Goblet cells of the conjunctiva: A review of recent findings. Progress in Retinal and Eye Research. 54, 49-63 (2016).
  7. Nowell, C. S., et al. Chronic inflammation imposes aberrant cell fate in regenerating epithelia through mechanotransduction. Nature Cell Biology. 18, (2), 168-180 (2016).
  8. Nagata, M., Ohashi, Y., Ozawa, H. A histochemical study of the development of premaxilla and maxilla during secondary palate formation in the mouse embryo. Archives of Histology and Cytology. 54, (3), 267-278 (1991).
  9. Zhang, L., et al. A role for MEK kinase 1 in TGF-beta/activin-induced epithelium movement and embryonic eyelid closure. The Embo Journal. 22, (17), 4443-4454 (2003).
  10. Sharov, A. A., et al. Noggin overexpression inhibits eyelid opening by altering epidermal apoptosis and differentiation. The Embo Journal. 22, (12), 2992-3003 (2003).
  11. Setala, N. L., Metso, J., Jauhiainen, M., Sajantila, A., Holopainen, J. M. Dry eye symptoms are increased in mice deficient in phospholipid transfer protein (PLTP). The American Journal of Pathology. 178, (5), 2058-2065 (2011).
  12. Zhang, Y., et al. Mastermind-like transcriptional co-activator-mediated Notch signaling is indispensable for maintaining conjunctival epithelial identity. Development. 140, (3), 594-605 (2013).
  13. McCauley, H. A., et al. TGFbeta signaling inhibits goblet cell differentiation via SPDEF in conjunctival epithelium. Development. 141, (23), 4628-4639 (2014).
  14. Guo, D., et al. Ocular surface pathogenesis associated with precocious eyelid opening and necrotic autologous tissue in mouse with disruption of Prickle 1 gene. Experimental Eye Research. 180, 208-225 (2019).
عزل مقلة العين السليمة للحصول علي الانسجه السطحية البصرية المتكاملة للفحص النسيجي والمناعي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, D., Liu, C. Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (152), e60086, doi:10.3791/60086 (2019).More

Guo, D., Liu, C. Isolation of Intact Eyeball to Obtain Integral Ocular Surface Tissue for Histological Examination and Immunohistochemistry. J. Vis. Exp. (152), e60086, doi:10.3791/60086 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter